LA AGREGACIN CELULAR EN LA PRODUCCIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN CULTIVOS VEGETALES IN VITRO

Gabriela Trejo-Tapia y Mario Rodrguez-Monroy

RESUMEN El cultivo de clulas vegetales es una alternativa biotecnolgica para la produccin de metabolitos secundarios. Sin embargo, la productividad de los sistemas in vitro es menor a la obtenida de plantas. En esta revisin se ilustra la diferenciacin y compartamentalizacin celular como eventos necesarios para la sntesis de metabolitos secundarios en las plantas. Se discute la induccin de la agregacin celular en los cultivos in vitro como una de las estrategias para favorecer la acumulacin de estos compuestos qumicos. Este efecto positivo podra ser explicado como consecuencia de la formacin de estructuras morfognicas y/o por una condicin de estrs por limitaciones de oxgeno al interior de los agregados. Finalmente, se muestra que la combinacin de la agregacin con otras estrategias tales como la seleccin de lneas celulares, la elicitacin y la adicin de precursores constituye una alternativa para desarrollar bioprocesos a partir de clulas vegetales in vitro para la produccin de compuestos qumicos de alto valor agregado.

as plantas son fuente de una amplia variedad de compuestos qumicos, conocidos como metabolitos secundarios, que son utilizados como frmacos, pesticidas, colorantes, saborizantes y fragancias, entre otros. Comnmente, estos compuestos se extraen de plantas silvestres o cultivadas, lo que tiene una serie de desventajas. Su acumulacin en las plantas es baja y lenta, ya que est regulada espacial y temporalmente. Es decir, ocurre en clulas, rganos y tejidos especficos, en fases determinadas del ciclo de vida de la planta, bajo condiciones estacinales o de estrs (Verpoorte et al., 2002). Puede existir alta variabilidad entre poblaciones e inclusive entre individuos. En el caso de plantas silvestres, su explotacin comercial est basada en la recoleccin de material en su hbitat natural, frecuentemente incluyendo la raz, lo que ha provocado que muchas estn amenazadas o en peligro de extincin.

La produccin del Taxol, compuesto de alta demanda por su actividad citotxica, y la del alcaloide vinblastina, potente antileucmico, son ejemplos de frmacos que se obtienen de plantas cuya demanda es difcil de abastecer. Para preparar 1kg de Taxol, se necesita la corteza de 1000 rboles de Taxus brevifolia L. (Kieran et al., 1997). Asimismo, para obtener 1g de vinblastina, se necesita media tonelada de hojas secas de Catharanthus roseus (L.) G. Don (Sottomayor et al., 2004). El cultivo masivo de clulas vegetales se ha propuesto como una alternativa biotecnolgica para el desarrollo de sistemas de produccin de metabolitos secundarios (Sharp y Doran, 2001). Sin embargo, despus de ms de 40 aos de investigacin y desarrollo tecnolgico, los casos exitosos que justifican tcnica y econmicamente su operacin a nivel comercial son limitados, pudindose citar entre ellos la produccin de shikonina por clulas de Lithospermum erythrorhizon y

de Taxol por clulas de Taxus spp. (Zhao et al., 2005). El cultivo de clulas y tejidos vegetales se basa en el principio de totipotencia celular, que establece que a partir de cualquier clula de una planta es posible regenerar un individuo completo. Mediante esta herramienta, es posible obtener cultivos de clulas no diferenciadas, como callos y suspensiones celulares, adems de cultivos de rganos como brotes y races. Los sistemas que operan a nivel comercial usan principalmente cultivos de clulas en suspensin (Zhao et al., 2005) aunque tambin se reporta un proceso que opera con races transformadas (Guillon et al., 2006). Los cultivos de clulas no diferenciadas presentan velocidades de crecimiento mayores a los de clulas diferenciadas u rganos (races y brotes); adems, los procesos de transferencia de masa son ms eficientes y pueden desarrollarse cultivos con densidades celulares ms elevadas, lo que representa ventajas para el desarrollo, control

PALABRAS CLAVE / Agregacin Celular / Compartamentalizacin / Diferenciacin / Metabolitos Secundarios /

Recibido: 16/05/2007. Modificado: 17/09/2007. Aceptado: 18/09/2007.

Gabriela Trejo-Tapia. Doctora en Ciencias, Centro de Investigacin y Estudios Avanzados, Instituto Politcnico Nacional (CINVESTAV-IPN), Mxico. Investigadora, Centro de Desarrollo de Productos Biticos (CeProBi-IPN), Mxico. Direccin: Departamento de Biotecnologa, CeProBi-IPN. Km. 8.5 Carretera Yautepec-Jojutla. Colonia San Isidro. Yautepec, Morelos, Mxico 62731. e-mail: gttapia@ipn.mx Mario Rodrguez-Monroy. Doctor en Ciencias, Universidad Autnoma de Mxico. Investigador, CeProBi-IPN, Mxico. e-mail: mrmonroy@ipn.mx

