UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

DEPARTAMENTO ACADMICO DE CIENCIAS, TECNOLOGA E INGENIERIA DE LOS
ALIMENTOS


PROYECTO DE TESIS
VARIACION DE COMPUESTOS FITOQUMICOS, POLIFENOLES Y
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE CASCARA, PULPA Y SEMILLA DE
ANONA (Rollinia mucosa)

EJECUTOR : QUISPE GARIBAY, Carla
ASESOR : Dr. PELAEZ SANCHEZ, Pedro

LUGAR DE EJECUCIN : Universidad Nacional Agraria de la Selva

Tingo Mara, 2012

I. EL PROBLEMA

1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La anona (Rollinia mucosa) es una especie nativa de Amrica
tropical, probablemente de origen amaznico. En la selva peruana se cultiva en
los Departamentos de Loreto, San Martn, Ucayali, Amazonas, Hunuco,
Pasco, Cuzco y Puno. Este producto es poco empleado, el poblador consume
solo la pulpa en forma directa.
La literatura cientfica es escasa en cuanto a informaciones sobre
la composicin fitoqumica, polifenoles y capacidad antioxidante acerca de
anona. Actualmente se tiene referencias de que la pulpa de esta planta posee
capacidad antioxidante y teraputica, pero no se conoce mas detalles sobre las
hojas y semillas.
Teniendo en cuenta lo enunciado, el presente estudio pretende
incursionar en la investigacin de la variacin de compuestos fitoqumicos,
polifenoles y capacidad antioxidante; de la cscara, pulpa y semilla de la
anona, considerando fruto verde y maduro.





1.2. JUSTIFICACION DEL PROBLEMA
El consumo de productos naturales con propiedades antioxidantes
se viene promoviendo especialmente por sus bondades curativas y
nutricionales, de igual modo sucedera para el caso de la hoja, pulpa y semilla
de anona.

La caracterizacin fisicoqumica, fitoqumica y capacidad
antioxidante de las hojas, pulpa y semilla de anona; permitira tener el
conocimiento cientfico adecuado, para poder utilizar esta planta en forma mas
integral, diseando para ello nuevos productos con actividad funcional.

El uso racional de esta planta permitira a los pobladores que lo
poseen contar con una alternativa de ingresos econmicos adicionales,
situacin que podra ser mejorada con el desarrollo de adecuados proyectos de
inversin que consideren el incremento del cultivo y transformacin de las
hojas, pulpa y semillas.

El cultivo de la anona podra convertirse en una opcin econmica
alternativa, al cultivo de la hoja de coca, ya que estara contribuyendo a que el
campesino tenga una nueva fuente de ingresos econmicos.


II. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Determinar la variacin de compuestos fitoqumicos, polifenoles y
capacidad antioxidante de cscara, pulpa y semilla de anona,
considerando fruta verde y madura.

2.2. Objetivos especficos
Caracterizar fitoqumicamente la cscara, pulpa y semilla de anona,
considerando fruta verde y madura.
Determinar el contenido de polifenoles de cscara, pulpa y semilla de
anona verde y madura
Determinar la capacidad antioxidante de los extractos etanolicos
cscara, pulpa y semilla de anona verde y madura.













III. MARCO TEORICO
3.1. Antecedentes
En archivos del EndNote existen trabajos realizados en hojas,
frutas verdes y semillas de anona, donde indican que estas materias tienen
compuestos antitumorales, cambiar antecedentes actuales por los otros.
Se sabe que la capacidad antioxidante total para pulpa de
guanbana (annona muricata) congelada utiliz el mtodo ABTS, expresado
como cido Ascrbico (AA), es de 76.8 4.0 mg AA/100 g, valor menor al 10%
del ms alto (acerola: 1198.9 8.1 mg AA/100 g) y bajo comparado con un
fruto de mayor consumo en Colombia como el mango (224.7 4.6 mg AA/100
g) (KUSKOSKI et al., 2005).

