PRIMEIRO RELATRIO DE LABORATRIO DE BIOQUMICA E METABOLISMO DE PLANTAS

ERICO CASTRO, GIANDR TORREZAN, HILTON MORBECK E PATRCIA

2002

NDICE
INTRODUO.............................................................................3 REFERENCIAL TERICO.............................................................4 Colorimetria e Espectrofotometria...............................4 Protenas e Aminocidos..............................................5 Carboidratos.................................................................7 Mtodos de Quantificao de Aminocidos.................9 Mtodos de Quantificao de Protenas......................11 Consideraes sobre os mtodos.....................13 Mtodos de Quantificao de AR...............................14 Mtodos de Quantificao de AST.............................15 MATERIAL E MTODOS...........................................................17 Determinao de AA pelo Mtodo da Ninidrina:.......17 Determinao de Protena Mtodo de Bradford..........18 Determinao de AR pelo Mtodo do DNS...............20 Determinao de AST pelo Mtodo da Antrona.........21 Anlise.........................................................................22 RESULTADOS E DISCUSSO......................................................23 Grficos curva padro de AA (A570 m)...................24 Grficos curva padro de Protenas. (A595 m).........25 Grficos curva padro de AR (A540 m)...................26 Grficos curva padro de AST (A620 m).................27 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS...............................................28 QUESTIONRIO...................................................................29

INTRODUO
As plantas geralmente produzem uma grande variedade de compostos orgnicos que exercem funes vitais em seu organismo. Alm desses compostos, outros so formados atravs do direcionamento de uma pequena parte da matria seca total produzida pela planta, durante o processo fotossinttico. Os tecidos vegetais possuem diversas substncias que so classificadas em dois grupos: as macromolculas (protenas, cidos nuclicos, polissacardeos e lipdeos) e as micromolculas (aminocidos, nucleotdeos e oligossacardeos). Para identificar ou quantificar essas substncias so usados mtodos baseados em reaes qumicas, nas quais o reagente interage com a estrutura da substncia a ser quantificada. A quantificao pode ser realizada por vrios mtodos, porm os mais utilizados so a colorimetria e a espectrofotometria, que so tcnicas cuja concentrao determinada pela quantidade de luz absorvida pelo meio de reao. A determinao da concentrao de uma dada substncia em um tecido vegetal atravs desses mtodos necessita da comparao com uma concentrao j conhecida. Para isso, o mesmo mtodo que quantifica a substncia do tecido aplicado a uma variao de concentraes gradativas conhecidas, cujos resultados so denominados de curva padro.

REFERENCIAL TERICO

COLORIMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA: As solues de alguns compostos qumicos so coloridas porque absorvem mais certos comprimentos de onda da radiao do visvel, enquanto outros so transmitidos ou refletidos. Medies de absoro de luz so usadas para detectar e identificar molculas e determinar sua concentrao na soluo. Existem dois mtodos de anlise por absoro de luz: a colorimetria e a espectrofotometria. A anlise colorimtrica consiste na variao de cor de um sistema pela modificao da concentrao de um certo componente. A cor pode ser provocada pela formao de um composto corado, resultante da adio de um reagente apropriado, ou pode ser intrnseca ao constituinte analisado. A intensidade da cor pode ser comparada com a que se obtm pelo tratamento idntico de uma quantidade conhecida da substncia (Jeffery, 1992). Esta comparao feita pela medida da absoro relativa da luz entre uma concentrao conhecida da substncia e aquela que se quer analisar. Na colorimetria visual usa-se, em geral, como fonte de luz, uma fonte natural ou artificial de luz branca. As determinaes so feitas num instrumento simples, denominado colormetro, ou comparador de cores. Quando a vista for substituda por uma clula fotoeltrica, o instrumento um colormetro fotoeltrico. Em anlises espectrofotomtricas a fonte de radiao emitida atinge at a regio ultravioleta do espectro. Desta radiao selecionam-se comprimentos de onda definidos que constituem

bandas, com largura menor que 1nm. Este procedimento necessita de um instrumento mais complexo, o espectrofotmetro, cujas anlises tambm, so por variao de cor. A principal vantagem dos mtodos colorimtricos e espectrofotomtricos a de proporcionarem um meio simples para determinar quantidades diminutas de substncias. A dependncia da absoro de luz, em funo da variao de concentrao da substncia colorida constitui a base para os mtodos de dosagem colorimtricos. Esta dependncia expressa quantitativamente pela equao de Lambert-Beer. Na espectrofotometria, a frao de luz absorvida por uma soluo est relacionada com o comprimento de onda da espessura da camada em absoro, ou seja, no espao que a luz tem que percorrer dentro da soluo e da concentrao das substncias em absoro. Essas duas relaes correspondem Lei de Lambert-Beer, que tem a seguinte frmula: Log I0/I = cl onde I0 a intensidade da luz incidente, I, a intensidade de transmisso de luz, , o coeficiente de extenso molar (unidade de litros por mol-centmetro), c, a concentrao da substncia em absoro (em moles/L) e l, o percurso da onda dentro da amostra em absoro. Essa lei assume que a incidncia da luz paralela e monocromtica (um simples comprimento de onda) e que as molculas de solvente e soluto esto orientadas aleatoriamente. A expresso log I0/I chamada absorbncia (A) (Nelson & Cox, 2000). PROTENAS E AMINOCIDOS

