UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

SEMINARIO N 02 TECNICAS INMUNOLOGICAS

GRUPO N 03
DR. GUSTAVO ANTEPARRA PAREDES INMUNOLOGIA 2011-II UNPRG-FMH GASCO ARTEAGA LESLIE GONZALES YOVERA JHEAN GUEVARA COTRINA CRISTIAN HERRERA CERCADO LUIS HUAMAN SEMINARIO YASMINA LOZANOS BURGA YENNY MAS GOLAC CIRO MENDOZA CASTILLO ALDO MENDOZA HERNANDEZ ALEX MESTANZA MORON RICARDO MORENO VASQUEZ LUIGUI OCAA PAREDES CRISTIAN PALACIOS APAESTEGUI ALBERTO PEDEMONTE MURRILLO ELKI

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

2011-II

TECNICAS INMUNOLOGICAS

1.ANTICUERPOS MONOCLONALES:
Los anticuerpos monoclonales son aquellos anticuerpos, todos iguales (qumicamente homogneos), producidos por una clula inmortal productora de anticuerpos.

1.1.Aspectos generales de la produccin de hibridomas Para producir anticuerpos monoclonales especficos frente a determinados antgenos, se siguen tres etapas bsicas:

Inmunizacin del animal con un antgeno o El antgeno tiene que presentar dos caractersticas para poder ser utilizado en la inmunizacin; tiene que ser purificado e inmunogenico. o Suele hacerse una primera inmunizacin seguida de dosis de recuerdo (colocadas en semanas o meses). o Vas de inmunizacin utilizadas: subcutnea, intraperitoneal e intravenosa. o Si la cantidad de antgeno es poca o este es poco inmunogenico, se puede inmunizar en el bazo o ndulo linftico. o El seguimiento del proceso se har en lapsos determinados de tiempo. o Si el antgeno es pequeo, se le acopla un carrier o potenciadores en la respuesta inmunogenica del animal (adyuvantes) o Se coloca al animal un ltimo refuerzo de fusin 3 das antes de su sacrificio. La fusin celular o entre: linfocitos B (clulas del bazo del animal inmunizado); sern estas clulas las que le brinden la caracterstica de productora de antgenos, y las clulas tumorales (mieloma) que le otorgara la inmortalidad y la proliferacin a la clula fusionada (HIBRIDOMA). o requisitos de la clula tumoral (mieloma): ausencia de produccin de Ig propia, mitosis rpidas; inductoras de fusin celular, poseer los marcadores necesarios para seleccionar las clulas fusionadas. o Seleccin de hibridomas: un hibridoma est formado un linfocito B mas una clula tumoral, ambos fusionados; pero no todos los linfocitos van a fusionarse con las clulas tumorales; por lo tanto tenemos que seleccionar solamente a las clulas fusionadas, es decir a los hibridomas, para esto se utiliza un medio con un sustrato para una enzima codificada por un gen del linfocito B; entonces todas las clulas que no posean el gen que codifica la enzima para el sustrato perecern, as las primeras en perecer son las clulas tumorales no fusionadas (por no presentar el gen para la enzima); luego los linfocitos perecen porque aun presentando el gen su tiempo de vida mximo en un cultivo es de solo 10 das; por lo tanto solamente obtenemos en el cultivo hibridomas que pudieron sobrevivir gracias al gen suministrado por el linfocito B.

o o

La fusin celular se realiza 3 o 4 das despus de la ultima inoculacin del antgeno La fusin es ayudada por el polietilglicol.

Ensayos de especificidad frente al antgeno o Es el punto ms critico en la produccin de anticuerpos monoclonales. o Caractersticas de las tcnicas utilizadas: sensibles, rpidas, simples, automatizadas y que brinden un control positivo y negativo. o Tcnicas utilizadas: radioinmunometricas y enzimoinmunimetricas. o Los cultivos que sean positivos a la reaccin deben ser clonados rpidamente. o Algunas de las clulas pueden perder un cromosoma y originar un cultivo biclonal o multiclonal. o Los cultivos biclonales ocasionan la prdida de capacidad para producir anticuerpos en una clula productora originalmente buena.

