DIVULGAO MICROEXTRAO POR FASE SLIDA Antonio Luiz Pires Valente* e Fabio Augusto Instituto de Qumica - Universidade Estadual

de Campinas - CP 6154 - 13083-970 - Campinas - SP Recebido em 22/10/98; aceito em 8/10/99

SPME, SOLID PHASE MICRO-EXTRATION. Fundamental aspects of Solid Phase Micro-Extraction (SPME) are discussed in the present paper. The application of SPME as a microtechnique of sample preparation for gas chromatographic analysis is considered and related to existing theoretical models. Both research prototypes and commercial SPME devices are considered. Keywords: solid phase micro-extraction (SPME); sample preparation; solventless analyte extraction.

INTRODUO A qualidade de um mtodo analtico determinada, como representado na Figura 1, pela qualidade de suas etapas, com seus erros experimentais. Por um lado, esta qualidade depende da tcnica de amostragem, com a qual seleciona-se uma frao presumivelmente representativa da amostra primria. Nesta frao devem-se identificar e quantificar analitos, que so os componentes qumicos que, tambm presumivelmente, a definem. comum no se analisar quimicamente matrizes na forma bruta, pois elas costumam ter e gerar interferncias e incompatibilidades com equipamentos analticos. Para contornar tais problemas so empregados procedimentos de preparo da amostra, com os quais procura-se isolar e concentrar os analitos a nveis adequados e obter um nvel de limpeza da amostra que no comprometa a sua anlise qumica. Portanto, o preparo da amostra tambm inclui a sua compatibilizao com a tcnica que fornecer os dados qumicos. A SPME uma opo relativamente recente1, que tem sido empregada para essas operaes que criam o elo entre a matriz qumica e o instrumental analtico, sendo particularmente interessante para Cromatografia Gasosa.

da amostra. Um destes mtodos a SPME, porque no utiliza solvente, tem alto poder de concentrao (adequando-se com as sensibilidades dos detectores de CG), aplicvel a muitos tipos de analitos e facilita o transporte do material extrado para o cromatgrafo3,4 O QUE SPME? SPME uma microtcnica, em que os processos de extrao e pr-concentrao de analitos ocorrem numa escala dimensional que no das mais usuais. O dispositivo bsico de SPME consiste de um basto de fibra tica, de slica fundida (FS) de 100 mm de dimetro, com 10 mm de uma extremidade recoberto com um filme fino de um polmero (e.g., polidimetilsiloxano = PDMS, poliacrilato = PA ou Carbowax = Cwx) ou de um slido adsorvente (e.g., carvo ativo microparticulado = Carboxen)5. O detalhe da Figura 2B representa uma fibra comercial em que o recobrimento, ou filme extrator, tem espessura de 100 m. A
mola

B
tubo de fixao da fibra (interno ao hipodrmico

tubo hipodrmico (agulha) d.e. ~ ~ 0,56 mm

Figura 1. Etapas num processo analtico visando a anlise qumica por CG.

fibra retrada

fibra exposta 300 m

10 mm

O intensivo uso da Cromatografia Gasosa (CG) e os consequentes desenvolvimentos tecnolgicos resultaram numa poderosa tcnica de separao que possibilita a deteco de analitos virtualmente puros2. Em outros termos, a CG prepara de forma admirvel os analitos para identificao e quantificao. Como tcnica analtica ela depende da qualidade da etapa de preparo da amostra, pois quase nenhuma matriz pode ser diretamente injetada num cromatgrafo gasoso. Este o caso tpico de anlise de matrizes de origem ambiental, que via de regra contm alm de particulados no volteis, termodegradveis, etc, gua em quantidades incompatveis com as colunas cromatogrficas e detectores de CG. Portanto, a viabilizao da anlise por CG depende de um mtodo adequado de preparo

Figura 2. Dispositivo da fibra de SPME: (A) Posio com a fibra retrada na agulha (tubo hipodrmico de dimetro externo 0,56 mm), (B) posio com a fibra exposta. No detalhe so mostradas as dimenses tpicas da seo com recobrimento de 100 m de espessura.

As espessuras dos recobrimentos, Lf, de fibras comerciais variam de 7 m a 100 m e seus volumes de 0,03 L a 0,7 L4,6. A extrao ocorre mergulhando-se a seo recoberta na amostra, ou no seu headspace. As seguintes consideraes ilustram as vantagens da microescala de extrao. Imagine-se uma gotcula, de 1 L, de solvente orgnico, colocada em 10 ml

