Prctica N 14 DETERMINACIN CUALITATIVA Y SEMICUANTITATIVA DE GLUCOSA EN ORINA Y SU DIFERENCIACIN DE OTROS AZUCARES REDUCTORES I.

INTRODUCCIN Los riones forman la orina mediante tres procesos: la filtracin glomerular, reabsorcin tubular y secrecin tubular. Durante estas etapas la orina en formacin adquiere diversas concentraciones y solutos que difieren con la orina que se excreta. En la orina excretada de sujetos normales no existen cantidades detectables de azcares debido a que en el borde en cepillo de las clulas tubulares proximales se reabsorbe (reabsorcin tubular) la glucosa que se filtra en el glomrulo renal (filtracin glomerular). Este mecanismo se basa en el transporte activo secundario que produce el gradiente de concentracin de Na+. En el epitelio de las clulas tubulares proximales existen dos protenas cotransportadoras de glucosa y sodio (SGLT2 y SGLT1) que utilizando la energa del gradiente de Na+ llevan glucosa al citoplasma celular en contra de un gradiente de concentracin. Luego la glucosa difunde fuera de la clula por el lado basolateral a travs de transportadores de glucosa GLUT2 y GLUT1 a favor del gradiente de concentracin. Sin embargo, en distintas afecciones existe una alteracin de la capacidad de la reabsorcin tubular de la glucosa lo que produce que se excrete este carbohidrato en la orina, lo que se conoce como glucosuria. Este fenmeno es el signo caracterstico de la diabetes tanto tipo I como tipo II. Se produce por el fallo de la regulacin de la glucemia por parte de la insulina que conlleva a aumento de esta. Ante este hecho, la reabsorcin tubular absorbe una cantidad mayor de glucosa de la que en estado basal absorbe; sin embargo, existe un lmite. Este ltimo es de aproximadamente 10mmol/L de glucosa en sangre o de 180 mg/dl. Por lo tanto, la valoracin de la presencia de glucosa urinaria permite descartar patologas en el organismo. Por otro lado, en la orina, adems de glucosa, puede eliminarse muchas otras sustancias reductoras entre las que podemos sealar: Otros azcares reductores: lactosa, fructuosa, galactosa y pentosas. Otros compuestos orgnicos: cido homogentsico, creatinina, cido rico, cido glucornico, cido ascrbico. Algunas drogas y/o sus catabolitos: salicilato cloral, formaldehdo, etc.

Todas ellas pueden dar resultado positivo con el reactivo de Benedict que con relativa frecuencia se utiliza para determinar glucosa en orina, pero como anotamos ste identifica a las sustancias con capacidad reductora y por tanto es de carcter inespecfico. La glucosa puede ser determinada de manera especfica utilizando como reactivo bsico la glucosa oxidasa (mtodo enzimtico), de uso generalizado en clnica.

A pH 7, la glucosa est presente en solucin en forma de hemiacetal cclico, siendo un 63,6% -D-glucopiranosa y un 36,4% -D-glucopiranosa (la proporcin de molculas lineales y de furanosa es despreciable). La glucosa oxidasa se une especficamente a la -D-glucopiranosa y no interacciona con -D-glucopiranosa. Es capaz de oxidar toda la glucosa en la solucin, dado que el equilibrio entre los anmeros y es conducido hacia la forma conforme sta va siendo consumida en la reaccin, dando como productos Dglucono-1,5-lactona y iones H+. Este ltimo interacciona con O2 produciendo H2O2. El perxido de hidrgeno en presencia de peroxidasa produce O tolidina La prueba est basada en que la glucosa urinaria en presencia de oxgeno, por accin de la glucosa oxidasa produce cido glucornico ms perxido de hidrgeno. Este, en presencia de peroxidasa oxida al indicador 0-tolidina (de color azul) ms agua. La finalidad del presente experimento es identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras, utilizando un mtodo especfico a base de glucosa oxidasa y otro inespecfico en base al reactivo de Benedict. II. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS Reactivos a utilizar: Reactivo de Benedict. Tiras impregnadas de glucosa oxidasa prefabricadas (Glucocinta Lilly). Procedimiento: Determinacin de sustancias reductoras en orina mediante el reactivo de Benedict. o Colocar Reactivo de Benedict en un tubo: 5 ml. o Llevar al bao de agua hirviendo por 5 min o exponer el tubo al fuego directo hasta que hierva por 1 min. Cuidar que la llama incida en la parte media y superficial del lquido contenido en el tubo. o Agitar para evitar que el lquido se proyecte hacia fuera del tubo. o Agregar orina problema: 5 gotas. o Colocar en bao de agua hirviendo por 5 min o exponer al fuego directo hasta ebullicin por 1 min. o Observar si hay cambio de color y precipitado. Si aparece un precipitado de color rojo ladrillo, la reaccin demuestra la presencia de sustancias reductoras.