En Brasil, utilizando las hojas de guanbana deshidratadas,
trituradas y maceradas con metanol para determinar su capacidad antioxidante
por DPPH se obtuvo 221.52 16.12 g/mL IC50 (GOMES et al., 2010),
concentracin por lo menos cinco veces mayor que las hojas que mostraron
mejor actividad (Poincianella pyramidalis: 42.95 1.77 g/mL IC50), lo cual
indica menor poder antioxidante.

La investigacin realizada en la India utilizando ste mismo mtodo
para diferentes concentraciones (100-500 g/mL) del extracto etanlico de
hojas de guanbana pulverizadas proporciona como resultado 70 g/mL IC
50
,
valor intermedio en el estudio de especies de Annonceas (BASKAR et al.,
2007). Al comparar stos valores de ambos estudios con el IC
50
de frutas como
el banano (13400 2500 g/mL IC50) y naranja (5400 1300 g/mL IC50)
(LIM et al., 2007), se observa que para lograr una reduccin del 50% del radical
DPPH, las hojas de guanbana en extracto metanlico o etanlico requieren
estar en menor concentracin que estos dos frutos, es decir su actividad
antioxidante es mayor.

3.2. Falta clasificacin taxonmica de la anona y algo de informacin de
composicin qumica de cscara, pulpa y semilla.

3.3. Capacidad antioxidante
Los antioxidantes son compuestos que prolongan la viada til de
alimentos, protegiendo contra el deterioro causado por la oxidacin. Los
antioxidantes inhiben la propagacin de radicales libres por eso son utilizados
para prevenir el deterioro de los alimentos, evitando la rancidez de las grasas y
los cambios de color. Los antioxidantes se clasifican en antioxidantes naturales
y antioxidantes sintticos (SEIS, 1997).

Los antioxidantes son compuestos que inhiben o retardan la
oxidacin de otras molculas mediante la inhibicin de la propagacin de la
reaccin de oxidacin (MARTNEZ, 2000).

Los compuestos antioxidantes estn en la capacidad de inhibir la
oxidacin de molculas y por lo tanto actuar como protectores de molculas
biolgicas contra especies reactivas de oxgeno o radicales libres. Muchos
antioxidantes pueden ser sintetizados en el cuerpo u obtenidos a partir de una
dieta basada en frutas, como la guanbana. El propsito del presente trabajo
fue revisar las principales investigaciones relacionadas con el estudio de la
capacidad antioxidante de la guanbana y los compuestos presentes que le
otorgan dicha propiedad. A partir del anlisis de catorce investigaciones
halladas sobre el tema, se encontr que en la mayora de los casos la
guanbana no contiene concentraciones elevadas de actividad o compuestos
antioxidantes en su pulpa fresca o congelada comparada con frutos de mayor
consumo en Colombia. Sus hojas, al igual que sus jugos y vinos, no contienen
concentraciones elevadas de actividad o compuestos antioxidantes. Sin
embargo, el tema de investigacin de compuestos antioxidantes en guanbana
se ha realizado con poca profundidad, hace falta estudios adicionales con
mtodos que logren la identificacin de los mecanismos de accin de los
compuestos presentes en el fruto completo (cscara y semilla) de las diferentes
variedades que se conocen de este fruto tropical (CORREA et al, 2012).

3.4. Radicales libres
Los radicales libres son tomos o grupos de tomos que tienen un
electrn desapareado o libre, por lo que son muy reactivos ya que tienden a
captar un electrn de molculas estables con el fin de alcanzar su estabilidad
electroqumica (DAJAS, 2001).Los radicales libres se generan durante el
metabolismo, cuando las clulas del organismo transforman los alimentos en
energa (DAZ et al., 1996).
El desbalance entre la produccin de Especies Reactivas de
Oxigeno Reactivo (EROS) y la defensa antioxidante, provoca un dao orgnico
conocido como estrs oxidativo, que lleva a una variedad de cambios
fisiolgicos y bioqumicas, los cuales ocasionan el deterioro y muerte celular
(RODRGUEZ et al., 2001).