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(10.000 L) de uma matriz aquosa com analitos orgnicos. Esta gotcula de solvente representaria um dcimo milsimo do volume da matriz. Por afinidade, analitos orgnicos migrariam da matriz para a gotcula de solvente onde seriam concentrados de acordo com seus coeficientes de partio entre o solvente orgnico e a matriz aquosa. Para fins quantitativos, depois de saturada com os analitos, a gotcula de 1L teria de ser retirada intacta do seio da matriz onde ela deveria ser imiscvel, mesmo sob agitao - e injetada para Cromatografia Gasosa. O volume da gota e o nvel de concentrao dos analitos resultariam num cromatograma em que a superposio dos analitos cauda do pico do solvente no comprometeria a anlise quantitativa. A microescala apresentaria mais uma vantagem: como, comparativamente matriz, em cada gota haveria pouco analito, as pequenas quantidades extradas no descacterizariam as correspondentes concentraes na matriz. Desta forma, outras extraes poderiam ser realizadas na mesma matriz, para dispor de replicatas estatisticamente confiveis. Entretanto, na forma descrita acima, este procedimento seria invivel pelas dificuldades experimentais inerentes, por exemplo, manipulao de volumes to pequenos de solvente. Na SPME o recobrimento da fibra age de modo similar gotcula do exemplo acima; entretanto, por estar imobilizado no suporte de FS, a sua introduo e remoo quantitativa da matriz facilitada, contornando grande parte dos problemas prticos associados ao exemplo discutido. Porm, sob os demais aspectos a SPME mantm todas as demais complexidades inerentes aos mtodos de extrao convencionais. Realizada a extrao, a fibra retirada da amostra e inserida no injetor do cromatgrafo gasoso, onde os analitos so termicamente dessorvidos sob fluxo do gs de arraste e carregados para a coluna cromatogrfica. Com as dimenses antes mencionadas as fibras extraem pequenas quantidades de analito, o que facilita sua dessoro e subsequente separao cromatogrfica. As fibras so frgeis, razo pela qual o dispositivo mostrado na Figura 2 foi projetado para que ela possa ser retrada para dentro do tubo hipodrmico durante operaes que possam danific-las (Figura 2A), tais como a de transporte e as de perfurar o septo do frasco de amostra e o do injetor do cromatgrafo. A operao completa para extrao e dessoro para anlise cromatogrfica descrita a seguir. DESCRIO E USO DO SISTEMA DE SPME COMERCIAL Com o dispositivo da fibra (Figura 2) e o amostrador (uma espcie de seringa, Figura 3) o manuseio das fibras para extrao bastante facilitado. O dispositivo da fibra, que no pode ser manipulado diretamente, usado com o amostrador onde, como mostrado na Figura 3, a fibra presa a um mbolo. Na extremidade oposta ao mbolo, o tubo hipodrmico fica exposto, pois alm de proteger a fibra ele a agulha com que so perfurados septos. Na Figura 3B mostrado que no corpo do amostrador existe uma fenda em forma de Z, na qual corre um pino que, preso ao mbolo, guia o seu deslocamento. No movimento de exposio da fibra, quando o pino atinge o corte transversal da fenda (Figura 3B), um pequeno giro do mbolo trava a fibra na posio exposta.
A B
Figura 3. (A) Vista interna do amostrador de SPME com a fibra exposta; (B) vista com a fibra exposta e o mbolo travado pelo pino no centro da fenda em Z.

perfurar septo extrair

retirar

para o cromatgrafo dessoro

retirar

injetor do cromatgrafo

EXTRAO

ANLISE CROMATOGRFICA

Figura 4. Uso do amostrador de SPME para o processo de extrao e o de dessoro do material extrado para anlise por CG.

Com a fibra retrada na agulha, o septo do frasco de amostra perfurado e a fibra exposta amostra. Terminado o tempo de extrao a fibra novamente retrada, a agulha retirada do septo e levada para insero no CG. Com a fibra retrada o septo do injetor perfurado, a fibra exposta para dessoro trmica e, terminada a dessoro, retrada e a agulha retirada. Aps o procedimento altamente recomendvel vedar a agulha com um pedao de septo, para evitar contaminaes da fibra, o que tambm auxilia amostrar em locais distantes e transportar o conjunto para o laboratrio 4. As fibras disponveis comercialmente para CG esto relacionadas na Tabela 1. As sugestes de aplicaes desta tabela so necessariamente genricas, pois as fibras relacionadas foram desenvolvidas para uso geral. Fibras para problemas especficos ainda no so comercializadas7. FUNDAMENTOS DA TEORIA DA SPME Numa extrao por SPME as molculas do analito tem de se deslocar da matriz e penetrar no recobrimento e, para isto, resistncias a transferncias de massa devem ser vencidas, at que se estabelea um equilbrio de partio (ou de adsoro, para o caso de recobrimentos slidos) do analito, entre a fibra e o meio que a envolve. Portanto, a teoria de SPME baseia-se na cintica de transferncia de massa entre fases e na termodinmica que descreve o equilbrio de partio do analito entre elas. A discusso terica, apresentada sequenciadamente em vrios artigos extensa, de tal forma que agrupada em livro sobre a tcnica3, cobre 72 pginas. Aqui esta discusso foi substancialmente abreviada. O EQUILBRIO DE PARTIO EM SPME A SPME um processo baseado em equilbrios simultneos em sistemas multifsicos. Um sistema trifsico ideal simples o de uma fibra mergulhada numa matriz aquosa com um headspace; sistemas reais so mais complexos pois, nem o headspace nem a matriz so solues ideais, os analitos podem interagir entre si, com as paredes do frasco e eventualmente com o basto de slica fundida da fibra. Os fundamentos da distribuio de massas na extrao podem ser descritos a partir do que ocorreria num sistema ideal trifsico: antes da extrao, n 0 moles do analito estariam presentes, com uma concentrao C0, em um volume Vm da matriz8; quando completada a extrao, os n0 moles se distribuiriam entre as fases, isto , nem na

A sequncia de procedimentos para realizar a extrao e a dessoro no injetor do cromatgrafo mostrada na Figura 4

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Tabela 1. Fibras de SPME disponveis comercialmente4,5. Tipoa No-polares Composio Qumica Polidimetilasiloxano (PDMS) Lf / m 100; 30; 7 85 65 65 75 T oC
b o

Aplicao sugerida Basicamente para compostos apolares. possvel usar com polares. Medianamente a altamente polares, como fenis, pesticidas orgafosforados. Cetonas, lcoois. Volteis de mdia a alta polaridade. Volteis e no volteis de baixa a alta polaridade. Volteis.

