Artigo

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Metodologias Analticas
para o controlo de produtos farmacuticos
RUI CERDEIRA DE CAM P OS COSTA *

A investigao de novas substncias com actividade teraputica, bem como de novas aplicaes para substncias activas em circuito comercial, guiada entre outros factores pela natureza das tcnicas analticas que so utilizadas ao longo deste processo. Na verdade, quanto maior e mais diversificado for o nmero de recursos analticos ao dispor das equipas que conduzem os projectos de investigao e desenvolvimento farmacutico, menor ser o tempo necessrio para evidenciar as qualidades das substncias para dar corpo a novas solues teraputicas.

Contudo, nem sempre um nmero elevado ou diversidade de meios analticos traz sucesso aos projectos. Por vezes, o insucesso descoberto j numa fase avanada dos projectos, representando para todos quantos neles intervm uma enorme desiluso. Este artigo procurar, por isso, mostrar de forma mais ou menos sucinta a aplicao dos recursos analticos ao longo do processo que conduz descoberta de uma nova substncia activa ou de uma nova aplicao para substncias activas j aprovadas por entidades regulamentares para fins humanos.

Introduo O processo que conduz ao aparecimento de uma nova substncia com actividade teraputica (substncia activa) altamente complexo, demorado, dispendioso e frequentemente infrutuoso. A quantidade de informao que gerada ao longo deste processo depende em larga medida da natureza dos recursos analticos que esto ao seu dispor. O desenvolvimento de uma nova substncia activa procura na essncia processos de sntese capazes de proporcionarem matrias-primas virtualmente puras. Infelizmente, tal desiderato no possvel; na verdade, o mais comum encontrar um conjunto de impurezas que acompanham a substncia activa, cuja natureza e quantidade depende fundamentalmente quer das condies reaccionais que se utilizam durante o processo de sntese, quer da estabilidade do produto final face a factores como sejam a temperatura, a humidade, a luz, ou o poder oxidante do meio envolvente.

Segundo a International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, vulgo ICH, as impurezas que habitualmente podem acompanhar uma substncia activa dividem-se em trs grupos [1]: impurezas inorgnicas; solventes residuais; impurezas orgnicas. As impurezas inorgnicas resultam exclusivamente do processo de sntese seleccionado e esto normalmente identificadas; entre elas possvel encontrar reagentes, catalisadores, metais residuais, sais inorgnicos e outros materiais como sejam, e.g., materiais de apoio a processos separativos. Quanto aos solventes residuais, dado que as reaces que compem o processo de sntese de uma dada substncia activa ocorrem em meio fundamentalmente lquido, comum no decurso do processo de sntese seleccionado, o recurso a diferentes tipos de lquidos orgnicos ou inorgnicos cuja presena no produto final dificilmente pode ser evitada.

No que diz respeito s impurezas orgnicas, dado que a sua presena no produto final pode resultar quer do processo de sntese, quer da estabilidade da prpria substncia activa durante a fase de armazenamento, comum design-las como impurezas relacionadas quer com o produto final quer com o processo. Estas impurezas podem estar ou no identificadas, podem ser ou no volteis e podem incluir: reagentes de partida; intermedirios; reagentes intermdios, e.g., catalisadores; produtos secundrios; produtos de degradao.

Metodologias para o controlo da substncia activa Para cada tipo de impureza necessrio estabelecer limites tendo por base consideraes de natureza toxicolgica. Para algumas das impurezas anteriormente descritas, nomeadamente metais pesados e solventes residuais, a definio desses limites relativamente mais simples de se estabelecer na medida

* Laboratrio de Desenvolvimento Farmacutico, Laboratrios Bial, Avenida Siderurgia Nacional, 4745-457 S. Mamede do Coronado, Portugal

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em que existem documentos que, apesar de cariz normativo, propem limites, que quando cumpridos pelas entidades proponentes de novas substncias activas, no carecem de justificaes adicionais aquando do pedido de autorizao para a sua comercializao. No caso concreto dos solventes residuais, a ICH atravs da sua guideline Q3C [2-4], agrupa os solventes em trs classes, tendo em conta o seu grau de toxicidade; num extremo a classe 1 que inclui os solventes mais txicos e para os quais esto definidos limites mais estreitos e cuja utilizao deve ser evitada (e.g., benzeno), e no outro a classe 3 que inclui os solventes menos txicos e cujos limites so mais largos (e.g., cido actico). O controlo deste tipo de impurezas realizado habitualmente por cromatografia gasosa (GC) utilizando diferentes tipos de detectores, sendo os mais comuns, o de ionizao de chama (FID) e a espectrometria de massa (MS). Para alguns solventes residuais, especialmente quando evidenciam na sua estrutura grupos com propriedades cido / base (e.g., cido actico), comum o recurso a procedimentos titrimtricos com deteco potenciomtrica. Em relao aos metais, existem igualmente documentos normativos [5] que auxiliam na definio dos limites a impor ao produto final. Para o seu controlo recorre-se com alguma frequncia a tcnicas colorimtricas e a tcnicas de espectroscopia de emisso/absoro atmica (AAS / EAS). O recurso espectrometria de massa com fonte de plasma (ICP-MS) ou fluorescncia de raios X considerado quando as espcies podem apresentar teores no produto final que no so passveis de doseamento pelas outras tcnicas anteriormente descritas. O desenvolvimento das metodologias analticas a utilizar no controlo de solventes residuais e metais dependem, entre outros factores, da seleco de procedimentos de extraco eficazes destas impurezas. No caso dos solventes residuais, este problema pode ser relativamente obviado atravs do recurso aos injectores do tipo Headspace, enquanto no caso dos metais a digesto das amostras um bom procedimento para reduzir a influncia da matriz.

