INFORME DE LABORATORIO ACTIVIDAD DE ENZIMAS PROTEOLITICAS

ABSTRACT Papain is an enzyme extracted from papaya proteolytic capable of digesting food protein. Its applications are in different areas. Today it is used in the food industry as a meat tenderizer and in the clarification of beer and other beverages. INTRODUCCIN Las plantas son una fuente tradicional de un gran nmero de enzimas para distintos usos a nivel mundial, como son principalmente, proteasas, amilasas, lipasas, etc. La Carica papaya es un vegetal totalmente adaptado a nuestra zona, su rpido crecimiento y la cantidad de aplicaciones posibles que tienen los productos obtenidos del mismo promueven un estudio detallado de los compuestos exudados presentes en el mismo. El aprovechamiento completo tanto de los frutos frescos, en la elaboracin de dulces regionales y la extraccin del ltex exudado podran originar un beneficio integral de dicho fruto. Las proteasas se refieren a un grupo de enzimas que tienen como funcin cataltica hidrolizar enlaces peptdicos de protenas. Cada tipo de proteasa tiene la capacidad de hidrolizar una clase especfica de enlaces peptdicos. En este caso la papna de 343 residuos, es una protena que pertenece al grupo de las cistein proteasas (es decir las proteasas en cuyo sitio cataltico encontramos una cistena), su peso molecular es de 33 KDa [3] y su precursor de 38.9 KDa. Para que la enzima sea activa es necesario hidrolizar su precursor en un sitio determinado en este caso entre los residuos 19 y 133. Esta enzima es requerida en reas como la farmacutica y la cosmtica, donde se utiliza en la fabricacin de cremas des manchadoras de la piel, que consumen aproximadamente un 10% de la produccin mundial. Por otra parte, la papana es uno de los componentes utilizados por laboratorios oftalmolgicos para fabricar tabletas enzimticas para la limpieza de lentes de contacto. Paralelamente, se comienzan a descubrir otras aplicaciones de la papana en negocios como la industria textil para macerar las fibras de lana y algodn, papelera, curtido de cuero, as como en procesos de depuracin de residuos lquidos y en investigacin de qumica analtica.

Tambin forma parte de suplementos dietarios, debido a su capacidad de favorecer el proceso digestivo, y de procesos de depuracin de aguas.

OBJETIVOS * Reconocer la actividad de las enzimas proteolticas mediante la prueba de coagulacin. * Distinguir algunos factores que afectan la actividad de accin enzimtica. * Comprender los mecanismos de accin enzimtica. * conocer en ejemplos prcticos las funciones enzimticas.

JUSTIFICACION Las enzimas son molculas proteicas que catalizan reacciones qumicas, siempre que sean termodinmicamente posible: una enzima hace que una reaccin qumica que es energticamente posible, pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones, las enzimas actan sobre unas molculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en molculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las clulas necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimticas.

Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la energa de activacin de una reaccin, de forma que se acelera sustancialmente la tasa de reaccin, de forma que se acelera sustancialmente la tasa de reaccin. Las enzimas no alteran el balance energtico de las reacciones en que intervienen, ni modifican, por lo tanto, el equilibrio de la reaccin pero consiguen acelerar el proceso incluso millones de veces. Una reaccin que se produce bajo el control de una enzima o de un catalizador en general, alcanza el equilibrio mucho ms deprisa que la correspondiente reaccin no catalizada. MATERIALES Y REACTIVOS 1 Gradilla 12 Tubos de ensayo 1 Pipeta graduada de 1m 1 Pipeta graduada de 5ml 1 Mortero con mango 1 pinza para tubo de ensayo 1 Embudo 1 Pipeteador 1 Erlenmeyer de 250 ml Balanza Incubadora Agua destilada Bicloruro de mercurio (HgCl2) 0.05M Cisteina (C3H7NO2S) 0.2 M EDTA 0.2M Perxido de hidrogeno al 1%

