Universidad Autnoma del Estado de Hidalgo Instituto de Ciencias Bsicas e Ingeniera Lic. de Qumica en Alimentos Anlisis de Alimentos Dra.

Alicia del Carmen Mondragn Portocarrero Trabajo: Anlisis de chocolate con leche Carlos V estilo suizo Por: Paulina Gutirrez Macas Noviembre, 2008 Anlisis de chocolate con leche Carlos V estilo suizo. 1. Introduccin 1.1 Fabricacin del chocolate El chocolate se fabrica con los productos del cacao (puntillas, masa, cacao y manteca) junto con azcar y otros ingredientes segn el tipo. El chocolate comn (oscuro) se prepara haciendo pasar una mezcla de puntillas de cacao entre rodillos de acero. El chocolate caliente y la manteca de cacao adicional y cualquier sabor que se agregue se procesa (enconchando) aproximadamente a 70C en una concha longitudinal o circular. El enconchado mejora la viscosidad, la textura y el sabor permitiendo que se desprendan productos voltiles indeseables como los cidos: actico, propinico y butrico. La humedad se elimina y se lleva a cabo la oxidacin de los componentes con un sabor astringente. Despus del proceso de templado, el chocolate lquido se coloca en moldes precalentados y pulidos y se deja enfriar. Las caractersticas especiales del chocolate se deben a las propiedades singulares de la manteca de cacao que se derrite a temperatura ligeramente menor a la del cuerpo humano y al azcar refinado y las partculas de cacao. Para el chocolate con leche, la leche se precondensa con azcar y se mezcla con licor de cacao, luego se seca para formar leche en polvo. La leche en polvo se mezcla con la manteca de cacao y se lleva a cabo el proceso como se describi con anterioridad, con excepcin de que el enconchamiento se lleva a cabo a temperaturas inferiores y por un tiempo ms breve. La crema de leche da ms suavidad al chocolate con leche y permite que se funda ms fcilmente. Durante el almacenamiento, el chocolate que no se ha fabricado en forma correcta o est mal empacado o almacenado puede formar una especie de pelusa blanca de grasa o una pelcula gris y pegajosa de azcar, ya que sta ltima absorbe humedad del medio (Egan, 1998).

1.2 Composicin Tabla 1. Requisitos de la composicin del chocolate |Tipo de chocolate |Slidos totales |Slidos secos |Manteca de cacao |Grasa (%|Slidos de |Grasa de |Sacarosa (% | | |de cacao seco (%|sin grasa de |(% min.) |min.) |leche (%|leche (% |mx.) | | |min.) |cacao (%| | |min.) |min.) | | | | |min.) | | | | | | |Chocolate |35 |14 |18 |------ |------ |------ |------ | |Chocolate comn |30 |14 |18 |------ |------ |------ |------ | |Chocolate con leche |25 |2.5 |------ |2.5 |14 |3.5 |55 | |Chocolate con leche |25 |2.5 |------ |25 |14 |< 3.5 |55 | |semidescremada | | | | | | | | |Chocolate blanco |------ |------ |20 |------ |14 |3.5 |55 | (Egan, 1998). 1.3 Antecedentes del producto Carlos V es una marca de chocolates de Mxico. Originalmente, el chocolate era elaborado por una compaa de dulces mexicana, la Fbrica de Chocolates la Azteca, que fue adquirida en 1995 por Nestl. Tras el cambio de propiedad de la marca, el chocolate cambi de sabor, hacindolo ms dulce, lo que hizo que disminuyera la demanda. La presentacin original y ms conocida de este chocolate es en barra al estilo suizo en su presentacin de 23 g (http://www.es.wikipedia.org/wiki/Chocolate). 1.4. Descripcin y caractersticas fsicas del producto Barra de chocolate lista para comer como golosina a cualquier hora del da. Carlos V tambin es un ingrediente para preparar deliciosos postres y pasteles. Carlos V, el rey del chocolate. Tamao: 9 cm de longitud, 2 cm de ancho. Peso: 23 g Forma: barra rectangular Sabor: chocolate dulce, agradable Olor: cacao, agradable Color: caf-marrn 1.4.1 Ingredientes: Azcar Manteca de caco Pasta de caco Leche descremada en polvo Grasa butrica Lecitina de soya Saborizantes artificiales 2. Muestreo

Una barra de chocolate es un material bastante homogneo; es decir su composicin es la misma en todas sus partes. Si se analiza el chocolate de una barrita, el primer paso para el muestreo consiste en triturarla en un mortero y transferirla de inmediato a un frasco bien tapado que se conservar a baja temperatura. Ahora bien, el slido es demasiado blando y pastoso para que pueda ser triturado, lo que se puede hacer es meter el mortero junto con el pistilo y los trozos de chocolate a un congelador. Una vez congelado, el chocolate se vuelve quebradizo y puede triturarse, de esta manera se obtiene una muestra con mayor superficie de contacto. 3. Anlisis fsico 3.1 Determinacin del punto de fusin Fundamento El punto de fusin de un compuesto slido cristalino es la temperatura a la cual se encuentran en equilibrio la fase slida y la fase lquida y generalmente es informado dando el intervalo entre dos temperaturas. Procedimiento Para cerrar los capilares, calentar el tubo de vidrio con un mechero y estirarlo cuando se ablande; luego fundirlo el extremo delgado para cerrarlo. Para llenar el capilar, pulverizar la sustancia en un vidrio de reloj con la punta de un agitador y aplicar el extremo abierto del capilar sobre la sustancia. Enseguida, tomar un tubo de vidrio de unos 30 cm de largo, apoyar un extremo en la mesa y dejar caer por arriba el capilar (el extremo cerrado hacia abajo), hasta que la sustancia quede en el fondo del capilar con una altura de unos 2 mm. Ahora cerrar con cuidado el capilar por su otro extremo. El capilar ya preparado se une al termmetro mediante una rondana de hule (la cual nunca debe tocar el aceite). La sustancia en el capilar debe quedar pegada al bulbo del termmetro. Llenar el tubo de Thiele con aceite mineral (Nujol) hasta cubrir la entrada superior del brazo lateral y sostenerlo en un soporte con unas pinzas. Colocar el termmetro con el capilar en el corcho horadado, cuidando que el bulbo del termmetro y la muestra queden al nivel del brazo superior del tubo lateral, sin que el aceite toque la rondana de hule (porque se afloja y se cae el capilar). Comenzar a calentar suavemente el brazo lateral del tubo de Thiele con un mechero. Para conocer aproximadamente a qu temperatura funde la muestra, regular el calentamiento del tubo de Thiele de tal manera que la temperatura aumente a una velocidad de 20C por min. Preparar otro capilar con la muestra pulverizada. Repetir el procedimiento y una vez que falten unos 30C para llegar a la temperatura de fusin, disminuir la velocidad de calentamiento a 2C por min. El promedio de las dos temperaturas es el punto de fusin de la muestra (http://132.248.103.112/organica/1311/1311pp2.ppt). 3.2 Anlisis organolptico