200-270 C 220-320oC 220-310oC 200-260oC 200-270oC -

Polares

Poliacrilato (PA) Carbowax/divinilbenzeno (CW-DVB)

Bi-polares

PDMS-DVB Carboxen-PDMS

a. No esto relacionadas fibras para Cromatografia Lquida. b. ToC = faixa de temperatura indicada dessoro. matriz aquosa (e equilbrio), neh no headspace e nef na fibra. A conservao de massa no processo expressada como:
e e n0 = nm + nh + ne f

(1)

Abaixo, a Equao 2 correlaciona as constantes de distribuio fibra-matriz, Kfm = Cef/Cem, fibra-headspace, Kfh = Cef/ Ceh e headspace-matriz, Khm = Ceh/Cem ; esta equao obtida da Equao 1 com as substituies dos volumes e concentraes das fases em equilbrio, respectivamente, para a matriz, o headspace e a fibra, Vem e C em, Veh e C eh, Vef e Cef 9:
K fm = K fh Khm

(PDMS, Lf = 100 m) e um analito como benzeno, de Df = 2,8 x 10-6 cm.s-1, previsto que t95 seria cerca de 20 segundos11. Na prtica este valor s aproximado quando a extrao do benzeno feita de uma matriz gasosa12. Em extraes de matrizes aquosas, o tempo necessrio ao trnsito do analito pela matriz at atingir a superfcie da fibra teria de ser considerado; neste caso o te de 200 s ou mais11 (Figura 5).

(2)

Aps substituio das constantes de distribuio e da Equao 2 na Equao 1 e rearranjos algbricos, obtm-se a Equao 39, que fornece a quantidade de analito extrado no sistema em equilbrio.

ne f =

K fmVf C0Vm K fmVf + KhmVh + Vm

(3)

Assim, a Equao 3 correlaciona a quantidade extrada do analito com os parmetros fundamentais dos equilbrios simultneos e descreve o aspecto termodinmico da SPME. Contudo, a Equao 3 no se relaciona com o intervalo de tempo necessrio para atingir o equilbrio. Este intervalo de tempo, que fundamental do ponto de vista experimental, depende das dificuldades de transferncia de massa no sistema. CONSIDERAES CINTICAS EM SPME A Equao 4, cujo desenvolvimento detalhado em10, expressa o tempo para atingir o equilbrio, te, em funo da espessura do recobrimento (Lf) e do coeficiente de difuso do soluto nessa camada (Df).
t e t 95 = L2 f 2Df

Figura 5. Perfis de extrao para 1 ppm de benzeno em gua, (A) segundo o modelamento pela Equao 4 (usando-se Kfm = 125, Df = 2,8 x 10-6 cm.s-1 e Dm = 1,08 x 10-5cm.s-1), sob trs condies de agitao: (B) agitao magntica a 2500 rpm, (C) 1800 rpm, (D) 400 rpm e (E) sem agitao. Agitador magntico de 7 mm de comprimento, frasco de 7,4 ml, fibra de Lf = 0,56 mm posicionada no centro do frasco.

(4)

Segundo esta equao, o tempo necessrio para atingir o equilbrio seria infinito mas, devido s incertezas experimentais inerentes s extraes por SPME, considera-se, como mostrado na Equao 4, um tempo de equilbrio prtico, t95, que correspondente extrao de 95% da massa que seria extrada aps um tempo infinito de extrao. A correlao do modelamento pela Equao 4 com a situao experimental precisa ser avaliada com cautela. Por exemplo, quando nela so substitudos os parmetros para a fibra com o recobrimento mais espesso comercialmente disponvel

Na Figura 5 so mostradas cinco perfis de extrao (curvas correlacionando frao extrada com tempo de extrao), do benzeno com fibra PDMS. A curva A terica e representa o comportamento segundo a Equao 4; as demais curvas so experimentais, com vrios nveis de agitao da matriz aquosa (curvas B, C, D) e sem agitao (curva E). Comparando-se as curvas experimentais nota-se que o te diminui com o aumento da agitao da matriz, porque este procedimento facilita o contacto do analito com a fibra. No entanto, mesmo sob agitao o te substancialmente menor do que o previsto pela Equao 4. Isto ocorre porque apesar da agitao, a superfcie da fibra fica em contacto com uma camada esttica da matriz, de espessura , onde no existe agitao (Figura 6). Ao contrrio do que ocorre na regio agitada, na camada esttica a transferncia de massa ocorre exclusivamente por difuso e, portanto, mais lenta. Na Equao 5 o produto KfmLf relaciona os fatores responsveis pelo retardamento de te, pois o tempo para equilbrio incrementado com o aumento da camada esttica, da espessura do recobrimento da fibra e de Kfm, que dimensiona a quantidade de analito necessria para ser atingida