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y manipulacin de procesos a escala de los alcaloides indlicos. Estos industrial. Sin embargo, la falta de compuestos se encuentran princidiferenciacin celular en los cultivos palmente en plantas de las familias puede ocasionar que la concentracin Apocinaceae, Loganiaceae, Rubiadel metabolito en el cultivo sea meceae y Nissaceae y se caracterizan nor que en la planta. Por ello, la propor la presencia de los ncleos indductividad del sistema in vitro puede lico e iridoide, los cuales provienen ser menor tanto en biorreactor como de la triptamina y la secologanina en matraz y, en consecuencia, el pro(Roberts y Strack, 1999). ceso no es econmicamente rentable La biosntesis de los alcaloides (Verpoorte et al., 2002) y el uso de indlicos es sumamente compleja y suspensiones celulares agregadas o todava no se conocen todas las enpoco diferenciadas podra representar zimas involucradas, ni los mecanisuna de las limitantes para el desarro- Figura 1. Esquema de un corte transversal de hoja de Catharan- mos que regulan su biosntesis. Uno thus roseus ilustrando la compartamentalizacin de las enzimas llo comercial de sistemas biolgicos de la ruta de biosntesis del alcaloide bisindlico vinblastina. de los estudios ms completos es el en biorreactores. correspondiente a la biosntesis del TDC: triptofano descarboxilasa, STR: estrictosidina sintasa, D4H: En las plantas, la deacetoxi-vindolina-4-dioxigenasa, DAT: 4-O-deacetilvindolina-4- alcaloide bisindlico vinblastina en diferenciacin consiste en el conjunto O-acetiltransferasa. C. roseus. La vinblastina resulta de la de procesos moleculares, bioqumicos condensacin de los alcaloides catay fisiolgicos mediante los cuales una clula suspensin para incrementar la produccin rantina y vindolina; sta ltima, a su vez, es meristemtica adquiere propiedades metab- de metabolitos secundarios. Tal es el caso sintetizada en seis pasos a partir del alcaloilicas, estructurales y/o funcionales diferentes del establecimiento de cultivos clorfilos, es de tabersonina. Mientras que la catarantina a las de la clula progenitora. Entre otros decir, con cloroplastos funcionales (Taya et se encuentra en cualquier rgano de la plancambios, se presentan: 1) el desarrollo de al., 1995; Kino-Oka et al., 2001). Pero las ta, la vindolina es sintetizada nicamente en organelos como los plstidos para realizar alternativas ms exploradas han sido la se- las hojas y tallo (De-Luca y Cutler, 1987; la fotosntesis (cloroplastos) o vacuolas en leccin de lneas celulares con agregados de De-Luca y St-Pierre, 2000). La distribucin celular donde se biosintetizen y acumulen metabo- mayor tamao y el desarrollo de agregalitos secundarios, 2) la formacin de pared dos con clulas especializadas (Jianfeng de algunas de las enzimas involucradas en celular secundaria caracterstica de las clu- et al., 1998a). El objetivo del presente tra- la biosntesis de los alcaloides indlicos ha las que constituyen el tejido vascular, 3) la bajo es mostrar la complejidad anatmica y sido estudiada en plantas de C. rosesus (Storganizacin de las clulas para constituir biosinttica que representa para la planta la Pierre et al., 1999). Las enzimas triptofano los diferentes tejidos y rganos de la planta, acumulacin de metabolitos secundarios, as descarboxilasa (TDC) y estrictosidina sintay 4) la especializacin para la biosntesis y/o como revisar el papel de la agregacin ce- sa (STR) se localizan en las clulas epidracumulacin de metabolitos (St-Pierre et al., lular en los cultivos in vitro para la produc- micas de tallos, hojas y botones florales, y cin de estos compuestos. en el protodermo y clulas corticales que ro1999; De-Luca y St-Pierre, 2000). dean el meristemo apical de la punta de las La produccin y acumuraces. Por su parte, las enzimas desacetoxilacin de metabolitos secundarios es una Diferenciacin Celular y Biosntesis vindolina-4-hidroxilasa (D4H) y acetilvindoexpresin de un estado particular de diferen- de Metabolitos Secundarios: lina 4-O-acetiltransferasa (DAT) estn resciacin celular, el cual es influenciado por Los Alcaloides Indlicos tringidas a clulas especializadas conocidas un nmero de factores; diferentes clases de Para ejemplificar la es- como laticferas e idioblastos de hojas, tallos metabolitos secundarios requieren diferentes grados de diferenciacin celular o tisular. trecha relacin entre la biosntesis de un y botones florales. Los estudios (St-Pierre La formacin de gradientes fsicos o bio- metabolito secundario y la diferenciacin et al., 1999; Samanani y Facchini, 2006) qumicos debidos a la organizacin celular celular en las plantas, se presenta el caso muestran la separacin espacial de la ruta es tambin un factor importante. Por de biosntesis de vindolina en clulas ejemplo, la acumulacin de isoprenoiparticulares de hoja, tallo y flores, e des depende de la diferenciacin de indican que la ruta temprana, la que plstidos, debido a que la mayora de va a la triptamina, ocurre en las calas enzimas de la ruta de biosntesis pas epidrmicas de hojas y tallos inse localizan en estos organelos. En maduros, mientras que las etapas tarotros casos es necesario el desarrollo das correspondientes a la biosntesis de rganos de almacenamiento, como de vindolina se localizan en clulas los pelos glandulares y las clulas lalaticferas e idioblastos (Figura 1). ticferas en el caso de los alcaloides Por otro lado, es importante con(Samanani y Facchini, 2006). siderar que al interior de la clula Como alternativa a las suspentambin existe una compartamentasiones celulares se ha considerado el lizacin de la ruta de biosntesis (Fiuso de sistemas in vitro diferenciados gura 2). La triptamina, el precursor como son brotes o races, que si bien indlico, es sintetizada en el citosol, presentan rendimientos mejores a los mientras que su condensacin con la de las clulas en suspensin, desde secologanina, el precursor iridoide, el punto de vista tecnolgico su cul- Figura 2. Compartamentalizacion celular de la ruta de biosntesis tiene lugar en la vacuola (Verpoorte, tivo a gran escala es ms complejo y de la vinblastina. TDC: triptofano descarboxilasa, STR: estric2000). De manera similar, vindolicostoso (Verpoorte et al., 2002); por tosidina sintasa, D4HH deacetoxi-vindolina-4-dioxigenasa, DAT: na y catarantina son sintetizadas en ello se ha buscado promover la dife- 4-O-deacetilvindolina-4-O-acetiltransferasa. Fuentes: Roberts y el citosol, pero su condensacin para renciacin de cultivos de clulas en Strack (1999), Collu et al. (2002). dar lugar a la vindolina ocurre en la