Observamos la formacin del precipitado rojo ladrillo (Orina problema) Para identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras, realizamos la siguiente determinacin con la misma muestra de orina.

No observamos la formacin del precipitado rojo ladrillo (orina de compaero) Determinacin enzimtica de la glucosa en orina (Mtodo de la glucosa oxidasa). Procedimiento: o Introducir la tira impregnada de glucosa oxidasa (Glucocinta) en la orina recin emitida contenida en un depsito de 5- 10 ml. o Observar si a los 60 segundos, despus de humedecida la cinta, adquiere o no color azul.

Compare la intensidad de la coloracin azulada con una escala adjunta que representa aproximadamente las concentraciones preestablecidas de glucosa. No realizamos este procedimiento por falta de la Glucocinta o III. CUESTIONARIO 1. Fundamente la utilizacin del reactivo de Benedict para la deteccin de sustancias con capacidad reductora, incluida la glucosa. El reactivo de Benedict cualitativo es una disolucin alcalina de ion cprico, de color azul intenso. Se prepara de la siguiente forma: en un matraz de un litro se introducen 17,4 g de sulfato cprico cristalino, 173 g de citrato de sodio y 100 g de carbonato de sodio anhidro. Se van disolviendo con agua hasta completar la disolucin a un litro. En un tubo de ensayo se vierten 5 ml del reactivo de Benedict y se calienta a ebullicin. No debe cambiar el color azul. Se aaden 8 gotas de orina que se quiere estudiar y se hierve un minuto. Una turbidez verde indica la presencia de 0,1 a 0,3% de azcar reductor y un precipitado rojo naranja indica que la concentracin de azcar supera el 1,5%. 2. Qu resultados podran obtenerse al tratar una muestra problema de orina, primero con el reactivo de Benedict y luego por el mtodo de la glucosa oxidasa? Si solo se tratase la muestra con el reactivo de Benedict podra errneamente diagnosticarse glucosuria debido a que esta tcnica es inespecfica para cualquier sustancia reductora. Sin embargo, mediante el mtodo de la glucosa oxidasa el cual es especfico se puede corregir la limitacin del reactivo de Benedict. 3. Qu presunciones planteara si una muestra de orina tratada primero con el reactivo de Benedict da resultado positivo y sin embargo, al ser tratada con el mtodo de la glucosa oxidasa, da negativo? La existencia de otros azcares reductores (lactosa, fructuosa, galactosa y pentosas), o compuestos orgnicos (cido homogentsico, creatinina, cido rico, cido glucornico, cido ascrbico) o drogas y sus metabolitos. 4. Ante una prueba positiva de glucosa en orina: Qu presunciones diagnsticas, en relacin a la glicemia del paciente podra plantear? Principalmente diabetes mellitus Secundariamente: - Gota, fiebres eruptivas, el clera, la malaria, la cirrosis heptica y enfermedades orgnicas del sistema nervioso. - Shock emocional - Emocional - Ciertas drogas txicas pueden dar lugar a esta condicin: morfina, atropina, cido clrico, cianhdrico y el alcohol.

5. Explique el fundamento del mtodo de a glucosa oxidasa para la deteccin de glucosuria. Las tiras de glucosa oxidasa contienen mediante impregnacin del rea de prueba una mezcla de glucosa oxidasa, peroxidasa, cromgeno y solucin amortiguadora para producir una reaccin enzimtica secuencial doble. En el primer paso, la glucosa oxidasa cataliza una reaccin entre la glucosa y el aire ambiental para producir cido glucnico y perxido. En el segundo paso, la peroxidasa cataliza la reaccin entre perxido y cromgeno para formar un compuesto oxidado coloreado que representa la presencia de glucosa.

Luego el cromgeno oxidado coloreado se cuantifica mediante espectrofotometra. 6. Explique que es el umbral renal de la glucosa. Es la capacidad mxima de la reabsorcin tubular para absorber el 100% de la glucosa que se filtra en el proceso de filtracin glomerular del rin. Esto representa una concentracin de 10mmol/L de glucosa en sangre. IV. Bibliografa - GUYTON, C.G. and HALL, J.E. Tratado de Fisiologa Mdica. 12 Edicin. Elsevier, 2011. - Jos Mara Macarulla, Flix M. Goi. Bioqumica humana: curso bsico. 2 Edicin. Reverte, 1994 - Susan King Strasinger, Marjorie Schaub Di Lorenzo. Anlisis de orina y de los lquidos corporales. 5 Edicin. Ed. Mdica Panamericana, 2010. - Pginas web: http://www.salud.es/glucosuria/causas-glucosuria