Disciplina: Biossegurana e Bioconteno em Laboratrio

Biossegurana em Biotrios e em Biotecnologia Industrial

Profa. Nelma R. S. Bossolan (nelma@ifsc.usp.br) 11/11/2011

Programa da disciplina
O laboratrio de pesquisa e seus riscos Boas prticas laboratoriais Biossegurana em laboratrios de pesquisa e Nivelamento de Riscos Biolgicos Planejamento e adequao Fsica de reas de Risco I e II Biossegurana Geral e Biossegurana em Laboratrio de Conteno Bioproteo e Bioterrorismo Legislao e normas de biossegurana.

Biossegurana em Biotrios Biossegurana em Biotecnologia Industrial

Biossegurana em Organismos Geneticamente Modificados - OGMs
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BIOSSEGURANA EM BIOTRIOS
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Legislao brasileira para uso de animais em pesquisa e ensino - 1

Lei 11.794, de 8/10/2008 Estabelece critrios para a criao e a utilizao de animais em atividades de ensino e pesquisa cientfica, em todo o territrio nacional.

Legislao brasileira para uso de animais em pesquisa e ensino - 2

1. A utilizao de animais em atividades educacionais fica restrita a: I estabelecimentos de ensino superior; II estabelecimentos de educao profissional tcnica de nvel mdio da rea biomdica.

2. So consideradas como atividades de pesquisa cientfica todas aquelas relacionadas com cincia bsica, cincia aplicada, desenvolvimento tecnolgico, produo e controle da qualidade de drogas, medicamentos, alimentos, imunobiolgicos, instrumentos, ou quaisquer outros testados em animais, conforme definido em regulamento prprio. 3. No so consideradas como atividades de pesquisa as prticas zootcnicas relacionadas agropecuria.
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Biotrio
Instalaes capazes de produzir e manter espcies animais destinadas a servir como reagentes biolgicos em diversos tipos de ensaios controlados, para atender as necessidades dos programas de pesquisa, ensino, produo e controle de qualidade nas reas biomdicas, cincias humanas e tecnolgicas segundo a finalidade da instituio (Cardoso, 2001).
Biotrio do CTC-FMRP-USP
Biotrio da FMVZ-USP

Tipos de biotrios - 1
Biotrio de criao
Onde so produzidas e mantidas as matrizes das linhagens. Controle rigoroso da sade dos animais e esquemas especiais de acasalamento para manuteno das caractersticas genticas. Instalao em reas isoladas, distantes de centros urbanos; Normas para o transporte dos animais devem ser observadas.
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Tipos de biotrios - 2
Biotrio de experimentao
Recebem animais do biotrio de criao ou de produo*. Os animais ficaro alojados durante um determinado perodo experimental. Construo deve ser prxima do laboratrio de pesquisa. Instalao de barreiras sanitrias de proteo, tanto para o trabalhador quanto para o meio ambiente.
* Onde se criam grandes quantidades de animais para tender s pesquisas.
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RISCOS PROVENIENTES DO MANEJO DE ANIMAIS

Animais podem excretar microrganismos nas fezes, urina, saliva ou aeroliz-los. Inoculao de patgenos por mordeduras ou arranhaduras. Transmisso direta do patgeno, por contato com o animal, seu sangue ou tecidos coletados em necrpsias e autpsias. Transmisso indireta, por inalao de poeira originada das gaiolas e camas dos animais. Alergia a animais de laboratrio: doena ocupacional. Reao de hipersensibilidade do tipo imediato, pelo contato com a pelagem, urina, soro ou qualquer outro tipo de tecido animal.
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Zoonoses comumente associadas a animais de laboratrio

*Zoonoses so infeces ou infestaes provocadas por agentes patognicos transmitidos aos seres humanos por animais vertebrados ou seus tecidos, sendo consideradas doenas de carter ocupacional 10 em pessoas que trabalham em biotrios.

Padronizao dos animais

criao e manuteno de linhagens outbred (heterozigotas para muitos pares de alelos e mantidas em sistemas de cruzamento randmico) e

Gentica

inbred (linhagens homozigotas para quase todos os pares de alelos, mantidas por sistemas de acasalamento entre irmos por mais de 20 geraes). mutantes e animais geneticamente modificados. A nutrio adequada d condies ao animal de atingir seu potencial: gentico, de crescimento, reprodutivo, longevidade e resposta estmulos.
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Nutricional

Padronizao dos animais

Gnotobiticos Possuem uma microbiota associada conhecida. Germ Free Animais totalmente isentos de germes.