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La Agregacin Celular como Alternativa para la Acumulacin de Metabolitos Secundarios en Cultivos In Vitro Las suspensiones vegetales estn formadas por clulas meristemticas, es decir clulas no diferenciadas, que no se separan despus de la divisin y forman agregados multicelulares de diferente tamao y forma (Figura 3a, Meyer et al., 2002). La tendencia natural a agregarse est regulada por la cohesividad de la pared celular Figura 3. Agregados de Uncaria tomentosa. a: suspensin celuy permite la comunicacin lar con agregados de distinto tamao, b: agregado no-morfognico, c: agregado morfognico, d: esquema de la organizacin clula-clula, que a la vez celular del agregado morfognico. puede favorecer el transporte de intermediarios, necesario vacuola, lo que muestra claramente la nece- para la biosntesis de metabolitos secunsidad de transporte de intermediarios entre darios, como se indic anteriormente. los distintos organelos celulares. Lo anterior Las suspensiones celulares muestra en su conjunto que la biosntesis de son un sistema in vitro utilizado ampliamenla vinblastina requiere clulas de diferentes te en investigacin por ser el ms prctico tipos y con determinadas caractersticas (Fi- para el cultivo a gran escala y presenta mlgura 1) adems de la especializacin intrace- tiples ventajas para el control de parmetros lular que involucra a mltiples compartimen- en los biorreactores (Kieran et al., 1997). tos celulares (Figura 2; Roberts y Strack, Para lograr las mejores condiciones de trans1999; St-Pierre et al., 1999). ferencia de masa se prefieren las suspensio-

nes celulares formadas por clulas individuales o agregados pequeos. Los agregados tienden a sedimentar ms fcilmente que las clulas libres, lo que dificulta mantenerlos en suspensin, o debido a su adhesin llegan a obstruir las tuberas en los biorreactores, por mencionar algunas dificultades de ndole tecnolgica. Las clulas que conforman una suspensin fina son relativamente similares y resulta difcil que en cada una de ellas se lleven a cabo todos los procesos necesarios para la biosntesis de metabolitos secundarios antes mencionados: sntesis de intermediarios, condensacin, transporte y acumulacin (Figura 3b). Por ello se plantea que la formacin de agregados o el cultivo de rganos puede ser una alternativa ms atractiva para la sntesis y acumulacin de metabolitos secundarios. La influencia de la agregacin y el tamao de los agregados celulares en la acumulacin de metabolitos secundarios se han estudiado en varias especies, tanto en matraz como en biorreactor (Tabla I). Estos agregados se caracterizan por medir varios milmetros e incluso centmetros de dimetro; son esfricos, de superficie lisa, cohesivos y presentan cierto grado de diferenciacin celular o tisular (Figura 3c). En condiciones ptimas, las clulas que los conforman pueden proliferar sin perder su

Tabla I Estudios que relacionan el tamao de agregado celular con la produccin de metabolitos secundarios en matraces y biorreactor
Planta Camptotheca acuminata Carthamus tinctorius Catharanthus roseus Cinchona ledgeriana Catharanthus rosesus Daucus carota Fragaria ananassa Hypericum perforatum Rhodiola sachalinensis Rhodiola rosea Salvia officinalis Saussurea medusa Saussurea medusa Tagetes patula Uncaria tomentosa Vaccinium pahalae Vitis vinifera
a