3.4.1. Radical 1,1 difenil-2- picril-hidrazil (DPPH).
Es un radical libre estable y se utiliza como indicador para medir la
capacidad de secuestro de cualquier compuesto que posea actividad
antioxidativa. El principio del mtodo de DPPH consiste en la sustraccin de un
tomo de hidrgeno proveniente de un donador (ejemplo compuesto fenlico)
para generar el compuesto difenilpicrilhidrazina y una especie radical. En este
proceso, la reaccin desarrolla un cambio de color de violeta a amarillo a
medida que disminuye la absorbancia detectable a 515 nm (LEBEAU et. al.,
2000).

3.4.2. Radical 2,2- azinobis (3-etilbenzotiazoline 6 acido sulfonico)
(ABTS).
Entre los mtodos utilizados para determinar la capacidad de un
antioxidante para captar radicales libres, ABTS es uno de los ms aplicados, al
considerarse un mtodo de elevada sensibilidad, prctico, rpido y muy
estable; a pesar de esto los valores de actividad antioxidante pueden depender
del tiempo escogido para efectuar la medida. La absorbancia medida por el
mtodo ABTS es determinada a los 1 y 7 minutos; los resultados obtenidos por
algunos investigadores indican que la reaccin con el radical ABTS no se
completa hasta pasado 1 minuto (KUSKOSKI et al., 2005)
3.5. Alimentos funcionales
Se podra definir como cualquier alimento en forma natural o
procesada, que adems de sus componentes nutritivos contiene componentes
adicionales que favorecen la salud, capacidad fsica y el estado mental de la
persona (CHASQUIBOL, 2003).


















IV. HIPOTESIS
Es posible determinar la variacin de compuestos fitoqumicos,
polifenoles y capacidad antioxidante de cscara, pulpa y semilla de anona
verde y madura, con el fin de saber el grado de madurez que tiene mayor
capacidad funcional.














V. MATERIALES Y METODOS
5.1. Lugar de ejecucin
El presente trabajo de investigacin se realizara en la Universidad
Nacional Agraria de la Selva en los laboratorios del Centro de Investigacin y
Desarrollo Biotecnolgico de la Amazona (CIDBAM) y Centro de investigacin
de Productos Naturales de la Amazona (CIPNA), ubicada en el distrito de
Rupa Rupa, provincia de Leoncio Prado, departamento de Hunuco; a una
altitud de 660 m.s.n.m. a 09 17 08 de Latitud Sur, a 75 59 52 de Latitud
Oeste ,con clima tropical hmedo y con una humedad relativa media de 82% y
temperatura media anual de 24
o
C.

5.2. Materia prima
La materia prima para los experimentos sern las hojas, pulpa y
semilla de anona madura, se obtendrn del fundo de un agricultor, ubicado en
Alto Pendencia.

5.3. Equipos materiales y reactivos
5.3.1. Equipos de laboratorio
- Espectrofotmetro modelo Genesys 6 (Thermo Electrn
Corporation).
- Balanza analtica modelo AE 163 (METLER TOLEDO, Switzerland).
- Balanza analtica, marca DIGITAL PRECISIES J 210, color blanco.
- Estufa modelo ODH6- 9240A (TOMOS HeatringDrying Oven.
- Congelador FFV-2065FW (Frigidaire, USA).
- Desionizador, modelo D 7035 (Barnstead).
- Agitador magntico modelo 625 standard (VWRTM hotplate/stirrer).
- Homogenizador, modelo VORTEX GENIE-2 (Scientific industrias
SITM).
- Refrigeradora Icebeam Door Cooling LG GR-5392QLC.
- Mufla.
- Shaker.
- Centrifuga.
- pH metro.
- Brixmetro.
- Vernier.
- Equipo de destilacin.
- Extractor soxhelt.
- Desecador de vidrio o campana de desecacin.
- Cocina de digestin.
- Aparato de destilacin de Kjeldahl.
- Destilador de reflujo.