Sanitria

Specific Patogen Free (SPF) Animais isentos de Agentes Patognicos Especficos. Animais Convencionais Animais que possuem microbiota indefinida criados sem barreiras sanitrias.

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Modelos animais em pesquisa*

Camundongo (Roedor da Fam. Muridae, Mus domesticus domesticus).
Usados na produo de anticorpo e em testes de vacinas recombinantes.

Rato (Roedor da Fam. Muridae, Rattus rattus, linhagem Wistar rato branco).
Vrios usos.

Hamster (Roedor da Fam. Cricetidae, Mesocricetus auratus).

Mais usados pelo Laboratrio de Parasitologia.
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* Mais utilizados no Instituto Butantan (SP).

Modelos animais em pesquisa*

Coelho (Fam. Leporidae, Oryctolagus cuniculus, raa Branco Nova Zelndia).
Usados para testes de pirognio dos imunobiolgicos.

Cobaia (ou porquinho da ndia, roedor da Fam. Cavidae, Cavia porcellus).

Utilizados nos testes de controle de qualidade de praticamente todas as vacinas e soros.
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* Mais utilizados no Instituto Butantan (SP)

Instalaes e equipamentos
Planejados para manter a segurana de usurios, animais e meio ambiente. Salas ou reas especficas para animais, lavagem e preparo de materiais. Depsitos. Administrao. Vestirios. Laboratrios.

Climatizao (temperatura, umidade e ventilao adequadas) Renovao total de ar em torno de 15-20 trocas de ar/hora. Gradiente de presso no interior das salas de animais menor do que o das reas contguas (presso maior nas reas limpas e estreis).
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Gaiola para condicionamento de animais em biotrios.

Biotrio de corredor nico (Fonte: Cardoso, 2001).

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Estante ventilada (ar duplamente filtrado entrada e sada, temperatura e umidade controlada).

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Iluminao natural

Janela protegida por tela

Equipamento de proteo individual: luvas, jaleco e mscara

Pronturio do animal
(espcie, data de entrada, projeto de

pesquisa a que est ligado, nmero do CQB se for OGM) 18

Acidentes que geralmente ocorrem em biotrios

Ferimentos causados por animais (arranho, mordedura, etc). A conteno do animal efetuada de maneira adequada evita este tipo de acidente. Cortes causados pelas gaiolas, tampas ou outro material; Quedas causadas por pisos escorregadios ou degraus; Tores causadas por objetos pesados, levantados incorretamente; Ferimentos nos olhos e pele, quando da utilizao incorreta de agentes qumicos.
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Lembrando que...
...Segurana biolgica tem um objetivo duplo:
Reduzir a exposio de pessoas que manipulam as mais variadas formas de agentes biolgicos. Prevenir a sada desses agentes biolgicos e/ou animais de dentro dos sistemas de conteno utilizados como barreiras de segurana.
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Nveis de Biossegurana para o trabalho com animais vertebrados (NBA)

Mantm equivalncia aos nveis de segurana de trabalho em laboratrio (NBs 1, 2, 3 e 4). NBA 1, NBA 2, NBA 3 e NBA 4

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Biossegurana animal nvel 1

Prticas e tcnicas (1) Baixo risco individual e Manejo padro comunitrio. para colnias convencionais Nvel de biossegurana
Envolve agentes infecciosos bem caracterizados que comprovadamente no causam riscos de doenas em humanos adultos saudveis e possuem riscos mnimos para tcnicos de laboratrio e para o meio ambiente.

Equipamentos de segurana Instalaes Aventais e uniformes no Bsicas devem ser usados fora das instalaes de animais.

* Adaptado de Katia T. dos Reis - Biossegurana em Biotrios de Criao e Experimentao Animal 22

Biossegurana animal nvel 2

Quando se manipulam animais infectados com microrganismos da classe 2.

Nvel de biossegurana (2) Moderado risco individual e comunitrio podendo causar patologias ao homem ou ao animal.
Envolve agentes infecciosos bem caracterizados que ocasionam riscos de doenas em humanos adultos.

Equipamentos de segurana Uso obrigatrio de Barreira parcial jaleco e luvas, (guich de descontaminao dos desinfeco), dejetos infectados e uso de EPIs das gaiolas dos (mscara, animais antes da culos protetor, higienizao, acesso etc.) para a limitado e sinalizao manipulao de para alerta de riscos. agentes ou animais infectados que produzem aerossis. Prticas e tcnicas

Instalaes Acesso limitado por portas com travamento de segurana, entre outras.

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Biossegurana animal nvel 3

Quando se manipulam animais infectados com microrganismos da classe 3.