Metabolito Camptotecina Colorante rojo Alcaloides indlicos Quinina y quinidina Ajmalicina Antocianinas Antocianinas Hipericina, pseudohipericina e hiperforina Salidrsidos Salidrsidos Acido urslico Jaceosidina e hispidulina Flavonoides Tiofeno Alcaloides oxindlicos Antocianinas Antocianinas

Sistema de cultivo Matraces Biorreactor airlift (5L) Matraces Matraces Tanque agitado (3L) Matraces Matraces Matraces Matraces Matraces Biorreactor de columna Matraces Airlift (1 y 10L) Matraces Matraces Tanque agitado (1L) Matraces Airlift (2L) Matraces Matraces Matraces Matraces

Dimetroa 2-4mm 2-4mm >1,0mm 3-7mm 0,053-0,108m 3-6mm 8mm 1mm 390m 1mm 5mm 2-5mm >1cm <100m <100m 2-4mm 5-10mm 11-13mm 5mm 0,018-0,232m <0,279m <50m

Referencia Yu et al. (2005) Hanagata et al. (1993) Zhao et al. (2001) Keler et al. (1999) Hoekstra (1993) Montiel et al. (2007) Madhusudhan y Ravishankar (1996) Edahiro y Seki (2006) Karppinen et al. (2006) Jianfeng et al. (1998a, b) Gyrgy et al. (2005, 2006) Bolta et al. (2003) Zhao et al. (2003), Fu et al. (2005) Yuan et al. (2004) Hulst et al. (1989) Trejo et al. (2005) Ppin et al. (1999) Meyer et al. (2002) Qu et al. (2006)

Dimetro en el que se reporta el mayor contenido de metabolito secundario.

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integridad. Este tipo de agregados son considerados como un grupo de clulas autoinmovilizadas. Hoekstra (1993) propuso el cultivo de agregados de Cinchona ledgeriana Moens. de 3-6mm de dimetro para la produccin de quinina y quinidina. Los agregados de 2-4mm de Rhodiola sachalinensis A. Bor. acumularon hasta diez veces ms salidrsidos que agregados de tamao menor (Jianfeng et al., 1998a, b). Inclusive, en un reactor tipo airlift, suspensiones de agregados de 3-7mm acumularon seis veces ms metabolitos que las suspensiones finas. Por otro lado, los agregados de C. roseus de 3-7mm de dimetro produjeron dos veces ms alcaloides que las suspensiones finas (Zhao et al., 2001). En otro estudio la produccin de jaceosidina e hispidulina en Saussurea medusa fue mayor en agregados de 2-4mm de dimetro (Fu et al., 2005). Se observ una relacin directa entre el tamao de los agregados de Fragaria ananassa R. y la produccin de antocianinas; la lnea agregada produjo 95% ms antocianinas que la fina (Edahiro y Seki, 2006). En contraste, las clulas aisladas de Salvia officinalis L. produjeron 50 veces ms cido urslico (terpeno) que los agregados (Bolta et al., 2003). Los estudios anteriores muestran que, efectivamente, el grado de agregacin y el tamao de los agregados celulares influyen en el nivel de produccin de metabolitos secundarios. Sin embargo, no es claro de qu manera afectan la fisiologa y el metabolismo de las clulas. Por qu agregados ms grandes (1mm) producen ms metabolitos secundarios que agregados pequeos (<1mm)?. La mayora de las explicaciones apuntan en dos sentidos: 1) la agregacin influye sobre las condiciones locales de las clulas que conforman un agregado celular, y 2) est relacionada con la morfognesis. Tamao de los Agregados y Procesos de Transferencia de Masa Las diferencias en la produccin de metabolitos secundarios observada entre los agregados y las suspensiones finas han sido analizadas considerando problemas de difusin de nutrientes. Es decir, el tamao de los agregados influye en los procesos de transferencia de masa, ya que las clulas localizadas en el interior de

