Como ocorre a replicao do DNA

OBJETIVOS
Ao nal desta aula, voc dever ser capaz de: Apresentar as importantes descobertas relacionadas ao mecanismo de duplicao do material gentico, chamado replicao. Compreender a importncia que esse mecanismo exerce sobre a perpetuao da vida de todos os seres.

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Pr-requisito
Conhecimentos adquiridos nas aulas sobre estrutura do DNA (2 a 4 Mdulo 1).

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INTRODUO

Aps a comprovao da natureza do material gentico, ou seja, da descoberta de que o DNA a molcula que armazena toda a informao que ser utilizada pelo organismo para manifestar as suas caractersticas fenotpicas, atravs da produo de protenas, surgiu o desafio de desvendar o mecanismo pelo qual essa informao passada de uma clula-me para uma clula-lha durante o processo de diviso celular. Voc deve estar lembrado de que o modelo desenvolvido por Watson e Crick, em 1953, descreveu a molcula de DNA como uma dupla-hlice formada por tas antiparalelas compostas pelos nucleotdeos A, T, G e C. Deve lembrar-se, ainda, de que as duas tas permanecem ligadas atravs de ligaes fracas do tipo pontes de hidrognio formadas entre as bases nitrogenadas dos nucleotdeos, sendo que a Adenina forma duas pontes de hidrognio com a Timina, e a Guanosina forma trs pontes de hidrognio com a Citosina. Esse modelo mostrou ser ideal para o armazenamento e transmisso da informao gentica, mas voc deve estar se perguntando o porqu desta armao. Vamos observar o esquema apresentado na Figura 9.1 e acompanhar o raciocnio a seguir.

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Figura 9.1: Quando duas tas de DNA esto ligadas por pontes de hidrognio, as pontes podem ser rompidas. Assim, a base nitrogenada de cada nucleotdeo presente em cada uma das tas apresenta a capacidade de formar pontes de hidrognio com a base nitrogenada complementar de um outro nucleotdeo.

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O DNA composto por duas fitas complementares, certo? As ligaes entre as duas tas so do tipo pontes de hidrognio, que podem ser facilmente rompidas e restauradas conforme j estudamos na Bioqumica. Muito bem, ento essa estrutura de dupla-hlice pode ser rompida com uma certa facilidade levando formao de duas tas simples. Pois bem, cada uma das bases nitrogenadas de cada um dos nucleotdeos presentes em cada uma das tas separadas esto aptas a formar pontes de hidrognio com as bases nitrogenadas de outros nucleotdeos. Se houver uma Adenosina livre, ela poder formar duas pontes de hidrognio com uma Timina. Da mesma forma, se houver uma Citosina livre, ela poder formar trs pontes de hidrognio com uma Guanosina e assim, sucessivamente, todas as bases podero se ligar a novas bases, de modo que duas novas dupla-hlices podero ser formadas a partir de duas tas simples. Parece simples, no ? Esse mecanismo foi proposto por Watson e Crick na ocasio da divulgao da estrutura do DNA, e recebeu o nome de replicao, que implica a potencialidade de se produzir innitas rplicas de um DNA a partir de uma nica dupla-hlice. Mais adiante, veremos em detalhes como esse mecanismo ocorre. Vejamos, agora, quais as possibilidades disso acontecer. Em teoria, a replicao do DNA poderia ocorrer de trs diferentes maneiras, conforme ilustrado na Figura 9.2.

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Figura 9.2: Os esquemas apresentam os trs possveis tipos de replicao: (a) semiconservativa; (b) conservativa e (c) dispersiva.

A replicao semiconservativa mostrada na Figura 9.2.a (modelo defendido por Watson e Crick) implica a sntese de duas molculas-lhas de DNA na qual a ta original da molcula-me, que foi utilizada como molde, mantida (por isso chamada semi, que quer dizer metade!), e a segunda complementar corresponde ta-lha sintetizada a partir do molde. A replicao conservativa mostrada na Figura 9.2.b implica a sntese de duas tas complementares, que usam a molcula-me como molde, mas, aps a sntese, essas molculas seriam separadas dos seus moldes e formariam uma nova molcula, de modo que a molcula-me manteria as duas tas originais conservadas. A replicao dispersiva, por sua vez, mostrada na Figura 9.2.c, implica a sntese de duas tas complementares, que usam a molculame como molde, mas, aps a sntese, as molculas resultantes seriam formadas pela juno de partes da ta-me e partes da ta recmsintetizada, gerando molculas mistas.