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equilbrio

Frao Extrada

Extrao / min

Figura 6. Extrao SPME direta com agitao prtica. d = espessura da camada esttica (no agitada).

a concentrao de equilbrio na fibra13. A Equao 5 aplicada extrao do benzeno de gua resulta numa previso de te = 190 s14, prxima dos resultados mostrados na Figura 5. t e t 95 = 3 K fm L f Dm (5)

Frao Extrada

Extrao / min

o equilbrio facilitado quando a frao extrada pequena em relao quantidade de analito disponvel

Figura 7. Correlaes entre os Khm e Kfh e os perfis de extrao para analitos extrados num sistema hipottico (adaptada de 15; detalhes no texto).

Lh Lm te t95 = 1,8 + K fm L f Khm Dh 1,6Dm

(6)

Massa extrada / ng

A Equao 5 tem implicaes experimentais importantes na extrao direta com agitao. Uma delas a de que o tempo para atingir o equilbrio mais dependente da difuso do soluto na camada aquosa estacionria (Dm) do que na fibra. Alm disto, fibras com recobrimentos menos espessos so convenientes para extraes mais rpidas (deve-se, porm considerar que com recobrimentos finos a quantidade de material extrado menor, o que pode limitar a sensibilidade analtica). As discusses anteriores enfocaram os fundamentos da SPME direta em matrizes aquosas e gasosas. A SPME tambm pode ser usada para extraes do headspace, como discutido a seguir. Nestas extraes, a transferncia de massa num sistema trifsico fibra-headspace-matriz depende dos equilbrios de partio entre as trs fases, das dimenses das fases e dos coeficientes de difuso do soluto nelas. A correlao entre estes fatores e o tempo de equilbrio, vlida para extraes sem agitao descrita pela Equao 6:

conforme o destaque na Figura 7B, conclui-se que a extrao favorecida para analitos que tenham, simultaneamente, Khm elevado e baixo Kfh, porque a concentrao de analito na fibra pequena em relao sua concentrao na amostra16 - o que ocorre na prtica, pois os volumes dos recobrimentos das fibras so muito menores que os da amostra e do headspace. Um exemplo interessante do efeito do valor de Kfh representado na Figura 8, em que so mostrados perfis de extrao do headspace para benzeno e o-xileno.

o - xileno, Kfh = 2900

De acordo com esta equao, conveniente minimizar as espessuras da matriz (Lm), do headspace (Lh) e da fibra (Lf). As limitaes para diminuio de Lf foram comentadas anteriormente; uma excessiva diminuio de Lm tambm pode comprometer a sensibilidade do mtodo e as diminuies de Lm e Lh podem afetar negativamente a termodinmica de extrao, caso as concentraes do analito variem excessivamente no headspace e na matriz. Outros aspectos prticos prendem-se aos coeficientes de difuso e s constantes de equilbrio de partio. Problemas com coeficientes de difuso desfavorveis podem ser contornados com agitao e/ou aquecimento do sistema. Quanto s constantes de distribuio, o compromisso entre elas pode ser explorado com base na Figura 7. Na Figura 7A esto representados, para analitos com Kfh 10.000, os perfis de extrao para Khm = 0,2, Khm = 0,02 e Khm = 0,00215. Nota-se que o equilbrio atingido muito mais rapidamente para o maior valor de Khm. Por outro lado, na Figura 7B, em que esto representados perfis de extrao para Khm = 0,2 e Kfh = 100, 1.000 e 10.000, evidenciado que o equilbrio atingido mais rapidamente para o menor valor de Kfh. Portanto,

benzeno, Kfh = 301

Tempo de extrao / min

Figura 8. Perfiz de extrao obtidos para SPME de headspace sob agitao, de soluo aquosa com 1 ppm de benzeno e o-xileno (adaptada de 9).

Na Figura 8, o tempo de extrao do benzeno de cerca de 20 s e o do o-xileno aproximadamente 100 s. Eles tm, respectivamente, pontos de ebulio iguais a 80oC e 144oC. A maior volatilidade do benzeno torna mais fcil a sua passagem para o headspace. Ao mesmo tempo, menor a quantidade de benzeno extrada no equilbrio (K fh = 301 (benzeno) e 2900 (o-xileno)17). As discusses anteriores indicam que no trabalho experimental os perfis de extrao devem ser estabelecidos, para serem obtm o tempo e as condies adequadas para o equilbrio de extrao. Definir estas condies constitui-se no desenvolvimento de um mtodo SPME, discutido a seguir.