1.2Produccin de anticuerpos In vivo: se obtiene mg/ml de liquido asctico In vitro: se obtiene g/ml de sobrenadante de cultivo

1.3Purificacin de anticuerpos Es la separacin de anticuerpos de: protenas, fluidos biolgicos o componentes del medio de cultivo mediante mtodos cromatograficos (mtodos fsicos de separacin de mezclas complejas). 1.4Anticuerpos monoclonales humanos La clula productora de anticuerpos (linfocito B) puede obtenerse de: o amgdalas: no es idnea por presencia bacteriana o bazo: idneo pero de difcil acceso o sangre perifrica: no es idnea pero es la nica opcin los linfocitos se obtienen de personas que han sido inmunizadas, siguiendo una pauta determinada, haber padecido una cierta enfermedad, o haber estado expuesto a un inmunogeno de manera casual. Una vez obtenidos los linfocitos se procede al proceso de inmortalizacin, existiendo para este proceso varias opciones: o Fusin: no funciona en humanos o Transformacin de linfocitos: se utiliza el virus de Epstein-Barr que se inserta el genoma del linfocito B, aun as existen diversas complicaciones para este proceso: puede que no ocurra la transformacin del linfocito B; si se logra transformar puede que la produccin de anticuerpos baje luego de algn tiempo o en el mejor de los casos, si se produce la formacin de anticuerpos, las cantidades son mnimas. o Transformacin fusin: se trata de utilizar de ambos procesos pero aun as la produccin de anticuerpos monoclonales es muy difcil de conseguir.

1.5anticuerpos Bifuncionales Son anticuerpos, a menudo monoclonales, donde cada uno de los dos sitios que unen los antgenos son especficos para un DETERMINANTE ANTIGNICO DIFERENTE. Son anticuerpos artificiales producidos por la fusin de clulas de hibridomas y linfocitos, fusin de dos hibridomas .Funcionan como mediadores principales de la citotoxicidad de las clulas diana y se ha demostrado que son eficientes en el direccionamiento de drogas, toxinas, haptenos marcados isotpicamente y clulas efectoras hacia tejidos enfermos, principalmente tumores.

1.6.os Anticuerpos Recombinantes Los anticuerpos recombinantes consisten slo en la regin de enlace del antgeno y se producen con la tecnologa del ADN recombinante, que permite actuar en el ADN de los organismos y, por ende, en sus caractersticas genticas, de manera especfica y selectiva. De hecho, permite extraer el ADN de un organismo, identificar y separar la porcin que interesa, e introducirla en el ADN de un organismo diferente, en el que seguir desempeando su funcin. Los anticuerpos recombinantes son producidos principalmente en bacterias; stas ofrecen un recurso gentico estable y son fciles de manipular. La expresin y la purificacin de los anticuerpos recombinantes a travs de fermentaciones bacterianas son menos costosas y ms sencillas, y requieren menos tiempo. 1.7.Aplicaciones De Los Anticuerpos Monoclonales: Los anticuerpos monoclonales estn siendo utilizados en todos los campos de las biolgicas, ejemplos: Inmunoquimica. Mapeo gentico Estudio de antigenos de histocompatibilidad. Estudio de antigenos de diferenciacin de clulas tumorales Purificacin de sustancias biolgicas Desarrollo de nuevo inmunoensayos. Reactivos de diagnostico. Reactivos teraputicos parasitologia

1.8.Aticuerpos Cataliticos Los anticuerpos potencialmente pueden unirse a los estados d transicin en cualquier molcula. Al estabilizar estos estados los anticuerpos se comportan como enzimas. Los anticuerpos tienden a unirse con estructuras en un estado de baja energa. Como no se pueden formar frente a los estados de transicin de las molculas, por su inestabilidad, se busca una molcula estable, anloga al estado de transicin de otra que se pretenda catalizar. De esta manera el anlogo puede actuar como antgeno y producir anticuerpos que a modo de enzimas, presentan alta afinidad por los estados de transicin de la molcula a catalizar. Para producir anticuerpos catalticos se usa anlogos de los reactivos en estado de transicin como haptenos para generar la