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O primeiro modelo parece o mais simples, no mesmo? E tambm o mais bvio, por isso foi defendido por Watson e Crick logo no incio. A soluo das dvidas muitas vezes se encontra na realizao de experimentos elegantes e inteligentes. Acompanhe o que foi feito. Em 1958, Matthew Meselson e Franklin Stahl utilizaram a bactria Escherichia coli para desvendar o modelo. Os pesquisadores cultivaram Escherichia coli em meio contendo um istopo de nitrognio pesado, N15, em substituio ao istopo normal N14. As bases nitrogenadas do DNA possuem nitrognio. Assim, o DNA das clulas que foram crescidas na presena de N15 apresentaram uma densidade maior do que o DNA das clulas crescidas na ausncia de N15. Voc deve estar pensando: Mas como que eles zeram para separar o DNA mais denso do DNA menos denso? E quem era quem? Ento, vamos tentar entender, explicando a tcnica que foi utilizada. Voc pode acompanhar a explicao seguindo o esquema mostrado na Figura 9.3.

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Figura 9.3: Gradiente de equilbrio de densidade de Cloreto de Csio.

A densidade da maioria dos DNAs semelhante densidade de solues concentradas de sais pesados, tais como Cloreto de Csio (CsCl). Por exemplo, a densidade do CsCl a 6M de cerca de 1,7 g/cm3 e a densidade do DNA de Escherichia coli contendo N14 de 1,710 g/cm3. A substituio de N14 por N15 aumenta a densidade do DNA para 1,724 g/cm3. Quando uma soluo de CsCl a 6M submetida centrifugao em alta velocidade (30.000 a 50.000 revolues por minuto) durante 48 horas, ocorre a formao de um gradiente de equilbrio de densidade.

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A fora centrifugal causada pela centrifugao em alta velocidade sedimenta o sal no fundo do tubo. Em contrapartida, a fora de difuso resulta no movimento de molculas de sais de volta para a parte superior do tubo, s que em concentrao baixa. Aps um tempo longo de centrifugao, o equilbrio entre a fora de centrifugao e difuso atingido, de modo que nesse momento existe um gradiente linear crescente de concentrao de sal do topo para o fundo do tubo. A densidade do CsCl a 6M de cerca de 1,7 g/cm3 no equilbrio. Aps a centrifugao, o gradiente linear de densidade ir variar de 1,65g/cm3 no topo do tubo a cerca de 1,75 g/cm3 no fundo do tubo. Se houver DNA nessa soluo de CsCl e, conseqentemente, no gradiente, o mesmo se mover para uma posio na qual a densidade da soluo de CsCl seja igual a dele. Assim, um DNA com densidade 1,71 g/cm3 estar em uma posio diferente de um DNA com densidade 1,724 g/cm3, o que tornar possvel a separao do DNA mais denso do DNA menos denso. Voltemos agora para o experimento de Meselson e Stahl. Aps o cultivo das clulas durante algum tempo na presena de N15, todo o DNA estava mais pesado que o normal (mais denso). O prximo passo foi retirar todo o meio de cultura contendo N15 e adicionar meio de cultura contendo o N14 . A Escherichia coli se divide a cada vinte minutos, de modo que, aps cada diviso, um ciclo de replicao do DNA est completo. Assim, coletando clulas em diferentes intervalos de tempo, extraindo seu DNA e submetendo-os ao gradiente j descrito foi possvel desvendar como se d o mecanismo de replicao. Antes de chegarmos ao resultado nal, vamos analisar que modelos de replicao poderiam ser criados de acordo com os padres que viessem a ser obtidos aps o gradiente de equilbrio de centrifugao. Vamos acompanhar o esquema apresentado na Figura 9.4 e as explicaes a seguir.

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Figura 9.4: Padres esperados para os diferentes tipos de replicao aps o gradiente de equilbrio de Csio.

