INGENIERA HONGOS METABOLISMO SECUNDARIO: HOJA DE RUTA A NUEVOS COMPUESTOS Daniel H. Scharfa, b, Axel A.

Brakhagea, b, *

RESUMEN Los productos naturales juegan un papel importante no slo en el medio ambiente, pero tambin como compuestos tiles en diversas aplicaciones como en la medicina o la proteccin de las plantas. Un enorme nmero de tales compuestos se han derivado de microorganismos que colonizan diversos hbitats. Tradicionalmente, las nuevas cepas de bacterias o los hongos han sido seleccionadas para su potencial para producir compuestos biolgicamente activos. En el post era de la genmica, sin embargo, hay un nmero creciente de nuevos mtodos basados en la ingeniera gentica a obtencin de nuevos metabolitos. En esta revisin, se resumen los progresos realizados recientemente en el desarrollo de nuevos enfoques prometedores para el descubrimiento de productos naturales de los hongos con la minera del genoma, la activacin de silenciosos grupos de genes, la expresin heterloga de genes de la biosntesis, el intercambio de mdulos de la enzima, as como rediseo de flujo metablico. INTRODUCCIN Los productos naturales son compuestos de bajo peso molecular cuya funcin biolgica se ha mantenido y optimizado durante la evolucin. Algunos de estos compuestos son de gran importancia para diversas aplicaciones en la medicina o la proteccin de las plantas. Entre los aos 1983 y 1994, se aprobaron 520 nuevos medicamentos. De estos, 40% se basaron en productos naturales. En 1999, 9 de la 20 la mayora de los medicamentos que se venden se basan en productos naturales como compuestos derivados de hongos, tales como el inmunosupresor ciclosporina, las estatinas para bajar el colesterol o los antibiticos cefalosporina (Barber et al, 2004;. Fernandes y Miska, 2002). Por lo general, los compuestos conocidos se identificaron a partir diferente fuentes microbianas cultivadas bajo condiciones de laboratorio. Sin embargo, ya que la mayora de los microorganismos en la naturaleza no se pueden cultivar en el laboratorio y, adems, sin embargo, muchos microorganismos hacer no revelar su verdadero potencial biosinttico en el laboratorio, nuevos procedimientos necesarios para establecer a descubrir nuevos compuestos de microorganismos. Hasta hoy, los mtodos clsicos tienen tenido mucho xito. Adems, sin embargo, en el post-genmica poca hay varias herramientas nuevas disponibles para descubrir o crear nuevos compuestos (Brakhage y Schroeckh, 2011). Con la ayuda de la ingeniera gentica es posible activar la biosntesis de silencio grupos de genes, para generar derivados de compuestos conocidos o crear tailor-made/artificial nuevas vas de biosntesis de anterioridad metabolitos desconocidos. Muchas de estas tcnicas han sido ya aplicado a los hongos con el fin de ampliar nuestro arsenal de frmacos. Sin embargo, Se requieren nuevas mejoras como la automatizacin para hacer estas tcnicas an ms atractivo para la industria y los programas de cribado de alto rendimiento. Estas tecnologas pueden ser espera que ayude a la generacin de numerosos compuestos nuevos en un tiempo y el costo de manera eficaz. Hay

varios excelentes crticas cubriendo los aspectos de esta rea de investigacin en hongos (Brakhage y Schroeckh de 2011, Li, 2011; Martin et al, 2010;. Snchez et al, 2012.; Schmitt et al, 2004;. Van den Berg et al, 2010;. Wallwey y Li, 2011, Yin y Keller, 2011). En la siguiente revisin, nos centramos en la evolucin reciente de la ingeniera gentica para generar novela naturales productos en los hongos. 2. LAS ESTRATEGIAS PARA OBTENER NUEVOS COMPUESTOS 2.1. La activacin de grupos de genes silenciosos Miles de productos naturales se puede esperar en espera de descubrimiento debido a que los microorganismos que sintetizan no han sido pero cultivada, o, si se cultivan, no mostr su verdadera potencial biosinttica en el laboratorio porque la biosntesis genes permanecen en silencio (Hertweck, 2009b). Hasta hoy en da, varios mtodos basados en la ingeniera gentica se han descrito para la funcin de hongos secundarios del metabolismo grupos de genes: muchos de ellos codifican un gen regulador va especfica. Por la sobreexpresin de la APDR gen del factor de transcripcin que es parte de la seleccionada grupo de genes APD silenciosa