As protenas so os componentes bsicos mais importantes de toda clula viva, apresentando uma variedade de funes biolgicas. So polmeros desidratados de aminocidos sintetizados biologicamente, constitudos, na maioria, por um grupo de vinte aminocidos, covalentemente ligados linearmente (Nelson & Cox, 2000). Os aminocidos comuns variam quimicamente, mas todos apresentam um grupamento cido carboxlico e um grupamento amino ambos ligados a um simples tomo de carbono (carbono ). Eles servem como subunidades na sntese de protenas, as quais so longos polmeros lineares de aminocidos unidos cabea a cauda por ligaes peptdicas entre o grupo caboxlico de um e o grupo amino do outro. Neste carbono esto ligadas as cadeias laterais, as quais proporcionam as diferenas entre um aminocido e outro. Todos os aminocidos, com exceo da glicina, apresentam ligados a seu carbono grupamentos distintos. As cadeias laterais ou grupamentos R diferem em estrutura, tamanho e carga eltrica, portanto, lhes conferem caractersticas diferentes influenciando em sua solubilidade na gua e reatividade qumica. Essas caractersticas tambm conferem propriedades diferentes molcula protica que integram. Podem ser agrupados em aminocidos bsicos, cidos ou neutros (Nelson & Cox, 2000). Alm dos vinte aminocidos padres, existem alguns formados a partir de modificaes deles, os quais podem fazer parte de estruturas celulares como a parede celular ou alguns tipos de tecido, exemplos: 4-hidroxiprolina, derivado da prolina e 5-hidroxiglicina, derivado da glicina (Nelson & Cox, 2000).

Os aminocidos so molculas anfteras, isso quer dizer que eles podem agir como tampes em solues, porm cada aminocido difere em sua propriedade cido-base, possuindo pK 1 ( COOH), pK2 ( NH3+) e pKR (grupo R) distintos (Nelson & Cox, 2000). A unio de aminocidos forma os polipeptdeos com peso molecular abaixo de 10.000 daltons e as protenas. Esta unio ocorre por desidratao, formando a ligao peptdica entre o grupo amino de um aminocido e o grupo carboxil de outro. A ionizao de polipeptdeos depende de seus grupos -amino e -carboxil livre em cada extremidade e do nmero de seus grupos R ionizveis. As protenas so formadas por uma ou mais cadeias polipeptdicas e podem adquirir conformaes diferentes proporcionadas por interaes (pontes de hidrognio, ligaes dissulfdicas, entre outros), formando as estruturas secundria e terciria. Quando a conformao ocorre entre duas ou mais cadeias polipeptdicas forma-se a estrutura quaternria. A estrutura primria apenas a unio dos aminocidos pelas ligaes peptdicas. Assim como os aminocidos, os peptdeos e as protenas possuem caractersticas anfteras. CARBOIDRATOS Os carboidratos ou sacardeos so molculas biolgicas mais abundantes. Eles so quimicamente mais simples do que os nucleotdeos e os aminocidos, contendo apenas trs elementos (carbono, hidrognio e oxignio; possuindo em sua molcula um grupo cetona ou um grupo aldedo) combinados de acordo com a formula (CH2 O)n em que n 3. as unidades bsicas de um

carboidrato so denominadas monossacardeos. Existem muitos tipos diferentes de monossacardeos, o quais, diferem no numero de tomos de carbono e na organizao dos tomos de H e O ligados a esses carbonos. Alem disso, os monossacardeos podem ser enfileirados de infinitas maneiras para formar polissacardeo. At 1960, acreditava-se que os carboidratos desempenavam apenas funes passivas como fontes de energia e como materiais estruturais. Os carboidratos no catalisam reaes qumicas complexas nem se replicam como os cidos nuclicos. Devido ao fato de os polissacardeos no serem construdos de acordo com um molde gentico como as protenas e os cidos nuclicos, eles tendem a ser muito mais heterogneos (tanto em tamanho quanto em composio) do que as outras molculas biolgicas. Entretanto, tornou-se claro que a variao estrutural inata dos carboidratos fundamental para a sua atividade biolgica. As organizaes aparentemente casuais dos carboidratos nas protenas e na superfcie das clulas so a chave para muitos eventos de reconhecimento entre as protenas e entre as clulas (Voet, Voet e Pratt, 2000). As ligaes entre monossacardeos so denominadas ligaes glicosdicas, e ocorrem entre o grupo hidroxil de um e o carbono anomrico de outro com a liberao de uma molcula de gua. Na produo de energia so utilizados os acares redutores (por exemplo: glicose e frutose). Esses acares so capazes de reagir como agentes redutores, devido presena em sua molcula de grupos aldedo ou cetona livres, cujas propriedades redutoras podem ser comprovadas pela sua capacidade de reduzir diversos ons metlicos, como on ferro (Fe3+) ou on cobre (Cu2+), onde o grupo carbonil oxidado a grupo carboxil.

Essa propriedade a base para mtodos quantitativos (Reao de Fehling). A medida do reagente oxidante reduzido por uma soluo de acar pode estimar a concentrao deste. Os acares redutores podem unir-se e formar dissacardeos como a sacarose e vice-versa. Quando o carbono anomrico participa de uma ligao, o acar no pode reduzir ons, ento se a ligao entre dois monossacardeos envolve os carbonos anomricos de cada um, o dissacardeo produzido no redutor (Sacarose). Por isso, a sacarose o acar de transporte da planta. So denominados acares solveis totais aqueles que so solveis em gua. Esses acares representam a reserva de energia prontamente disponvel para crescimento. Os acares solveis totais so representados por glicose e frutose (ac. Redutores) e sacarose (ac. No redutor).

Mtodos de quantificao de aminocidos

de fundamental importncia a realizao de anlise quantitativa de aminocidos para a determinao da estrutura das protenas e dos complexos peptdicos similares, que so elementares para a determinao qumica de amostras de molculas orgnicas (Spackamn, Stein e Moore, 1958). Nesta atividade o grupo quantificar do aminocidos pelo mtodo da Ninhidrina (Hidrato de tricetohidrindeno): A ninhidrina (Figura 1) ocasiona a reao de desaminao oxidativa dos aminocidos, produzindo amnia (NH3) e a reduo da ninhidrina a hidrindantina. Esta reage com a amnia liberada, formando um complexo azul, com absoro mxima em luz de comprimento de onda de 570 nm. A intensidade da cor azul produzida

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em condies padronizadas serve de base para um teste quantitativo para aminocidos, podendo detectar at 1g de aminocido. Outras aminas alm dos aminocidos, tambm reagem com a ninhidrina, formando uma cor azul, mas sem ocorrer liberao de CO2, a qual indicativa de um aminocido. A amnia (NH3) e peptdeos tambm reagem, porm, mais lentamente que os -aminocidos. A prolina e a 4-hidroxiprolina produzem um complexo de cor amarela quando reagem com a ninidrina.