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DESENVOLVIMENTO DE UM MTODO DE SPME A discusso que segue aplica-se ao desenvolvimento de um mtodo de SPME em condies de equilbrio (dispositivos para extrao exaustiva s existem a nvel de pesquisa7) e anlise por CG, para a qual a SPME foi primordialmente desenvolvida. Este desenvolvimento pode ser considerado como constitudo das etapas de extrao e de transferncia do material da fibra para anlise cromatogrfica. Na primeira etapa essencial estabelecer os perfis de extrao dos analitos; na segunda etapa deve-se otimizar a transferncia do material extrado para a coluna cromatogrfica e a resoluo cromatogrfica. A metodologia deste procedimento envolve a seguinte estratgia analtica. O conhecimento do problema analtico. Estabelecer quais os analitos de interesse e preparar uma amostra sinttica a partir de seus padres ou de compostos similares. Com esta amostra executa-se o primeiro passo da etapa de extrao: avaliar o te de cada analito, via de regra com mais do que um tipo de fibra (Tabela 1) e analisar os extratos por CG. Sero coletadas informaes sobre: as condies cromatogrficas (coluna, detector, etc) apropriadas para os analitos; qual recobrimento mais adequado para os analitos; quais condies de extrao (agitao, temperatura, extrao direta ou de headspace, volumes do frasco de amostragem, da amostra e do headspace) so as mais convenientes; quais as condies para dessoro no injetor do cromatgrafo (que podem redefinir as condies cromatogrficas); o procedimento experimental para obter os perfis de extrao destes analitos padro. Primeira aproximao do problema representado pela matriz: Trabalhar, como anteriormente, com amostras sintticas dos analitos, ou os compostos que os representem, em concentraes similares s esperadas na matriz. Assim ser possvel avaliar: se possvel optar por fibra com recobrimento de menor espessura; se possvel extrair os analitos do headspace; se as condies de extrao e de cromatografia tem de ser redimensionadas; se os perfis de extrao aplicam-se concentraes prximas das reais. Segunda aproximao do problema representado pela matriz: Simular a matriz, adicionando s amostras sintticas componentes extra-analitos representativos daqueles que possivelmente existam na matriz real. Isto poder revelar: se possvel operar com a SPME direta, pois componentes da matriz podem contaminar/deteriorar a fibra e/ou impedir a subsequente anlise por CG; se as condies de extrao anteriormente avaliadas tem de ser readaptadas; se vivel analisar simultaneamente todos os analitos, pois alguns podem demandar a extrao do headspace e outros a extrao direta (neste caso o mtodo passa a ser substancialmente complexo). Trabalhar com a sua matriz real: todas as preocupaes experimentais anteriores so passveis de reavaliaes e eventuais modificaes. Validar o mtodo. Discutido em Validao do Mtodo. A estratgia acima aplica-se desde o preparo da amostra at a sua anlise; no caso de SPME ela envolve tanto procedimentos bsicos, aplicveis a qualquer mtodo analtico, quanto procedimentos prprios da SPME. SELEO DO MODO DE EXTRAO As opes so a SPME direta e de headspace. O fato da SPME direta no ser aplicvel a matrizes aquosas contendo particulados e a matrizes slidas evita trabalhos infrutferos.

Por exemplo, na extrao de humuleno e cariofileno de lpulo18 a opo natural foi a extrao do headspace, por tratar-se de matriz slida. Para matrizes aquosas limpas ambas alternativas mencionadas devem ser verificadas. Um critrio geral o de que a SPME de headspace indicada para analitos de mdia e alta volatilidade12. No entanto, numa anlise de COVs (compostos orgnicos volteis) em gua a SPME direta foi a melhor opo pois, com fibra PDMS 100 m as relaes entre as quantidades recuperadas por extrao direta e de headspace foram de 30:1 para cloreto de vinila, 13:1 para clorofrmio, 10:1 para benzeno e 6:1 para tolueno4. Portanto, eventualmente a SPME direta pode ser aplicada para compostos volteis9,11. SELEO DO TIPO DE FIBRA As sugestes gerais de uso para as fibras comercialmente disponveis relacionadas na Tabela 1 so teis como ponto de partida, mas devem ser conferidas experimentalmente. Por exemplo, na Figura 9 mostra-se que a umidade, um fator relacionado com a caracterstica da amostra, afeta a extrao de acetona, etanol e isopreno de hlito humano19.
Contagens (unidades arbitrrias) Contagens (unidades arbitrrias)

20 x 104 15 x 10
4

PDMS 100 m

1000 x 10 4 PDMS/DVB 75 x 104 50 x 10 4 25 x 10 4

10 x 104 5 x 10
4

Etanol

Acetona

Isopreno

Etanol

Acetona

Isopreno

Umidade relativa

Figura 9. Efeito do tipo de recobrimento e umidade relativa sobre a quantidade de compostos extrados de amostra gasosa (hlito humano).