A tarefa de estabelecimento de limites mximos para os teores de impurezas orgnicas admissveis no produto final relativamente mais complexa, uma vez que depende quer do desempenho do processo sinttico em termos de eficcia de purificao da substncia activa, quer das caractersticas de toxicidade das potenciais impurezas. Por essa razo, a ICH considera que, sempre que uma impureza aparea na matria-prima em quantidade superior a 0,15 % dever ser qualificada, i.e., dever avaliar-se o seu potencial toxicolgico [1]. Assim, se for estabelecida, por exemplo, uma especificao de 0,30 % para uma determinada impureza na substncia activa, com base na informao disponvel sobre o desempenho do processo de purificao, visvel atravs dos resultados obtidos para as primeiras produes, ser necessrio qualificar essa impureza antes de utilizar-se a substncia activa em considerao em ensaios clnicos. Para alm do limite de qualificao, a
ICH define outros limites cuja utilizao

veniente especificar um valor menor ou igual a 0,10 %. Deste modo pode obviarse a necessidade de se proceder identificao e eventualmente qualificao da impureza em questo, salvo se se tratar de um produto com elevada actividade farmacolgica utilizado em baixa quantidade, ou se a dose diria mxima admissvel for superior a 2 g; neste caso deve seguir-se o limite de 0,05 %. Dos limites propostos pela ICH resulta que as metodologias utilizadas para controlar as impurezas devero ter um limite de quantificao no mnimo de 0,05 % quando a dose mxima diria de substncia activa que pode administrar-se ao humano inferior a 2 g, e de 0,03 % se a dose for maior do que 2 g. Habitualmente, o nmero de impurezas orgnicas que podem acompanhar uma determinada substncia activa superior a 1. Torna-se, por isso, desejvel que a sua quantificao e, se possvel, a da substncia activa, seja realizada recorrendo ao mesmo mtodo analtico. Para que tal seja possvel comum recorrer-se utilizao de tcnicas separativas, nomeadamente HPLC, GC ou electroforese capilar (CE), acopladas aos mais diversos sistemas de deteco. O desenvolvimento de um mtodo analtico assente numa tcnica separativa parte, nestes casos, de duas premissas importantes: o mtodo deve proporcionar uma adequada resoluo entre os sinais transientes das diferentes espcies a quantificar, para um adequado tempo de corrida; o mtodo deve ter a capacidade para quantificar as diferentes impurezas acima de 0,03 ou 0,05%, consoante a dose diria mxima admissvel superior ou inferior a 2 g, respectivamente. Durante as primeiras fases do desenvolvimento de um novo processo de sntese no se conhecem todas as potenciais impurezas dessa substncia activa. Por outro lado, por vezes, as caractersticas fsico-qumicas de algumas impurezas no possibilitam a obteno de padres que possam ser utilizados como termo de referncia, ou quando possvel, a sua sntese conduz a quantidades exguas. O desconhecimento das potenciais impu-

bastante til durante o desenvolvimento de uma nova substncia activa [1]: teores < 0,05 %; limite abaixo do qual uma impureza no considerada para efeitos de clculo, salvo se a dose diria mxima admissvel for superior a 2 g; neste caso o limite a seguir de 0,03 %; teores 0,10 %; as impurezas devem ser quantificadas, embora no estejam necessariamente identificadas; quando tal acontece, o doseamento destas impurezas realizado atravs do mtodo do padro externo sendo essa funo desempenhada por um padro da substncia activa, ou pelo mtodo da percentagem de rea no caso de procedimentos baseados na tcnica de cromatografia lquida (HPLC) ou GC. Aquele limite reduz-se para 0,05 % quando a dose diria mxima admissvel for superior a 2 g; teores > 0,10 %; as impurezas alm de quantificadas devero estar identificadas. Com base nas aces que necessrio promover em funo dos limites anteriormente indicados , por vezes, con-

