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Inside Analysis #01

Adenylate Cyclase Brain

Phylogenetic Tree

© Bioinformatics @ Cusmibio 2009 Lorenzo Gatti


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DESCRIZIONE ANALISI

L’analisi vuole determinare un’ipotesi evolutiva attraverso l’allineamento di


sequenze di geni omologhi provenienti dalla stessa specie. I geni considerati
codificano per l’Adenilato ciclasi (brain), un enzima della classe delle liasi
che catalizza la seguente reazione:

ATP = AMP 3',5'-ciclico + pirofosfato

Questo enzima fa parte di una via di trasduzione del segnale (via dell'adenila-
to ciclasi), che consente di produrre effetti fisiologici in seguito al legame
di un messaggero con la cellula.

RICERCA DEI CODICI

Per risalire a tutti i geni da includere nell’analisi è stato utilizzato un ge-


ne-browser in grado di restituire tutte le informazioni legate ad una determi-
nata entry: ADCY

http://www.genenames.org/cgi-bin/hgnc_search.pl

I risultati della query hanno evidenziato la presenza di 10 geni che codificano


per AC.

CODICI E TRASCRITTI

La prima fase di verifica dei codici dei trascritti è stata svolta attraverso
il gene-browser http://genomes.ucsc.edu. A partire della sequenza amminoacidica
determinata dalla sequenza dell’mRNA del gene ADCY1 si sono cercati i geni omo-
loghi nella specie H.Sapiens effettuando un BLAT della sequenza della proteina
sull’intero genoma umano. I risultati sono stati i medesimi di quelli proposti
dal gene-browser http://www.genenames.org.

Human ADCY1 AC1 NM_021116


Human ADCY2 AC2 NM_020546
Human ADCY3 AC3 NM_004036
Human ADCY4 AC4 NM_139247
Human ADCY5 AC5 NM_183357
Human ADCY6 AC6 NM_015270 NM_020983 (Due isoforme)
Human ADCY7 AC7 NM_001114
Human ADCY8 AC8 NM_001115
Human ADCY9 AC9 NM_001116
Human ADCY10 AC10 NM_018417

PIC#01 - Query results from http://www.genenames.org


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ALLINEAMENTI

Per effettuare gli allineamenti delle strutture dei geni individuati dalla ri-
cerca è stato utilizzato lo strumento “Exalign”. L’algoritmo che è alla base di
Exalign è in grado di individuare allineando due sequenze omologhe la presenza
di esoni divisi da uno o più introni.

Per costruire un albero filogenetico al fine di proporre una teoria evoluzioni-


stica di come si sono sviluppati i 10 trascritti è stato necessario allineare
le sequenze le une contro le altre per evidenziare somiglianze o differenze
strutturali.

ADCY1 (NM_021116) VS. ADCY2 (NM_020546)

A livello dell’esone no. 9 del trascritto NM_021116 è possibile evidenziare nel


trascritto NM_020546 la presenza di due introni che separano gli esoni no. 10,
11, 12.

PIC#01 - Text output from Exalign ADCY1 vs ADCY2

PIC#02 - Graphic output from Exalign ADCY1 vs ADCY2

Dalla rappresentazione grafica è possibile individuare la posizione dei due in-


troni che separano l’esone da 195pb nella sequenza NM_020546 - ADCY2.

NM_021116 195

NM_020546 44 81 70

ADCY1 (NM_021116) VS. ADCY3 (NM_004036)/ADCY4 (NM_139247)/ADCY7 (NM_001114)/AD-


CY8 (NM_001115)

Gli allineamenti tra la sequenza del trascritto NM_021116 - ADCY1 e quelle dei
trascritti ADCY3/4/7/8 non portano alcuna informazione aggiuntiva all’analisi.
Exalign non mostra alcuna presenza di esoni divisi da introni. Si può tuttavia
notare come siano più conservati gli esoni posti all’inizio e alla fine della
sequenza e non siano conservati quelli in posizione intermedia. Si può ipotiz-
zare che i domini funzionali conservati caratterizzino la proteina codificata,
mentre la parte variabile differisca a seconda dell’ambiente (tessuto) in cui
la proteina è presente.
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PIC#03 - Text output from Exalign ADCY1 Vs. ADCY 3