Una verdadera cata requiere siempre el cumplimiento de unos requisitos previos. En primer lugar se debe tener en cuenta la temperatura ambiental del lugar donde se lleve a cabo, ya que por encima de los 21C el chocolate perder su textura. Cada uno de los catadores tendr un plato donde se colocarn en orden las onzas de chocolate, empezando por el ms delicado y finalizando por el ms fuerte y con mayor cantidad de cacao. Justo al lado, pan sin condimentar, manzanas verdes y agua mineral con gas, que se intercalarn entre las diferentes degustaciones; y una ficha de cata donde el degustador anotar sus impresiones. Las servilletas de papel blancas sern absolutamente necesarias para limpiarse las manos y la boca, y debern ser sustituidas a menudo para que las distintas trazas aromticas no se mezclen entre s (http://www.informativos.net/Noticia.aspx?noticia=46034 - 198k). 3.2.1 Anlisis del sabor Fundamento Se realiza el anlisis del sabor del chocolate a travs del sentido del gusto. Procedimiento Una vez el chocolate triturado en la boca, lo se presiona suavemente entre la lengua y el paladar para que coja rpidamente temperatura y empiece a fundirse. Se reparte por toda la boca para alcanzar las distintas zonas de papilas gustativas y poder examinar todas sus caractersticas. Se identifican los sabores primarios propios del cacao, dulzor, acidez y amargor, y los secundarios, fruto de los distintos tipos de cacao utilizados, los ingredientes aadidos y el proceso de elaboracin. Adems se encuentra toda una serie de sensaciones tctiles como el tiempo de fusin, la cremosidad, la astringencia y naturalmente el equilibrio de sabores y aromas. 3.2.2 Anlisis del olor Fundamento Se realiza el anlisis del olor del chocolate a travs del sentido del olfato. Procedimiento Los aromas del chocolate se analizan en dos fases, de forma directa e indirecta o retronasal. Se toma la pastilla o tableta y se acerca a la nariz aspirando los olores que desprende. Se deben encontrar los aromas primarios, es decir los caractersticos del cacao, y tambin los secundarios, o sea los correspondientes a los distintos cacaos utilizados en la combinacin y los que aportan otros ingredientes y el propio proceso de elaboracin. Seguidamente se tritura el chocolate, se deja fundir en la boca y se expira el aire. As se vuelven a examinar los aromas primarios y secundarios, pero tambin su persistencia e intensidad. 3.2.3 Anlisis del color

Fundamento Se analiza la apariencia del chocolate a travs del sentido de la vista. Procedimiento Se valora la uniformidad del color; la ausencia de zonas blanquecinas que indicaran que el chocolate ha sufrido oscilaciones de temperatura durante su conservacin; la tonalidad, que puede abarcar casi toda la gama de marrones e incluso algunas notas rojizas en los chocolates puro o con leche, y el brillo, que denota una perfecta elaboracin y una correcta conservacin. Tambin se examinamos la presencia de hendiduras o burbujas de aire en la pastilla o tableta y si se producen migas al romperla. 3.2.4 Anlisis de la textura Fundamento Se analiza la textura del chocolate a travs del sentido del tacto. Procedimiento Se comprueba la ductilidad del chocolate presionndolo con los dedos pulgar e ndice para apreciar su capacidad de modelarse con el calor corporal. Se rompemos el chocolate, primero con las manos y despus con los labios para comprobar la granulosidad, la ligereza y la textura. Deber tenerse en cuenta que un buen chocolate jams debe resultar pegajoso si se consume a la temperatura adecuada (alrededor de20C). 4. Anlisis qumico El estudio qumico del producto se hace en base al anlisis proximal. La calidad del chocolate se evala al determinar: la humedad, la grasa, los azcares, el nitrgeno, las purinas totales, las cenizas, las cenizas solubles en agua, la fibra cruda y los metales traza (por ejemplo, As, Pb y Cu), etc. No existe un mtodo analtico oficial para la determinacin de cacao y de sus derivados, sin embargo, su contenido se determina indirectamente por la cantidad de teobromina presente en el producto. En el anlisis tambin se incluye la determinacin de compuestos especiales como cafena y teobromina. Adems para evaluar la inocuidad del alimento se realiza el anlisis microbiolgico. Tabla 2. Datos analticos para el chocolate con leche (Egan, 1998). |Parmetro |Porcentaje (%) | |Humedad |0.8-1.8 | |Cenizas totales |1.8-2.4 | |Cenizas solubles en agua |--------- | |Grasa |30-40 | |Sacarosa |35-47 | |Lactosa |7-11 |

|Almidn |--------- | |Nitrgeno total |0.8-1.5 | |Teobromina |0.2-0.5 | |Fibra cruda |0.4-1.0 | 4.1 Determinacin de humedad 4.1.1 Mtodo de Karl Fisher Fundamento Se basa en el empleo del reactivo de Karl Fisher, el cual consta de yodo, dixido de azufre, una amina (imidazol) en alcohol. Inicialmente el dixido de azufre reacciona con el metanol para formar le ester, posteriormente ste es neutralizado por la amina. El ester es oxidado por el yodo a sulfato en una reaccin que involucra al agua. Las reacciones qumicas que tienen lugar son: A) CH3OH + SO2 + RN ( [RNH](SO4)CH3 B) H2O + I2 + [RNH](SO4)CH3 + 2RN ( [RNH](SO3)CH3 + 2[RNH]I Procedimiento Se aaden a la muestra yodo y un exceso de SO2, imidazol y metanol, posteriormente se coloca en una cmara cerrada protegida contra la humedad atmosfrica, el exceso de I2 que no puede reaccionar con el agua se puede determinar visualmente. Este reactivo es un poderoso deshidratante, por lo que tanto la muestra como el reactivo deben protegerse contra la humedad del aire. El punto final de la titulacin se puede detectar en forma visual, sin embargo, en la mayora de las veces se usan instrumentos electromtricos comercialmente disponibles. En su forma ms simple el reactivo funciona como indicador, la disolucin muestra mantiene un color amarillo canario mientras haya agua, que cambia luego a amarillo cromato y despus a pardo en el momento del vire. En su forma ms simple el mtodo potenciomtrico consta de una fuente de corriente directa, un restato, un galvanmetro o un microampermetro y electrodos de platino, en este caso es necesario que exista una diferencia de potencial que genere una corriente y tambin es importante que exista contacto del titulante con el analito. El reactivo se estandariza contra una solucin tipo de agua en metanol o de un hidrato salino puro tal como el dihidrato de tartrato de sodio (http://www.monografias.com/trabajos15/determinacion-humedad/determinacionhumedad.shtml). 4.2 Determinacin de ceniza 4.2.1 Determinacin de cenizas totales por va hmeda Fundamento Descomposicin de la materia orgnica en medio cido por lo que la materia inorgnica puede ser determinada por gravimetra de las sales que precipiten, y tambin por algn otro mtodo analtico para las sales que permanezcan en disolucin acuosa o cida. Procedimiento Pesar 5 g de muestra en un vaso de precipitados, adicionar 10 ml de cido ntrico concentrado, calentar durante una hora hasta la obtencin de un color translcido, enfriar, recuperar, filtrar en un matraz aforado de 100 ml, aforar con agua. Tomar una alcuota de