produccin de anticuerpos, los anticuerpos se aslan del suero de los animales y se analizan para encontrar el anticuerpo monoclonal que cataliza la reaccin seleccionada. Adquieren capacidad para distinguir las diferentes formas estereoqumicas de una molcula, son estere especficos, desempeando un importante papel en infinidad de procesos industriales, incluida la sntesis de sustancias teraputicas. Mediante hipermutacin somtica, generado en una segunda inmunizacin puede mejorar su eficacia. Anlisis revelan que el anticuerpo obtenido (maduro) presenta una afinidad de unin, por el hapteno (no induce por s misma la formacin de anticuerpos pero al unirse a una protena transportadora como la albmina estimula una respuesta inmunitaria), 30 000 veces mayor que el anticuerpo inmaduro. La finalidad de este proceso es refinar la cavidad que reconocer al antgeno.

Aplicaciones Desintoxicacin de cocana: Potencial aplicacin en la industria farmacutica. Al romper la molcula de cocana en enlaces especficos, eliminado sus efectos txicos. Se utiliza en el tratamiento de pacientes adictos a cocana para evitar los efectos letales de la sobredosis de cocana.

Destruccin de clulas cancergenas. Las clulas cancergenas contienen determinantes nicos en su superficie que no tienen las clulas normales, llamados antgenos de clulas tumorales. Los Anticuerpos se unen especficamente a los antgenos de las clulas tumorales, as los frmacos usados para tratar cncer se pueden dirigir directamente al tumor. El Anticuerpos tiene dos sitios de unin a antgeno diferentes. Uno contra el antgeno de las clulas tumorales y otro contra el profrmaco. Los anticuerpos dirigidos contra antgeno tumoral se unen a las clulas tumorales, con enzimas conjugadas La enzima une el profrmaco. Cataliza la ruptura y la liberacin del frmaco. El frmaco que ahora se localiza en el tumor acta contra las clulas tumorales, en algunos casos promoviendo la lisis celular

2. REACCIONES SEROLOGICAS: 2.1. Reacciones de Precipitacin: Se basa en que se enfrentan antgenos solubles a los anticuerpos especficos correspondientes, formando complejos antgeno anticuerpo insolubles. Son reacciones reversibles en la que si hay exceso de reactante provoca la disociacin del complejo y asi, la desaparicin de los complejos insolubles (Resolubilizacion).

2.1.1. En medio liquido: el precipitado formado del contacto una concentracin fija de anticuerpos y concentracin variable de antgeno; sigue la curva de Heidelbeg y Kendal :
RAMA ASCENDENTE: Exceso de Ac. Precipitado + RAMA DESCENDENTE: Exceso de Ag. Precipitado -

PUNTO DE EQUIVALENCIA No hay se produce ms precipitado(/)

AUMENTA CONCENTRACION DE ANTIGENO

Epitopos del antgeno saturados= no unin entre Ac-Ag.= Poca Precipitacin No captura Ac = no se forma Precipitado (poco).

Abundantes Precipitados= unin cruzada de Ag-Ac

Aunque estos mtodos no estn entre los ms sensibles (ya que dos hay una miso valor para dos resultados distintos) es ms frecuente de usar por su simplicidad, repetitividad y facilidad de automatizacin .La cuantificacin de la formacin del ppdo. Se realiza en funcin de la dispersin a la luz que produce3n la Nefelometra o de la diferencia de luz incidente y luz trasmitida (turbimetria)

2.1.2 En medio Semislido: Oudin demostr que un sistema e Ag- Ac. nicos daban una sola banda de precipitacin, mientras que la mescla de varios antgenos y correspondientes anticuerpos generaban mltiples bandas en un medio gel. Desde entonces las mas importantes son la doble difusin y a Inmunodifusion:

DOBLE DIFUSION: (OUCHTERLONY) Cuando un Ag. Y Ac. Difunden libremente en el gel se forma una banda de Precipitacion para alcanzar la Zona de Equilibrio, pudindose ver a simple vista:lo cual indica la pureza del preparado mientras que la presencia de varias indica que nos encontramos frente a un antgeno complejo, formando muchas protenas distintas.en este casos se debe preparar :
IDENTIDAD: Ac precipita Ag de ambos lado ,Ac reconoce rea similares en una familia de Ag.=
Lneas desaparecen

Ac

IDENTIDAD PACIAL: Ambos Ag comparten un epitopo comn = una lnea de prolonga.