Figura 1. Molcula de Ninidrina

Pode-se tambm utilizar-se de outros mtodos, como o mtodo da fluorescamina. A fluorescamina um reagente mais sensvel que a ninhidrina, sendo capaz de detectar nanogramas de aminocidos. Semelhante a ninhidrina, a fluorescamina forma um complexo com outras aminas que no aminocidos (Murray, 1994). Entretanto existem outros mtodos utilizados (menos comuns) para determinao de aminocidos: Reao de Pauly: O cido sulfnico reage com o aminocido histidina produzindo um composto de colorao vermelha; Reao de Sakuguchi: O -naftil e Hipoclorito de Sdio reagem com a arginina, produzindo um composto avermelhado; Reao de Folin-Ciocalteau e Millon: Especfica para o aminocido tirosina; Reao de Holkins-Call: Especfica para o aminocido triptofano;

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Reao do Nitroprusiato: Especfica para o aminocido cistena (Oliveira, 1992).

Mtodos de quantificao de protenas

Atualmente existem em utilizao vrias tcnicas

colorimtricas para analisar protenas, entretanto nenhuma totalmente satisfatria. Ao se fazer a determinao protica de uma substncia preciso levar em conta sua constituio, a natureza dos outros componentes da amostra, como tambm no tempo e preciso desejados e na sensibilidade do mtodo de anlise. Dentre os mtodos desenvolvidos para a quantificao de protenas, temos:

Mtodo do biureto:
Peptdeos reagem com o biureto em soluo alcalina e em presena de soluo de sulfato de cobre diluda, formando um composto de cor prpura-violeta. A cor deve-se ligao do tomo de Cu a quatro tomos de N das cadeias peptdicas. Este mtodo simples para a quantificao da protena total, mas requer de 20 a 40 mg de protenas.

Mtodo de Kjeldhal (1880):

Consiste na queima total do material orgnico das amostras pela adio de cidos oxidantes fortes, sob temperaturas relativamente elevadas. Aps completa transformao dos compostos nitrogenados em sais de amnio, a mistura fortemente alcalinizada com NaOH, sendo a amnia recolhida com um volume conhecido de cido brico

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(NH4H2BO3) e titulada com cido clordrico (HCl). A quantidade calculada de nitrognio encontrada por essa titulao multiplicada por um fator mdio de 6,25 para fornecer a quantidade de protena total presente na amostra.

Mtodo turbidimtrico:
Baseia-se na precipitao de protenas em presena de um cido. o mais rpido, levando em torno de 10-15 minutos. Porm nem todas as protenas precipitam da mesma forma em presena de cidos e substncias como cidos nuclicos tambm podem precipitar.

Mtodo de Folin Ciocalteau (1969):

Este mtodo uma modificao do mtodo de biureto, onde o cobre em meio alcalino reage com a protena formando um complexo (reao de Piotrowsky ou biureto). Este complexo apresenta aminocidos fenlicos que reduz o reagente de Folin-Ciocalteau, dando uma cor azul. A intensidade da cor mxima em pH 10 e medida espectrofotomtricamente a 660 nm, aps 30-120 minutos. Trata-se de um mtodo muito sensvel, podendo analisar amostras de 5 g de protenas, mas a amostra no pode ter a presena de fenis.

Mtodo de Lowry (1951):

Este mtodo utiliza o soro humano diludo entre 100 a 1000 vezes, como padro. Em baixas concentraes a leitura efetuada a 750 nm. Sua utilizao sugerida como forma de eliminar fontes de erro pela desnaturao superficial que ocorre com o BSA.

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Mtodo de Bradford (1976):

O mtodo baseado na ligao da protena ao corante. O corante utilizado o Coomassie Brilliant Blue G-250, onde este reagente existe em duas formas coloridas diferentes, vermelha e azul. A forma vermelha do reagente convertida em azul aps a ligao do corante com a protena, esta colorao ocorre em dois minutos aps o reagente ser adicionado e estvel por at uma hora (Bradford, 1976). Consideraes sobre os mtodos
- O Biureto

cerca de 100 vezes menos sensvel do que o Lowry;

- O Lowry mais dependente no tipo de protena utilizada no padro; - Ambos os mtodos esto sujeitos interferncia por diversas substncias, causando variao entre determinaes; - ons amoniacais causam interferncia na reao do biureto e o NaOH pode no neutralizar todo o sulfato de amnio; - Para diferentes protenas, a intensidade de cor do biureto no diretamente proporcional ao incremento de colorao causado pelo cobre na reao com o reagente de Folin. Com o Folin, uma quantidade muito pequena de cobre suficiente para proporcionar quase que a colorao final, enquanto, no biureto as constantes de dissociao da reao cobre + protena cobre protena so em geral, dez vezes maiores do que na reao do Folin; - Eze & Dumbroff (1982) compararam os mtodos de Bradford e Lowry. Verificaram que a adio de clorofila aos padres proticos comprometeu a preciso de ambas as tcnicas, causando aumentos de 20% (Bradford) e de 400% (Lowry). A precipitao de protenas com