PIC#04 - Graphic output from Exalign ADCY1 Vs. ADCY 3

PIC#04 - Text output from Exalign ADCY1 Vs. ADCY 4

PIC#05 - Graphic output from Exalign ADCY1 Vs. ADCY 4

PIC#06 - Text output from Exalign ADCY1 Vs. ADCY 7

PIC#07 - Graphic output from Exalign ADCY1 Vs. ADCY 7

PIC#08 - Text output from Exalign ADCY1 Vs. ADCY 8


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PIC#09 - Graphic output from Exalign ADCY1 Vs. ADCY 8

ADCY1 (NM_021116) VS. ADCY5 (NM_183357)

L’allineamento contro la sequenza del trascritto NM_183357 è significativa per


la presenza di due introni posizionati in due esoni contigui lungo la sequenza
di NM_021116. Essi dividono gli esoni no. 15-16 e 17-18 nel trascritto ADCY1.

PIC#07 - Text output from Exalign ADCY1 Vs. ADCY 5

PIC#10 - Graphic output from Exalign ADCY1 Vs. ADCY 5

Dalla rappresentazione grafica è possibile individuare la posizione dei due in-


troni che separano gli esoni da 264pb e 214pb ca. nella sequenza NM_021116 -
ADCY1.

NM_183357 264 214 ca.

NM_021116 117 147 99 115

ADCY5 (NM_183357) VS. ADCY6 (NM_015270)

L’allineamento tra la sequenza del trascritto NM_183357 e la sequenza del tra-


scritto NM_015270 non mostra particolari differenze. È possibile pertanto ipo-
tizzare che i due geni derivino da una duplicazione l’uno dell’altro.

PIC#11 - Text output from Exalign ADCY5 Vs. ADCY 6


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ADCY2 (NM_020546) VS. ADCY4 (NM_139247)/ADCY7 (NM_001114)

Gli allineamenti delle sequenze dei trascritti mostrano un’alta similarità e


conservazione di quasi la totalità dei domini funzionali (esoni). Per rendere
più semplice l’analisi si è preferito escludere i trascritti ADCY4 e ADCY7 a
favore del trascritto ADCY2.

ADCY9 (NM_001116) VS. ADCY10 (NM_018417

L’analisi dei trascritti NM_00116 e NM_018417 non fornisce alcun dato signifi-
cativo. L’allineamento è solo parziale e non rispecchia il trend degli allinea-
menti effettuati con i trascritti precedenti: è possibile escluderli da ogni
altra considerazione.

RISULTATI DEGLI ALLINEAMENTI

A fronte dei risultati ottenuti dai vari allineamenti strutturali è possibile


escludere da ulteriori considerazioni i trascritti NM_004036, NM_139247,
NM_015270 e NM_020983, NM_001114, NM_001115, NM_001116, NM_018417.

I risultati che non è possibile rigettare sono dati dagli allineamenti tra i
trascritti NM_021116 vs. NM_183357, NM_021116 vs. 020546 e NM_020546 vs.
183357.

Da questi allineamenti è possibile prevedere un allineamento multiplo sommativo


dei risultati significativi ottenuti.

1 1 1 1 ACDY1

2 introni 1 introne 1 introne

1 1 1 ACDY2

1 1 1 1 ACDY5

Si individuano due regioni in cui sono avvenute delle modificazioni dovute al-
l’evoluzione. La prima regione è stata rilevata attraverso l’allineamento tra
il trascritto ADCY1 e il trascritto ADCY2 mentre la seconda è stata rilevata
attraverso l’allineamento tra il trascritto ADCY1 e ADCY5.