10 ml y colocarlo en un vaso de precipitados de 250 ml a peso constante, evaporar a sequedad, colocar en estufa a peso constante. Calcular por diferencia de peso la cantidad de minerales en la alcuota y relacionarla con el aforo total. El procedimiento de repite para un blanco de referencia. 4.2.2 Alcalinidad de la ceniza Fundamento Determinar el balance cido-base de los alimentos y para detectar adulteracin de los alimentos con minerales. Procedimiento Aadir a la ceniza 20 ml de HCl 0.1 M, disolver calentando en balo caliente y filtrar la solucin a travs de papel filtro Whatman nmero 54, evitar salpicaduras. Lavar la cpsula de evaporacin y el papel filtro con agua destilada caliente, repetir haciendo otras dos extracciones cidas. Enfriar la solucin filtrada y titular con NaOH 0.1 M usando anaranjado de metilo como indicador. La diferencia entre los volmenes del HCl aadido y el NaOH es debida a la alcalinidad de la ceniza. Calcular la alcalinidad expresndola en carbonato potsico (K2CO3). Nota: 1 ml de HCl 0.1 M= 0.00691 g de carbonato potsico (http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/mmedina/archivos/Practica7cenizas.pdf) 4.3 Determinacin de grasa 4.3.1 Mtodo de Rse Gottlieb Fundamento En disolucin alcalina el material se trata en fro con amoniaco y alcohol, y la grasa se extrae con una mezcla de ter y petrleo ligero. El alcohol precipita las protenas, las cuales se disuelven en al amoniaco, entonces la grasa se puede extraer con el ter, luego se agrega el petrleo ligero ya que reduce la proporcin de agua y tambin la presencia de sustancias solubles no grasas en el extracto, como la lactosa. Procedimiento Pesar la muestra en papel satinado previamente tarado. Encerrarla parcialmente para que pueda entrar en contacto con los reactivos e introducirla hasta el fondo en una probeta de 50 ml con tapa. Agregar 5 ml de agua destilada y agitar hasta que se la muestra se disperse totalmente, calentando si es necesario a 60 C en bao de agua. Enfriar y agregar 1 ml de NH4OH concentrado. Agitar y agregar 5 ml de etanol. Agitar y agregar con pipeta aforada 10 ml de ter etlico. Agitar durante 30 s y agregar con pipeta aforada 10 ml de ter de petrleo. Volver a agitar y leer bien el volumen total de la mezcla. Dejar reposar entre 4 y 24 h en lugar fresco de modo de evitar la evaporacin de solventes. Con pipeta aforada tomar 10 ml de la fase superior etrea y evaporarlos en un pequeo cristalizador tarado. Dejar enfriar en desecador, pesar y expresar como porcentaje de grasa en la muestra. 4.3.2 Mtodo de Mojonnier Fundamento Mtodo de extraccin intermitente o discontinua con disolvente. Se extrae la grasa con una

mezcla de ter de petrleo y ter etlico, principalmente, pero tambin participan el hidrxido de amonio y etanol. Se llevan a cabo tres periodos de extraccin. La grasa extrada es secada y llevada a peso constante. El resultado se expresa en % de grasa por peso. Procedimiento Pesar 10 g de muestra y colocarla en el tubo de extraccin Mojonnier. Adicionar 1 ml de hidrxido de amonio 0.88 y mezclar. Adicionar 10 ml de etanol, mezclar y enfriar. Aadir 25 ml de ter etlico, tapar el tubo y agitar vigorosamente por un minuto. Enfriar, agregar 25 ml de ter de petrleo y agitar vigorosamente por 30 s. Dejar reposar por 30 min o hasta que est completamente separada la fase orgnica. Si es necesario, agregar agua destilada para establecer una interfase entre los dos lquidos en la parte ms angosta del tubo. Decantar la fase etrea en un matraz bola previamente puesto a peso constante. Repetir la extraccin tres veces usando una mezcla d etanol, 25 ml de ter etlico y 25 ml de ter de petrleo. Adicionando el extracto en el matraz bola. Evaporar el disolvente en rotavapor, secar el extracto lipdico en la estufa a 100C por 1 h y pesar. Calcular el porcentaje de grasa por diferencia de pesada (http://www.biol.unlp.edu.ar/analisisdealimentos/tp-lipidos08.doc -). 4.3.3 Determinacin del contenido graso de la leche por cromatografa de gases Fundamento A partir de la fraccin grasa aislada del alimento se obtienen los steres metlicos de los cidos grasos por transesterificacin se realiza en condiciones tales que se minimicen las prdidas de los steres de menor peso molecular (C4, C6, C8). Seguidamente se analizan cromatogrficamente con ayuda de un estndar interno (valerianato de metilo) que de una seal separada y se determine el contenido en cido butrico, que permitir calcular el contenido de leche en el alimento. Procedimiento |Reactivos | |Metanol |Formiato de metilo | |Cambiador de iones fuertemente cido |Disolucin de metilato sdico 1% | |Toluol |n-heptano | |Cloruro clcico de gano fino desecado 2 h a 105 C |Butirato de metilo | |Valerianato de metilo |Disolucin patrn y disoluciones patrn | Preparacin de reactivos Cambiador de iones fuertemente cido: se mezclan 50 g de Dowex 50 WX-8 (tamao de grano 20/50 mesh), despus de embebidos en agua con 100 ml de formiato de metilo, dejndolo caer gota a gota. Se extiende el cambiador por la capa de vidrio formando una capa fina y se deja reposar durante 24 h. El contenido acuoso se ajusta al 35% aproximadamente, se guarda en un desecador. Poco antes de utilizarlo se mezclan 5 g del cambiador. Disolucin de metilato sdico 1%: se aaden 100 ml de metanol al matraz Erlenemeyer y se mezclan con 1 g de sodio metlico enfriando el matraz por fuera con agua helada. La disolucin se pasa a un frasco pequeo y se refrigera. Las disoluciones con turbidez o sedimento se deben desechar. Disolucin patrn: se pesa 1 g de ster metlico del cido butrico y 1 g de cido valerinico con una precisin de 0.5 mg en un matraz de 50 ml y se enrasa con n-heptano (c= 20 mg/ml para cada ster).Disolucin patrn: I: se pesa 1

g de valerianato de metilo con una precisin de 0.5 mg en un matraz aforado de 50 ml y se completa con n-heptano (c= 20 mg/ml). II: se pasan 5 ml de disolucin patrn I a un matraz de 50 ml y se enrasa con n-heptano (c= 20 mg/ml). a) Preparacin de la muestra de grasa En un matraz redondo de 25 ml se pesan unos 500 mg de grasa aislada 0.5 mg y se disuelven en n-heptano. Dependiendo de la cantidad de cido butrico esperado en la grasa total se aade la cantidad correspondiente de patrn externo: 1 ml de la disolucin patrn I para un contenido de 1.5 a 4 % de cido butrico (por ejemplo para mantequilla o para mezclas con ms del 50% de mantequilla) y 1 ml de la disolucin patrn II si el contenido de cido butrico es inferior a 1.5%. Se mezcla con 0.4 ml de la disolucin de metilato de sodio y se calienta a ebullicin durante 20 min refrigerando a reflujo en ausencia de humedad. A continuacin, el matraz se enfra a 15-20C sin quitar el refrigerante, se aaden 0.3 g del cambiador inico, se cierra el matraz con un tapn esmerilado y se agita durante 2 min. Despus se aade ms cambiador inico (0.2 g), se agita el matraz y se deja reposar durante 5 min. Se decanta la solucin de steres a un segundo matraz redondo con 0.2 g de cloruro de calcio desecado; no debe caer nada del cambiador inico al segundo matraz. Se agita la disolucin durante 2 min, se mezcla de nuevo con 0.2 g de cloruro de calcio, se vuelve a agitar y se deja reposar durante 10 min. Si el sobrenadante est turbio se centrifuga 5 min a 2000 rpm. En el cromatgrafo se inyectan de 0.2 a 0.5 l de la disolucin lmpida. A continuacin se realiza el cromatograma de la disolucin patrn (Mattisek y col, 1998) 4.4 Determinacin de protena 4.4.1 Determinacin de protena por el mtodo Kjeldahl Fundamento Digestin hmeda de la materia orgnica y cuantificacin del amoniaco producido a partir del amoniaco. Etapas: 1. Digestin. Oxidacin de protena y compuestos orgnicos por H2SO4 concentrado Fijacin de nitrgeno como sulfato de amonio Durante el proceso de digestin ocurre la deshidratacin y carbonizacin de la materia orgnica combinada con la oxidacin de carbono a dixido de carbono. El nitrgeno orgnico es transformado a amoniaco que se retiene en la disolucin como sulfato de amonio. La velocidad del proceso puede ser incrementada adicionando sales que abaten la temperatura de descomposicin (sulfato de potasio) o por la adicin de oxidantes (perxido de hidrgeno, tetracloruro, persulfatos o cido crmico) 2. Destilacin: Desprendimiento de amoniaco por una base fuerte. El amoniaco puede ser recuperado en: Agua cido fuerte cido brico (anftero) 3. Titulacin: cido-base Si el amoniaco se retiene en agua o en cido brico la titulacin es directa, si es recuperado en un exceso de cido fuerte la valoracin se realiza por retroceso.