un agregado de un tamao relativamente grande no estn expuestas de manera similar a los nutrientes, iluminacin, O2 y otros factores microambientales en comparacin a las clulas localizadas en la periferia (Hulst et al., 1989; Ppin et al., 1999; Meyer et al., 2002). De los factores mencionados, la difusin del O2 ha recibido la mayor atencin, lo que podra ser consecuencia de la importancia que tiene el O2 como nutriente para el desarrollo de cultivos aerbicos, como lo son las clulas vegetales en suspensin (Kieran et al., 1997). El O2 se constituye como un nutriente fundamental en los procesos de oxidacin y para la obtencin de energa por parte de las clulas; sin embargo, es considerado como un nutriente limitante en los cultivos en suspensin debido a su baja solubilidad en agua, de apenas 8mgl-1. Como consecuencia de lo anterior, las clulas del centro de un agregado grande pueden llegar a estar limitadas en su disponibilidad de O2, generando una condicin de estrs y como la acumulacin de metabolitos secundarios. O bien, puede inhibirse la produccin del compuesto, si est asociada al O2. Con la finalidad de probar esta hiptesis se ha determinado para una serie de lneas celulares el perfil de concentracin de O2 en funcin del dimetro del agregado, as como el dimetro crtico (dcrit; Tabla II). Este parmetro se define como el dimetro mximo para la respiracin ilimitada a travs del agregado y se calcula la ecuacin 1 (Hulst et al., 1989) como (1) donde dcrit : dimetro crtico, De : coeficiente de difusin efectiva de O2 (m2s-1), cs : concentracin de O2 en la superficie del agregado (molm-3), ceq : concentracin de O2 en el equilibrio (molm-3), y OUR: velocidad de consumo de O2 (molm-3). Hulst et al. (1989) establecieron lneas celulares de Tagetes patula con agregados de 1,0 a 12,8mm de dimetro y observaron que a partir de los 3,0mm, la produccin de tiofeno (metabolito con actividad insecticida) fue proporcional al aumento del dimetro del agregado. Incluso, la cantidad de tiofeno excretada al medio dependi del tamao del agregado. Los agregados de 1mm no excretaron los metabolitos, mientras que los de 1,4-5,4mm, lo hicieron en niveles

de 8-40molcm-3 de clulas, representando hasta el 90% del total producido. Este resultado lo atribuyeron a que en los agregados de ese tamao, las clulas del centro estaban limitadas en su disponibilidad de O2 y por lo tanto estresadas. Se determin que en un agregado de 1mm de dimetro, la concentracin de O2 en el centro es solo de 30% en comparacin a la superficial, y es cercana a cero en agregados de 3mm. Es decir, en los agregados ms productivos las clulas estn limitadas por O2. De manera contraria, en suspensiones de C. roseus cultivadas en un biorreactor tipo tanque agitado, la produccin de ajmalicina (alcaloide indlico) est inhibida en agregados con dimetro >250m (Keler et al., 1999). Previamente se demostr que existe una correlacin positiva entre la concentracin de O2 disuelto y la produccin del alcaloide (Schlatmann et al., 1995), por lo que se propuso que el comportamiento de los agregados grandes (1000m) podra explicarse en base a problemas de difusin de O2. Calcularon que un agregado de 250m est formado por ms de 1500 clulas y que el dcrit era de 3,8mm. Es decir, las clulas que conformaban esos agregados de 250m no deberan estar limitadas por O2. Entonces, la limitacin de este nutriente no explica la disminucin en la acumulacin de ajmalicina. Agregacin y Morfognesis Como se discuti en la seccin anterior, la limitacin de O2 no explica en todos los casos las diferencias observadas en el nivel de metabolitos secundarios en funcin del tamao del agregado, por lo que se ha intentado determinar si la agregacin celular de los cultivos in vitro implica un proceso de diferenciacin celular. Para ello se busca generar agregados compactos o compact callus aggreggates (CCA) y tratar de evidenciar la formacin de estructuras morfognicas que pudieran asociarse con la produccin de metabolitos secundarios. Los estudios histolgicos de los agregados de C. ledgeriana (Hoekstra, 1993), R. sachalinensis (Jianfeng et al., 1998a, b) y C. roseus (Zhao et al., 2001) permitieron conocer que no solo estaban formados por clulas meristemticas, como ocurre en las suspensiones finas (Figura 3). En particular, los agregados de R. sachalinesis presentaron en su centro tejido de parnquima y en las capas perifricas clulas meristemticas rodeadas por una capa epidrmica. Mientras los agregados de C. ledgeriana y C. roseus presentaron tejido vascular, los agregados compactos de S. medusa productores de jaceosidina mostraron potencial para regenerar plantas (Fu et al., 2005). En agregados compactos

Tabla II Dimetro crtico (mm) de algunos cultivos de clulas vegetales

Especie Catharanthus roseus Tagetes patula Vaccinium pahalae Metabolito Alcaloides indlicos Tiofeno Antocianinas Dimetro crtico 3,8 3,0 1,5 Referencia Keler et al. (1999) Hulst et al. (1989) Ppin et al. (1999)