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TCA eliminou a interferncia da clorofila. Melhor resultado foi obtido tratando o tecido com acetona, antes da extrao com TCA; - Uma vez removida a interferncia, ambos os mtodos so confiveis. O Bradford mais rpido, simples e sensvel, mas o Lowry propicia maior linearidade sob altas concentraes de protena e maior estabilidade da colorao desenvolvida. Nesta atividade, utilizaremos o Mtodo de Bradford para determinao de protenas, por ser o mais rpido, simples e sensvel. Mtodos de quantificao de acares redutores A reao de Benedict- A soluo um reagente comumente usado na deteco de acares redutores; nesse reagente ons de Cu 2+ so mantidos em soluo, como um complexo alcalino de citrato. Quando o Cu2+ reduzido, o Cu+ resultante menos solvel e precipita-se da soluo alcalina sob forma de Cu2O, um slido amarelo ou vermelho. O acar redutor, por sua vez, oxidado, quebrado e polimerizado na soluo alcalina de Benedict, (Conn e Stumph, 1983). Oliveira (1992) e Southgate (1991) citam que os acares redutores tambm podem ser detectados pelos mtodos: Reduo da ferricianida, reao com cido para-hidroxibenzicohidrazida (PHBAH), e 3, 4 dinitrobenzico. reao com trifenil tetrazolium e os mtodos do cido pcrico, do fenol sulfrico, do Ferro reduzido, e metileno azul. O mtodo do cido dinitrosaliclico (DNS) o mais empregado. Este reagente composto de cido dinitrosaliclico, sais de Rochele, fenis, bissulfito de sdio e hidrxido de sdio. A qumica do cido DNS foi muito discutida durante vrios anos. O cido 3,5 dinitrosaliclico reduzido para cido 3- amino-5

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nitroslico, um produto de colorao laranja, enquanto que o grupo aldedo dos acares redutores so oxidados para grupos carboxlicos (Figura 2) (Miller, 1959).

Figura 2. Reao do DNS com o acar redutor.

Mtodos de quantificao de acares solveis totais H vrios mtodos de determinao de acares em tecidos, sendo os mais conhecidos o Mtodo de Somogy- Nlson que consiste em reaes de reduo detectadas pelo reagente de Fehling e o Mtodo da Antrona que consiste em reaes de condensao que utilizam reagentes cidos pra desenvolvimento de cor. O mtodo de Somogy e Nelson (1952) baseado na reduo de um reagente cprico em meio alcalino pelos acares redutores, sendo a reao quantificada por colorimetria. Os mtodos redutomtricos utilizam o licor de Fehling original ou com modificaes tais como ocorre nos mtodos de Bennedict, Somogy, Hagedor-Hensen, Lane-Enyon, porm, todos se baseiam no mesmo princpio, ou seja: O licor de Felhing consiste de uma soluo alcalina de sulfato de cobre em tampo de tartarato duplo de sdio e potssio. O on cprico (Cu2+) do licor, na presena de acares redutores em

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meio alcalino a quente reduzido a cuproso (Cu+) formando um precipitado vermelho de xido cuproso, conforme esquema: Acar redutor enediol (redutona) 2OH + 2Cu+ + mistura acar-cido 2CuOH Cu2O + H2O (ppt vermelho). Para a determinao dos acares solveis totais, o mtodo mais adequado o da antrona (Ashewell, 1957). Essa substncia um hidroxiantraceno, de forma estvel, slido e incolor. A reao da antrona com os acares ocorre em meio fortemente cido, havendo hidrlise e desidratao dos acares, produzindo hidroxifurfural e furfural, os quais reagem com a antrona e formam um produto de colorao azul-esverdeada (Figura 3).

Figura 3. Reao da antrona com cido sulfrico e depois com o acar solvel.

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MATERIAL E MTODOS
As atividades foram realizadas no Laboratrio de Nutrio e Metabolismo de Plantas, Departamento de Biologia da UFLA /Setor de Fisiologia Vegetal. Para a determinao das curvas padres seguiu-se os protocolos descritos abaixo. DETERMINAO DE AMINOCIDOS ( -NH2) PELO MTODO DA NINIDRINA: Preparo dos Reagentes: A) Tampo citrato de sdio 0,2 M pH 5,0 B) Reagente ninhidrina 5% dissolvida em Metil Celosolve (2,5g de ninidrina em 50ml de Metil Celosolve) C) KCN (2% em Metil Celosolve) 2ml de KCN 0,01M (65mg KCN/ 100ml de gua destilada) em 100ml de Metil Celosolve D) Etanol 60% (v/v) Observao: quando guardados separadamente e de modo adequado podem ser armazenados por at 30 dias. Procedimento para obteno da curva padro de

aminocidos (aa) partir de uma soluo de glicina (0,1 mol/ml): Pode ser utilizado outro aminocido ou oura mistura de

aminocidos, desde que nesta concentrao final***. Aps a adio do padro de aminocidos e dos reagentes A, B e C, agitar e levar ao banho-maria 100C por 20 minutos para

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desenvolver a colorao. Posteriormente, completar com etanol 60% e agitar novamente (o volume final da reao e 4,0 ml). Tabela 1. Procedimento para obteno da curva padro de aminocidos
Reagentes GLY (0,1mol/ml) gua A+B+C (ml)** 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 Etanol 60% (ml)*** 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 mol de aa Tubos (ml) (ml) 01 0,0 1,0 0,00 02 0,2 0,8 0,02 03 0,4 0,6 0,04 04 0,6 0,4 0,06 05 0,8 0,2 0,06 06 1,0 0,0 0,10 ** 0,5ml de A + 0,2ml de B + 1,0ml de C

Fazer a leitura a 570nm aps o resfriamento. Para quantificar os aminocidos em tecidos vegetais seguir o procedimento de extrao mais indicado para cada tecido e posteriormente usar at 1,0ml de extrato (mximo), adicionando os reagentes.