Nel trascritto ADCY2 tuttavia è possibile notare come la struttura nella regio-
ne 2 sia simile alla struttura nella regione 2 del trascritto ADCY1. Questo po-
trebbe segnalare la presenza di due introni conservati dall’evoluzione anche
nella regione 2 del trascritto ADCY2, tuttavia Exalign non li rileva a causa
della scarca percentuale di basi allineate.

Non è possibile determinare un’ipotesi evoluzionistica più probabile limitata-


mente ai confronti considerati. Sarà necessario proseguire l’analisi spostando
l’attenzione anche sui geni paraloghi ai trascritti NM_021116, NM_020546,
NM_183357.
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ALLINEAMENTO CON TRASCRITTI PARALOGHI

L’allineamento contro sequenze di trascritti paraloghi è stato effettuato pren-


dendo in considerazione le specie per le quali era disponibile un codice di
trascritto REFSEQ.

Per ogni trascritto di H.Sapiens è stato individuato un trascritto paralogo in


M.Musculus e R. Norvegicus.

Gene | H.Sapiens | M. Musculus | R.Norvegicus

ADCY1 | NM_021116 | NM_009622 | NM_001107239

ADCY2 | NM_020546 | NM_153534 | NM_031007

ADCY5 | NM_183357 | NM_001012765 | NM_022600

Dopo aver effettuato gli allineamenti contro i trascritti paraloghi i risultati


restituiscono un’evidente uguaglianza tra le varie sequenze come nello schema
sotto riportato.

ADCY1 | NM_021116 ≈ NM_009622 ≈ NM_001107239

ADCY2 | NM_020546 ≈ NM_153534 ≈ NM_031007

ADCY5 | NM_183357 ≈ NM_001012765 ≈ NM_022600

[“≈” = simile a]

Tutte le considerazioni che sono state descritte per i confronti contro i tra-
scritti ortologhi valgono in modo simile anche per i trascritti paraloghi. Nel
caso sopra descritto il trascritto NM_009622 - ADCY1 in M.Musculus presenta due
introni che separano gli esoni 15-16 e 17-18 in corrispondenza degli esoni 17 e
18 del trascritto ADCY5, mentre il trascritto NM_153534 - ADCY2 in M.Musculus
presenta due introni che separano gli esoni 10-11-12 in corrispondenza del-
l’esone no. 9 del trascritto ADCY1. Le medesime analisi valgono anche per tutti
i trascritti provenienti da R.Norvegicus.

In conformità a quanto evidenziato dagli allineamenti con sequenze paraloghe è


ora possibile proporre un’ipotesi circa come si sia evoluto il gene che codifi-
ca per la proteina integrale di membrana adenilato ciclasi.

ADCY1 - 2 introni
Ancestor 0 H.Sapiens ADCY2 - 2 introni
ADCY5 - 0 introni

ADCY1 - 2 introni
Ancestor 1 M.Musculus ADCY2 - 2 introni
ADCY5 - 0 introni

ADCY1 - 2 introni
R.Norvegicus ADCY2 - 2 introni
ADCY5 - 0 introni
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L’evoluzione del gene ADCY si è sviluppata in due momenti separati: il primo è


stato determinato dalla duplicazione di un gene ADCY antenato, il secondo è de-
scritto completamente dall’acquisizione degli introni che ora sono riscontrabi-
li nei trascritti ADCY1 e ADCY2. Tutti i trascritti duplicati che non presenta-
no introni derivano da una delle due copie del gene ADCY che non aveva acquisi-
to gli introni. Le duplicazioni successive alla prima divisione del gene ante-
nato sono avvenute a valle dell’acquisizione degli introni. È possibile affer-
mare che non siano avvenuti eventi di intron-loss a causa dell’evidente assenza
di introni nei trascritti duplicati esclusi dall’analisi a partire degli alli-
neamenti tra trascritti omologhi.