Nvel de biossegurana Prticas e tcnicas (3) Risco individual elevado, risco comunitrio baixo.
Envolve procedimentos para trabalhar com animais infectados por microrganismos que apresentam potencial de transmisso aergena e podem causar doenas potencialmente letais.

Equipamentos Instalaes de segurana Os do nvel 2, porm, devem Alta ser usados para segurana todos os tipos de manipulaes com animais infectados.

Prticas do nvel 2, mais: uniforme especial e acesso controlado.

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Biossegurana animal nvel 4

Quando se manipulam animais infectados com microrganismos da classe 4.

Nvel de biossegurana

Prticas e tcnicas

Equipamentos de Instalaes segurana Barreiras mximas, isto , classe III de Segurana segurana biolgica mxima ou barreira parcial em combinao com: proteo total do corpo com uma pea nica dotada de ventilao e presso positiva, gaiolas dotadas de filtros, estantes com fluxo laminar, etc
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(4) Elevado risco Prticas do nvel 3, individual e comunitrio. mais: troca de roupa de rua por uniforme Envolve procedimentos especial em para trabalhar com vestirio, ducha na animais infectados por sada, microrganismos que descontaminao de apresentam alto risco todos os dejetos de ocasionar doenas antes de sua letais, causar retirada do transmisso por infectrio. aerossis ou
relacionadas com agentes de risco de transmisso desconhecido.

Descarte de materiais
Papel, plstico, fichas de identificao: compactados e incinerados. Cama suja, incluindo material fecal e restos de rao: acondicionar em sacos plsticos, que devero ser etiquetados, vedados e incinerados. Carcaa de animais: incinerao aps maceramento in situ. Objetos cortantes: ensacados, etiquetados com o sinal de risco biolgico, autoclavados ou incinerados. Material infeccioso: acondicionado duplamente em saco plstico, etiquetado com sinal de risco biolgico, incinerado imediatamente ou autoclavado at o momento da incinerao.

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BIOSSEGURANA EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

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Processos biotecnolgicos
Produo de po, vinho, cerveja, alimentos com microrganismos vivos (iogurte, queijos). Produo de vitaminas, antibiticos, enzimas, plantas hbridas, aminocidos, anticorpos monoclonais, insulina.

Riscos associados
Gerao de compostos que causam riscos:
Matria-prima (meios, p.e.) Os prprios microrganismos Produto final bruto e/ou subprodutos Resduos Produto final purificado
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Esquema genrico de um processo biotecnolgico

- Centrifugao. - Rompimento celular. - Extrao lquido-lquido. - Filtrao. - Cromatografia.

- Preparo do meios de cultivo. - Inculo - Fermentao

Quando ocorre a maioria dos problemas de sade!

Para cada uma das etapas, existem normas de biossegurana especficas a serem seguidas! 29

OGMs e a indstria biotecnolgica

Dcada de 1980: 1as instalaes para cultivo de microrganismos recombinantes em larga escala. Produo de anticorpos monoclonais, de protenas de E. coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisae, Clostridium acetobutylicum e de clulas animais.

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OGMs e a indstria biotecnolgica

Organismos recombinantes de baixo nvel de risco so empregados em processos industriais:
E. coli derivada da cepa K-12: bem caracterizadas, atenuadas, no patognicas e aprovadas pela FDA.
Produo de insulina e hormnio de crescimento humano.

Cepas especficas de levedura: insulina humana e vacinas contra hepatite. Clulas do ovrio de hamster chins: obteno de ativador de plasminognio e eritropoetina.
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Processos em larga escala com OGMs

Trabalhos de pesquisa e processos biotecnolgicos cujos cultivos utilizem volumes superiores a 10 litros ou para concentrados celulares com mais de 1 Kg.

4 nveis de classificao dos cultivos de OGM em larga escala, em funo do grau de risco* aos trabalhadores e meio ambiente: Boas prticas de ampliao de escala (BPAE). Nvel de Biossegurana 1 Escala Ampliada (NS1-EA). Nvel de Biossegurana 2 Escala Ampliada (NS2-EA). Nvel de Biossegurana 3 Escala Ampliada (NS3-EA).
* Risco causado pelo organismo utilizado no processo e no pelos seus produtos.
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Boas prticas de ampliao de escala (BPAE)

