SPETTROSCOPIA DI

FLUORESCENZA
EBF 10
Livelli energetici di una molecola
Una molecola non pu assumere un qualunque valore di
energia, ma soltanto alcuni livelli energetici discreti
(effetto quantistico)





Lenergia totale di una molecola pu essere scomposta in una
parte elettronica e una parte nucleare (roto-vibrazionale):
E
molecola
= E
elettronica
+ E
nucleare

E
4
E
3
E
2
E
1
(stato ground)
E
n
e
r
g
i
a

E
m
o
l
e
c
o
l
a

distanza interatomica
energia di
dissociazione
lunghezza di legame
(coordinata nucleare)
livelli vibrazionali
(dello stato ground elettronico)
Livelli energetici di una molecola
E
molecola
= E
elettronica
+ E
nucleare

molecola
(r,R) =
elettronica
(r,R)
nucleare
(R)

Livelli energetici di una molecola
In seguito allassorbimento di un fotone avviene una
transizione della molecola dallo stato ground ad uno
stato eccitato.
Transizioni fra livelli elettronici hanno energie molto
elevate e avvengono in tempi molto brevi.

Moto Scala temporale Energia
Elettronico ~1 fs > 10 000 cm
-1
Vibrazionale 10 fs 0.1 ps 300-3 000 cm
-1

Rotazionale 0.1-10 ps 3-300 cm
-1

Assorbimento di luce
A T
ambiente
il sistema si trova
tipicamente nello stato ground.
Lassorbimento di un fotone
nellUV o nel visibile corrisponde
ad un salto ad uno stato
elettronico eccitato.
Il processo di assorbimento
molto rapito (10
-15
s) rispetto ai
moti nucleari (10
-12
s).
Nella scala dei ps la molecola pu
scambiare energia vibrazionale
con lambiente circostante.
Emissione di fluorescenza
La perdita di energia vibrazionale
in eccesso avviene attraverso
meccanismi non-radiativi
(rilassamento vibrazionale).
Successivamente (10
-9
s), la
molecola pu decadere allo stato
ground elettronico emettendo un
fotone (fluorescenza)
Lenergia del fotone emesso
minore di quella del fotone
assorbito
Regole base della fluorescenza
Durante una transizione elettronica i nuclei sono essenzialmente
fermi (principio di Franck-Condon), pertanto il sistema si porta in
uno stato vibrazionale eccitato dello stato elettronico eccitato.

Lemissione di fluorescenza avviene dal livello vibrazionale pi
basso dello stato elettronico eccitato in quanto il rilassamento
vibrazionale molto pi rapido della fluorescenza.

I fotoni emessi hanno dunque energie inferiori (lunghezze donda
maggiori) a quelle dei fotoni assorbiti (Stokes shift).

Gli spettri di emissione sono speculari a quelli di assorbimento.
Assorbimento vs. Fluorescenza
S
0
S
1
v=0
v=1
v=2
v=3
v=4
v=5
v=0
v=1
v=2
v=3
v=4
v=5
Le strutture dei livelli energetici dello stato ground e
dello stato eccitato sono simili ma non identiche.
e
s
t
i
n
z
i
o
n
e

m
o
l
a
r
e

(
M
-
1

c
m
-
1
)

Energia
Effetto del solvente
Rilassamento del solvente:
la gabbia di molecole
dacqua che circondano il
cromoforo si riorganizza in
maniera da stabilizzare lo
stato eccitato.
Es. il solvente si ri-arrangia quando lo stato eccitato ha un momento
di dipolo elettrico diverso da quello dello stato ground
Perch importante la fluorescenza in biologia?
Gli a.a. aromatici delle proteine sono molecole fluorescenti la
cui emissione dipende dallambiente circostante: misure di
fluorescenza forniscono informazioni sullo stato della proteina
(es. se un Trp nascosto oppure esposto al solvente).
E possibile marcare macromolecole biologiche non
fluorescenti come il DNA o le proteine con piccole molecole
fluorescenti (sonde fluorescenti), come ad es. la fluoresceina.
Il gene di una proteina fluorescente (GFP) pu essere inserito
in qualsiasi parte del DNA.
Coltura di fibroblasti
Citoscheletro cellulare
Grani di polline
Stato di spin di una molecola
STATO
GROUND
STATO DI
SINGOLETTO
(S=0)
STATO DI
TRIPLETTO
(S=1)
Esistono stati elettronici di una molecola con spin diverso da S=0

Es. Uno stato eccitato in cui due elettroni occupano due orbitali
molecolari differenti con spin elettronici paralleli:
Intersystem crossing
Una collisione molecolare pu causare linversione
dello spin di un elettrone nello stato eccitato.

