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Métodos Cromatográficos

Separación e identificación de compuestos orgánicos mediante HPLC (simulación)

RESUMEN: Mediante el software hplcsimulator se realizan una serie de determinaciones cromatográficas variando en las mismas la inmensa mayoría de los factores que intervienen en el proceso cromatográfico y analizando sus efectos en los resultados finales de los ejercicios propuestos.

OBJETIVOS:

Entender el fundamento de la HPLC (High Performance Liquid Cromatography), aprendiendo el manejo del programa de simulación hplcsimulator, estudiando las diferentes variables que afectan la separación cromatográfica de compuestos mediante una técnica de HPLC.

INTRODUCCIÓN TEÓRICA GENERAL

La cromatografía es una metodología que permite separar, identificar y/o analizar los componentes de mezclas complejas, que por otras técnicas no podrían resolverse. Dicha técnica está basada en la diferente velocidad de migración que adquieren los componentes de una mezcla al hacerlos pasar a través de una fase estacionaria, que se fija a una columna o a una superficie sólida, bajo la influencia de una fase móvil, con la que es inmiscible. Aquellos compuestos que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil, mientras que los que se unen débilmente se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente, mediante observación y/o registro de datos, después de que haya tenido lugar la separación de los componentes de la mezcla.

Existe un amplio grupo de técnicas de separación y la cromatografía puede ser preparatoria o analítica.

A lo largo del desarrollo de la práctica, que consistirá en la simulación de distintas técnicas cromatográficas mediante el software hplcsimulator se irán aplicando, indistintamente, ciertos parámetros cromatográficos fundamentales:

Cromatograma

Tiempo de retención, t R . Tiempo muerto, t M o t 0 Tiempo de retención corregido o neto t R ’, es la diferencia entre los dos anteriores y mide el tiempo que el componente permanece en la fase estacionaria.

Desviación estándar, σ t . Altura media del pico en el punto de inflexión.

 

Anchura de pico a la semialtura w 05 (w 1/2 ). Se define como 2’345σ t .

 

Anchura base del pico w b . Se define como 4σ t .

Factor de capacidad, o factor de retención k’.

Factor de selectividad, α. Un sistema será más selectivo cuanto más distintos sean sus tiempos de retención. Según esto, α ha de ser mayor a 1; si α = 1, no hay separación.

Número de platos teóricos de la columna. Mide la capacidad de la columna para separar los

componentes, no la retención de los mismos.

(

)

(

)

Eficacia de la columna. Viene dada por el número de platos teóricos N: N = L/H.

Resolución, R s de la columna. Constituye una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1. Estudio de la composición de la fase móvil, modo de separación, resolución y selectividad.

a) Para ello se selecciona un grupo de 5 compuestos y se prepara una muestra de estándares con concentraciones 20 μM. Se varía el porcentaje y el tipo de solvente orgánico, así como el modo de

operación (isocrático, gradiente).

así como el modo de operación (isocrático, gradiente). ¿Qué ocurre con la resolución? Conforme se incrementa

¿Qué ocurre con la resolución? Conforme se incrementa la proporción del solvente B, en modo isocrático disminuye la resolución de los picos.

¿Qué ocurre con la retención? En modo gradiente se consiguen mejores resoluciones a costa de un aumento de los tiempos de retención.

resoluciones a costa de un aumento de los tiempos de retención. Con metanol se consiguen malos

Con metanol se consiguen malos resultados en ambos modos

¿Qué ocurre con el ensanchamiento del pico? El ensanchamiento de los picos aumenta con k’ como se puede observar en el gráfico isocrático, de manera que al aumentar la relación de capacidad se hace más difícil la resolución y la detección.

Propuesta de condiciones de separación:

Modo Gradiente. Agua/Acetonitrilo: 0 minutos 5% Acetonitrilo; 5 minutos 50% Acetonitrilo. Temperatura de columna 23º C. Volumen de inyección 5μL; Flujo 3 mL/minuto. Columna 200 x 4’6 mm. Tamaño de partícula 2.0 μm.