Procedimiento Pesar de 0.1 a 0.2 g de muestra e introducir en un tubo de Kjeldahl, agregar 0.15 g de sulfato de cobre pentahidratado, 2.5 g de sulfato de potasio o sulfato de sodio y 10 ml de cido sulfrico concentrado. Encender el aparato y precalentar a la temperatura de 360C. Colocar el tubo en el portatubos del equipo Kjeldahl y colocarlo en el bloque de calentamiento. Poner la unidad de evacuacin de gases con las juntas colocadas sobre los tubos de digestin. Accionar la campana de succin de gases antes de que se produzcan stos. Calentar hasta la total destruccin de la materia orgnica, es decir, hasta que el lquido est transparente, con una coloracin azul verdosa. Una vez finalizada la digestin, sin retirar la unidad de evacuacin de gases, colgar el portatubos para enfriar. Apagar el equipo y desconectar la trampa. En un matraz de Erlenmeyer de 250 ml adicionar (segn se indique) 50 ml de HCl 0.1 N y unas gotas de indicador rojo de metilo 0.1 % o bien 50 ml de cido brico 4% con indicadores (fenolftalena 0.035 mg%, rojo de metilo 6.6 mg%, verde de bromocresol 3.3 mg%). Conectar el aparato de destilacin y esperar unos instantes para que se genere vapor. Colocar el tubo de digestin con la muestra diluida, las sales disueltas en un volumen no mayor a 10 ml de agua destilada y 40 ml de hidrxido de sodio 0.1 N, en el aparato de destilacin, cuidando de introducir la manguera (que se halla conectada al refrigerante) hasta el fondo de la disolucin del matraz Erlenmeyer. Destilar hasta alcanzar un volumen de destilado en el matraz de 100-150 ml. En el caso de recibir el destilado en HCl 0.1 N titular el exceso de cido con una solucin de NaOH 0.1 N. En el caso de recibir con cido brico, valorar con una solucin de HCl 0.1 N. El procedimiento de repite para un blanco. 4.4.2 Determinacin de protena por el mtodo de Lowry Fundamento Mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las protenas. A la muestra se aade un reactivo que forma un complejo coloreado con las protenas, siendo la intensidad de color de la disolucin resultante proporcional a la concentracin de protenas, segn la ley de Lambert-Beer. Este mtodo consta de dos etapas: Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-protena tienen un color azul claro. Adems, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena, exponindose los residuos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con tartrato. La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos fenlicos de los residuos de tirosina presentes en la mayora de las protenas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenlicos da lugar a un complejo de color azul intenso. Procedimiento Reactivos Reactivo A: Na2CO3 al 2%, NaOH 0.1 M Reactivo B1: CuSO45H2O al 1% Reactivo B2: tartrato sdico-potsico al 2% Reactivo C: Se prepara en el momento de iniciar el ensayo, mezclando A, B1 y B2 en

proporciones 50:0.5:0.5 (en volumen) Reactivo Folin Ciocalteau: reactivo comercial diluido a 1/4 Solucin patrn de albmina de suero bovino (BSA) de concentracin 2 mg/ml Para determinar la concentracin de protenas de la muestra problema se construye una curva patrn o de calibrado a partir de una solucin patrn (BSA) (2 mg/ml). La concentracin que tienen las muestras problema se determina por interpolacin de los valores de absorbancia en la curva patrn. El tubo 0, que slo contiene agua destilada y los reactivos, sirve de blanco para el ajuste del colormetro a cero de absorbancia. Numerar del 0 al 6, tubos de plstico de 10 ml. Pipetear las cantidades de agua, solucin patrn de albmina y solucin problema sealadas en la tabla (abajo). Preparar el reactivo C, a partir de A, B1 y B2. Pipetear a todos los tubos el reactivo C. Mezclar el contenido de cada tubo y dejarlo reposar 10 min en oscuridad. A continuacin aadir a todos los tubos el reactivo de Folin (diluido 1/4), mezclando bien. Dejar reposar 20 min en oscuridad para que se desarrolle completamente la reaccin coloreada. Leer las absorbancias en el colormetro a 580 nm. Previamente el aparato se ajusta a A=0 con el blanco (tubo n 0); de esa forma slo se mide el color producido por las protenas, puesto que se resta el color debido a los reactivos. Preparacin de la curva de calibrado y muestra: |Tubo |Agua |Patrn |Problem|Reactivo|Folin |A580|mg | | | |(2mg/ml) |a |C |diluido | |prot/tubo| |0 |1,0 |-- |-- |5 ml |0,5 ml | | | | |ml | | | | | | | |1 |0,9 |0,1 ml |-- |5 ml |0,5 ml | | | | |ml | | | | | | | |2 |0,8 |0,2 ml |-- |5 ml |0,5 ml | | | | |ml | | | | | | | |3 |0,7 |0,3 ml |-- |5 ml |0,5 ml | | | | |ml | | | | | | | |4 |0,6 |0,4 ml |-- |5 ml |0,5 ml | | | | |ml | | | | | | | |5 |0,7 |-- |0,3 ml |5 ml |0,5 ml | | | | |ml | | | | | | | |6 |0,5 |-- |0,5 ml |5 ml |0,5 ml | | | | |ml | | | | | | | (http://www2.uah.es/mapa/Professor%20Sample%20Site/activos/practicas/Lowry.doc ) 4.4.3 Determinacin de protena por el mtodo de Biuret Fundamento Formacin de un complejo colorido entre enlaces peptdicos y in cprico en medio alcalino. El complejo presenta un color violeta caracterstico, que se puede observar a 310