Das fibras estudadas acima, a PDMS foi selecionada por ser menos afetada pela umidade, embora a PDMS / DVB extrasse maiores quantidades dos analitos. A literatura reporta usos e caractersticas de fibras (ver Apndice B, p. 229-241 em2); estas informaes tambm podem ser localizadas em notas tcnicas dos fabricantes20. ESTUDO DOS PERFIS DE EXTRAO Estabelecer os perfis de extrao uma forma segura de avaliar a eventual necessidade de reciclagem de procedimentos que otimizem o tempo de extrao. Entre os fatores passveis de alterao esto a espessura da fibra e sua afinidade com os analitos, a agitao do sistema (Figura 5), a sua temperatura e o tipo de frasco utilizado (volume, formato e material de construo). Comparar os perfis de extrao de analitos diferentes mostra qual o tempo mnimo para as extraes simultneas numa amostra e quais as sensibilidades relativas entre os correspondentes analitos (Figura 8). Um exemplo de explorao das informaes obtidas dos perfis de equilbrio encontra-se na anteriormente citada extrao de humuleno e cariofileno de lpulo18, onde o interesse era obter as razes entre as quantidades de humuleno e cariofileno (H/C). Dois procedimentos de SPME de headspace foram testados: (a) extrair depois de aquecer a amostra a 50oC por 12 h e (b) extrair quando a amostra atingisse a temperatura de 50oC. Na Figura 10 os valores obtidos de H/C so comparados ao obtido por extrao com vapor dgua, que o mtodo convencional para estas anlises18. No exemplo da figura 10 determinou-se que o tempo de extrao adequado para humuleno e cariofileno era de 4 h, com ou sem o pr-aquecimento da amostra, e que sem o pr-aquecimento a razo H/C obtida (2,75) prxima ao valor medido com o mtodo de extrao por arraste com vapor dgua. Alm disso, como com pr-aquecimento por 12 h a razo H/C aumentava para cerca de 3, sups-se que

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Figura 10. Razes humuleno / cariofileno para extraes SPME de uma amostra de lpulo aquecida a 500C sem e com um perodo de 12 h de pr-aquecimento 18. Tambm mostrada a razo H/C obtida pela extrao com arraste por vapor dgua.

Figura 11. Efeito do volume do headspace sobre a quantidade de analito extrada. Frasco de 40 ml, fibra PDMS 100 m. (A) clorofrmio, Kfm = 400, Khm = 0,15, (B) 1,1,1-tricloretano, Kfm = 2500, Khm = 0,7 e (C) tetracloreto de carbono, Kfm = 1000, Khm = 1,24 (adaptada de 32).

este procedimento alteraria a amostra (o que foi confirmado e atribudo a oxidao do cariofileno). Informaes especficas como as acima e as referentes s Figuras 5 e 8 podem ser obtidas da literatura 22,23 . SELEO DA TCNICA DE AGITAO Como mostrado na Figura 5, a otimizao da agitao fundamental para abreviar o tempo de extrao. A agitao magntica, por sua simplicidade, a mais comumente utilizada. Outras tcnicas demandam dispositivos mais complexos: vibrao da fibra, usada em injetor automtico desenvolvido pela Varian; movimentao circular do frasco24; e sonicao, que diminui o tempo de equilbrio mas pode adulterar a amostra24-26. Em anlises de gases os efeitos de agitao podem ser conseguidos utilizando-se a tcnica de extrao sob fluxo da amostra12,19 . OTIMIZAO DA DESSORO A dessoro otimizada: (a) Com a fibra colocada no centro da zona aquecida do injetor27. (b) Com arraste rpido dos compostos dessorvidos da fibra, o que conseguido usando-se no injetor um liner de pequeno dimetro interno (geralmente di = 0,8 mm nos liners comerciais). Com a fibra inserida no liner criada uma regio de restrio, onde a velocidade do gs de arraste aumentada sem necessidade de alterar a sua presso, que depende das condies cromatogrficas. (c) Com o injetor em temperatura que seja um compromisso entre a permitida pela fibra e a volatilidade dos analitos. Fundamentos da otimizao da dessoro encontram-se na literatura28. OTIMIZAO DOS VOLUMES ENVOLVIDOS NA EXTRAO A otimizao dos volumes envolvidos em SPME continua sendo objeto de estudos29,30 , por depender de fatres e parmetros no contemplados nas equaes 5 e 6, como a agitao e o prprio volume do frasco de amostra (habitualmente, de 2 a 40 ml 31 ). O uso de frascos pequenos torna a otimizao um processo bastante delicado29 . Para simplificar esta discusso optou-se por um exemplo de avaliao de resultados, resultante de extrao de headspace de clorofrmio, 1,1,1-tricloroetano e tetracloreto de carbono usando frascos de 4, 15 e 40 ml e fibra PDMS 100 m 32 . Conforme mostrado na Figura 11, para Vm = 40 ml, para os trs compostos a frao extrada (n/n 0) tende aumentar conforme a razo V h / V m diminui; a mesma tendncia foi observada para V m = 4 e 15 ml.