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Figura 1 Tipos e fontes de impurezas que podem surgir no decurso do processo de desenvolvimento de uma nova substncia activa

rezas, ou a ausncia de padres destas, dificulta quer o desenvolvimento de um mtodo que apresente um poder de resoluo suficientemente adequado para impurezas que so desconhecidas, quer a posterior aplicao do mtodo desenvolvido durante as anlises de rotina. O trabalho de desenvolvimento da metodologia analtica normalmente realizado atravs da anlise quer de amostras de substncia activa sujeitas a condies que proporcionem alguma degradao, quer de padres de algumas das potenciais impurezas, quando disponveis, utilizando diferentes tcnicas separativas equipadas com diferentes tcnicas de deteco e operando com diferentes condies instrumentais, no sentido de encontrar as condies analticas que proporcionam maior selectividade. A informao retida por cada pico em termos de selectividade pode ser avaliada atravs da anlise da pureza espectral do pico obtido, utilizando como tcnica de deteco uma tcnica de varrimento, como por exemplo, um detector de dodos ou um espectrmetro de massa. A informao que recolhida durante esta fase pode ser utilizada em sentido inverso como auxlio na identificao de potenciais novas impurezas. Todas as metodologias de anlise fsico-qumica utilizadas devero ser sujeitas a validao seguindo as recomendaes das guidelines da ICH [6, 7]. As dificuldades que surgem durante a fase de aplicao de rotina do mtodo, no que diz respeito ausncia de padres de algumas impurezas, so contornadas mediante a quantificao das impurezas segundo duas metodologias: % da rea do pico de cada impureza relativamente ao somatrio das reas de todos os picos que aparecem no cromatograma; os resultados que se obtm com esta metodologia podem

ser convertidos em % m/m atravs da utilizao de factores de resposta relativos, i.e., a razo entre as sensibilidades da substncia activa e de cada impureza; para impurezas cujo factor de resposta relativo desconhecido utiliza-se o valor 1; pelo mtodo do padro externo, confrontando neste caso os sinais das impurezas observados nos cromatogramas da amostra com os sinais da substncia activa presentes nos cromatogramas das solues padro, devidamente corrigidos fazendo intervir o factor de resposta relativo de cada impureza. Para que o mtodo seja capaz de proporcionar um limite de quantificao de pelo menos 0,03 ou 0,05 %, por vezes, torna-se necessrio aumentar a quantidade de amostra a analisar, resultando da, por vezes, perda de linearidade de resposta para a substncia activa. Quando isto ocorre, o procedimento analtico deve incluir a anlise de solues diludas para o doseamento da substncia activa e de solues concentradas para o doseamento das impurezas. Alternativamente, pode recorrer-se a um segundo mtodo, e.g., um procedimento titrimtrico, que apesar de no ser o melhor em termos de selectividade complementado pelo mtodo utilizado para dosear as impurezas. Caso a substncia activa seja um enantimero ser necessrio um terceiro mtodo que permita dosear o enantimero que surge no produto final como impureza. Neste caso concreto, o mtodo dever incluir na sua descrio um elemento com capacidade de resoluo entre enantimeros. Para os baseados na tcnica de HPLC, a separao conseguida habitualmente por recurso a colunas quirais e menos frequentemente a colunas convencionais de fase reversa utilizando o elemento selector na fase mvel. Para

os mtodos baseados na tcnica de GC a separao realizada com colunas capilares quirais, enquanto que os mtodos electroforticos baseiam a sua capacidade de resoluo no elemento selector includo no eluente. As metodologias utilizadas para dosear a substncia activa e avaliar a sua pureza so sempre acompanhadas por uma ou mais metodologias de identificao. A espectroscopia de infra-vermelho talvez a mais utilizada, contudo, comum tambm encontrar-se metodologias baseadas na cromatografia em camada fina (TLC), em reaces colorimtricas, ou em reaces de precipitao. As substncias activas so tambm controladas em termos de humidade, habitualmente pela tcnica de Karl-Fischer. Para alm dos parmetros anteriormente referidos tambm importante, quando a dimenso da partcula da substncia activa tem influncia no seu desempenho in vivo, proceder-se determinao da sua distribuio granulomtrica. Esta determinao pode ser realizada entre outras, pela metodologia de difraco de raios X recorrendo aproximao de Fraunhofer. A influncia no desempenho in vivo pode tambm resultar da capacidade da substncia activa exibir polimorfismo, i.e., a capacidade para cristalizar com diferentes estruturas as quais podem apresentar diferenas em algumas das suas propriedades fsico-qumicas, nomeadamente solubilidade e estabilidade. Esta caracterstica constitui objecto de estudo nos primeiros estgios do desenvolvimento, mediante o recurso anlise por difraco de raios X e s tcnicas de anlise trmica como o caso da calorimetria diferencial de varrimento (DSC). Estes estudos visam identificar no s os possveis polimorfos de uma determinada substncia activa,

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Tabela 1 Alguns exemplos de metodologias analticas utilizadas para o controlo de impurezas em produtos farmacuticos.