DETERMINAO DE PROTENAS PELO MTODO DE BRADFORD (COMASSIE BLUE G-250):

Preparo do reagente: A Comassie blue G-250 dissolver 100mg de Comassie em 50ml de etanol 95%. A esta soluo adicionar 100ml de cido fosfrico 85%. A soluo resultante diluda para 1 litro com gua. As concentraes finais sao: 0,01% de Comassie, 8,5% de cido fosfrico e 4,7% de etanol. Ateno:

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O cido fosfrico tem que ser adicionado ao Comassie O reagente de Comassie deve ser filtrado antes de ser usado. Procedimento para obteno da curva padro de protenas

dissolvido em etanol, nunca o contrrio.

partir de uma soluo de Soro Albumina Bovina (BSA) (1mg/ml ou 10 g/0,1ml):

Tabela 2. Procedimento para obteno da curva padro de protenas Glicose (60mg/ml) Tubos 01 02 03 04 05 06 (ml) 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 gua (ml) 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 g/ml de AST 0 20 40 60 80 100 ANTRONA (ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

Observao: para minimizar os erros de pipetagem pode-se preparar solues de 20, 40, 60, 80 e 100 g de BSA/0,1ml e retirar uma alquota de 0,1ml de cada uma. A quantificao de protenas em extratos vegetais pode ser feita usando-se volumes iguais do extrato e de TCA (10%) resultando em uma concentrao final de TCA igual a 5%. Este extrato deve ser centrifugado e o precipitado ressuspendido com NaOH 0,1N. Posteriormente, retirar uma alquota de 0,1 ml da protena ressuspendida, adicionar 5ml do reagente de Comassie, agitar e fazer a leitura a 595nm.
DETERMINAO DE ACARES REDUTORES PELO MTODO DO CIDO DINITROSALICLICO (DNS)

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Preparo dos reagentes: A DNS (Dissolver 2,5g de cido dinitrosaliclico (DNS) e adicionar 50ml de NaOH 2N) B - Disssolver 75g de Tartarato duplo de Sdio e Potssio (Sal de Rochelle), adicionar 125ml de gua e agitar sob aquecimento at a dissoluo total. Posteriormente, adicionar o reagente B sobre o A, misturandoo sob aquecimento at dissolver completamente. Depois de resfriada, completar o volume da soluo para 250ml. Procedimento para obteno da curva padro de acares redutores (AR) a partir de uma soluo de glicose (10mM): Pode ser utilizada uma mistura de frutose e glicose desde que dem a mesma concentrao final.
Tabela 3. Procedimento para obteno da curva padro de acares redutores Glicose (10mM) Tubos 01 02 03 04 (ml) 0,0 0,2 0,4 0,6 gua (ml) 1,5 1,3 1,1 0,9 moles de AR 0,0 2,0 4,0 6,0 DNS (A+B) (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0

Aps adicionar o reagente de DNS, agitar a mistura e levar os tubos para banho-maria 100C por 5 minutos. Deixar esfriar temperatura ambiente e completar o volume para 10ml com gua destilada ou no (conforme o caso). Fazer a leitura a 540nm. Para quantificar os AR de um estrato de tecidos convenientemente preparados, pode-se usar at 1,5 mL de alquota e adicionar o reagente de DNS e posteriormente seguir as mesmas recomendaes para a obteno da curva padro.

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DETERMINAO DE ACARES SOLVEIS TOTAIS PELO MTODO DA ANTRONA: Preparo do reagente: Pesar 40mg de Antrona, colocar em um bquer e adicionar 1,0 ml de gua destilada e depois 20ml de cido sulfrico concentrado (H2SO4). Este reagente deve ser preparado na hora do uso. Antes de colocar a antrona, manter os tubos de ensaio em gelo. Procedimento para obteno da curva padro de acares solveis totais (AST) partir de uma soluo de glicose (60 g/ml ou 0,333 mM de glicose):
Tabela 4. Procedimento para obteno da curva padro de acares solveis totais. Glicose (60mg/ml) Tubos 01 02 03 04 05 06 07 (ml) 0,0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 gua (ml) 1,0 0,9 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 g/ml de AST 0,0 6,0 12,0 24,0 36,0 48,0 60,0 ANTRONA (ml) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Depois de adicionar o reagente Antrona, agitar os tubos e levalos ao banho-maria 100C por 3 minutos. Resfriar temperatura ambiente ou no gelo e fazer a leitura a 620nm. Para quantificao de AST em extrato de tecidos vegetais pode-se usar alquotas de at 1,0ml. ANLISE

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Nos trabalhos realizados, cada participante do grupo era responsvel por duas repeties de cada ponto das curvas. As curvas padres foram determinadas no Windows Exel com o uso do grfico de disperso, sobre o qual aplicou-se regresso linear, cujo modelo y = ax + b. Como critrio de qualidade de ajuste foi utilizado o R2.

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RESULTADOS E DISCUSSO

Para se estudar o teor das biomolculas (aminocidos, protenas, acares redutores e acares solveis totais) dos tecidos vegetais necessita-se de uma curva padro. Esta, por possuir quantidades conhecidas da molcula em questo, permite estimar a quantidade dela no tecido vegetal. Cada ponto das curvas padres foi obtido com uma concentrao conhecida da substncia desejada, ou seja, para aminocidos usou-se glicina, para protenas, soro albumina bovina (BSA) e para acares redutores e solveis, glicose. Aplicou-se, ento, regresso linear, sendo que a frmula y = ax + b serve para determinar a concentrao das substncias extradas de um tecido vegetal, onde y o valor da absorbncia e x a concentrao a ser determinada. O R 2 avalia a variao dos resultados obtidos na curva. Quanto menor a variao, o resultado de R2 estar mais prximo de 1 (resultado ideal), que pode ser alcanado se a variao for uniforme. Sendo assim, quanto mais prximo de 1, mais precisas sero as determinaes do teor da substncia no tecido vegetal. Os resultados obtidos nas atividades realizadas por cada membro do grupo esto apresentados nos grficos abaixo.

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Curva Padro Aminocidos (rico)

0,6 0,5 ABS (570 nm) 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,025 0,05 0,075 0,1 Concentrao (m ol) y = 4,4869x + 0,0075 R2 = 0,9825

Curva Padro Aminocidos (Giandr)

0,6 0,5 ABS (570 nm) 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,025 0,05 0,075 0,1 Concentrao (m ol)

y = 4,6676x + 0,0055 R2 = 0,9914

25

0,5 0,45 0,4 ABS (570 nm) 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0

Curva Padro Aminocidos (Morbeck)

y = 4,2274x + 0,0194 R2 = 0,9801

0,025

0,05

0,075

0,1

Concentrao (m ol)

Figura 4. Grficos curva padro de aminocidos (A570 m) de cada participante do grupo.