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD DE ENZIMAS PROTEOLTICAS. Al presente existen varios mtodos para la determinacin de proteasas (papana). Cada uno tiene caractersticas ventajosas y desventajosas frente a losotros y se usan de acuerdo a los requerimientos particulares de la determinacin. Mtodo de Balls y Hoover (66), conocido como el mtodo de coagulacin de la leche, es, sin duda, uno de los mtodos mas expeditos para determinar actividad enzimtica de una proteinasa. Se toma como indice de actividad proteoltica, el tiempo necesario para que una cantidad conocida de enzima coagule un determinado volumen de solucin de leche. La actividad se expresa en trminos de unidades de leche coagulada por g de preparado enzimtico. La unidad de leche coagulada se la define coma la cantidad en peso de un preparado enzimtico necesario para coagular 5 ml de solucin de leche estndar por minuto, cuando la temperatura es de 40C y el pH 6. La principal desventaja de este mtodo radica en el hecho de no medir la proteolisis total, es decir, la hidrlisis de un substrato de protena, pero, por el contrario, mide la actividad de la coagulacin de la leche. Afortunadamente, sin embargo, la coagulacin de la leche parece ser una propiedad caracterstica de los componentes proteolticos de este grupo de enzimas y puede ser usada con seguridad en la medicin proteoltica.

DESCRIPCION Y PROCEDMIENTO DE LA PRCTICA PREPARACIN DE LA SOLUCIN ENZIMTICA Macerar 50 g de papaya en un mortero sin adicionar agua Filtrar a travs de una doble capa de gasa recogiendo el filtrado en un Erlenmeyer. Rotular el filtrado como solucin enzimtica. EFECTO DE SUSTACIAS QUMICAS SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA PAPAINA REACTIVOS (ml) 1 2 3 solucion enzimatica 0.5 0.5 0.5 agua destilada 0.1 0.1 peroxido de hidrogeno 1% bicloruro de mercurio 0.05 M 0.1 MEZCLAR, DEJAR EN REPOSO POR 15 MINUTOS Y ADICIONAR agua destilada 0.4 _ 0.4 EDTA 0.2 M _ 0.2 _ Cisteina 0.2 M _ 0.2 _ 4 0.5 0.1 5 0.5 0.1 6 0.5 0.1 -

_ 0.2 0.2

0.4 _ _

_ _ _

En un tubo de ensayo adicionar 0.5 ml de solucin enzimtica, adicionar 2.5 ml de leche en los tubos 1, 2, 3, 4 y 5. En el tubo 6 se adiciona 2.9 ml de leche. Mezclar e incubar a 50 grados C Observar la formacin del coagulo

En esta prctica, se adicionaron todos los reactivos sin dejar en reposo 15 minutos ciertos reactivos previamente mencionados en la tabla.

La actividad enzimtica est regulada principalmente por los siguientes factores: concentracin de la enzima, concentracin del sustrato, temperatura y pH del medio.

Debido a la amplia especificidad de la papana y su gran estabilidad se emplea en la industria de los alimentos, en la produccin de concentrados, en medicina para controlar problemas digestivos y en la industria para el tratamiento de textiles y cueros.

La capacidad de la leche se fundamenta en que normalmente la casena de la leche se encuentra en forma de micelas y la digestin con una proteasa separa un glicopptido de la molcula de casena desestabilizando la micela y causando coagulacin.

La papana en su estado natural presenta una baja actividad enzimtica debido a la presencia en este estado de enlaces azufre azufre (S-S) en el sitio activo de la molcula. Para que la enzima obtenga su capacidad cataltica es necesario transformarlos enlaces S-S a enlaces sulfhdricos libres (S-H). La activacin de la enzima se puede lograr adicionando agentes reductores moderados como la cistena, sulfuros, sulfitos y cianuros. Adems de la adicin de agentes reductores tambin se utiliza un agente quelante como el EDTA el cual elimina la presencia de iones divalentes como Cd, Zn, Fe, Cu, Hg y Pb los cuales catalizan la formacin de enlaces azufre azufre (S-S).