5.3.2. Materiales de laboratorio
A. Materiales de vidrio
- Matraces erlenmeyer de 250 ml.
- Pipetas graduadas de 2, 5 y 10 ml.
- Micropipetas 10 50 l, 20-200 l y 100-1 000 l.
- Tubos de ensayo Gene Mate

de 5 y 10 ml.
- Fiolas de 50, 100, 500 y 1 000 ml.
- Probetas graduadas de 10, 100, 250 y 500 ml.
- Vasos de precipitacin (50 ml., 100 ml., 500 ml.,1000 ml.)
- Placas Petri.
- Balones de digestin.
- Baln de fondo plano.
B. Otros materiales
- Cubetas de poliestireno, Gene Mate

(1cmx 1cmx4.5cm).
- Tips, FISHERBRAND

(1 000ul, 200ul).
- Microtubos (1,5 -2,00 ml).
- Filtros de membrana de 2 mm y 0,2 m.
- Capsulas de porcelana.
- Bureta.
- Esptulas.
- Gradillas.
- Sujetadores de balones.
- Pinzas de metal.
- Papel filtro.
- Esptulas.

4.1.1. Reactivos y solventes
- cido glico
- 2,2-Diphenyl-1-picrilhydrayl (DPPH; Sigma Aldrich, USA).
- Etanol absoluto al 96% y 80 %.
- Folin-ciocalteus, Merck. Germany.
- Carbonato de Sodio (Na
2
CO
3
) p.a. ISO. Scharlau.
- Hidrxido de Sodio (NaOH) en lentejas p.a. ISO. Merck.
Germany.
- Agua destilada (H
2
Od).
- Agua destilada desionizada (H
2
Odd).
- Fenolftalena.
- cido sulfrico concentrado.
- Hexano.
- Sulfato de potasio.
- Sulfato de cobre.
- cido brico.
- cido clorhdrico.
- Acetona.
- Diclorometano.
- ter de petrleo
- Benceno
- Cloroformo
- Gelatina



5.4. Mtodos de anlisis
5.3.2. Anlisis fitoqumico
Mtodo de estudio para determinar compuestos fitoqumicos
(NEIRA et al., 2005).
5.3.3. Anlisis de polifenoles totales.
Mtodo de espectrofotometra de absorcin molecular, descrito por
(SANDOVAL et al., 2001).
5.3.4. Evaluacin de la capacidad antioxidante
Inhibicin del radical 1,1 difenil 1-2- picril-hidrazil (DPPH). Mtodo
de inhibicin del radical DPHH, descrito por SANDOVAL et al.,( 2001).

PULPA
VI. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
6.1. Obtencin de muestra
Para ejecutar esta parte de la investigacin se utilizarn frutos de
anona en estado verde y maduro, los cuales sern trados de Alto Pendencia,
luego se proceder al acondicionamiento de las muestras, segn sea su
naturaleza, tal como se muestra en la Figura 1.
















Figura 1. Acondicionamiento de la muestra

Cosecha
Seleccin
Blanqueado
do
Oreado
Secado
Molienda
Envasado
Almacenado
CASCARA
SEMILLA
Lavado
Secado
Molienda
Lavado
Pelado
Despepitado
Liofilizado
Conservacin
6.2. Caracterizacin fitoqumica de cscara, pulpa y semilla de anona
verde y madura.
Con la muestra acondicionada como se muestra en la figura 2 se
procede a la preparacin del extracto para la caracterizacin fitoquimo como se
menciona en el tem 5.3.2. mostrada tambin en la figura 2.