Columna 200 x 4’6 mm. Tamaño de partícula 2.0 μm. b) Seleccionar un par de compuestos

b) Seleccionar un par de compuestos críticos (el par de menor resolución).

¿Cómo se puede mejorar la resolución de dicho par? La resolución de los picos puede mejorar aumentando la longitud de la columna.

¿Qué factores afectan la selectividad? La selectividad se ve afectada principalmente por los tiempos de retención: un sistema será más selectivo cuanto más distintos sean sus tiempos de retención. Depende de la naturaleza de las fases estacionarias y móviles y de la temperatura de operación de la columna.

c) Mantener un porcentaje fijo de solvente orgánico, cambiar tipo de solvente y observar el cambio de presión en las bombas.

¿A qué se debe la diferencia entre solventes? Se produce una disminución de la presión al usar acetonitrilo ya que la viscosidad de éste es menor.

2. Estudio de la temperatura de la columna, velocidad de flujo y volumen de inyección.

a) Mantener las condiciones óptimas de separación efectuadas anteriormente y modificar la temperatura de la columna.

¿Qué sucede con el tiempo de análisis? Va disminuyendo a costa de una pérdida de resolución.

¿Qué sucede con la resolución de los compuestos? Como se ha dicho, va disminuyendo.

b) Mantener las condiciones óptimas de separación y modificar la velocidad de flujo.

¿Qué sucede con el tiempo de análisis? Disminuye cuando aumenta la velocidad de flujo.

¿Qué sucede con la resolución de los compuestos? Disminuye progresivamente con el aumento de velocidad, produciéndose distorsiones importantes en las bandas.

c)

Mantener las condiciones óptimas y modificar el volumen de inyección.

¿Qué sucede con el tiempo de análisis y la presión? No provoca cambios en ninguno de los dos parámetros.

¿Qué sucede con la resolución de los compuestos? A una carga excesiva de muestra se produce una deformación de las bandas, por lo que se provoca una pérdida de eficacia del sistema.

3. Influencia de la columna cromatográfica (longitud y diámetro de la columna, tamaño de partícula)

a) Mantener las condiciones óptimas y modificar las dimensiones de la columna. Observar caída de presión, resolución y tiempos de retención.

¿Cómo influye la longitud de la columna en la separación cromatográfica? Al aumentar mejora los picos aumentando su altura, aunque también aumenta el tiempo de retención.

¿Cómo influye el diámetro de la columna en la separación cromatográfica? El incremento del diámetro, disminuye rápida la resolución y aumenta la distorsión de las bandas.

b) Mantener las condiciones óptimas de separación, unas dimensiones de columna adecuada y modificar el tamaño de partícula. Observar las caídas de presión, la retención (k) y el ancho del pico

(W b ).

¿Qué relación existe ente el diámetro de partícula y la retención? Los tiempos de retención no varían al variar el tamaño de partícula.

¿Por qué aumenta la presión? Porque cuanto menores son las partículas de relleno mayor resistencia se opone al flujo de fase móvil, por lo que hay que trabajar con alta presión.

¿Cómo influye el tamaño de partícula en la separación cromatográfica? Para una fase estacionaria concreta, cuanto menor es el tamaño de partícula mejor es la eficacia de la separación ya que el soluto debe recorrer menores distancias para alcanzar el equilibrio.

c) Mantener las condiciones óptimas de separación, unas dimensiones de columna adecuadas y modificar los parámetros de la ecuación de van Deemter.

¿Cómo afecta a la separación cromatográfica cada uno de estos términos? La variación de A aumenta la base del pico. B afecta a σ, aumentando ésta al aumentar B. C disminuye la resolución y aumenta la distorsión

¿Cuál de los 3 ejerce mayor influencia en la resolución de los picos y por qué? El efecto más notorio es el de la variación de C, porque el soluto requiere un cierto tiempo para transferirse entre las fases móvil y estacionaria, cuando el caudal es demasiado rápido no puede alcanzarse el equilibrio.