utilizando un promotor inducible, la transcripcin de todos los grupo de genes se activan y compuestos citotxicos nunca Se identificaron antes descritos para A. nidulans aspyridones nombre (Fig. 1A). Este mtodo se aplic tambin para activar una hasta ahora desconocida grupo de genes de A. nidulans inp designado. Sorprendentemente, la sobreexpresin de la transcripcin putativo SCPR gen especfico de la va del factor (Metabolismo regulador de la va transversal secundaria), no slo se activa la agrupacin de genes inp sino tambin la agrupacin de genes AFO en una diferente cromosoma que codifica los genes de la biosntesis asperfuranone (Chiang et al., 2009). Otros estudios demostraron que la transcripcin SCPR factor no slo induce a los genes de la agrupacin inp pero tambin el factor de transcripcin Afoa gen asperfuranone que posteriormente activado los genes de la biosntesis asperfuranone (Bergmann et al., 2010). Por lo tanto, un factor de transcripcin putativo va especfica es capaz de activar otro grupo de genes que permite una diafonaventre los diferentes grupos de genes. Es concebible que tal cruz hablar entre grupos de genes existe para muchos grupos de genes de hongos aadiendo otro nivel de complejidad que podran formar la base de biosntesis combinatoria. Del mismo modo, el promotor inducible por alca se utiliz para reemplazar el promotor nativo de la Afoa transcripcional gen regulador de la agrupacin de genes de la biosntesis de asperfuranone. Esto se llev a cabo en una cepa que carecen de produccin de la mayor polictido esterigmatocistina como resultado de un objetivo knock-out de el esterigmatocistina va gen stcJ. Esta supresin aparentemente hecho que la molcula de precursor de PKS malonil-CoA disponible para la produccin de una novela polyketide designado asperfuranone (Chiang et al., 2009). Estos ejemplos muestran que la sobreexpresin de la va reguladores especficos es una herramienta valiosa para activar la biosntesis de silencio grupos de genes que conducen a nuevos compuestos, a pesar de que el xito y la la especificidad de tal manipulacin gentica no se puede predecir todava.Tambin es posible manipular los reguladores de amplio dominio para influir en el metabolismo secundario. La supresin de una protena Nacetyltransferase en A. nidulans condujo a la formacin de pheofungins que representar nuevos metabolitos relacionados con feomelaninas en rojo pelo mostrando actividad citotxica (Scherlach et al., 2011). La biosntesis de pheofungins requiere la biosntesis de cidos orsellinic va. El mecanismo que subyace a la

activacin se desconoce. Es concebible que la falta de N-acetilacin de las protenas provoca estrs en el hongo y por lo tanto resulta en la produccin de pheofungins (Fig. 1B). Alternativamente, un regulador de la va podra han sido influenciados por el post-translacional modificacin desaparecidos, lo que conduce a la activacin de la biosntesis pheofungin. Este ejemplo muestra que las enzimas involucradas en la post-traduccional modificaciones de la protena representan objetivos interesantes para la ingeniera el metaboloma secundaria. Otro ejemplo destacado para un regulador de amplio dominio es Laea que exhibe una metiltransferasa putativo involucrados en la regulacin del metabolismo secundario en hongos filamentosos. La sobreexpresin del gen aumenta la Laea produccin de diversos metabolitos secundarios en varios hongos (Bok y Keller, 2004; Kale et al, 2008;. Kosalkova et al, 2009;. Sugui et al,. 2007). OIEA y la VeA factor de desarrollo regulados por la luz son ambos forman parte del complejo de terciopelo (Bayram et al., 2008), lo que sugiere, al menos en parte, un enlace entre el metabolismo secundario y el desarrollo. Hay varios otros reguladores de amplio dominio demostrado participar en la regulacin de los grupos de genes de metabolitos secundarios tales como la CCAAT CBC complejo de unin y el regulador de pH PacC que se mostraron para regular al menos la biosntesis de la penicilina en A. nidulans (Brakhage et al, 2009;. Espeso et al, 1993;.. Litzka et al, 1998). La produccin de monodictyphenone y emodina derivados fue inducida por delecin dirigida del gen CCLA, cuya producto es un componente de la brjula (complejo relacionado con Set 1) complejo de A. nidulans, que