Figura 2. Flujograma de anlisis fitoqumico




100 g MP en polvo
Solucin etanlico
Marcha Fitoquimica
Extracto etanlico
Metabolitos
secundarios
Cantidad y tipo de
metabolitos
secundarios
Solventes de
polaridad
Tcnicas
cromatografas
Marcha de
solubilidad
Maceracin alcohlica x 7
dias
Concentrar
CASCARA PULPA SEMILLA
6.3. Determinacin del contenido de polifenoles de cscara, pulpa y
semilla de anona verde y madura
Se emplearn las muestras preparadas en la figura 1,
determinndose el contenido de polifenoles totales y en lo posible la
determinacin por HPLC de los componentes que constituyen los polifenoles
totales.













Figura 3. Flujograma para la evaluacin de contenido de polifenoles




MP en polvo
Evaluacin de contenido de
polifenoles(700 nm)
20C

Frascos ambar 200ml
Filtrado
Envasado
1.5 g / 15 ml de
hidroalcohol/24h

Almacenado
Extraccin hidroalcohlica
CASCARA PULPA SEMILLA
R1 R2

R3

6.4. Determinacin de la capacidad antioxidante de cscara, pulpa y
semilla de anona verde y madura.
Para determinar la capacidad antioxidante se emplear el mtodo
DPPH, se utilizarn las muestras acondicionadas, el mtodo se presenta en la
parte de mtodos de anlisis, inciso 5.3.4.
Para la determinacin del coeficiente de inhibicin del radical DPPH se
seguir el mtodo por espectrofotometra de luz visible a 517nm. Para ello se
preparar 10 mL de solucin stock de DPPH a 1mM en metanol al 99% de pureza, se
agitar hasta la solubilizacin completa del compuesto y se almacenar a 4C
protegido de la luz. A partir de sta solucin stock se preparar 50 mL de DPPH a 20
M en metanol al 99% de pureza. Para la inhibicin del radical DPPH en hojas, pulpa y
semilla de anona se realizarn partiendo del extracto hidroalcohlico en mg/mL
(filtrado y centrifugado 10000 rpm/10min a 4C). Para determinar el porcentaje de
inhibicin se utilizar la siguiente ecuacin:
( )
100 %
(

=
AbsControl
AbsMuestra AbsControl
DPPH Inhibicion

Dnde: Abs Control: Absorbancia del control
Abs Muestra: Absorbancia de la muestra en 10 min.



















VII. DISEO EXPERIMENTAL
En la Figura siguiente se muestra el diseo experimental que se emplear.





FV
1

FM
M
ANONA
MP en polvo
Evaluacin de la actividad antioxidante (DPPH)
Longitud de onda (517nm)


20C

Frascos ambar 200ml
Filtrado
Envasado
1.5 g / 15 ml de
hidroalcohol/24h

Almacenado
Extraccin hidroalcohlica
CASCARA PULPA SEMILLA
R1 R2

R3








Dnde:
- FV y FM: Frutos verdes y maduros.
- C
1
, C
2
: Cscara de fruto verde y maduro.
- P1, P2: Pulpa de fruto verde y maduro.
- S1, S2: Semilla de fruto verde y maduro

Figura ?. Diseo experimental para determinacin de la variacin del
contenido de polifenoles y capacidad antioxidante.
VIII. ANALISIS ESTADISTICO

Los resultados del diseo experimental (Figura 3) para determinar
la hoja con mejor caracterstica fisicoqumica y capacidad antioxidante, sern
analizados mediante el diseo completo al azar con arreglo factorial (DCA),
3A2B con tres repeticiones (DE MENDIBURU, 2007).

Polifenoles
DPPH
IC
50

C
1
P1 S
1
P
2
S
2
C
2

Dnde:

= Es la observacin (i,j) esimo: Polifenoles, DPPH, IC

50
.
= Medio Poblacional
A
i
= efecto i - simo: pulpa de fruto verde y maduro.
B
j
= efecto j simo: parte de fruto (cscara, pulpa, semilla).
A
i
x B
j
= Interaccin de los factores pulpa de fruto y parte del fruto.
E
ij
= Error experimental.




IX. ASPECTOS ADMINISTRATIVOS
9.1. Cronograma de actividades
9.2. Presupuesto


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