nm o 540-560 nm, el cual se da por la coordinacin de un tomo de cobre con cuatro tomos de nitrgeno. El complejo se basa en al desprotonacin de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los tomos de oxgeno y de nitrgeno del pptido. Procedimiento Reactivos Reactivo del Biuret (sulfato de cobre 0.15%, tartrato de sodio y potasio 0.6% y NaOH 0.3%) Soluciones patrn de albmina bovina de concentracin: 4.0, 6.0, 8.0 y 10 g/dl Hidrxido de sodio al 3% Colocar 1 ml de la solucin de protena adecuadamente diluida en tubos de ensaye perfectamente etiquetados, y adicionar 4 ml de reactivo de Biuret. Mezclar y dejar en reposo 30 min a temperatura ambiente, determinar la absorbancia del color violeta producido a 540 nm contra un blanco preparado de la misma manera con 1 ml de solucin en que se encuentra diluida la muestra. La concentracin de protena se obtiene por referencia a una curva de calibracin preparada con albmina bovina srica con concentraciones de 1 a 10 mg/ml. 4.4.4 Determinacin de protena por el mtodo de Bradford Fundamento Se emplea un colorante hidrofbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de cido fosfrico tienen un color pardo y que, al encontrarse en medio hidrofbico del interior de una protena, origina un color azul intenso que se puede medir fcilmente. Este mtodo depende, pues de la interaccin relativamente inespecfica entre un colorante hidrofbico y las protenas, por lo que es relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y lquidos orgnicos como el metanol. Procedimiento Colocar en un tubo de ensaye etiquetado 0.1 ml de muestra adecuadamente diluida. Adicionar 5 ml de reactivo de colorante (Azul Brillante de Coomasie G-250 0.1 mg/ml con cido fosfrico al 8.5% y etanol al 4.75%). Mezclar perfectamente en vrtex o por inversin del tubo. Dejar reposar por 5 min a temperatura ambiente. Leer la absorbancia a 595 nm frente a un blanco. La concentracin de protena de calcula a partir de una curva de calibrado preparada con una solucin de albmina bovina srica de 1 a 10 mg/ml, tratada de la misma manera que la muestra problema. 4.4.5 Determinacin de protena por espectrometra de absorcin UV Fundamento La mayora de las protenas muestran una absorcin a 280 nm, la cual se atribuye al grupo fenlico de la tirosina y al grupo indlico del triptfano. Se toma en cuenta la absorcin del disolvente ya que ste puede absorber en la misma regin. Procedimiento

Colocar la disolucin problema debidamente diluida en una celda del espectrofotmetro. Determinar la absorbancia a 280 nm, usando como blanco la solucin en que se encuentra preparada la muestra. La concentracin de protena se obtiene por referencia a una curva de calibrado preparada con albmina bovina srica en concentraciones de 50 a 500 g/ml. 4.4.6 Determinacin de protena por el mtodo de Dumas (sistematizado) Fundamento Destruccin de la materia orgnica a travs de una combustin en una atmsfera rica en oxgeno. Todo el producto de la combustin pasa a travs de un tamiz molecular conformado por perclorato de magnesio anhidro e hidrxido de sodio en base de tierras raras. Una vez que el tamiz molecular retiene los gases no deseados, el nitrgeno es arrastrado hacia la celda de deteccin con gas Helio o Argn y es cuantificado por conductividad trmica. Procedimiento Pesar 1 g de nuestra homogeneizada sobre un papel de estao (tin foil) o cpsula de gel. Doblar el papel de estao con el objeto de contener la muestra. Identificar la muestra en la computadora e ingresar tambin el peso. Colocar la muestra dentro del horno de combustin y presionar el botn ANALISIS. El resultado de protena se mostrar automticamente en el software del equipo (http://www.inboxsa.com/Comparaci%F3n%20entre%20los%20m%E9todos%20Kjeldahl %20y%20Dumas%20para%20el%20an%E1lisis%20de%20Prote%EDna.pdf). 4.4.7 Determinacin de protenas de la leche Fundamento La casena, al contrario de otras protenas, es soluble en solucin de oxalato de sodio. El mtodo se basa en esta distincin. Procedimiento Pesar exactamente 10 g de muestra finamente triturada en un tubo para centrfuga, adicionar dos porciones de 100 ml de ter, centrifugar y decantar el lquido sobrenadante en cada adicin. Secar el residuo en estufa a 100C, el residuo se vuelve a triturar con ayuda de una varilla de vidrio. Agregar 200 ml de una solucin de oxalato de sodio, se deja reposar durante 4 h, agitando frecuentemente. Centrifugar y filtrar a travs de un papel filtro. Descartar los primeros 5-10 ml del filtrado y determinar nitrgeno en 50 ml de este filtrado. Transferir 100 ml del filtrado a un matraz volumtrico de 200 ml y aforar hasta la marca. Precipitar las protenas adicionando 2 ml de cido actico glacial, agitar filtrar y determinar el nitrgeno en 100 ml del filtrado. La diferencia del nitrgeno entre un filtrado y otro representa el nitrgeno de la casena en 2.5 g de muestra. Este valor, multiplicado por 4 y por 6.38 es igual a la protena contenida en 10 g de muestra utilizada en el anlisis. El total de protena de leche es igual a: casena X 1.25 (Jacobs, 1938). 4.5 Determinacin de fibra 4.5.1 Determinacin de fibra bruta segn Scharrer-Krschner

Fundamento El material a investigar una vez triturado, y en este caso, desengrasado, se trata con una mezcla cida, se filtra, el residuo se lava con etanol y ter, se seca y se pesa. Despus de incinerado, se resta el contenido en cenizas del peso que se obtuvo anteriormente. Procedimiento |Reactivos | |Mezcla cida: disolver 25g de cido tricloactico en 500 ml de |Etanol 96% (v/v) | |cido actico 70%, mezclar con 124 ml de cido ntrico 65% y | | |completar hasta 1 L con cido actico 70%. | | |ter etlico (intervalo de ebullicin 34-35C) |ter de petrleo (intervalo de ebullicin 3060C) | a) Tratamiento previo Para desengrasar la muestra sta se lava, antes de pesarla, de dos a tres veces con ter de petrleo, el cual se elimina por decantacin, y el resto del disolvente se deja evaporar. b) Tratamiento Cantidad de muestra: depende del contenido de fibra bruta (3-20 g). La muestra se pesa exactamente, se pasa al matraz de fondo plano y se mezcla con 80 ml de mezcla cida (primero se aaden slo 60 ml, el matraz se agita enrgicamente y se lava la pared interior con los 20 ml restantes). Se calienta a reflujo durante 30 min y a continuacin se enfra al aire primero y despus al chorro de agua. El papel libre de cenizas se seca durante 1 h a 103 2 C, se enfra en el desecador y se pesa exactamente. El contenido del matraz se pasa por el papel filtro con ayuda de un matraz kitasato y de vaco. El matraz se enjuaga con agua caliente, con lo que deber lavarse el papel filtro libre de cidos (el pH se determina con las tiras indicadoras); el kitasato se vaca varias veces, debido a que el cido actico es muy voltil y reduce el vacio retardando el lavado. Se lava el residuo tres veces con 10 ml de etanol y dos veces con 10 ml de ter etlico. El papel filtro con el residuo se pasa a un crisol previamente secado y pesado y se seca durante 1 h a 103 2C, se enfra en el desecador y se pesa exactamente. c) Incineracin El papel filtro junto con el residuo se incineran durante 1 h aproximadamente a 700 C. Se enfran en un desecador y finalmente se pesan las cenizas (Matissek y col, 1998). 4.5.2 Determinacin de fibra por el mtodo de Southgate Fundamento El mtodo fracciona a la fibra en polisacridos no celulsicos insolubles y solubles;