Ag1

Ag 2

NO IDENTIDAD: Lneas de desaparece, se cruzan = Los Ac. Reconoce Epitopos diferentes.

Se usa para demostrar presencia de Ac especficos frente a antgenos de agentes infecciosos, o a la presencia determinados antgenos en muestras biolgicas, si se dispone de antisueros de reactividad conocida.

INMUNODIFUSION RADIAL (MANCINI): Para determinar cuantitativamente la cantidad de protena (Ag.) presente en la solucin, se basa en incorporar al medio gel una concentracin de Ac. Especficos y dejar difundir la solucin con la Protena. Cuando llega a su Eq. Se forma un anillo de precipitacin estable observable a simple vista.Los antgenos muy concentrados forman anillos grandes y los pocos concentrados pequeos y el rea del circulo (dimetro al cuadrado) es directamente proporcional a la concentracin de Ag.

2.2.Reacciones De Aglutinacin La aglutinacin se define como el agrupamiento de antgenos particulados por la accin de antcuerpos especficos .Se produce el reconocimiento y la unin, seguida de la formacin de agregados visibles. La aglutinacin es slo semicuantitativa a diferencia de las reacciones de precipitacin, pero con la ventaja de una mayor sensibilidad y el seguir a simple vista el resultado de la reaccin Pueden producirse resultados falsos negativos (aglutinacin incompleta) debido a que los anticuerpos no consiguen unir a las partculas adyacentes. A este tipo de anticuerpos, se les llama anticuerpos o aglutininas incompletas. La causa del fenmeno puede deberse a : Viscosidad : su aumento potencia la aglutina.

Clase de anticuerpos : IgG menos capaces que las IgM. Fenmeno de zona: exceso de anticuerpos, exceso de antgeno.

De acuerdo a Coombs los tres requerimientos de las pruebas de aglutinacin son: La disponibilidad de una suspensin estable de clulas Presencia de uno mas antgenos en la superficie Conocimiento que se pueden encontrar anticuerpos incompletos

2.2.1AGLUTINACIN DIRECTA Una clulas o antgeno particulado insoluble, se aglutina directo por el anticuerpo. Un ejemplo es la aglutinacin de eritrocitos A por antisuero anti A. Lo nico que se necesita es un medio con la fuerza inica adecuada y anticuerpos con dos o ms sitios de fijacin , que se unan a partculas antignicas distintas. En algunos casos los hemates y bacterias se tratan con enzimas, con el fin de potenciar la aglutinacin. Entre los usos principales de la aglutinacin directa estn el tipado de grupos sanguneos, serotipado de bacterias intestinales, diagnostico de brucelosis, toxoplasmosis, etc.

2.2.2AGLUTINACIN INDIRECTA Se basa en la transformacin de antgenos solubles en insolubles, mediante su captura sobre la superficie de clulas o partculas inertes. Hay una serie de antgenos que se fijan directamente sobre los globulos rojos, pero en la mayora de los casos, los antgenos solubles necesitan para unirse de la ayuda de agentes acoplantes. Adems de los hemates se pueden pueden usarse partculas inertes como bentonina y latex.

a) Aglutinacin de Ltex Se utiliza en el diagnostico de enfermedades producidas por hongos, bacterias, parsitos ; en algunas infecciones virales se utiliza para el cribado de algunos anticuerpos especficos. b) Hemaglutinacin indirecta ( HAI )