metila lisina 4 de la histona H3 y por lo tanto contribuye a la regulacin epigentica (Chiang et al., 2010). El complejo Saga / Ada, que regula muchos procesos celulares mediante la coordinacin de la acetilacin de histonas, contiene la histona GCNE acetiltransferasa y fue informado recientemente de tener un importante influir en la regulacin de la penicilina, y esterigmatocistina la biosntesis de cidos orsellinic en A. nidulans (Ntzmann et al., 2011). Otro mtodo exitoso fue reportada por brevianamide 2.2. LA EXPRESIN HETERLOGA DE GRUPOS DE GENES La expresin de grupos de genes de metabolitos secundarios en heterlogo hongos de acogida es un campo cada vez mayor y, potencialmente, pueden resolver al menos en parte el problema de la expresin de los grupos de genes en los hongos que no son susceptibles a las tcnicas genticas todava. Por otra parte, que puede contribuir a dilucidar y redisear la biosntesis vas. Un ejemplo reciente fue reportado para la produccin de monacolina K y terrequinone A en una ingeniera de Aspergillus oryzae cepa (Sakai et al., 2012). Esta cepa sobreexpresa el regulador gen Laea que dio lugar a la expresin del gen introducido racimos. A. oryzae tambin se utiliz como un husped para la reconstruccin de la ruta de biosntesis pyripyropene (Itoh et al., 2010). Este metabolito es un meroterpenoid, un producto natural hbrido de ambos terpenoides y origen polyketide. Pyripyropene es especialmente interesante como un frmaco debido a que el compuesto inhibe la acil-coenzima A: colesterol aciltransferasa. Adems, otras especies de Aspergillus se utilizaron como huspedes para la produccin de diversos compuestos. La dirigida al sitio de integracin de sistemas de A. nidulans se desarroll permite la produccin de un polictido (Hansen et al., 2012). Especficamente, se produjo la dicetopiperazina prenylated tryprostatin B en A. nidulans mediante la expresin del grupo de genes correspondiente desde A. fumigatus bajo el control del promotor inducible alcA (Maiya et al., 2009). De este modo el rendimiento de tryprostatin B fue significativamente aument a 250 mg / l. 2.3. CAMBIO DE DOMINIO DE LAS ENZIMAS MULTI-MODULARES

Hay dos clases principales de enzimas implicados mltiples modulares en el metabolismo secundario, es decir, pptido sintetasas no ribosmicas (NRPS) y polictido sintasas (PKS) (Walsh y Fischbach, 2010). Ambas clases de enzimas estn organizadas en mdulos se asemejan un kit de bloque de construccin. Esta caracterstica nica es un valioso punto de partida para la ingeniera de enzimas y la recombinacin combinatoria de tales mdulos. Hay varios ejemplos que aplican estas tcnicas para la produccin de metabolitos nuevos. Algunos de ellos se discuten aqu. Genes de PKS de tipo I consisten en mdulos, cada uno de codificacin de la enzimtica funciones (Hertweck, 2009a). Barajar o intercambio de determinadas Mdulos de PKS pueden conducir a la biosntesis de los recursos naturales "antinatural" productos. Se inform swaps de dominio para la PKS / codificacin NRPS la biosntesis de los compuestos estrechamente relacionados y tenellin desmethylbassianin (Fisch et al., 2011). Por la expresin heterloga del correspondiente gen hbrido de PKS / NRPS en A. oryzae novela No se detectaron metabolitos, que exhibe distintas caractersticas como patrn de metilacin o la longitud de la cadena que podra estar asociado con el dominio correspondiente arrastrando los pies (fig. 2A). En otro ejemplo, del dominio racional de intercambio, una PKS hbrida fue generado por cambio del A. nidulans asperfuranone ACP dominio transacilasa (SAT) con la esterigmatocistina SAT dominio del mismo organismo (Liu et al., 2011). Este cambio condujo a la formacin de un nuevo metabolito, que tenan la misma longitud de la cadena como asperfuranone (Fig. 2B). El conocimiento detallado de la reductora PKS responsable de formacin hypothemycin y la creacin de enzimas quimera distintas dado lugar a la produccin de un diasteremero no natural (Zhou et al., 2012). El principio de dominio arrastrando los pies no se limita a las PKS, es tambin aplicable a NRPS. Mediante el intercambio de dominios de los PNR involucrados en la biosntesis de surfactina en Bacillus subtilis con dominios de hongos ? - (?