Tale processo (non-radiativo) chiamato
intersystem crossing e comporta il passaggio della
molecola da uno stato eccitato di singoletto (S
1
, S
2
,
) ad uno stato eccitato di tripletto (T
1
, T
2
, ).

In prima approssimazione, le transizioni radiative da
tripletto a singoletto (e viceversa) sono proibite.
Diagramma di Jablonski
S
1
S
0
T
1
ISC
fluorescenza
(10
-9
10
-7
s)
assorbimento
fluorescenza
rilassamento vibrazionale
Intersystem crossing
assorbimento
(10
-15
s)
processi radiativi: processi non-radiativi:
Diagramma di Jablonski
S
1
S
2
S
0
T
1
assorbimento
fluorescenza o fosforescenza
rilassamento vibrazionale
o conversione interna (IC)
quenching
Intersystem crossing (ISC)
IC
ISC
fluorescenza
(10
-9
10
-7
s)
fosforescenza
(10
-3
10
-2
s)
Meccanismi di diseccitazione
Fluorescenza intrinseca (emissione spontanea):
k
F
= 1/ t
F
Conversione interna: k
IC
(
IC
~ 10
-12
sec)
Energia di eccitazione dissipata attraverso:
Il sistema rilassa allo stato ground ri-emettendo
un fotone: t
F
~ 10
-8
sec
collisioni con il solvente
modi vibrazionali interni
Meccanismi di diseccitazione
Intersystem crossing: k
ISC
(
ISC
~ 10
-12
sec)

Quenching: k
q

Conversione da stato di singoletto eccitato a stato di
tripletto eccitato; evento piuttosto raro.
trasferimento radiativo dal tripletto allo stato ground
processo proibito in prima approssimazione (AS=1)
fosforescenza: emissione di un fotone nel passaggio dal
tripletto allo stato ground (10
-3
10
2
s)
Collisioni o formazione di complessi con altre molecole in
soluzione (ad es. O
2
e I

) possono indurre il rilassamento

non-radiativo verso lo stato ground.
Quenching della fluorescenza
Due campioni di chinino disciolti in acqua e illuminati da un laser viola.
Tipicamente il chinino emette una fluorescenza di colore blu, visibile nel
campione di destra. Il campione di sinistra contiene ioni cloruro, che
smorzano la fluorescenza del chinino, non permettendogli di emettere
fluorescenza (la debole luce viola solamente il riflesso del laser sul vetro).
Tempo di vita dello stato eccitato
Immaginiamo di illuminare un campione per un certo intervallo
di tempo (in modo che alcune molecole possano andare nello
stato eccitato) e di spegnere poi rapidamente la sorgente
luminosa.
La rapidit con cui le molecole eccitate decadranno allo stato
ground (in assenza di luce) pari a:
b
N k
dN
=
dt
b
a
b
N
b
N
a
k

t k
b b
e N t N

= ) 0 ( ) (
q ISC IC F
k k k k k + + + =
Quantum yield (u
F
)
Lemissione di fotoni per fluorescenza non lunico meccanismo di
diseccitazione dello stato di singoletto eccitato.
Il numero di fotoni emessi per fluorescenza dunque in generale
inferiore al numero dei fotoni assorbiti.
Resa quantica di fluorescenza u
F
: rapporto tra numero di
fotoni emessi per fluorescenza e numero di fotoni assorbiti
... + + + +
= u
IC ISC q F
F
F
k k k k
k
processi di diseccitazione
diversi dalla fluorescenza
Misura di Fluorescenza
Non uno strumento a
doppio-raggio: non fornisce
una misura assoluta
Intensit emessa per fluorescenza
Lintensit della luce trasmessa dal campione alla lunghezza
donda
ex
pari, per la legge di Lambert-Beer, a:

Ai valori di assorbanza tipicamente usati in fluorescenza (A<0.1),
si pu approssimare la funzione esponenziale come segue:

La differenza I
0
I pari allintensit della luce assorbita dal
campione alla lunghezza donda
ex
:
I = I
0
exp[ - 2.303 c(
ex
) C d ]
I I
0
[ 1 - 2.303 c(
ex
) C d ]
I
0
I = 2.303 c(
ex
) C d I
0
u
F
resa quantica di fluorescenza
f() frazione dellemissione totale alla lunghezza donda
q frazione della radiazione emessa che arriva al rivelatore
Lintensit di emissione osservata alla lunghezza donda
em
dunque
proporzionale al prodotto tra lintensit della luce assorbita (I
0
-I) dal
campione a
ex
e la probabilit di emissione a
em
Lintensit di luce emessa per fluorescenza rilevata dal detector
dipende anche dai seguenti 3 termini:

F(
em
) = 2.303 c(
ex
) C d I
0
u
F
f(
em
) q
intensit della luce
assorbita a
ex
probabilit di
emissione a
em
Intensit emessa per fluorescenza
fattore
geometrico

Apparato Sperimentale
1. Lampada
2. Fenditura regolabile
3. Monocromatore
(eccitazione ed
emissione)
4. Reticolo di diffrazione
(eccitazione ed
emissione)
5. Compartimento del
campione
6. Correzione della luce
di eccitazione
7. Rivelatore
Configurazioni geometriche
Configurazione pi comune: 90

Altre configurazione servono a ridurre
eventuali effetti distorsivi*

Le configurazioni in cui la superficie del
campione a 30 rispetto alla direzione
della luce incidente minimizzano:
la quantit di luce incidente riflessa
i problemi di allineamento della
cuvette (perch la luce incidente
distribuita su unarea ampia del
campione)
(*) Se la concentrazione di fluorofori elevata si possono avere distorsioni del segnale:
la radiazione emessa pu essere ri-assorbita da altre molecole
leccitazione del campione pu essere non uniforme: solo una piccola
percentuale della luce viene assorbita dai fluorofori visibili dal detector
Fluorofori di interesse biologico
Fluorofori intrinseci
aminoacidi aromatici
cofattori (NADH, FAD, ...)
clorofilla, beta-carotene,
Znporfirine, ...

Sonde fluorescenti
per proteine, DNA, membrane,
organelli, ...
Gli spettri di emissione
sono nel vicino UV

La fluorescenza del Trp
estremamente sensibile
allambiente locale
Fluorescenza intrinseca:
aminoacidi aromatici
Fluorescenza intrinseca: aminoacidi aromatici
Trp Tyr Phe
Sostanza

max
(nm)
c
max
x 10
-3

max

(nm)
u
F
t
F

(ns)
Triptofano 280 5.6 348 0.20 2.6
Tirosina 274 1.4 303 0.14 3.6
Fenilalanina 257 0.2 282 0.04 6.4
Adenina 260 13.4 321 2.6x10
-4
< 0.02
Guanina 275 8.1 329 3.0x10
-4
< 0.02
Citosina 267 6.1 313 0.8x10
-4
< 0.02
Uracile 260 9.5 308 0.4x10-
4
< 0.02
NADH 340 6.2 470 0.019 0.40
Assorbimento Fluorescenza
Tutti in H
2
O a pH = 7
Nelle proteine la fluorescenza dominata dal triptofano
Bassa fluorescenza intrinseca degli acidi nucleici sonde fluorescenti
Effetto dellambiente sullo spettro di emissione
dei triptofani delle proteine
La forma ossidata del coenzima NAD
+
non fluoresce
Lo spettro di emissione cambia se lNADH si lega ad una proteina
(il quantum yield aumenta tipicamente di un fattore 4)
Fluorescenza intrinseca: cofattori o coenzimi
Sostanza

max
(nm)
c
max
x 10
-3

max

(nm)
u
F
t
F

(ns)
Triptofano 280 5.6 348 0.20 2.6
Tirosina 274 1.4 303 0.14 3.6
Fenilalanina 257 0.2 282 0.04 6.4
Adenina 260 13.4 321 2.6x10
-4
< 0.02
Guanina 275 8.1 329 3.0x10
-4
< 0.02
Citosina 267 6.1 313 0.8x10
-4
< 0.02
Uracile 260 9.5 308 0.4x10-
4
< 0.02
NADH 340 6.2 470 0.019 0.40
Assorbimento Fluorescenza
Tutti in H
2
O a pH = 7
Nelle proteine la fluorescenza dominata dal triptofano
Bassa fluorescenza intrinseca degli acidi nucleici sonde fluorescenti
Sonde fluorescenti
Spesso le molecole di interesse non sono fluorescenti,
oppure la loro fluorescenza intrinseca non adeguata
per un determinato utilizzo ( il caso ad es. del DNA)
In questi casi la molecola viene marcata con fluorofori
estrinseci (sonde fluorescenti)
Nel caso delle proteine generalmente conveniente
usare sonde con lunghezze donda di eccitazione e di
emissione maggiori di quelle degli aminoacidi aromatici
Sonde fluorescenti
cloruro di dansile
(DNS-Cl)
fluoresceina
ANS
FITC
rodamina B
bromuro di etidio
Immagine ottenuta con microscopio a
fluorescenza di cellule endoteliali.