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de Hypericum perforatum L. se observ la acumulacin de hipericinas, compuestos con actividad antidepresora, en las clulas de la superficie del agregado durante la etapa tarda de crecimiento (Song et al., 2007). Estos antecedentes muestran que el grado de agregacin y compactacin estn relacionados con la morfognesis. El desarrollo de lneas celulares con las caractersticas antes descritas ha sido resultado principalmente de la manipulacin de los componentes del medio de cultivo y el tipo de explante. Por ejemplo, 1) la sustitucin del cido 2,4-diclorofenoxiactico por una auxina ms dbil como el cido -naftalenactico o el cido 3-indol actico (Hulst et al., 1989; Hoekstra, 1993; Chang et al., 2006), 2) la sustitucin de la citocinina cinetina por 6-bencilaminopurina (Hoekstra, 1993; Zhao et al., 2001), 3) la modificacin en la relacin auxina/citocinina (Hoekstra, 1993), 4) el aumento en la concentracin de nitrato, y 5) la modificacin en la concentracin de otros componentes del medio de cultivo como vitaminas o sacarosa (Zhao et al., 2001). En lo que al explante se refiere, en la especie Calophyllum inophyllum Linn. el uso de nodos /internodos favoreci el desarrollo de agregados compactos en comparacin a hoja (Pawar et al., 2007), mientras que en R. sachalinensis, se formaron a partir de explantes de cotiledones y no de tallos u hojas (Wu et al., 2003). Recientemente Montiel et al. (2007) reportaron que la expresin del gen Agl12 de Arabidopsis thaliana en suspensiones celulares de C. roseus promueve el desarrollo de agregados globulares con clulas tipo parnquima. En estos agregados la produccin del alcaloide ajmalicina fue mayor que en las suspensiones no transformadas. El gen Agl12 acta al nivel de la expresin de genes que codifican para dos enzimas de la ruta de biosntesis de alcaloides, la geraniol-10-hidroxilasa (G10H) y la 1-deoxi-D-xilulosa 5-fosfato sintasa (DXS), las cuales estn involucradas en la biosntesis de la secologanina (precursor terpnico). Estos resultados muestran que los factores de transcripcin involucrados en la diferenciacin a tejidos u rganos pueden constituir una nueva herramienta de la ingeniera metablica para disear cultivos in vitro capaces de producir metabolitos secundarios. Combinacin de la Agregacin con otras Estrategias Los trabajos reseados mostraron que la agregacin promueve la produccin de metabolitos secundarios. Sin embargo, esto no ha sido suficiente para desarrollar bioprocesos econmicamente rentables. Por ello, se ha recurrido a combinar la agregacin con otras estrategias como la

seleccin de lneas celulares, la elicitacin o la adicin de precursores. O bien, a utilizar a los agregados como bio-transformadores. A continuacin se presentan algunos ejemplos. Rhodiola rosea L. es una especie vegetal de inters medicinal que acumula en su rizoma salidrsidos y los glicsidos de cinamil-alcohol, rosina, rosavina y rosarina. En cultivos de CCA de R. rosea se estimul la produccin de rosina y rosavina mediante la biotransformacin del cinamil-alcohol (Gyrgy et al., 2004). Por otro lado, se observ la formacin de nuevos compuestos qumicos con potencial biolgico. Al adicionar glucosa al medio de cultivo la capacidad de biotransformacin a rosina se duplic (Gyrgy et al., 2005, 2006). En otro caso, Qu et al. (2006) propusieron que la adicin de fenilalanina (30moll-1) y metil jasmonato (218moll-1) a agregados de 50m de V. vinifera estimulaba hasta en cinco veces la produccin de antocianinas. En CCA de R. sachalinensis se observ que una mayor relacin auxina:citocininas era benfica tanto para el desarrollo de los agregados como para la produccin de los salidrsidos (Xu et al., 1999). Se observ tambin que la adicin al medio de cultivo de sacarosa (100gl-1) tuvo un efecto positivo en la sntesis de los compuestos qumicos. Los resultados reseados muestran que la obtencin de agregados celulares es una estrategia que favorece la sntesis y acumulacin de metabolitos secundarios en los cultivos in vitro. Estos agregados podran asemejar hasta cierto punto la compartamentalizacin que se presenta en las plantas y que permite la biosntesis de compuestos qumicos. La combinacin de la agregacin con otras estrategias, tales como la seleccin de lneas celulares, la elicitacin y la adicin de precursores, constituye una alternativa para desarrollar bioprocesos in vitro para la produccin de compuestos qumicos de alto valor agregado.
AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por la Secretara de Investigacin y Posgrado del IPN (Proyecto SIP 20070118). Los autores son becarios COFAA y EDI.
REFERENCIAS Bolta Z, Baricevic D, Raspor P (2003) Biomass segregation in sage cell suspension cultures. Biotechnol. Lett. 25: 61-65. Chang SH, Tsay JY, Ho CK, Huang CY (2006) Callus culture and camptothecin production of Camptotheca acuminate. Taiwan J Sci. 21: 513521. Collu G, Garca AA, van der Heijden R, Verpoorte R (2002) Activity of the cytochrome P450 enzyme geraniol 10-hydroxylase and alkaloid production in plant cell cultures. Plant Sci. 162: 165-172.