celulosa y lignina. La lignina es determinada gravimtricamente y el contenido de polisacridos es determinado a partir de constituyentes que son medidos colorimtricamente. Procedimiento Se extraen los azcares libres de la muestra con metanol al 85% y los lpidos se extraen con ter. La muestra se incuba toda la noche con takadiastasa para hidrolizar el almidn. Se extraen los polisacridos solubles con agua caliente (fibra soluble) y se centrifuga la muestra para precipitar la fibra insoluble (fraccin I). Luego se aaden 4 volmenes de etanol al sobrenadante y se centrifuga la muestra para precipitar las fibras solubles (fraccin II). Se hidrolizan la fraccin I y la fraccin II con H2SO4 durante 2.5 h a 100C, se centrifuga la fraccin I y se lava el sedimento de la fraccin I con etanol al 50% y se combina este lavado con etanol con el sobrenadante de la fraccin I. Se hidroliza la celulosa del sedimento de la fraccin I con H2SO4 por 24 h a 0-4C, se filtra el cido hidrolizado. Se lava el sedimento del filtro con agua. Se seca la muestra y se pesa, posteriormente se incinera el residuo. La prdida de peso se denomina lignina de klason. Se miden mediante colorimetra las hexosas, pentosas y cidos urnicos de los hidrolizados cidos 1n de las fracciones I y II as como las hexosas y pentosas de los hidrolizados de H2SO4 al 72%. La fibra es la suma de los azcares ms el peso de la lignina (http://www.docencia.izt.uam.mx/lyanez/analisis/material_adicional/fibranotas.ppt ). 4.5.3. Determinacin de fibra dietaria por tratamiento con proteasas Fundamento Se basa en la digestin in vitro de la muestra con pepsina y pancreatina. Procedimiento La muestra puede ser liofilizada, o bien ser el residuo insoluble luego de una extraccin con alcohol. En productos ricos en lpidos es necesario extraerlos antes del anlisis con alcohol/benceno o alcohol/cloroformo. La muestra debe molerse para pasar a travs de una malla de 0,5 mm. Calentar un 1 g de muestra con 50 ml de agua a 100C por 15 min, agregar 50 ml de HCL 0.2M e incubar con 100 mg de pepsina durante 18 h a 40C. Neutralizar, agregar 50 ml de buffer fosfato de sodio 0,1M, pH 6,8, e incubar con 100 mg de pancreatina durante 1 h a 40C. Acidificar a pH 4-5, centrifugar y lavar el residuo con agua. Lavar el residuo con acetona y secar a 105C toda la noche, pesar, el residuo obtenido es la fibra insoluble en agua. El sobrenadante que se obtiene al centrifugar se debe precipitar con 4 volmenes de etanol a 95%, centrifugar y lavar el sedimento con etanol al 80%. Secar en atmsfera de nitrgeno a 50-60C durante 1 h, el residuo obtenido es la fibra soluble en agua (http://www.biol.unlp.edu.ar/analisisdealimentos/tp-fibra-08.doc -).

4.6 Determinacin de carbohidratos 4.6.1 Determinacin de sacarosa por polarimetra Fundamento Una muestra de ensayo se trata con hidrxido de amonio, para llevar a la mutorrotacin de la lactosa hasta el equilibrio final. Se neutraliza y luego se clarifica por adiciones sucesivas de acetato de zinc y hexacianoferrato de potasio (II), seguido de filtracin. La rotacin ptica se determina sobre una porcin de filtrado. Sobre otra porcin de filtrado se induce la inversin (basada en el principio de Clerget) por hidrlisis cida moderada de la sacarosa, dejando lactosa y otros azcares virtualmente no afectados. La rotacin ptica de determina despus de la inversin. El contenido de sacarosa se calcula a partir del cambio en la rotacin ptica en la inversin. Procedimiento Se pesan, aproximadamente 20 g de muestra representativa, se desengrasa durante 4 h en un extractor Soxhlet, luego se seca en estufa a 100 C 2 C, repitiendo el secado hasta que dos pesadas sucesivas no difieran en ms de 0.5 mg. Transferir la muestra a un vaso de precipitado de 250 ml y adicionar 50 ml de agua caliente (80-90C) y mezclar bien. Transferir la mezcla cuantitativamente a un matraz volumtrico de 200 ml, enjuagando el vaso de precipitado con sucesivas cantidades de agua a 60C, hasta que el volumen total est entre 120 y 150 ml. Mezclar y enfriar a 20 2 C. Agregar 5 ml de solucin de hidrxido de amonio al 3.5%, mezclar vigorosamente y mantener durante 15 min a 20 2C. Posteriormente se neutraliza el hidrxido de amonio mediante la adicin de una cantidad estequiomtrica equivalente al cido actico al 12%, sin dejar de mezclar se agregan 12.5 ml de solucin de acetato de zinc 1 M y de la misma manera se agregan 12.5 ml de solucin de hexacianoferrato de potasio (II) 0.25 M. Llevar el contenido del matraz a 20C y diluir hasta el aforo con agua a 20 C. Desde esta etapa, todas las adiciones de agua o reactivos se deben hacer de tal manera de evitar la formacin de burbujas de aire y, con el mismo objetivo en vista, todas las mezclas se deben llevar a cabo mediante rotacin de matraz ms que por agitacin. Si se encuentran presente burbujas de aire antes de completar la disolucin a 200 ml, se pueden remover conectando el matraz a una bomba de vaco y rotando el matraz. Cerrar el matraz con un tapn seco y mezclar minuciosa mediante agitacin. Dejar decantar al precipitado por unos pocos minutos y luego filtrar la solucin a travs de un papel filtro seco, descartando los primeros 25 ml de filtrado. Determinar la rotacin ptica del filtrado a 20 2C. Colocar mediante pipeta 40 ml de filtrado dentro del matraz volumtrico de 50 ml, agregar 6 ml de cido clorhdrico al 22%. Colocar el matraz durante 15 min en el bao de agua regulando a 60C, estando el matraz inmerso hasta la base del cuello. Mezclar por rotacin el matraz durante los primeros 5 min, tiempo en que el contenido del matraz debera haber alcanzado la temperatura del agua del bao termorregulado. Enfriar a 20 C y diluir hasta el aforo con agua a 20C. Mezclar y mantener durante 1 h a esa temperatura. Determinar la rotacin ptica de la solucin invertida a 20 2C. 4.6.3 Determinacin de azcares por HPLC con detector de ndice de refraccin (IR) Fundamento