EJERCICIOS:

Simular la separación cromatográfica de los compuestos alcohol bencílico y fenol, en un nivel de concentración 20 μM, (fijando las condiciones de trabajo que se reflejan en el texto base).

a) Indicar el tiempo de retención para cada compuesto. 181’15 segundos para fenol y 180’87 segundos para alcohol bencílico.

b) Modificar la composición de la fase móvil manteniendo el modo isocrático hasta conseguir una separación completa de los dos compuestos. Indicar la nueva fase móvil y el tiempo de retención de

cada uno de ellos. Adjuntar el cromatograma. 32% de metanol en isocrático. 906’92 segundos para fenol y 869’28 segundos para alcohol bencílico.

para fenol y 869’28 segundos para alcohol bencílico.  Utilizar acetonitrilo 95% como modificador, manteniendo

Utilizar acetonitrilo 95% como modificador, manteniendo el régimen isocrático.

a) Indicar el régimen de retención de cada compuesto. 180’28 segundos para fenol y 179’88 segundos para alcohol bencílico, cuatro veces más rápido que con el uso de metanol.

Acetonitrilo 72%

220.45 segundos para fenol y 211.26 segundos para alcohol bencílico.

para fenol y 211.26 segundos para alcohol bencílico.  Comparar los resultados de las dos separaciones

Comparar los resultados de las dos separaciones cromatográficas obtenidas. ¿Cuál de las dos elegiría para cuantificar estos dos compuestos en un laboratorio en el que se realizan un elevado

número de muestras al día? Justifique su respuesta. Se elegiría el modo isocrático con solventes Agua: Acetonitrilo al 72%, tanto por resolución como por tiempo de retención.

Modifique la velocidad de flujo en ambas separaciones (aumente y disminuya).

a) Comente las diferencias en la resolución de los picos y en los tiempos de retención, en caso

de aumento y en caso de disminución de la velocidad de flujo. Al aumentar el flujo a 4 mL/min en el modo Agua: Acetonitrilo al 72%, disminuyen considerablemente los tiempos de retención a 55.11 y 52.82 segundos para fenol y alcohol bencílico, respectivamente. No ocurre así con el metanol.

b) Aumente la velocidad de flujo hasta un valor de 4 mL/min. Encuentre una composición de

fase móvil adecuada para conseguir una separación adecuada de los analitos, empleando un modificador y otro. Con el 68% de acetonitrilo y una columna de 200 mm en un tiempo de retención para ambos compuestos poco superior a 50 segundos y con buena resolución de picos con un valor α > 1.

Simule la separación analítica de los siguientes nueve compuestos: benzonitrilo, acetofenona, nitrobenceno, p-clorofenol, 3-fenilpropanol, anisol, metilbenzoato, bromobenceno y p-xileno, todos ellos a un nivel de concentración de 10 μM. Indique todas las condiciones óptimas de separación y adjunte un cromatograma de la misma.

de concentración de 10 μM. Indique todas las condiciones óptimas de separación y adjunte un cromatograma
de concentración de 10 μM. Indique todas las condiciones óptimas de separación y adjunte un cromatograma

Modo Gradiente. Acetonitrilo (B) y Agua. 0 minutos 5% de B y 5 minutos hasta el final 95% de B. Temperatura 10º C. Volumen de inyección 10 μL. Flujo 1.0 mL/minuto. Columna 200 mm x 4’6 mm.

BIBLIOGRAFÍA:

Gallego Picó A.; Garcinuño Martínez, R.; Morcillo Ortega, M. Experimentación en Química Analítica. Uned.

2012.

Yost, R.W. Ettre, L.S. Conlon, R.D. Introducción a la Cromatografía Líquida Práctica. Perkin Elmer. 1981.

Skoog, D.A. et. al. Principios de Análisis Instrumental. 5ª Ed. MacGraw Hill. ISBN 9788448127756.