CUESTIONARIO 1. Zimgeno

Un zimgeno o proenzima es un precursor enzimtico inactivo, es decir, no cataliza ninguna reaccin como hacen las enzimas. Para activarse, necesita de un cambio bioqumico en su estructura que le lleve a conformar un centro activo donde pueda realizar la catlisis. En ese momento, el zimgeno pasa a ser una enzima activa. El cambio bioqumico suele ocurrir en un lisosoma, donde una parte

especfica de la enzima precursora se escinde del resto para activarla. La cadena de aminocidos que se libera por la activacin se llama pptido de activacin. Funcin Los zimgenos son utilizados en muchas reacciones biolgicas, como en la digestin o en la coagulacin sangunea. Son un brillante ejemplo de regulacin endgena de las enzimas, de cmo controlar su funcin. Las modificaciones que sufren los zimgenos son irreversibles, por lo que para poder detener las reacciones que llevan a cabo es necesario un inhibidor de la enzima a la que dan lugar. Cabe destacar el ejemplo del tripsingeno (zimgeno), que da lugar a la tripsina (enzima), que a su vez activa otros zimgenos. Para poder detener la activacin de los zimgenos, la tripsina no se puede volver a convertir en tripsingeno, sino que debe secretarse un inhibidor de la tripsina para detener su accin. A continuacin se indican algunos de los zimgenos ms conocidos:

Angiotensingeno. Tripsingeno. Quimotripsingeno. Pepsingeno. La mayor parte de las protenas del sistema de coagulacin. Algunas de las protenas del sistema del complemento. Procaspasas. Proelastasa. Prolipasa. Procarboxipolipeptidasas.

2. Si hubo errores en la prctica, Cuales fueron sus causas? Las causas presentadas

3. Aplicaciones de la papana. Industria textil: se usa para desengomar la seda, por lo general con un tratamiento previo al bao desgomizante principal. Tambien se utiliza en la industria de la lana para reducir el encogido al lavar y para mejorar la calidad de las tinturas usadas. Industria medicinal: En el tratamiento de la difteria, lceras sifilticas, eczemas, psoriasis, la cera que se forma en los odos y herpes. Tambin se han encontrado aplicaciones como analgsico y antiinflamatorios en las dismenorreas femeninas y recientemente en artrosis y osteoporosis. Industria de jugos: es muy utilizada en el pre-tratamiento de las frutas destinadas a jugos y aceites esenciales, y en vinos como clarificante en situacin similar a la industria cervecera. Industria diettica: se emplea en la produccin de alimentos especiales para bebs, ya que mejoran la capacidad de asimilacin de los alimentos al degradar los compuestos de alto peso molecular a cadenas mas cortas de fcil incorporacin al torrente circulatorio alimenticio del beb.

Ventaja de la papaina frente a otras enzimas: La papana posee ventajas frente a otras enzimas naturales en los siguientes aspectos: Calidad y actividad enzimtica Estabilidad en condiciones desfavorables de temperatura humedad y presin atmosfrica Se encuentra en alta concentracin en el ltex que se extrae de la papaya. Posee un alto valor comercial por la diversidad de usos que presenta. CONCLUSIONES Una de las principales propiedades de la papana es su estabilidad. Adems cuando es sometida a reactivos que causan desnaturalizacin en otras enzimas esta sigue conservndose. Segn la informacin obtenida en la investigacin para realizar este informe, la temperatura ptima para la mayora de las reacciones enzimticas se halla

entre 30Cy 40C. Al aumentar la temperatura, la velocidad de reaccin aumenta y, para casi todas las enzimas, un incremento de 10C duplica e incluso triplica la velocidad de reaccin. Sin embargo, ese mismo aumento de temperatura acelera tambin la inactivacin de la enzima por desnaturalizacin trmica. la temperatura ptima utilizada durante el experimento para la papana esta en un rango entre los 35C y 45C, por lo que en algunos momentos esta temperatura aumentaba y esto influye en los resultados obtenidos.