26

Curva Padro Protenas (rico)

0,4
ABS (595 nm)

0,3 0,2 0,1 0 0

y = 0,0031x + 0,0051 2 R = 0,9974

20

40

60

80

100

Concentrao (g/0,1ml)

Curva Padro de Proteinas (Giandr)

0,4
ABS (595 nm)

0,3 0,2 0,1 0 -0,1 0

y = 0,003x - 0,0013 2 R = 0,9939

20

40

60

80

100

Concentrao (g/0,1ml)

27

Curva Padro de Protenas (Morbeck)

0,4
ABS (595 nm)

0,3 0,2 0,1 0 0

y = 0,003x + 0,0162 2 R = 0,9886

20

40

60

80

100

Concentrao (g/0,1ml)

Figura 5. Grficos curva padro de protenas (A595 m) de cada participante do grupo.

28

Curva Padro de AR (rico)

0,8
ABS (540nm)

0,6 0,4 0,2 0

y = 0,1112x - 0,0165 2 R = 0,9956

-0,2 0

Concentrao (mol)

Curva Padro de AR (Giandr) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 y = 0,1067x + 0,0053 R2 = 0,9956

ABS (540nm)

Concentrao (mol)

29

Curva Padro de AR (Morbeck) 0,8 ABS (540nm) 0,6 0,4 0,2 0 -0,2 0 2 4 6

y = 0,1109x - 0,0093 R2 = 0,9987

Concentrao (mol)

Figura 6. Grficos curva padro de acares redutores (A540 m) de cada participante do grupo.

30

Curva Padro AST (rico)

0,7
ABS (620 nm)

0,5 0,3 0,1

y = 0,0105x + 0,0225 R2 = 0,9882

-0,1 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60
Concentrao (g/ml)

Curva Padro AST (Giandr)

0,7
ABS (620 nm)

0,5 0,3 0,1

y = 0,0111x + 0,0256 R2 = 0,991

-0,1 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60
Concentrao (g/ml)

31

Curva Padro AST (Morbeck)

0,7
ABS (620 nm)

0,5 0,3 0,1

y = 0,0119x - 0,0102 R2 = 0,9935

-0,1 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60
Concentrao (g/ml)

Figura 7. Curva padro de acares solveis totais (A620 m) de cada um dos participantes do grupo em cada ponto da curva e sua mdia.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ASHEWELL 1957.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72, 248-254, 1976.

CONN & STUMPH. Introduo Bioqumia. 1983.

JEFFERY, G.H. et al. Anlise qumica quantitativa. Vogel, 1992. 712p. MILLER, G.L. Use of dinitrosalicylic reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, 31: 426-428, 1959. MURRAY, R.K.; GRANNER, D.K.; MAYES, P.A.; RODWELL, V.W. Harper: Bioqumica. 7.ed. So Paulo: Ateneu editora, 1994. 763p. NELSON, D.L.; COX, M.M. Lehninger: Principles of Biochemstry. 3ed. New York: Worth Publishers, 2000. 1152p. OLIVEIRA, L.E.M. Utilizao de laboratrios e preparo de solues e reagentes para anlise bioqumicas (apostila). 1992. Relatrio de Laboratrio de Bioqumica e Metabolismo de Plantas. UFLA. Roteiros de aulas prticas de Laboratrio de Bioqumica e Metabolismo de Plantas. Curvas padres. Lavras, UFLA.

32

 SOMOGY, M. & NELSON. Notes on sugar determination. 1952. SOUTHGATE, D.A.T. Determination of food carbohydrates. 2.ed. London: Elsevier Applied Science, 1991. 232p.
SPACKAMN, D.; STEIN, W.; MOORE, S. Automat recording apparatus for use in the chromatography of amino acids. Analytical Chemistry, 30 (7), p. 1190-1206, 1958. VOET, D; VOET, J.G.; PRATT, C.W. Fundamentos de Bioqumica. Porto Alegre: Artes Medicas, 2000. 931p.

33

Questionrio Relatrio de Curvas Padres

1) Quais os critrios e cuidados a serem utilizados na escolha de uma soluo tampo? uma soluo que resiste variao de pH quando a ela so adicionadas pequenas quantidades de cido ou base ou quando a soluo diluda. Consiste de uma mistura de cido fraco e sua base conjugada (tampo cido) ou de uma base fraca e seu cido conjugado (tampo bsico). A escolha de uma soluo tampo deve ser estabelecida buscando-se eficincia e maior capacidade tamponante da mesma. Para tal, existem dois fatores determinantes: Concentrao do sistema = Concentrao dos componentes do sistema Relao [cido conjugado] = 10 = 1 =1 inferindo pela equao de Henderson-Hasselbach:
pH = pKa + log [ BC] [ AC]
[Base conjugada] 1 10

pH = pKa log 1

Composio Qumica:

cido Fraco e sal derivado desse cido: Exemplo: cido Actico e Acetato de Sdio;

Base fraca e um Sal derivado desta base:

34

Exemplo: Hidrxi de Amnia e Cloreto de Amnia;

H3CCOOH <---> H3CCOO- + H+ - O deslocamento do equilbrio mantm o pH; - Se colocamos OH- , o equilbrio desloca para direita; - Se colocarmos H+ , o equilbrio desloca para esquerda;

Obs.: O calcrio (CaCO3) usado para fazer calagem em solos cidos. Corrige a acidez de solos cidos, pois o CaCO3 um sal derivado de cido fraco e base forte, portanto seu nion sofre hidrlise alcalina.