-L-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina sintetasa implicado en penicilina / biosntesis de cefalosporina, la formacin de la novela se observ derivados de surfactina (Stachelhaus et al., 1995). 2.4. REDISEO DE FLUJO METABLICO Diseo metablico se basa en el principio fundamental de que ingeniera el metabolismo de un organismo proporciona nuevo titular unidades para una ruta de biosntesis o redirige el flujo metablico hacia la acumulacin de ex menores o incluso desconocidos metabolitos. Hay varios ejemplos que describen la aplicacin de los mtodos relacionados para molculas importantes como ciclosporina A, lovastatina y penicilina / cefalosporina (Brakhage et al, 2009.; Manzoni y Rollini, 2002; Survase et al, 2011).. Un destacado ejemplo es la transferencia y la ingeniera de la cefalosporina ruta de biosntesis en el hongo Penicillium productor de penicilina chrysogenum (Weber et al., 2012). P. chrysogenum fue con xito diseado para producir una novela carbamoilada cefalosporina mediante la expresin de Acremonium chrysogenum expandasa / hidroxilasa y Streptomyces clavuligerus carbamoiltransferasa en una penicilina Cepa G de alta produccin (Harris et al., 2009). Varios Tambin se produjeron otros compuestos de cefalosporina relacionados. Para ejemplo P. chrysogenum que lleva un gen de expandasa bacteriana produce cido adipoil-7-aminodeacetoxycephalosporanic como la producto principal (Robin et al., 2003). Adems de esto, es un subproducto formado que parece ser deacetoxicefalosporina C. Otra posibilidad para obtener nuevos compuestos es la supresin de genes de un grupo de genes de la biosntesis. Esta inactivacin de genes podra conducir a acumulacin de intermediarios de la va. Un ejemplo exitoso de esta es la va de biosntesis de gliotoxina, un citotxico potente producto

natural que contiene azufre. Por inactivacin de los genes de el clster, se identificaron varios metabolitos nuevos (Davis et al., 2011; Forseth et al, 2011;. Scharf et al, 2011a, b).. La inactivacin de la gliG gen que codifica una glutatin-S-transferasa llevado a formacin de un precursor de dicetopiperazina dihidroxilado (Scharf et al., 2011b), mientras que la inactivacin del gen de la oxidasa GLIT gliotoxina conduce a la formacin de la reduccin de gliotoxina con grupos tiol libres (Scharf et al., 2010). Otro ejemplo para la ingeniera de va es la combinacin promiscua de la PKS RPPA de Streptomyces coelicolor, que cataliza la sntesis de varios metabolitos PKS, con la peroxidasa de soja que forma compuestos dimricos o el cloroperoxidasa del hongo Caldariomyces fumago (Jeong et al., 2005). La combinacin de estas actividades enzimticas llev a la formacin de compuestos clorados o bromados (fig. 3). La paso ms es la incorporacin parcial de este biosntesis va en un sistema de microfluidos (Ku et al., 2006). 3. Conclusiones Hoy en da, basada en la ingeniera gentica hay varios mtodos disponibles que permiten el descubrimiento de nuevos compuestos. con el ayudar a estos mtodos varios compuestos con interesantes actividades han sido ya identificados. Las aplicaciones potenciales de estos nuevas molculas estn todava bajo investigacin. Sin embargo, la mayora de estos mtodos slo se han aplicado a los hongos que son susceptibles de manipulacin gentica. Para la gran mayora de los hongos, hasta ahora no hay existe sistema de transformacin gentica, que podra ser un inconveniente para su manipulacin gentica directa. Alternativamente, heterlogo expresin de interesantes grupos de genes del metabolismo secundario en especies de hongos definidos pueden ser una opcin. Una importante tarea futura ser tambin ser la automatizacin de los mtodos de cribado y la combinacin de la manipulacin gentica con tcnicas de ingeniera de nuevos como microfluidity. En conjunto, estos enfoques ayudarn a descubrir el depsito sin explotar de los productos naturales de la naturaleza. AGRADECIMIENTOS El apoyo financiero de la escuela de posgrado excelencia financiado DFG Escuela de Jena para la Comunicacin Microbiana (JSMC) y la Internacional Escuela de Investigacin Leibniz para Microbiana y Biomolecular Interacciones como parte de la JSMC se agradece. la autores agradecen a Peter Hortschansky, Andreas Habel y Thorsten Heinekamp los comentarios crticos sobre el manuscrito.