Na Figura 11 o uso da razo Vh/Vm muito conveniente, porque como o volume do frasco fixo, essa razo pode ser otimizada variando-se a quantidade de amostra. O uso da frao n/n0 analiticamente relevante, porque expressa a sensibilidade do mtodo e fornece a sua recuperao. Na figura notam-se comportamentos diversos entre os analitos considerados, o que atribuido s diferenas entre os valores de Kfm e Khm dos compostos, como discutido no tem 5.2 (Figura 7). VALIDAO DO MTODO As estrategias gerais para validao de um mtodo dependem, entre outros fatores, das amostras, dos propsitos analticos e da instrumentao disponvel33. Ela pode envolver: estabelecimento de linearidade, recuperao (frao extrada dos analitos) e repetibilidade; comparao com mtodos convencionais; avaliaes com amostras-padro e comparaes interlaboratoriais e com resultados de anlises por instituies independentes. Um procedimento importante da convalidao de um mtodo SPME aplic-lo, assim como o(s) mtodo(s) convencional a amostras reais, comparando-se os resultados como exemplo, veja-se na Figura 10 que para um dos modos de extrao SPME a razo H/C coincide com o valor obtido aps extrao por arraste com vapor; outros exemplos deste procedimento so descritos na literatura34-44. As comparaes interlaboratoriais e confrontao com anlises independentes so menos comuns; exemplos delas so encontradas nas refs.4,45,46. BREVE RESUMO BIBLIOGRFICO SOBRE SPME A SPME tem aplicaes em reas como anlise ambiental e de solos, gua, alimentos, produtos naturais e farmaceuticos, anlise clnica e forense1. Sendo um tcnica relativamente nova (da dcada de 901) continua em consolidao22, tanto sob o aspecto de fundamentao terica, quanto sob os de aplicaes. Na primeira descrio de extrao por SPME os dispositivos de extrao consistiam de microseringas de CG, adaptadas para conter pedaos de fibra tica que podiam ser expostas e retradas na agulha da seringa. O filme de PDMS, que recobria as fibras para resistncia mecnica, foi testado como meio extrator demonstrando a potencialidade dessa microtcnica, com extraes diretas de solues aquosas de hidrocarbonetos aromticos, que foram quantificados por GC com limites de deteco de at 1 g.L-1 e desvios-padro relativos de at 6% entre replicatas47. Comprovada a potencialidade da SPME, iniciaram-se os estudos dos seus parmetros operacionais bsicos31,48. No primeiro ensaio de extrao seletiva com fibra diferente da PDMS49 foram quantificados e identificados fenis em soluo aquosa por extrao com fibras de 95 m de poliacrilato e anlise por CG-EM (Cromatografia Gasosa com Deteco por Espectrometria de Massas). Ainda hoje, ampliar a diversidade dos tipos de fibras uma necessidade; como

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exemplo, o desenvolvimento da fibra Carboxen/PDMS facilitou a extrao compostos volteis, como os de aromas50 e gases sulfurosos4. Recentemente foi proposto um modelo matemtico que permite estimar a concentrao desse analito, a partir do seu fator de resposta para o detector por ionizao em chama e a rea do seu pico cromatogrfico, obtido aps uma extrao por SPME de headspace51. Este estudo, baseado em experimentos com 71 compostos funcionalmente diversos, evidencia as vantagens de aplicar SPME na anlise de volteis biolgicos. O modelamento matemtico da dinmica do processo de adsoro em SPME, em condies de agitao experimental demonstra que anlises quantitativas podem ser efetuadas antes de ser atingido o equilbrio de extrao32. So relatados tempos para equilbrio de at 1 h (SPME direta) e at 40 min (SPME headspace); os quais, pela modelagem estudada, podem ser substancialmente abreviados. Num estudo usando fibras PDMS, para quantificar no headspace hidrocarbonetos de petrleo presentes em gua, demonstrada a possibilidade do clculo das Kfm desses analitos a partir de sua reteno cromatogrfica22. Num trabalho similar com seis tipos de fibras sugerido que a quantificao a partir do headspace pode ser dfcil pela variabilidade da Kfh dos analitos23. Foram propostos os modelamentos do equilbrio de soro e da cintica de extrao utilizando como analitos 11 compostos orgnicos volteis, considerando-se os efeitos salino (em gua do mar) e efeitos de matriz devido presena de cidos hmicos52. Num estudo envolvendo extrao de headspace em condies de fluxo, foi demonstrado que os tempos de equilbrio so menores do os obtidos com extraes de headspace esttico convencional, por minimizao da dependncia com a difuso do analito no ar12. Os fundamentos da amostragem dinmica de ar tambm foram avaliados, concluindo-se que este tipo de amostragem pode ser realizada sem agitao12,19. A extrao de aldedos, pirazinas, piridinas e tiazis (produtos da reao de Maillard) por PDMS 100 m e CBW/DVB 65 m, incluindo avaliao do efeito salino, foi objeto de avaliao sistemtica, em que se discutem vrios fatores experimentais que afetam as extraes tanto para fins quantitativos quanto para qualitativos23. Num estudo sobre extrao de pirazinas de cacau torrado foi evidenciado que o rendimento de extrao maior quando feita no headspace do slido ao invs de no headspace de sua suspenso aquosa53. As condies de injeo splitless no CG foram exploradas, demonstrando-se, p.ex, que o tempo de dessoro no CG importante na recuperao de analitos de diferentes volatilidades54,55. Em aromas de mas, 29 componentes foram extrados e quantificados por PDMS 100 m / CG-EM37; menciona-se um efeito de matriz devido competio dos analitos pela fibra, que pode afetar a condio de saturao da fibra. Na determinao de nitrocompostos utilizados como almscares artificiais em vrios tipos de cosmticos so discutidos efeitos de matriz para diversos tipos de cosmticos56. Para a otimizao de um mtodo para quantificao de 31 aromatizantes tpicos de tabaco foram testadas as fibras PDMS 100 m, PA 65 m, PDMS/DVB 65 m, CBX/DVB 65 m57; observou-se pronunciado efeito de matriz e que fibras polares se mostraram as mais adequadas nas extraes. No mesmo trabalho, determinou-se que o efeito salino afeta de modo diferente a extrao dos diversos analitos testados. A SPME de headspace foi aplicada, com resultados melhores do que a SPME direta, para anlise quantitativa de componentes de aroma produzidos por bactrias derivados de carne34; as extraes com fibra PA foram melhores do que com PDMS, devido ao carter polar (cidos orgnicos) desses analitos. Vrias descries de aplicao da SPME incluem valiosas informaes sobre a comparao desta tcnica com outras. Para a anlise de constituintes dos aromas de refrigerantes tipo cola, a SPME de headspace comparada com o headspace dinmico convencional seguido de adsoro em Tenax35. demonstrado que a SPME um mtodo mais rpido, embora