2) Qual o princpio da ao tamponante de uma soluo tampo? Os possveis valores da concentrao de H+ e OH-, em uma soluo aquosa, podem ser de vrias ordens de magnitude, variando de cerca de 10 1,3 a 10-15,3. Assim sendo, conveniente represent-los em uma escala logartmica, reduzida e de mais fcil manuseio. Por conveno utilizada a escala pH para representar a concentrao de ons hidrognio. Esta notao foi delineada pelo qumico sueco Srensen em 1909. O p usado em pH, pOH, pKw etc. originou da palavra alem Potenz a qual significa fora no sentido de expoente. pH = - log [H+] ou, [H+] = 10-pH Tambm podem ser definidos: pOH = -log [OH-]

35

[OH-] = 10-pOH e pKw = -log Kw onde Kw o produto inico da gua na reao: H2 (l) + H O(l) H O (aq) 2 H + OH Esta reao chamada de autoionizao ou dissociao da gua. A figura abaixo representa de uma maneira esquemtica o que acontece com um cido forte em soluo em equilbrio. Por exemplo: Uma soluo aquosa 0,10 M de um cido forte, cido ntrico, HNO3, [H+] = 0,10 M e [NO3 ] = 0,10 M; a
-

concentrao de HNO3 virtualmente zero. O pH desta soluo : pH = - log [H+] = - log (0,10) = 1. .....ANTES DA DISSOCIAO DISSOCIAO equilbrio APS A

HA A-

H+

36

DISSOCIAO DE UM CIDO FORTE

Em uma soluo aquosa de cidos e bases fracas existe o equilbrio entre ons e espcies qumicas dos cidos ou bases. Representado por HA um cido fraco tem-se a seguinte equao de ionizao, com sua constante de dissociao ou ionizao: HA + H2O H 3O+ + A[H3O+] [A-] Ka = -------------------[HA] onde: Ka = constante de ionizao do cido fraco; [A-] = concentrao molar de ons A- presente no equilbrio; [H3O+] = concentrao molar de ons H3O+ presente no equilbrio;

37

[HA] = concentrao molar de cido fraco no dissociado presente no equilbrio. De modo semelhante ao que foi feito com o cido forte, tambm pode ser feito uma representao esquemtica da dissociao de um cido fraco, como na figura abaixo. Deve ser destacado que o estado antes da dissociao nunca existe realmente em soluo, porque a soluo est sempre em equilbrio. O lado esquerdo apenas terico. ANTES DA DISSOCIAO DISSOCIAO equilibrio APS A

HA A-

HA

H+

DISSOCIAO DE UM CIDO FRACO

38

3) Explique o princpio do desenvolvimento de cor resultante utilizados da para reao os do(s) reagente(s) de especfico(s) de mtodos determinao

aminocidos, protenas, aucares redutores e totais. Mostre as reaes. Relatrio pginas 4 16. 4) Construa as figuras representativas das curvas padres determinando inclusive suas equaes de regresso. Relatrio pginas 24 27 5) Compare os mtodos de quantificao utilizados nesta aula com os disponveis na literatura. Relatrio pgina 13 6) Tem-se uma soluo de 25 ppm de Ca na forma de CaCl2. Qual o volume dessa soluo necessrio para preparar 100 mL de um padro de Ca 0,3 mM.? 25 V = 0,3 x 0,1 L V = 0,0012 L = 1,2 mL 7) Transformar para ppm os seguintes valores: a) 0,0015%;
1 mg x 1,5 mg x 0,001 g 0,0015 g 100 g 1000 g x = 1,5 mg em 100 g x = 15 mg /1000 g = 15 mg / Kg = 15 ppm

b) 22,3 mg/L

39

1 ppm 1 ppm

mg/Kg (em p/p) mg/L (em p/v)

portanto 22,3 mg/L = 22,3 ppm

c) 40 mg/100 mL
1 ppm mg/L (em p/v)

40 mg = 400 mg / L 0,1 L

d) 125 g/ 5 L;
125 = 25g /L 5 1 mg x 0,001g 25 g

x = 25000 mg/L x = 25000 ppm

e) 0,025%;
1 ppm 1 mg x mg/Kg (em p/p) 0,001g 0,025 g

x = 25 mg /100 g x = 25 mg / 0,1 Kg x = 250 mg / Kg x = 250 ppm

f) 1000ppb;
1 ppb 1 ppm 1 g x = 1 ppm g/Kg mg/Kg 10-3 mg ng/mg

40

g) 312 mg/ L;
1 ppm 1 ppm mg/Kg (em p/p) mg/L (em p/v)

portanto 312 mg/L = 312 ppm

h) 312 g/m3;
312 g 10 L 1 ppm x = 312 ppm
3

312 x10 mg 10 L
3

= 312 mg / L

mg/L (em p/v)

i) 3 g/T;
1 ppm 1 ppm mg/Kg (em p/p) 0,001 g / 0,001 T

3 g/T = 3 ppm

j) 5 mg/ mL;
1 ppm 5 mg mg/L (em p/v) 0,001L

x = 5000 mg/L = 5000 ppm

k) 0,07 g/1000 mL;

1 ppm 1g 0,07 g mg/L (em p/v) 1000 mg x

x = 70 mg/L = 70 ppm

m) (NH4)2SO4 - 5 mM. Quantos ppm de N, S, H e O?

41

132 mg 5 mg

28 mg de N x

132 mg 5 mg

8 mg de H x

x = 1,06 mg de N x = 1,06 ppm de N 132 mg 5 mg 32 mg de S x

x = 0,3 mg de H x = 0,3 ppm de H 132 mg 5 mg 64 mg de O x

x = 1,21 mg de S x = 1,21 ppm de S

x = 2,43 mg de O x = 2,43 ppm de O

n) MgHPO4 10 mM. Quantos ppm de Mg, P, H e O?