De-Luca V, Cutler A (1987) Subcellular localization on enzyme involved in indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus. Plant Physiol. 85: 1099-1102. De-Luca V, St-Pierre B (2000) The cell and developmental biology of alkaloid biosynthesis. Trends Plant Sci. 5: 168-173. Edahiro JI, Seki M (2006) Phenylpropanoid metabolite supports cell aggregate formation in strawberry cell suspension culture. J. Biosci. Bioeng. 102: 8-13. Fu CX, Zhao DX, Huang Y, Ma FS (2005) Cellular aggregate size as a critical factor for flavonoid production by suspension cultures of Saussurea medusa. Biotechnol. Lett. 27: 91-95. Guillon S, Trmouillaux-Guiller J, Pati PK, Rideau M, Gantet P (2006) Hairy root research: recent scenario and exciting prospects. Curr. Opinion Plant Biol. 9: 341-346. Gyrgy Z, Tolonen A, Pakonen M, Neubauer P, Hohtola A (2004) Enhancing the production of cinnamyl glycosides in compact callus aggregate cultures of Rhodiola rosea by biotransformation of cinnamyl alcohol. Plant Sci. 166: 229-236. Gyrgy Z, Tolonen A, Neubauer P, Hohtola A (2005) Enhanced biotransformation capacity of Rhodiola rosea callus cultures for glycoside production. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 83: 129-135. Gyrgy Z, Neubauer P, Tolonen A, Hohtola A (2006) Enhancing the biotransformation of Rhodiola rosea callus cultures. Acta Hort. 725: 613-620. Hanagata N, Ito A, Uehara H, Asari F, Takeuchi T, Karube I (1993) Behavior of cell aggregate of Carthamus tinctorius L. cultured cells and correlation with red pigment formation. J. Biotechnol. 30: 259-269. Hoekstra S (1993) Accumulation of indole alkaloids in plant-organ culture. Tesis. Universidad de Leiden. Holanda. Hulst AC, Meyer MMT, Breteler H, Tramper J (1989) Effect of aggregate size in cell cultures of Tagetes patula on thiophene production and cell growth. Appl. Microbiol. Biotechnol. 30: 18-25. Jianfeng X, Jian X, Aiming H, Pusun F, Zhiguo S (1998a) Kinetic and technical studies on largescale culture of Rhodiola sachalinensis compact callus aggregates with airlift reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 72: 227-234. Jianfeng X, Zhiguo S, Pusun F (1998b) Suspension culture of compact callus aggregate of Rhodiola sachalinensis for improved salidroside production. Enzyme Microb. Technol. 23: 20-27. Karppinen K, Hohtola A, Gyorgy Z, Neubauer P, Tolonen A, Jalonen J (2006) Comparison of growth and secondary metabolite accumulation in cultures of compact callus aggregates and shoots of Hypericum perforatum L. in shake flasks and in a bubble column bioreactor. Acta Hort. 725: 605-612. Keler M, ten Hoopen G, Furusaki S (1999) The effect of the aggregate size on the production of ajmalicine and tryptamine in Catharanthus roseus suspension culture. Enzyme Microb. Technol. 24: 308-315. Kieran P, MacLoughlin P, Malone D (1997) Plant cell suspension cultures: some engineering considerations. J. Biotechnol. 59: 39-52. Kino-Oka M, Nagatone H, Taya M (2001) Characterization and application of plant hairy roots endowed with photosynthetic functions. En Scheper T (Ed.) Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. Vol. 72. Springer. Berln, Alemania. pp: 183-218.

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673

Madhusudhan R, Ravishankar GA (1996) Gradient of anthocyanin in cell aggregates of Daucus carota in suspension cultures. Biotechnol. Lett. 18: 1253-1256. Meyer JE, Ppin MF, Smith MAL (2002) Anthocyanin production from Vaccinium pahalae limitations of the physical microenvironment. J. Biotechnol. 93: 45-57. Montiel G, Breton C, Thiersault M, Burlat V, Jay-Allemand C, Gantet P (2007) Transcription factor Agamous-like 12 from Arabidopsis promotes tissue-like organization and alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus suspension cells. Metab. Eng. 9: 125-132. Pawar KD, Joshi SP, Bhide SR, Thengane SR (2007) Pattern of anti-HIV dipyranocoumarin expression in callus cultures of Calophyllum inophyllum Linn. J. Biotechnol. 130: 346353. Ppin MF, Smith MAL, Reid JF (1999) Application of imaging tools to plant cell culture: relationship between plant cell aggregation and flavonoid production. In vitro Cell Dev. Biol. Plant 35: 290-295. Qu JG, Zhang W, Jin MF, Yu XJ (2006) Effect of homogeneity on cell growth and anthocyanin biosynthesis in suspension cultures of Vitis vinifera. Chin. J. Biotechnol. 22: 805-810. Roberts MF, Strack D (1999) Biochemistry and physiology of alkaloids and betalains. En Wink M (Ed.) Biochemistry of plant secondary metabolism. Annu. Plant Rev. 2: 17-18. Samanani N, Facchini PJ (2006) Compartmentalization of plant secondary metabolism. En Romeo JT (Ed.) Recent advances in Phytochemistry. Elsevier. Oxford, RU. pp: 5383.