Solventes residuais
GC-FID GC-MS Titrimetria com deteco potenciomtrica

Impurezas inorgnicas
Tcnicas colorimtricas
AAS/EAS ICP-MS

Impurezas orgnicas
Tcnicas separativas (HPLC, GC, Electrofrese capilar) acopladas a diferentes tipos de detectores

Fluorescncia de raio X

bem como as condies reaccionais que conduzem obteno do polimorfo mais estvel. desejvel que durante as fases posteriores de desenvolvimento da forma farmacutica no ocorram alteraes na estrutura cristalina da substncia activa que entra na sua composio e que, por conseguinte, possam ter possveis repercusses quer em termos de segurana decorrentes de alteraes na estabilidade do produto, quer em termos de eficcia do produto resultantes de alteraes de desempenho da substncia activa in vivo.

formulado, cuja natureza definida em funo do estado fsico do produto, da aplicao e da composio, conforme possvel observar nas farmacopeias, e.g., a Europeia [9] ou a dos Estados Unidos da Amrica [10].

New Drug Substances, ICH, Geneva, 2002. 2 International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Guideline Q3C Impurities: Guideline for Residual Solvents, ICH, Geneva, 1997. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Guideline Q3C(M) Impurities: Residual Solvents (Maintenance) PDE for Tetrahydrofuran, ICH, Geneva, 2002. Medicines Agency, Annexes to: CPMP / ICH / 283 / 95 & CVMP / VICH / 502 / 99, Annex I: Specifications for Class 1 and Class 2 Residual Solvents in Active Substances, Annex II: Residues ff Solvents Used in the Manufacture of Finished Products, EMA, London, 2005.
CPMP / QWP / 450 / 03 ,

Consideraes finais Das consideraes anteriores possvel verificar que a investigao de novas substncias com actividade teraputica, bem como de novas aplicaes para substncias activas j aprovadas para outras aplicaes teraputicas, guiada em parte pela natureza dos recursos analticos que so utilizadas ao longo deste processo. Na verdade, quanto maior e mais diversificado for o nmero de recursos analticos ao dispor das equipas que conduzem os projectos de investigao e desenvolvimento farmacutico, mais rapidamente ser possvel saber se a substncia realmente evidencia qualidades para dar corpo a uma nova soluo teraputica. Infelizmente, por vezes, por maior que sejam os recursos e o empenho de todos aqueles que integram as equipas de I&D, o insucesso s descoberto j numa fase avanada dos projectos, representando para todos quantos intervm nos projectos uma grande desiluso. Os projectos de I&D farmacuticos so por isso uma corrida contra o tempo, cujo objectivo maior encontrar o mais rapidamente possvel novas solues teraputicas que acrescentem valor s que j se conhecem, sempre em concordncia com os padres impostos pelas entidades regulamentares e pelos parceiros comerciais. Referncias
1 International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Guideline Q3A(R) Impurities in

European

Metodologias para a forma farmacutica De um modo geral a administrao da grande maioria das substncias activas pressupe a sua colocao numa matriz a que se d o nome de forma farmacutica. Esta operao pode conduzir, em certos casos, degradao da substncia activa com o aparecimento de impurezas cuja formao na substncia activa isolada pode no ser possvel [8]. Nestes casos, teremos, semelhana do que se escreveu para a substncia activa matria-prima, de desenvolver mtodos para quantificar a substncia activa e os produtos de degradao seguindo a mesma linha de pensamento. Para os processos produtivos que incorporam na sua descrio a utilizao de solventes residuais, por exemplo, durante as fases de granulao ou revestimento de comprimidos, apesar de serem descritos no dossier a submeter s autoridades regulamentares como no sendo constituintes do medicamento, contudo necessrio demonstrar que a sua presena inferior aos limites impostos pela ICH, habitualmente por GC com deteco por FID ou MS. Para alm destes, muitos outros ensaios so realizados sobre o produto

The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, CPMP / SWP / QWP / 4446 / 00, Note for Guidance on Specification Limits for Residues of Metal Catalysts, EMEA, London, 2002. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Guideline Q2A Text on Validation of Analytical Procedures, ICH, Geneva, 1994. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Guideline Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology, ICH, Geneva, 1996. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Guideline Q3B(R) Impurities in New Drug Products, ICH, Geneva, 2003. Council of Europe, Directorate for the Quality of Medicines of the Council of Europe (EDQM), European Pharmacopoeia, 5 th Edition, Strasbourg, 2005. United States Pharmacopeia Convention Inc, The United States Pharmacopeia 28 The National Formulary 23, Rockville, 2005.

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