I nuclei sono colorati con DAPI (blu), i
microtubuli sono colorati con fluoresceina
(verde) ed i filamenti di actina con
TRITC (rosso).
TRITC
DAPI
Fluoresceina

ass
= 358 nm (UV)

em
= 461 nm (blu/azzurro)

ass
= 494 nm

em
= 521 nm (verde)

ass
= 541 nm

em
= 572 nm (arancio)
Sensibilit allambiente esterno
Fluorescenza pi sensibile dellassorbimento allambiente esterno
tecnica migliore per monitorare ligandi o cambiamenti
conformazionali locali.

Sensibilit dovuta ai tempi in cui una molecola rimane in uno stato
eccitato.

Assorbimento ~10
-15
s molecola ed ambiente statici
Eccitazione singoletto ~10
-9
a 10
-8
s accadono molti processi

Molte molecole fluorescenti hanno fluorescenza piuttosto ridotta
in soluzione acquosa. Tale fluorescenza molto maggiore (fino a
20 volte maggiore) in un intorno non polare o rigido (ad es. quando
sono legate ad un sito non polare o rigido di una proteina o di un
acido nucleico).
Altro effetto dellambiente il quenching della fluorescenza di
un fluoroforo. Ci sono un gran numero di processi che possono
causare il quenching:

Quenching collisionale: lo stato eccitato deattivato a causa
delle collisioni del cromoforo con molecole presenti in
soluzione (ad es. con lossigeno).
Cromofori liberi in soluzione acquosa sono suscettibili al quenching. Se
incorporati in una macromolecola, leffetto fortemente ridotto.

Quenching statico: i fluorofori possono formare complessi non
fluorescenti con molecole in soluzione.

. . .
Quenching della fluorescenza
Sonde fluorescenti: marcature non-covalenti
ANS: fluorescenza ridotta (o assente) in soluzione acquosa,
forte fluorescenza quando legata in tasche idrofobiche di
una proteina

ex
= 280 nm
Sonde fluorescenti
ANS: fluorescenza ridotta in soluzione acquosa; aumenta
quando si trova in una tasca idrofobica di una proteina

Reagenti che formano legami covalenti:
Dansyl Chloride il gruppo cloruro sulfonile reagisce
principalmente coi gruppi amminici producendo composti
fluorescenti (blu-verde)

Bromuro di Etidio: fluorescenza molto superiore quando
allinterno del DNA a doppia elica

Indicatori di fluorescenza sensibili a:
pH: usati per misurare il pH dei siti attivi ad enzimi nei
compartimenti intracellulari
Potenziale di ossido/riduzione: differenze di voltaggio
membrane
Concentrazione di ioni: usati per misurare [Ca
++
]
intracellulare
Fluoresceina come misuratore di pH
Il rapporto I
ex495
/ I
ex450
aumenta allaumentare del pH
Indo-1 misura la concentrazione di Ca
2+
attraverso il
rapporto tra i due picchi di emissione
Sonde raziometriche
La serie delle Alexa, sviluppata nellultimo ventennio, comprende una serie
di sonde fluorescenti altamente fotostabili e con quantum yield
particolarmente alti. Sono poco sensibili al pH nellintervallo di pH 4-10.
Sonde fluorescenti che formano legami covalenti
Green Fluorescent Protein (GFP)
Premio Nobel per la chimica nel 2008 per gli studi sulla GFP.

Struttura molecolare della GFP







La GFP una proteina di 238 a.a. isolata per la prima volta nella
medusa Aequorea victoria (PDB ID: 1GFL).


cromoforo della GFP
(tripeptide derivato da Ser-Tyr-Gly)
Green Fluorescent Protein (GFP)
La GFP wild-type assorbe radiazione UV e blu (massimi di
assorbimento a 395 nm e 475 nm) ed emette luce verde
(massimo di emissione a 509 nm):





Green Fluorescent Proteins (GFPs)
Il cromoforo della GFP formata da a.a. naturali:
possibile esprime il gene della GFP nelle cellule e
sintetizzare in vivo proteine marcate con GFP.

Il cromoforo della GFP non fluorescente da solo. Per
questo motivo la marcatura va effettuata con lintera GFP.