Recomendado para trabalhos com organismos que no so conhecidos por causar doenas em adultos saudveis, no-toxignicos, bem caracterizados e/ou com uma longa histria de trabalho em grande escala. Estes organismos no devem ser capazes de transferir resistncia aos antibiticos para outros organismos. Exemplos: Saccharomyces cerevisiae, E. coli K12 Cuidados: manusear os OGMs com equipamentos que garantam a segurana pessoal (p.e.,EPIs).
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Nvel de Biossegurana 1 Escala Ampliada (NS1-EA). Recomendado para cultivos que usem organismos que no so conhecidos por causar doenas em seres humanos adultos saudveis e possuem um risco mnimo pessoal e para o ambiente. Meios de cultura no devem ser removidos do sistema fechado sem que os organismos viveis com DNA recombinante tenham sido inativados.
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Nvel de Biossegurana 2 Escala Ampliada (NS2-EA)

Nvel de Biossegurana 3 Escala Ampliada (NS3-EA)

Recomendado para o cultivo de organismos infecciosos que seriam tratados na NB-2 em escala de laboratrio.

Recomendado para o cultivo de organismos infecciosos que seriam tratados na NB-3 em escala de laboratrio. Sistemas fechados devem estar alocados em uma rea controlada
Entrada com porta dupla; Equipamento de lavagem de mos operados automaticamente com ps ou cotovelos; Com acesso restrito s pessoas; Com troca de roupas por EPIs; Descontaminao dos EPIs e encaminhamento para lavagem.

Sistemas fechados devem ter sensores

que monitorem a integridade do sistema; Que tenham sua integridade testada antes do incio de qualquer operao.

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Biossegurana na indstria de imunobiolgicos (soros e vacinas)

Nveis de segurana variam de acordo com a natureza do processo:
Produo de soros. Produo de vacinas em ovos embrionados: material viral em embries de galinhas no interior de ovos SPF. Ex. vacina contra a gripe. Biossegurana depende do quo perigoso o vrus. Produo de vacinas em fetos de roedores: vacinas anti-rbicas, vrus extremamente perigoso. Produo de vacinas em culturas de clulas: vrus inoculado em culturas de clulas de rim de hamster, p.e. Produo de vacinas de DNA: obtidas em meios de cultura de clulas modificadas ou no, cujos fragmentos atuam como antgeno. Exemplo: vacina contra a hepatite B. A vacina produzida inserindose mltiplas cpias do gene que codifica a protena HBsAg (partcula imunognica) do vrus da Hepatite B no cromossomo de uma levedura.
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ATIVIDADE

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Estudo de caso
O surto de febre Q
INTRODUO A descrio do evento que se segue ocorreu em um centro mdico, que tinha laboratrios de pesquisa em suas instalaes. A pesquisa ali realizada inclua estudos sobre doenas cardacas em recm-nascidos, os efeitos dos hormnios no desenvolvimento fetal, e os mecanismos envolvidos no desenvolvimento de edema pulmonar. As pesquisas faziam uso de aproximadamente 600 animais de grande porte por ano, com at 40 animais sendo mantidos simultaneamente no biotrio. Dentre a populao de animais estudada, tambm haviam fmeas grvidas. O laboratrio de pesquisa (ver figura abaixo) estava instalado no 14 andar do Edifcio A, que ficava localizado em posio central no centro mdico. Os animais utilizados na pesquisa eram recebidos no Edifcio B e transportados atravs do corredor do 5 andar do Edifcio C, em direo aos elevadores localizados no edifcio D. Os elevadores foram usados para transportar os animais para o 14 andar. O ar circulante no edifcio C entrava via compartimento localizado no anexo E. Estudo de caso baseado no material disponvel no site da Asia Pacific Biosafety Training Network (http://www.apbtn.org/apbtn/trainingMaterials.html).
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Estudo de caso
O CASO No final de maro de 1979, o centro mdico foi informado que um funcionrio (homem de 74 anos) que trabalhava na manuteno dos elevadores tinha morrido de embolia pulmonar decorrente de um processo infeccioso. Os sintomas da infeco haviam iniciado cerca de duas semanas antes, quando o paciente procurou atendimento mdico. Cinco dias depois deste atendimento o paciente deu entrada no hospital, com queixa de dor torcica aguda. Aps a obteno do diagnstico sorolgico para este caso, amostras de outros quatro funcionrios que haviam ficado doentes nos ltimos seis meses foram testadas para anticorpos para o agente etiolgico do caso fatal. Todos os quatro apresentaram sorologia positiva para o agente. Dos cinco funcionrios que trabalhavam na instituio, apenas um trabalhava diretamente com os animais utilizados no laboratrio. Por conta deste cinco casos, solicitou-se a coleta e anlise de soros dos 690 funcionrios do centro mdico. A anlise identificou 14 casos clnicos confirmados; 69 casos clnicos presuntivos, 6 como soroconverses sem a doena clnica, e 50 pessoas com sorologia positiva, mas sem sintomas clnicos. No total dos casos (incluindo os cinco casos iniciais), concluiu-se que 88 pessoas estiveram envolvidas em um surto de uma doena infecciosa que foi marcada pela morte do fincionrio da manuteno do elevador.