Se utilizan antgenos ligados a glbulos rojos para detectar anticuerpos especficos frente a bacterias y parsitos, la confirmacin de sfilis, diagnostico de infecciones por el virus Herpes Zoster, etc. Los anticuerpos detectados pueden cuantificarse mediante titulacin. El proceso se lleva a cabo mediante diluciones seriadas en placas multipocillos en fondo de U. Si hay suficientes anticuerpos para aglutinar se forma una malla que se deposita en el fondo. Cuando no hay anticuerpos suficientes las clulas sedimentaran en forma independiente y resbalaran por los bordes del pocillo. c) Inhibicion de la aglutinacin Se basa en la competencia entre antgenos solubles y particulados para combinarse con los anticuerpos presentes en la muestra. Normalmente se hacen reaccionar primero el antgeno soluble y los anticuerpos presentes en el suero y luego se comprueba si este pretratamiento inhibe la aglutinacin de las partculas o clulas indicadoras. Se realiza para el diagnostico del embarazo. d) Reacciones que usan antiglobulinas Sirven para detectar la presencia de aglutininas incompletas mediante el uso de un segundo anticuerpo ( antiglobulina ) que se une a ellas, provocando as la formacin de agregados. La antiglobulina es el eslabn que une a los anticuerpos fijados sobre los eritrocitos adyacentes pero demasiado separados . Se le conoce como el test de Coombs y puede ser directo e indirecto. Directo: detecta la presencia de glbulos rojos sensibilizados por anticuerpos en pacientes con anemias autoinmunes. Indirecto: investiga la presencia de anticuerpos incompletos libres en el suero del paciente. La reaccin de Waaler Rose detecta la presencia del factor reumatoide que es un autoanticuerpo de la clase IgM que reacciona con el fragmento Fc de las IgG. e) Reacciones de Floculacin Se caracteriza porque los agregados que se producen en la reaccin permanecen en suspensin, posiblemente a la naturaleza del antgeno. Ejemplo la reaccin VDRL utilizada para descartar sfilis. 2.3. Inmunofluorescencia La inmunofluorescencia es una tcnica de inmunomarcacin que hace uso de anticuerpos unidos qumicamente a una sustancia fluorescente para demostrar la presencia de una determinada molcula. La inmunofluorescencia, como todos los inmunoensayos, aprovecha la capacidad que tienen los anticuerpos para unirse con alta especificidad a una determinada molcula blanco; pero se diferencia de otras tcnicas inmunoqumicas en que aqu

la marca unida al anticuerpo es una molcula fluorescente tal como por ejemplo, el isotiocianato de fluorescena. El anticuerpo marcado se hace reaccionar contra un preparado biolgico y luego se expone la muestra asi tratada a una fuente de luz de onda corta (ultravioleta o azul) seleccionada por medio de un monocromador. Esta luz de onda corta genera un fenmeno de fluorescencia en la molcula marcadora que a su vez emite luz a una longitud de onda mas larga (verde, amarillo o naranja). Esta luz emitida puede ser cuantificada con facilidad por fotometra o en el caso de tratarse de preparados histolgicos, puede ser observada por medio de un microscopio de fluorescencia. En el caso de la utilizacin de la inmunofluorescencia como mtodo de tincin para microscopa ptica, el fluorescente revela la localizacin a nivel celular o subcelular de la molcula diana.. Existen varios diseos de microscopios que pueden ser utilizados para el anlisis de preparados histolgicos marcados por inmunofluorescencia. El mas simple de todos es el microscopio de epifluorescencia, aunque tamben es ampliamente utilizado el microscopio confocal. Tambin es posible utilizar varios tipos de tcnicas microscpicas de alta resolucin.

Tipos de inmunofluorescencia Existen dos tipos de tcnicas de inmunofluorescencia; primaria (o directa) y secundaria (o indirecta). Primaria o IFD

. La inmunofluorescencia directa (IFD) es un procedimiento de un solo paso que se utiliza para demostrar el depsito de inmunoglobulinas, complemento y fibringeno en la piel. Para ello se obtiene una biopsia del paciente y se incuba con anticuerpos marcados con fluoresceina y dirigidos contra las inmunoglobulinas. Si estos se han fijado podrn ser visualizados mediante un microscopio de inmunofluorescencia. La inmunofluorescencia directa nos permite observar depostos de inmunoglobulinas en las diferentes estructuras epidermicas, asi tendremos depsitos a nivel del espacio intercelular (en las enfermedades contra anticuerpos

constituyentes de los desmosomas), nivel de la unin dermo-epidermica (en enfermedades con anticuerpos contra protenas de la unin dermo-epidermica,), anticuerpos despositados en los vasos dermicos (se observan en las vasculitis) o en dermis papilar (dermatitis herpetiforme), o hallazgos combinados (ICS y MBZ, como en en pnfigo paraneoplsico

Secundaria o IFI

La inmunofluorescencia secundaria, o indirecta (tambin conocida por sus siglas IFI) La inmunofluorescencia indirecta (IFI) es una tcnica de dos pasos que tiene como objetivo la demostracin de anticuerpos circulantes en el suero del paciente dirigidos contra estructuras epidrmicas. Para ello se incuba un sustrato (piel de conejo) con el suero del paciente a estudio y posteriormente se incuba con anticuerpos marcados con fluorescena dirigidos contra las inmunoglobulinas.