Para a replicao semiconservativa mostrada na Figura 9.4.a, ao nal do primeiro ciclo, todas as molculas apresentariam um peso intermedirio resultante da presena de uma ta leve e uma ta pesada. No nal do segundo ciclo, metade das molculas apresentaria um peso intermedirio (uma ta leve e a outra ta pesada) e a outra metade seria leve (duas tas leves). O padro esperado aps a separao do DNA no gradiente de Cloreto de Csio seria o seguinte: uma banda intermediria aps o primeiro ciclo (intermediria, em que todas as molculas apresentariam uma ta pesada e a outra ta leve); duas bandas aps o segundo ciclo, uma leve (duas molculas leves) e outra intermediria (duas molculas intermedirias).

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Para a replicao conservativa mostrada na Figura 9.4.b, no nal do primeiro ciclo, metade das molculas seria pesada (conservadas) e a outra metade seria leve (replicadas a partir do molde pesado). No nal do segundo ciclo, o mesmo padro do primeiro ciclo seria esperado, pois a molcula-me sempre se conserva, de modo que a molcula pesada seria a mesma usada como molde e conservada no primeiro ciclo, o mesmo se repetindo aps o segundo ciclo. Dentre as molculas leves, uma delas seria a molcula gerada no primeiro ciclo e conservada, e as outras duas leves seriam geradas a partir dos moldes (uma leve conservada e uma pesada conservada). O padro esperado aps a separao do DNA no gradiente de Cloreto de Csio seria o seguinte: duas bandas aps o primeiro ciclo (uma molcula pesada e outra molcula leve); duas bandas aps o segundo ciclo (trs molculas leves e uma molcula pesada). Por ltimo, para a replicao dispersiva mostrada na Figura 9.4.c, no nal do primeiro ciclo, todas as molculas seriam uma mistura entre as molculas leves e pesadas. O mesmo seria observado aps o segundo ciclo. O padro esperado aps a separao do DNA no gradiente de Cloreto de Csio seria o seguinte: uma banda intermediria aps o primeiro ciclo (molculas com partes mescladas); uma banda aps o segundo ciclo (molculas com partes mescladas). O resultado obtido aps o gradiente de equilbrio de CsCl est ilustrado na Figura 9.5.

Figura 9.5: O esquema apresenta o resultado observado no experimento. Como controles ns podemos observar o DNA pesado contendo N15 e o DNA leve contendo N14. Aps o primeiro ciclo, houve o aparecimento de um tamanho intermedirio entre N15/N14. Aps o segundo ciclo, houve o aparecimento de um tamanho correspondente ao DNA leve, contendo N14 e um tamanho intermedirio entre N15/N14.

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(recm-sintetizada) e uma ta pesada (proveniente da ta molde). Aps o segundo ciclo, duas bandas foram observadas, uma leve, indicando a presena de DNA recm-sintetizado a partir do molde obtido no primeiro ciclo, e outra banda intermediria, indicando a presena de DNA na qual, uma das tas contm nitrognio pesado. Esses resultados comprovaram que a replicao do DNA semiconservativa.

RESUMO
Nesta aula, voc viu que o modelo proposto por Watson e Crick sugeriu um mecanismo de transmisso da informao gentica contida no DNA, atravs de um mecanismo conhecido como replicao. Voc viu, ainda, que a replicao do DNA semiconservativa, pois uma das tas da nova molcula sintetizada a mesma da molcula-me que serviu de molde para a sua sntese.

EXERCCIOS
1. Voc est convencido da importncia do mecanismo de replicao do DNA? Responda por qu. 2. De que maneira o modelo de Watson e Crick indicou o possvel mecanismo de duplicao da molcula do DNA? 3. O que signica replicao semiconservativa?

AUTO-AVALIAO
Voc no deve ter encontrado diculdades para responder aos exerccios propostos. Todas as respostas esto contidas no texto desta aula. O estudo desse contedo muito importante para a compreenso das prximas aulas, nas quais falaremos sobre o maquinrio de replicao. Por isso, bom estudo e at l!

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replicao indica que todas as molculas de DNA contm uma ta leve

A presena de uma banda intermediria aps o primeiro ciclo de

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