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Estudo de caso
Dois eventos merecem ser destacados: 1. Cerca de um ano antes do surto, um laboratrio que no estava relacionado com os projetos de pesquisa em andamento foi montado no 5 andar do Edifcio C. O laboratrio ficava ao lado do corredor utilizado para o transporte dos animais de pesquisa da rea de recepo para os elevadores. Os animais foram transportados em carrinhos descobertos. Testes sorolgicos dos trabalhadores deste laboratrio mostraram que durante o surto, 6 de 13 funcionrios foram infectados com o agente etiolgico, sendo necessrio a internao de 1 deles. 2. A lavanderia da instituio est localizada em um prdio separado fisicamente do prdio central. No entanto, o exame dos trabalhadores de lavanderia revelou que cinco tiveram sintomas da infeco e um deles com sorologia positiva; outros quatro funcionrios tinham apenas a sorologia positiva (sem sintomas).

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Estudo de caso
INFORMAES ADICIONAIS Coxiella burnetii o etiolgico da febre Q, que uma zoonose de caprinos, ovinos e gado. Estes so reservatrios primrios da doena, mas vrios outros animais tambm podem ser contaminados, inclusive os domsticos. Qualquer um destes animais pode servir como a principal fonte de infeco para os seres humanos. C. burnetii muito resistente e pode sobreviver por longos perodos no ambiente, disseminando-se pela poeira contaminada. Infeces humanas ocorrem normalmente pela inalao da bactria, presente no ar, ou contato com fluidos e excretas de animais infectados, como sangue, leite e fezes. O agente tambm transmitido do animal infectado para a sua prole recm-nascida, estando presente nas membranas fetais e lquido amnitico. Alm disso, os animais em um rebanho infectado pode transportar o organismo em sua l ou plos.

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Estudo de caso
PERGUNTAS 1. Qual a provvel fonte do agente infeccioso? 2. Qual o mecanismo provvel de exposio? 3. Que outros meios de exposio podem ter resultado em infeco? 4. Que medidas de segurana (prticas, equipamentos e instalaes) poderiam ter reduzido ou impedido as infeces associadas ao laboratrio? Considere os nveis de biossegurana recomendados para a manipulao de C. burnetti e de animais de pesquisa infectados por esta bactria.

Esta atividade dever ser realizada em grupo (de 3 alunos cada) e dever ser enviada para o e-mail da Profa. Nelma (nelma@ifsc.usp.br), at 02/12/2011.

Aviso: Os slides das aulas estaro disponveis no site www.ifsc.usp.br/~ilanacamargo

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Bibliografia
Cardoso, T.A.O. Consideraes sobre a biossegurana em arquitetura de biotrios. Bol. Centr. Panam. Fiebre Aftosa, 64-67: 3-17, 1998-2001. Neves, S.M.P.; Chaguri, L.C.A.G. Biossegurana em Biotrios. In: Hirata, M.H.; Mancini Filho, J. Manual de Biossegurana. Editora Manole Ltda, 2002. p.349-379. Pessoa Jr., A.; Polakiewicz, B.; Abraho Neto, J. Biossegurana em Biotecnologia Industrial. In: Hirata, M.H.; Mancini Filho, J. Manual de Biossegurana. Editora Manole Ltda, 2002. p.382-414. Politi, F.A.S.; Pietro, R.C.L.R.; Salgado, H.R.N. Caracterizao de biotrios, legislao e padres de biossegurana. Rev. Cinc. Farm. Bsica Apl., v. 29, n.1, p. 17-28, 2008. Reis, K. T. Biossegurana em Biotrios de Criao e Experimentao Animal. Biotrio de Experimentao Animal do CPqRR, FIOCRUZ. (http://www.cpqrr.fiocruz.br/posgraduacao/cienciasdasaude/apoio/Biosseguranca/03%2 0%20Biosseguranca%20em%20Bioterios%20de%20Criacao%20e%20Experimentacao% 20Animal.doc) Sarmento, E.O. Biossegurana e Experimentao Animal. Revista CFMV - Braslia/DF Ano XI - N 36 Setembro/Outubro/Novembro/Dezembrode 2005. Instituto Butantan: www.butantan.gov.br Fundao Oswaldo Cruz: www.fiocruz.br
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