Schlatmann JE, Vinke JL, ten Hoopen HJG, Heijnen JJ (1995) Relation between dissolved oxygen concentration and ajmalicine production rate in high density cultures of Catharanthus roseus. Biotechnol. Bioeng. 45: 435-439. Sharp JM, Doran PM (2001) Strategies for en hancing monoclonal antibody accumulation in plant cell and organ cultures. Biotechnol. Progr. 17: 979-992. Song X, Zhu J, Lv HF (2007) The development of secondary cells in the callus of Hypericum perforatum L. and hypericins accumulation. Bull. Exp. Biol. 40: 49-61. Sottomayor M, Lopes Cardoso I, Pereira LG, Barcel A (2004) Peroxidase and the biosynthesis of terpenoid indole alkaloids in the medicinal plant Catharanthus roseus (L.) G. Don. Phytochem. Rev. 3: 159-171. St-Pierre B, Vzquez-Flota FA, De Luca V (1999) Multicellular compartmentation of Catharanthus roseus alkaloid biosynthesis predicts intracellular translocation of a pathway intermediate. Plant Cell. 11: 887-900. Taya M, Miya-Oka M, Toyo-Oka Y, Kino-Oka M, Tone S, Ono K (1995) Growth characteristics of liverwort cells, Marcanthia paleacea var. diptera, in a photoautotrophic suspension culture. J. Ferm. Bioeng. 80: 580-585. Trejo G, Cerda C, Ramos A, Rodrguez M (2005) Produccin de alcaloides oxindlicos en agregados celulares de Uncaria tomentosa. Mem. XI Cong. Nacional de Biotecnologa y Bioingeniera. Mrida, Mxico. p. CII-29. Verpoorte R (2000) Plant secondary metabolism. En Verpoorte R, Alfermann AW (Eds.) Metabolic

Engineering of Plants Secondary Metabolism. Kluwer. Dordrecht, Holanda. pp: 1-29. Verpoorte R, Contin A, Memelink J (2002) Biotechnology for the production of plant secondary metabolites. Phytochem. Rev. 1: 13-25. Wu S, Zu Y, Wu M (2003) High yield production of salidroside in the suspension culture of Rhodiola sachalinensis. J. Biotechnol. 106: 3343. Xu JF, Ying PQ, Han AM, Su ZG (1999) Enhanced salidroside production in liquid-cultivated compact callus aggregates of Rhodiola sachalinensis: manipulation of plant growth regulators and sucrose. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 55: 53-58. Yu F, Zhang D, Bai F, An L (2005) The accumulation of isocamptothecin A and B in suspension cell culture of Camptotheca acuminate. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 81: 159-163. Yuan X, Zhao B, Wang Y (2004) Cell culture of Saussurea medusa in a periodically submerged air-lift bioreactor. Biochem. Eng. J. 21: 235 239. Zhao J, Hu Q, Guo YQ, Zhu WH (2001) Effects of stress factors, bioregulators, and synthetic precursors on indole alkaloid production in compact callus clusters cultures of Catharanthus roseus. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55: 693-698. Zhao D, Huang Y, Jin Z, Qu W, Lu D (2003) Effect of aggregate size in cell cultures of Saussurea medusa on cell growth and jaceosidin production. Plant Cell Rep. 21: 1129-1133. Zhao J, Davis LC, Verpoorte R (2005) Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotechnol. Adv. 23: 283-333.

CELLULAR AGGREGATION IN SECONDARY METABOLITE PRODUCTION IN IN VITRO PLANT CELL CULTURES Gabriela Trejo-Tapia and Mario Rodrguez-Monroy SUMMARY Plant cell culture represents a biotechnological alternative to direct extraction of whole plant for production of secondary metabolites. However, the productivity of in vitro systems is lower than that obtained from plants. This review illustratates cell differentiation and compartmentalization as necessary events for the biosynthesis of chemical compounds. The induction of in vitro cell aggregation is discussed as one of the strategies to stimulate the accumulation of the compounds of interest. This positive effect might be explained as a consequence of the development of morphogenic structures and/or a stress condition induced by oxygen limitation in the interior of the aggregates. Finally, it is shown that the combination of aggregation with other strategies such as selection of cell lines, elicitation or precursor addition constitutes an alternative for the development of bioprocesses based on plant cell cultures for the production of high value chemical compounds.

A AGREGAO CELULAR NA PRODUO DE METABLITOS SECUNDRIOS NOS CULTIVOS VEGETAIS IN VITRO Gabriela Trejo-Tapia e Mario Rodrguez-Monroy RESUMO O cultivo de clulas vegetais uma alternativa biotecnolgica para a produo de metablitos secundrios. No entanto, a produtividade dos sistemas in vitro menor obtida de plantas. Nesta reviso se ilustra a diferenciao e compartimentalizao celular como eventos necessrios para a sntese de metablitos secundrios nas plantas. Discute-se a induo da agregao celular nos cultivos in vitro como uma das estratgias para favorecer a acumulao destes compostos qumicos. Este efeito positivo poderia ser explicado como conseqncia da formao de estruturas morfognicas e/ou por uma condio de estresse por limitaes de oxignio ao interior dos agregados. Finalmente, se mostra que a combinao da agregao com outras estratgias tais como a seleo de linhas celulares, a elicitao e a adio de precursores constituem uma alternativa para desenvolver bioprocessos a partir de clulas vegetais in vitro para a produo de compostos qumicos de alto valor agregado.

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