El mtodo se basa en determinar el contenido de azcares: fructosa, glucosa y sacarosa mediante cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) con detector de ndice de refraccin (IR). La identificacin se efecta mediante los tiempos de retencin, y la cuantificacin se realiza segn el mtodo del estndar externo a travs de las reas de los picos o bien la altura de los mismos. Procedimiento a) Preparacin de estndares Pesar 2 g de sacarosa, 0.25 g de glucosa y 0.25 g de fructosa. Disolver las cantidades indicadas en 40 ml de agua y transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml, que contiene 25 ml de metanol. Aforar con agua y agitar hasta homogeneizar completamente. Filtrar la solucin obtenida a travs de un filtro de membrana con tamao de poro de 0.45 m, con ayuda de una jeringa y guardarla en un frasco. b) Preparacin de la fase mvil Mezclar 8 partes de volumen de acetonitrilo y 2 partes de volumen de agua. Esta solucin se debe desgasificar antes de su uso. c) Preparacin de la muestra Se sigue el mismo principio que para el punto 4.7.2 (determinacin de teobromina y cafena por HPLC). Parmetros para HPLC: Velocidad de flujo: 3 ml/min Temperatura de columna: 30C 1C Volumen de inyeccin: 30 l d) Poner en funcionamiento el cromatgrafo de HPLC y se inyectan volmenes iguales de solucin estndar y muestra. La comprobacin cualitativa de los sacridos a determinar, se realiza a travs de la comparacin de los tiempos de retencin de la muestra respecto de la correspondiente solucin estndar. La determinacin cuantitativa se realiza mediante integracin de las reas de los picos, o de las alturas de los picos referidas al valor correspondiente de la solucin estndar (http://www.tdr.cesca.es/TESIS_URV/AVAILABLE/TDX-0812102-093854//Apendices10.pdf). 4.7 Anlisis especiales 4.7.1 Determinacin de teobromina (solubilidad en tetracloruro) Fundamento Est basado en la solubilidad de la teobromina, en un disolvente adecuado, en este caso se utiliza el mtodo de la solubilidad en tetracloruro. Procedimiento Se pesan, aproximadamente 20 g de muestra representativa, se desengrasa durante 4 h en un extractor Soxhlet, luego se seca en estufa a 100 C 2 C, repitiendo el secado hasta que dos pesadas sucesivas no difieran en ms de 0.5 mg. Se pesa en una cpsula de porcelana, previamente tarada, 10 g de muestra desengrasada, con precisin de 0.1 mg. a) Tratamiento inicial Se aaden 2 g o 3 g de xido de magnesio y se mezcla bien con la varilla. Se aaden, aproximadamente 14 ml de agua, agregando pausadamente a la vez que se tritura cuidadosamente, hasta que se humedezcan todas las partculas (el material ser comprimido

en una torta firme). Se coloca la cpsula con la mezcla humedecida sobre el bao Mara durante 30 min, mezclando a intervalos para evitar que alguna parte comience a secarse; durante esta operacin el material debe mantenerse granulado. Al cabo de 30 min, se saca la cpsula del bao, y se tritura el residuo con la esptula mezclando as todas las partculas hmedas. b) Extraccin Se transfiere cuantitativamente a un Erlenmeyer de 250 ml, y se aaden 150 ml de tetracloroetano, se conecta el condensador de aire y se hierve 30 min. Se filtra en caliente a un segundo Erlenmeyer de 200 ml. El filtrado debe ser claro y casi incoloro. Se transfiere el residuo y el papel de filtro al primer Erlenmeyer con 120 ml de solvente y se calienta a reflujo otra vez durante 20 a 30 min. Mientras tanto se destila ms lquido en el segundo Erlenmeyer, desde el primero, extrado del condensador de aire. Se filtra el lquido caliente (segunda extraccin) en un segundo Erlenmeyer. Los filtrados de todas las extracciones se reciben en dos matraces Erlenmeyer, los lquidos de la ltima extraccin se destilan hasta reducirlos a 3 ml o 5 ml. Se enfra el Erlenmeyer y el residuo, y se aade con rotacin 65 ml de ter de petrleo, se mezcla bien, se tapa y se deja sedimentar por lo menos 1 h (hasta que el lquido sobrenadante est claro). Se recoge el precipitado sobre papel filtro de poro mediano, usando varias porciones de 5 ml a 7 ml de ter de petrleo para transferir y lavar (http://www.ibnorca.org/02_norm/Normas_CP17/APNB%20326013.pdf). 4.7.2 Determinacin de cafena y teobromina por medio de HPLC Fundamento Los derivados xantnicos cafena y teobromina se extraen y se determina el extracto filtrado y lmpido por medio de HPLC (deteccin UV). Procedimiento |Reactivos | |Acetato de plomo (II) Pb(CH3COOH)23H2O (neutro) |Bicarbonato de sodio NaHCO3 | |xido de plomo (II) PbO |Disolucin bsica de subacetato de plomo: se disuelven 230 g de | | |acetato de plomo (II) en 700 ml de agua destilada hirviendo y a | | |continuacin se aaden 120 g de xido de plomo (II). se filtra la| | |mezcla en caliente y tras enfriarla se pasa la matraz aforado y se| | |completa a 1 L | |xido de magnesio MgO |Acetonitrilo (para el anlisis del residuo) filtrado e filtro de | | |membrana | |Acetato de sodio CH3COONa |Agua bidestilada filtrada en filtro de membrana | |Disolucin de acetato sdico: 0.4% |Disolucin patrn I: se disuelven 0.5 g de cafena y 0.5 g de | | |teobromina en agua destilada en un matraz aforado de 1 L y se | | |enrasa (c= 0.5 mg/ml) | |Disolucin patrn II: se pipetean 10 ml de la solucin I y se |ter de petrleo | |transfieren a un matraz aforado de 50 ml, se afora (c=0.1 mg/ml) | |

a) Preparacin de la disolucin problema Pesar una cantidad de chocolate y eliminar la grasa extrayndola con un disolvente hidrocarbonado. Es preciso eliminar la grasa porque interfiere en un paso ulterior del anlisis, (la cromatografa). A continuacin se colocan las partculas de chocolate, en un tubo de centrfuga previamente tarado, de 15 ml y se pesa. Se aade al tubo una porcin de 10 ml de disolvente orgnico (ter de petrleo), se cierra el tubo y se agita vigorosamente para disolver la grasa del chocolate. La cafena y la teobromina son insolubles en este disolvente. Al centrifugar esta suspensin las partculas del chocolate se depositan en el fondo del tubo. El lquido clarificado se puede decantar y desecharse. La extraccin con nuevas porciones de disolvente se repite dos veces ms para asegurar la eliminacin completa de la grasa del chocolate. Finalmente el disolvente que pueda quedar en el chocolate de elimina calentando el tubo de centrfuga en un vaso con agua hirviendo. Pesando el tubo de centrfuga ms su contenido del residuo de chocolate desengrasado, se puede calcular la masa del residuo de chocolate por diferencia con la masa conocida del tubo vaco (http://www.books.google.com.mx/books?isbn=8429172246). En un matraz Erlenmeyer de 300 ml se pesa exactamente 3 g 0.1 mg de la muestra desengrasada. Tras aadir unas perlas de vidrio se pesa el matraz. Se aaden 96 ml de agua destilada fra y se calienta mientras se agita. Se mantiene en ebullicin lenta durante 30 min, posteriormente y al mismo tiempo que se agita, se aaden 4 ml de subacetato de plomo. Se determina el peso del matraz y el lquido evaporado se completa con agua hasta que el peso sea 101.0 g (4 ml de acetato de plomo= 5 g). El contenido del matraz bien mezclado se pasa por un filtro de pliegues seco, eliminndose los primeros 10 ml del filtrado. Tras aadir bicarbonato de sodio slido de repite la operacin (desechndose los primeros 10 ml) y se somete a ultrafiltracin con el filtro de membrana. b) Parmetros para HPLC Columna de separacin: Superspher RP-18, LiChroCART 200 X 4 mm (Fa Merck) Eluyente: acetonitrilo/disolucin de acetato sdico 0.4% 15 + 85 (v/v) Flujo: 0.7 ml/min (200 bar o 20 mPa) Modo: isocrtico Temperatura 20-22 C Detector UV 254 nm Volumen de inyeccin: 20 l (bucle) Se analiza cromatrogrficamente 2.0 l de las soluciones madre I y II, respectivamente, siguiendo las condiciones especificadas en b) (patrn externo) (Matissek y col, 1998). 4.8 Adulteraciones