120 mg 10 mg x = 2 mg de N x = 2 ppm de N 120 mg 10 mg 31 mg de P x 24 mg de Mg x 120 mg 10 mg 1 mg de H x

x = 0,08 mg de H x = 0,08 ppm de H 120 mg 10 mg 64 mg de O x

x = 2,58 mg de P x = 2,58 ppm de P

x = 5,34 mg de O x = 5,34 ppm de O

8) Uma soluo de KNO3 tem 140 ppm de N. Quantos ppm tem de K?

39 g de K x 14 g de N 0,140 g de N

x = 0,39 g de K = 390 mg /L x = 390 ppm

42

9) Para obtermos 10 litros de uma soluo de Ca 160 ppm, quanto de Ca(NO3)2 .4H2O preciso?
236000 mg de Ca(NO3)2.4H2O x 40000 mg de Ca 160 mg de Ca

x = 944 mg / L = 944 ppm de Ca(NO3)2.4H2O 994 x 1L 10 L

x = 9440 ppm = 9440 mg / 10 L = 9,44 g

10) Preparar uma soluo de 1 M em K, a partir de K2SO4.

K2SO4 x 1
M= m = 0,5 . 174 .1 = 87 g de K2SO4 em 1L de soluo PM x V

Kps -Kps

2K 2x 1

2SO4

K2SO4 = 1 M K+ 2x = 1 x = 0,5 M

x 1

SO4 = 1

2-

11) Preparar 1 litro de soluo que contenha 195 ppm de K e tendo como soluo estoque KNO3 1 M.
1M x 101 g de KNO3 x 39 g de K 0,195 g de K

x = 0,505 g de KNO3 = 0,505 g /L = 0,505 M M V = M' V' 1 V = 0,505 x 1 V = 0,505 L = 505 mL de KNO3 1M

12) O que normalidade, molaridade, molalidade e ppm? Normalidade (N): n de equivalente-grama do soluto dissolvido em um litro de soluo.

43

N=

N eq V

onde N eq = n de equivalente-

grama; V = volume expressa em mol L-1

N eq = eqg N ionizveis

onde,

eq g = equivalente-grama; N ionizveis = cido = n de H+ ionizveis Base = n de OH- ionizveis Sal = n do elemento de maior Nox Concentrao molar ou molaridade (M): n de mols de soluto dissolvidos em um litro de soluo, ou seja:
M= n V

expressa em mol L-1 ou g L-1 ou g cm-3. onde n = n de mols; V = volume da

soluo. Se n =
m PM

onde m = massa do soluto; PM = peso

molecular do soluto. Ento, molaridade pode tambm ser definida por:

M = m PM x V

Concentrao molalidade (): n de mols de soluto dissolvido em um quilograma de solvente.

n ms

onde = molalidade; n = n de mols; m = massa da expressa em mol Kg-1 ou g Kg-1

soluo.

44

Partes por milho (ppm): indica o n de partes de soluto em um milho de partes de soluo.
1g soluto 106 g soluo

1ppm (p/p) = mg g-1 1ppm (v/v) = 1ppm (p/v) = mL-1

expressa em mg Kg -1 ou

1mL soluto 106 mL soluo 1g soluto 10 mL soluo

6

expressa em mg L-1 expressa em mg L -1 ou mg

Obs. interessante ressaltar que os termos molalidade e molaridade esto sendo substitudos por ppm (molalidade est completamente abolido) visto que a tendncia atual somente trabalhar em termos de massa/massa. Fazendo correlaes encontra-se: 1 ppm (p/p) = expressa em mg Kg-1 ou g g-1 1 ppm (v/v) = expressa em L L-1 1 ppm (p/v) = expressa em mg L-1 ou g mL-1 1 M = 1000 ppm ento 1 ppm = 1 mM 13) Como so divididos quimicamente os aminocidos? Os aminocidos so divididos em quatro grupos de acordo com a polaridade do seus grupamento R lateral. So eles: Aminocidos com R = grupos apolares (hidrofbicos)

45

H H H N H C CH3 O C N H H3C C CH CH3 H3C O C N H C CH2 CH

O C N H H3C CH3

H C CH

O C

CH2 CH3

Alanina (Ala OU A) H N H C CH2 CH2 S CH3 O C H2C

Valina (Val ou V)

Leucina (Leu ou L) O C

Isoleucina (Ileu ou I) H N H C CH2 O C

H N C

O C CH2 N H

H C CH2

CH2 N Prolina (Pro ou P) Fenilalanina (Phe ou F) H Triptofano (Trp ou W)

Metionina (Met ou M)

46

Aminocidos com R = grupos polares neutros (hidroflicos)

H H N H C CH2 C O NH2 O O C N H C CH2 CH2 C NH2 N H O C H C CH2 OH Serina (Ser ou S) O C N H H C CH2 O C O C N H H C CH OH Treonina (Thr ou T) O C CH3

Asparagina (Asdn ou N)

Glutamina (Gln ou Q) H N C CH2 SH

H N H C H

O C

Glicina (Gly ou G)

Cistena (Cys ou C)

OH

Tirosina (Tyr ou Y)

Aminocidos com R = grupos polares cidos

H H N H C CH2 C O O O O C N H C CH2 CH2 C O O C

cido asprtico (Asp ou D)

cido glutmico (Glu ou E)

Aminocidos com R = grupos polares bsicos

47

H N H C CH2 CH2 CH2 CH2 NH3

O C N H

H C CH2 CH2 CH2 C H2N

O C H N H HN NH2 HC C CH NH C O C

Lisina (Lys ou K)

Arginina (Arg ou R)

Histidina (His ou H)

14) O que preciso, exatido e sensibilidade do mtodo? A exatido a concordncia entre o resultado determinado e o verdadeiro ou em outras palavras, exprime a correo de uma medida. A preciso a concordncia de uma ou mais medidas de uma mesma varivel, ou seja, exprime a reprodutibilidade de uma anlise. Sensibilidade a capacidade de aparelhos ou instrumentos ou anlises, de reagir mnima ao ou variao de influncias fsicas externas, tais como peso, presso, temperatura, concentrao, etc.

48