Sono state sviluppate una serie di GFP modificate:




Le lunghezze
donda di
eccitazione ed
emissione sono
differenti da quelle
della GFP wt
Fluorescence Resonance
Energy Transfer (FRET)
La FRET un processo fotofisico che coinvolge 2
molecole fluorescenti: donore (D) ed accettore (A).
la molecola donore otticamente eccitata da una
radiazione e cede (tramite un processo non radiativo)
parte di questa energia ad una molecola accettore.
Questo trasferimento di energia provoca la diminuzione
del tempo di vita medio della molecola donore.
Trasferimento di energia fra fluorofori
Supponiamo che il sistema sia fatto da due cromofori differenti:
donore (D): molecola che assorbe luce ad energie pi alte
accettore (A): molecola che assorbe luce ad energie pi basse
D
D*
A
A*
Fluorescence Resonance Energy Transfer
(o Frster Resonance Energy Transfer)
h
v
Donore Accettore
h
v
FRET
h v
Quando D assorbe un fotone, se D ed A sono vicini allora ci sar
una certa probabilit di trasferimento di energia da D ad A.
Se laccoppiamento tra le due molecole sufficientemente forte
il fotone assorbito pu essere emesso da A per fluorescenza.
Se lenergia del fotone emesso da D coincide con quella di
assorbimento di A, la debole interazione fra i cromofori
permetter il seguente meccanismo:
D* + A D + A*
k
T
k
-T
D
D*
A
A*
Subito dopo il trasferimento di
energia sia A che D si trovano in
stati vibrazionali eccitati.
Il rilassamento vibrazionale porta
rapidamente entrambe le molecole
allo stato ground vibrazionale.
Il processo k
-T
molto
meno efficiente
k
T
= costante cinetica
per il processo di
trasferimento di
energia da D ad A
Fluorescence Resonance Energy Transfer
D* + A D + A*
k
T
k
-T
Il trasferimento di energia varia dunque le popolazioni relative
di donore e accettore.
D subisce il quenching, mentre A viene portato allo stato
eccitato da cui pu emettere fotoni per fluorescenza.
=
Efficienza dellEnergy Transfer (E): la frazione di donori
che vengono diseccitati attraverso energy transfer
k
T
k
T
+ k
F
D
+ k
IC
D
+ k
ISC
D
E
Fluorescence Resonance Energy Transfer
Misura della distanza fra cromofori
o Efficienza dellEnergy Transfer (E) una funzione di R (la
distanza fra A e D)
o Secondo la teoria di Frster la costante cinetica per lenergy
transfer pari a:
tempo di vita del donore
in assenza di accettore
R
0
una costante detta distanza critica di trasferimento, o
distanza di Frster pari a:
6 1 2 4
0
) ( 211 . 0 J Q n R
d
k

=

u
D
6
0
) )( 1 ( R R k
d T
t =
Misura della distanza fra cromofori
n lindice di rifrazione del mezzo
u
D
il quantum yield di fluorescenza del donore in
assenza dellaccettore
k
2
un fattore che dipende dallorientazione
relativa dei due cromofori
J lintegrale di overlap fra lo spettro di emissione
del donore e quello di assorbimento dellaccettore
6 1 2 4
0
) ( 211 . 0 J n R
D
k u =


6
0
) )( 1 ( R R k
d T
t =
Donore
Accettore
Overlap
Assorbanza
Assorbanza
Fluorescenza
Fluorescenza
Lintegrale di overlap J definito
come:
dove la lunghezza donda,
c
A
() il coefficiente di
estinzione molare e ]
D
() lo
spettro di fluorescenza del
donore (normalizzato).
Integrale di overlap
Misura della distanza fra cromofori
Lefficienza E del processo di energy transfer dunque:
=
k
T
k
T
+ k
F
D
+ k
IC
D
+ k
ISC
D
E
=
k
T
k
T
+ 1/t
d
=
+ 1/t
d
E
=
6
0
) )( 1 ( R R k
d T
t =
R
0
6
R
0
6

R
6
+
Valori tipici di R
0
variano da 10 a 50 ; possono essere
misurate distanze fino a 80 circa.
6
0
) )( 1 ( R R k
d T
t =
Dipendenza dellefficienza dalla distanza
0
6 1
1
1
R
E
R
|
.
|

\
|
=
Lefficienza varia con linverso della sesta potenza di R
Nellesempio R
0

pari a 40 .
Quando E = 50%,
allora R=R
0

possono essere
misurate distanze
tra ~0.5 R
0
e ~1.5R
0

0
0.25
0.5
0.75
1
0 20 40 60 80 100
distanza ()
E
f
f
i
c
i
e
n
z
a

d
i

t
r
a
s
f
e
r
i
m
e
n
t
o

=
E
R
0
6
R
0
6

R
6
+