La obtencin de plantas transgnicas (manipuladas por I.G.

) depende de la introduccin (normalmente en cultivos de tejidos) de ADN forneo en su genoma, seguido de la regeneracin de la planta completa y la subsiguiente expresin de los genes introducidos (transgenes). Normalmente, para que un gen pueda funcionar en la planta, hay que hacer in vitro una "construccin gentica artificial": para ello se suele colocar delante de la parte codificadora que nos interesa una porcin de ADN que permite esa expresin (promotores, intensificadores de la transcripcin). Podemos incluso escoger nuestros promotores: algunos inducen la expresin en casi todos los tejidos de la planta, de forma continua (constitutiva); en cambio, otros logran que el transgn se exprese slo en determinados rganos o tejidos, o bajo el efecto inductor de alguna sustancia qumica. El florecimiento de la IG vegetal se debe principalmente a dos grandes avances de la dcada de los 80:
protocolos experimentales para la regeneracin de plantas completas frtiles a partir de cultivos de clulas o tejidos in vitro; mtodos para introducir el ADN exgeno, bien sea de modo directo o indirecto, seguido de su insercin en el genoma y su expresin. Regeneracin de plantas a partir de cultivos En principio se intent a partir de protoplastos, pero es laborioso y no funciona con muchas plantas A partir de discos foliares Pero en los ltimos 10 aos hemos aprendido a hacerlo mejor: la clave del xito consiste en extraer porciones de tejidos inmaduros (explantes), que siguen conservando su potencial morfogentico (totipotencia) y cultivarlos en medios nutritivos suplementados con mezclas de dos tipos de hormonas vegetales: auxinas (que tienden a inducir crecimiento de races) y citoquininas (inducen caulognesis). Lo que se obtiene en principio es un cultivo embriognico que forma el llamado embrin somtico. ste retiene el potencial morfogentico durante mucho tiempo. De este embrin se puede a su vez regenerar plantas completas normales y frtiles.

Esto ha permitido que actualmente se puedan regenerar casi todas las plantas de inters agrcola: cereales, leguminosas, hierbas forrajeras, caa de azcar, papaya, pltano, etc.

Mtodos de transformacin gentica

Perlitas microscpicas de oro o tungsteno se recubren del ADN de inters, y se disparan a gran velocidad con una pistola especial. Las clulas en la lnea directa del proyectil pueden morir, pero a su alrededor muchas clulas captan el ADN sin daos. Incluso se pueden transformar cloroplastos con este sistema. Sirve para plantas que son ms difciles de cultivarse sus tejidos (cereales, leguminosas), aunque tiene el inconveniente de que el ADN puede insertarse en copias, y puede ser inestable. El ADN se mezcla con protoplastos, y se aplican corrientes elevadas, lo que provoca la entrada de aqul.
Microbalstica (biolstica) Electroporacin Co-cultivo de clulas o tejidos con Agrobacterium tumefaciens

La biologa de esta bacteria

Agrobacterium tumefaciens del suelo que lleva haciendo ingeniera gentica por su cuenta con las plantas desde hace millones de aos. Nosotros hemos aprendido a aprovechar sus extraordinarias habilidades. La bacteria es un patgeno de plantas, inducindoles una malformacin llamada tumor de la agalla. Establece con la planta una especie de "colonizacin gentica" que obliga a la planta a fabricar una sustancia de la que slo se puede nutrir esta bacteria. El tumor es una especie de fbrica de esas sustancias, para el solo beneficio de Agrobacterium. La bacteria es atrada por sustancias que la planta excreta en sus zonas abiertas por pequeas heridas. Por all se introduce, quedando en los espacios intercelulares, y es entonces cuando transfiere a la clula vegetal un trozo de su material gentico: una porcin de un plsmido (ADN circular extracromosmico bacteriano), que se integrar en alguna zona del genoma de la planta.

Descripcin del plsmido Ti:

ADN-T, que es lo nico que se transfiere. Posee borde izquierdo, borde derecho, gen de biosntesis de hormona vegetal, gen de sntesis de opina. genes vir que provocan la transferencia del trozo T. genes de catabolismo de opinas (que permiten que la bacteria se nutra de estas sustancias).

El ADN-T entra al ncleo y se inserta al azar en algn sitio del genoma. All se expresan sus dos genes: el de las hormonas provoca crecimiento descontrolado de las clulas vegetales (de ah el tumor); el otro obliga a esas clulas a fabricar grandes cantidades de opinas, una sustancia que la planta no puede aprovechar; y la excreta. As pues, las bacterias se encuentran con un nicho ideal para nutrirse y multiplicarse: la planta se ha convertido en una especie de esclava metablica que mantiene el crecimiento de la bacteria en el seno del tumor de la agalla.