com o headspace dinmico convencional tenha sido obtida maior sensibilidade e extrao de maior variedade de compostos. Doze lcoois e estres foram analisados em cerveja por SPME de headspace, usando fibra PA; na comparao com o headspace esttico convencional houve boa correlao entre os dois mtodos e maiores sensibilidades com SPME36. Para identificao e quantificao por CG-EM de componentes de aromas de mas, a SPME de headspace37,38 foi comparada com o mtodo convencional de headspace dinmico39. O headspace de sucos de laranja foi estudado por SPME-CG-MS40 para identificar e quantificar 17 analitos; tradicionalmente estas anlises so realizadas41-43 por headspace esttico e dinmico, arraste gasoso (gas stripping) ou purga e trapeamento A SPME de headspace para anlise de aromas de queijos foi avaliada e comparada com o headspace esttico convencional, demonstrando-se que a SPME extrai maior nmero de componentes dos aromas44. A SPME de headspace permitiu a extrao de 11 pirazinas em 10 min, comparando-se muito favoravelmente com os tempos de extrao de 17 horas de outros mtodos58. AGRADECIMENTOS FAPESP pelo suporte a dois projetos que tornaram possveis os estudos que levaram ao presente artigo. REFERNCIAS 1. Arthur, C. L.; Pawliszyn, J.; Anal. Chem. 1990, 62, 2145. 2. Mc.Nair, H. M.; Miller, J. M.; Basic Gas Chromatography; Wiley-VCH; New York, NY, 1997; p.11. 3. Pawliszyn, J.; Solid Phase Microextraction: Theory and Practice; Wiley-VHC; New York, NY, 1997; p. 3. 4. Shirey, R. E.; Mani, V.; Pittcon Connference; Atlanta, GA, 1997. 5. Supelco Inc.; Chromatographic Products (catlogo); Supelco, Bellefonte, PA, 1996; p. 373. 6. Pawliszyn, J.; op. cit.; p.118. 7. Pawliszyn, J.; op. cit.; p.98. 8. Alexandrou, N.; Pawliszyn, J.; Anal. Chem. 1989, 61, 2770. 9. Zhang, Z; Pawliszin, J.; Anal. Chem. 1993, 65, 1843. 10. Pawliszyn, J.; op. cit.; p. 212. 11. Louch, D.; Motlagh, S.; Pawliszyn, J.; Anal. Chem. 1992, 64, 1552. 12. Martos, P. A.; Pawliszyn, J.; Anal. Chem. 1997, 69, 206. 13. Castellan, G. W.; Physical Chemistry; 2a ed.; AddisonWesley; Reading, MA, 1972; p.689. 14. Pawliszyn, J.; op. cit.; p.66. 15. Pawliszyn, J.; op. cit.; p.82. 16. Pawliszyn, J.; op. cit.; p.80. 17. Zhang, Z.; Pawliszyn, J.; J. Phys. Chem. 1996, 100, 17648. 18. Field, J. A.; Nickerson, G.; James, D. D.; Heider, C.; J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 1768. 19. Grote, C.; Pawliszyn, J.; Anal. Chem. 1997, 69, 587. 20. Supelco Inc.; Index to Solid Phase Microextraction (SPME) Literature; www.sigma-aldrich.com/SAWS.nsf/ Pages/fb_spmelit . 22. Saraullo, A.; Martos, P. A.; Pawliszyn, J.; Anal. Chem. 1998, 69, 1992. 22. Schfer, B.; Hennig, P.; Engewald, W.; J. High Resolut. Chromatogr. 1997, 20, 217. 23. Colleman III, W. M.; J. Chromatogr. Sci. A 1997, 35, 245. 24. Pawliszyn, J.; op. cit.; p.109. 25. Gorecki, T.; Pawliszyn, J.; Anal. Chem. 1996, 68, 3008. 26. Wang, Y.; Bonilla, M.; McNair, H. M.; J. High Resolut. Chromatogr. 1997, 20, 213. 27. Pawliszyn, J.; op. cit.; p.113. 28. Zhang, Z.; Poerschmann, J.; Pawliszyn, J.; Anal. Comunn. 1996, 33, 219. 29. Pawliszyn, J.; op. cit.; p.60.

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