2.4.Enzimoinmunoensayo (ELISA)
La posibilidad de usar enzimas como marcadores de anticuerpos o antgenos ha dado lugar a la aparicin de los mtodos inmunoenzimaticos, que permiten complementar,e incluso reemplazar a mtodos que utilizan otros marcadores,tales como la inmunoflorescencia o el radioinmunoensayo. El fundamento es el mismo para todas las variantes: uno de los componentes de la reaccin,unido a una enzima recciona con el otro(naturalmente asociado a tejidos o unido artificialmente a un soporte) detectndose despus la actividad enzimtica con la yuda de sustratos especficos. Las enzimas que se utilizan con mayor frecuencia: Peroxidasa (extraida del rabano) Fosfatasa alcalina (extraida de Escherichia coli o de intestino de ternera) Galactosidasa (extraida de E. coli)

Los conjugados enzima-anticuerpo se preparan con Ac de alta afinidad mediante unin covalente,en condiciones que respeten tanto la actividad biolgica de la enzima como la del anticuerpo.

Alguno sustratos especficos para medir las actividades enzimticas dan productos de reacciob solubles y coloreados,lo que permite su cuantificacin midiendo la densidad ptica. Los sustratos habituales para peroxidasa son o-dianisidina, o-fenilenodiamina (OPD) y tetrametilbencidina(TMB). Para fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa se usan sustratos que se hidrolizan por la accin enzimtica liberando nitrofenol soluble. Existen sustratos que tras la accin enzimtica liberan productos fluorescentes,el mas eficaz es el metil-umbeliferil-galactopiranosido, que hidrolizado por la beta-galactosidasa,produce metil-umbeliferona especialmente fluorescente.

DETERMINACIONES CUANTITATIVAS

Se describieron inicialmente para la dosificacin de antgenos en liquidos biolgicos y posteriormente se aadi la dosificacin de anticuerpos dirigidos contra antgenos proteicos,polisacridos y extractos particulares como los de los virus,bacterias,parasitos y hongos . Las pruebas pueden hacerse de dos formas: a) En fase hetereogenea : necesita una fase solida a la que esta ligado un componente para inmovilizar al otro componente,asociado a la enzima y poder asi evaluar la actividad enzimtica del complejo antgeno-anticuerpo enzima. b) En fase homognea: la dosificacin del complejo antgeno-anticuerpo-enzima se efectua directamente en la mezcla de la reaccin.

DETERMINACIN DE ANTGENOS

A.- No competitiva Sandwich El antgeno a dosificar se captura en un primer tiempo por el anticuerpo especifico inmovilizado sobre el soporte,y la cantidad del mismo que ha sido retenida se revela con otro anticuerpo de la misma especificidad acoplado a una enzima.Para utilizar esta variante es necesario que el antgeno tenga varios epitopos de modo que tras su reaccin con el anticuerpo inmovilizado,pueda reaccionar todava con el segundo anticuerpo especifico marcado.

B.- Inmunometrica En esta metodologa se inmoviliza un antgeno,idntico al que se quiere dosificar,sobre la fase solida. A continuacin se incuba la muestra que contiene el antgeno en concentracin desconocida con una cantidad conocida del anticuerpo especifico marcado con la enzima correspondiente.

C.- CompetitivaEl antgeno a dosificar se mezcla con una cantidad determinada de antgeno marcado para que ambos compitan en su fijacin sobre una cantidad limitada de anticuerpos especficos inmovilizados sobre la fase solida. Cuando en la muestra a

dosificar no hay antgeno,la actividad enzimtica es mxima y va disminuyendo cuando aumenta la concentracin antignica ,pues se fija menos antgeno marcado.