Vectores a partir del plsmido Ti Suelen ser de uno de dos posibles tipos:
vectores binarios vectores recombinativos (cointegrativos)

En esencia, hemos "vaciado" el interior del ADN-T, dejando de l slo los bordes (imprescindibles), y lo hemos sustituido por dos genes: uno es un marcador para localizar o seleccionar las clulas que se hayan transformado; el otro es el gen que queremos poner a trabajar en la planta. Ahora introducimos nuestro vector (con la correspondiente construccin gentica) en una cepa de Agrobacterium a la que hemos "desarmado" su plsmido Ti (con objeto aprovechar sus funciones de transferencia del ADN-T, pero inactivndole sus funciones patgenas). Ejemplo de uso: introduccin del gen Bt que determina la toxina antiiinsecticida de la bacteria Bacillus thuringiensis. Recientes progresos con vectores de Agrobacterium
Hasta hace muy poco este sistema no se poda aplicar a monocotiledneas. Pero recientemente, se ha logrado en: arroz (aunque de una variedad -Japonica- que no es tan interesante como la Indica) maz

Esto es importante, porque las monocotiledneas son esenciales, sobre todo en pases en desarrollo, y porque este sistema es ms fiable que otros (ms estable, una sola copia del transgn). Si en el futuro esto se ampla a trigo, cebada, etc., se habra dado un gran paso en la mejora de cereales.

Mtodo para transformar la planta entera (no hay que recurrir al ms tedioso sistema de cultivo in vitro): Las semillas de la planta se mezclan con la bacteria y se procede a la germinacin y crecimiento del vegetal: parece que quedan bacterias retenidas hasta que al llegar la floracin transmiten el ADN-T al zigoto. Otro mtodo consiste en sumergir plantas a punto de florecer en un cultivo fresco de Agrobacterium, y aplicar vaco. En ambos casos se espera a tener las semillas, se germinan, crecen, se autofecundan, y producen nuevas semillas, a partir de las cuales se pueden buscar los genotipos/fenotipos de inters.

Protocolos de transformacin mediante Agrobacterium tumefaciens

Los protocolos de transformacin por Agrobacterium tumefaciens son, en rasgos generales, muy similares. La base de la tcnica radica en poner en contacto el explanto que se va a utilizar para transformar con la cepa de Agrobacterium crecida en condiciones apropiadas. De acuerdo con la cepa utilizada, el requerimiento de antibiticos puede ser diferente. En general, las cepas de Agrobacterium se cultivan en medio LB suplementado con MgSO4 en presencia de los antibiticos requeridos. El Agrobacterium se cultiva toda la noche a 27-28 C. En el caso de la transformacin de hojas de tabaco, se cortan discos de hoja (explantos) de aproximadamente 1 cm de dimetro. El explanto se coloca en una caja de Petri que contiene medio MS lquido y el cultivo de Agrobacterium. Se incuba unos minutos en presencia de la bacteria y luego se pasa a un medio MS slido en presencia de las hormonas ANA y BAP para inducir la formacin de brotes. Luego, los explantos se traspasan a un medio MS slido suplementado con los antibiticos requeridos para seleccionar slo aquellos brotes que hayan incorporado el ADN-T y el marcador, un bacteriosttico que inhibe el crecimiento de Agrobacterium. Los explantos se replican cada 3 semanas durante 2 meses. Cuando se obtienen los brotes, estos se pasan a medio MS slido suplementado con los agentes de seleccin, pero en ausencia de hormonas para favorecer el desarrollo de races y tallos. Las plantas que enrazan en medio con seleccin se pasan a tierra en invernadero.

El protocolo de transformacin de Arabidopsis thaliana por Agrobacterium es extremadamente simple y la eficiencia de transformacin radica fundamentalmente en el buen estado fisiolgico de las plantas durante el proceso de transformacin y fecundacin. Una vez que las plantas florecen, se prepara la cepa de Agrobacterium tumefaciens que lleva el gen de inters en un vector binario. El cultivo de Agrobacterium se resuspende en una solucin de sacarosa al 5% y la planta se sumerge en la solucin de bacterias dejando en contacto las flores durante unos segundos con agitacin suave. Luego, las plantas se cultivan normalmente hasta la obtencin de semillas. Una vez obtenidas, las semillas se recolectan, se secan y se esterilizan usando cido clorhdrico. Las semillas transformadas se seleccionan durante 7 a 10 das en medio MS slido en presencia del agente selector. Estos tiempos son variables y dependen de la especie a ser transformada, la variedad elegida, el explanto utilizado y el protocolo elegido para la seleccin.