DETERMINACIN DE ANTICUERPOS

A.- Mtodo indirecto Los anticuerpos a dosificar se capturan en un primer tiempo por el antgeno correspondiente inmovilizado sobre el soporte,y la cantidad capturada se revela con un segundo anticuerpo (anti-inmunoinglobulina) acoplado a una enzima.La actividad enzimtica es directamente proporcional a la cantidad del anticuerpo a dosificar presente en la muestra. B.-Mtodo de captura El mtodo anterior no siempre es adecuado para determinar anticuerpos del isotipo IgM,pudiendo producirse reacciones falsamente positivas y falsamente negativas.Los falsamente positivos se producen por la presencia en la muestra de IgM anti-IgG (factor reumatoide) que puede reaccionar con el anticuerpo marcado,los falsamente negativos,por exceso de IgG especifica,que compite con la IgM por la cantidad limitada de antgeno inmovilizado sobre el soporte.

INMOVILIZACIN SOBRE NITROCELULOSA

Las membranas de nitrocelulosa retienen una gran cantidad de protenas y permiten,por tanto,la deteccin de compoque se encuentran en pequea cantidad en una mezcla proteica. Tras la inmovilizacin,estas protenas pueden detectarse hacindolas reaccionar con anticuerpos marcados con enzimas y revelando posteriormente la actividad enzimtica. La inmovilizacin sobre la membrana puede hacerse por dos procedimientos: A.- Mtodo de las manchas de las manchas o Inmuno-dot Se deposita una pequea gota de la solucin de protenas sobre la membrana y se deja secar.Una vez inmovilizadas las protenas,se tratan con los anticuerpos a determinar y posteriormente con el anticuerpo marcado(antiinmunoglobulina). Tras ello se incuba con el sustrato adecuado que, en este caso, debe dar productos coloreados pero insolubles. El resultado ser la aparicin de una mancha coloreada en el lugar de la membrana donde se inmovilizo la protena antignica. B.- Inmunotransferencia Cuando se separan las protenas presentes en una mezcla mediante la electroforesis en un gel, es difcil su caracterizacin o reconocimiento, pues: 1.- si es un gel de agaraosa,tiene mucha porosidad y deja penetrar sin dificultad los anticuerpos marcados,pero estos difunden con facilidad en su seno dificultando la interpretacin.

2.- si es un gel con porosidad baja (p. ej. Acrilamida), no permite la penetracin de los anticuerpos marcados.

ELECCION DE UNA PRUEBA DIAGNOSTICA

Como se ha visto anteriormente,existen muchos tipos de pruebas,varias de las cuales pueden aplicarse para el diagnostico de una misma enfermedad. Es evidente que en este caso,cada uno de ellas aporta informacin respecto a alguna caracterstica o fase del proceso patolgico,pues si todas fuesen iguales,bastara con utilizar siempre una sola de ellas. Las distintas caractersticas de una prueba respecto a su utilidad en el diagnostico vienen dadas por : Sensibilidad: Capacidad de dar resultados positivos en muestras de pacientes de una determinada enfermedad. Especificidad: Capacidad para discriminar entre enfermos y no enfermos deuna determinada enfermedad. Valor predictivo: Capacidad de la tcnica para distinguir entre sujetos que sufren una determinada enfermedad. Este valor predictivo se divide a su vez: A.- Positivo.- Es la frecuencia de la enfermedad entre los pacientes con resultado positivo. B.- Negativo.-Es la frecuencia de ausencia de la enfermedad en pacientes con resultado negativo. Eficacia: Porcentaje de pacientes clasificados correctamente por la prueba. Positivo verdadero: Sujeto enfermo correctamente clasificado por la prueba. Positivo falso: Sujeto o enfermo incorrectamente clasificado por la prueba. Prevalencia: Porcentaje de sujetos con la enfermedad en un momento dado.

En el diagnostico inicial el criterio principal es el valor predictivo y dentro de l, el referido a resultados positivos y que ser tanto mayor cuanto ms elevada sea la prevalencia de la enfermedad. Esto explica el porqu una buena prueba diagnstica puede fallar cuando se utiliza para un rastreo general, ya que en este caso la prevalencia en el conjunto de la poblacin cae bruscamente. En cambio cuando se incluye al paciente entre pacientes sospechosos se le sita en una poblacin de prevalencia alta, son lo que aumenta de forma notable su valor predictivo.