4.8.1 Adulteracin con grasa hidrogenada Fundamento Los cidos grasos metilados de las muestras son separados y cuantificados por cromatografa gaseosa con detector FID en columna capilar de fase reversa. Procedimiento a) Preparacin de las muestras: Fundir la muestra para asegurar una buena homogeneizacin, a no ms de 60 C. b) Preparacin de los steres metlicos: Pesar 250 mg de muestra en un tubo de vidrio con tapa rosca. Agregar 500 L de hidrxido de potasio en metanol 2 M. Agregar 5 mL de ter de petrleo. Agitar 2 min en vortex, reposar 1 h. Trasvasijar a los viales del muestreador automtico. Inyectar. Condiciones cromatogrficas: T detector: 250 C T inyector: 250 C Programa de temperatura del horno: 120 C por 5 min, aumentar la temperatura a razn de 10 C/min hasta 180 C, mantener por 30 min. Aumentar nuevamente a razn de 10 C/min hasta 210 C y mantener por 21 min (total 65 min). Flujo gas carrier: 15 psi Split: 1:100 Volumen de inyeccin: 1 L (http://www.ispch.cl/lab_amb/met_analitico/doc/ambiente%20pdf/Ac_grasos_transGC.pdf) . 5. Anlisis microbiolgico 5.1 Deteccin de Salmonella Fundamento La presente tcnica para la deteccin de Salmonella en alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos bsicos: 1. Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las clulas de Salmonella daadas a una condicin fisiolgica estable.

2. Enriquecimiento selectivo, empleado con el propsito de incrementar las poblaciones de Salmonella e inhibir otros organismos presentes en la muestra. 3. Seleccin en medios slidos, en este paso se utilizan medios selectivos que restringen el crecimiento de otros gneros diferentes a Salmonella y permite el reconocimiento visual de colonias sospechosas. 4. Identificacin bioqumica, este paso permite la identificacin genrica de los cultivos de Salmonella y la eliminacin de cultivos sospechosos falsos. 5. Serotipificacin, es una tcnica serolgica que permite la identificacin especfica de un cultivo. Procedimiento Medio de cultivo de pre-enriquecimiento: Caldo lactosado Caldo selenito-cistina Medio de cultivo de enriquecimiento: Caldo tetrationato Vassiliadis-Rappaport Caldo de soya tripticasa Leche descremada reconstituida Caldo soya tripticasa estril adicionado con sulfito de potasio Medios de aislamiento: Agar verde brillante (VB Agar con sulfito de bismuto Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) Agar para Salmonella y Shigella (SS) Agar entrico Hektoen Medios para pruebas bioqumicas

 Agar de tres azcares y hierro (TSI) Agar de hierro y lisina (LIA) Agar nutritivo Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad) Agar citrato de Simmons Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer) Caldo manitol Caldo malonato Caldo urea Caldo de urea rpido Caldo infusin cerebro corazn Soluciones: Solucin verde brillante al 0.1% (1:1000) Solucin de yodo-yoduro Solucin salina al 0.85% Solucin salina formalizada Reactivo de Kovac Solucin de alfa-naftol al 5% Solucin de rojo de metilo Solucin de hidrxido de potasio al 40% Solucin de gelatinasa al 5% a) Pesar aspticamente 25 g de la muestra en un vaso para licuadora o en bolsa estril para trabajar en homogeneizador peristltico (stomacher) agregando 225 ml de leche descremada reconstituida. Licuar por 2 min. Transferir aspticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estril de boca ancha con tapn de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el pH

aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6.8 0.2 con hidrxido de sodio 1N o cido clorhdrico 1N estriles. Adicionar 0.45 ml de la solucin verde brillante al 0.1% y mezclar bien. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa. Incubar 24 2 h a 35C. b) Aislamiento de Salmonella 1. Cerrar firmemente el tapn de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agitar suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitucin del caldo tetrationato puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport. 2. Incubar de 18 a 24 h a 35C o, para alimentos fuertemente contaminados a 42C por el mismo periodo. Estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios selectivos. 3. Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entrico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). 4. Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato. 5. Incubar las placas 24 2 h a 35C. 6. Examinar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella, de acuerdo con las siguientes caractersticas: Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras. Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas. Agar entrico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras. Agar Sulfito de Bismuto: las colonias tpicas de Salmonella pueden ser cafs, grises o negras; con o sin brillo metlico. Generalmente el medio circundante (halo) es caf, tornndose posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formacin del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias tpicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales. Agar SS: colonias translcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas. c) Identificacin bioqumica

1. Seleccionar al menos dos colonias tpicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien aisladas. Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple azcar hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estra en la superficie inclinada y por puncin en el fondo. Incubar por 24 2 h a 35C. Almacenar en refrigeracin de 5 a 8C las placas con medios selectivos por si es necesario retomar ms colonias. 2. Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones: Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentacin de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo ms intenso que el medio original debido a la no fermentacin de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayora de los casos se observa coloracin negra a lo largo de la puncin debido a la produccin de cido sulfihdrico. Agar LIA, se observa intensificacin del color prpura en todo el tubo por la descarboxilacin de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayora de las cepas de Salmonella producen cido sulfihdrico en este medio con ennegrecimiento a lo largo de la puncin. Retener todos los cultivos que muestren las reacciones caractersticas de Salmonella en los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas a continuacin. 3. Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA tpicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitir detectar S. arizonae y cepas atpicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que muestren reacciones atpicas en ambos medios. 4. Continuar el anlisis a partir de los tubos de TSI con reacciones tpicas. Si el cultivo presenta reacciones atpicas en este medio, tomar colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo atpico anterior y sembrar las pruebas bioqumicas nuevamente. 5. Continuar la identificacin bioqumica a partir de los cultivos recuperados de TSI. Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analtica seleccionando colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento. 6. Prueba de ureasa Prueba de ureasa (convencional). Con un asa estril, tomar crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control de medio para comparar el vire prpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24 2 h a 35C.

Prueba de ureasa (rpida). Tomar dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea (rpida). Incubar 2 h a 37 0.5C en bao de agua. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la prueba negativa (sin cambio de color del medio). d) Pruebas bioqumicas complementarias Cuando las pruebas serolgicas o bioqumicas iniciales, dan resultados atpicos o no concluyentes, realizar las pruebas que se describen a continuacin: 1. Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de la especie S. arizonae. 2. Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente: Agar citrato Simmons: o Inocular por estra el tubo. o Incubar 96 2 h a 35 2C. o Prueba positiva: crecimiento acompaado de un cambio de color de verde a azul. o Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color. Medio SIM o Inocular por puncin. o Incubar 24 h a 35 2C. o Movilidad: Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la puncin y en el seno del medio de cultivo. Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la puncin exclusivamente. o Produccin de cido sulfihdrico: Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la puncin que puede extenderse a todo el medio. Prueba negativa: ausencia de color negro. o Produccin de indol: adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0.2 a 0.3 ml de reactivo de Kovac.

 Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo. Prueba negativa: sin cambio de color. Caldo RM-VP o Inocular un tubo con el medio. o Incubar 48 2 h a 35 2C para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM. o Prueba de Voges-Proskauer (VP) Transferir a un tubo un ml del cultivo de 48 h. Adicionar 0.6 ml de solucin de alfa naftol. Adicionar 0.2 ml de solucin de hidrxido de potasio 40%. Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional). Interpretar los resultados despus de incubar 2 h a 35 2C o 4 h a temperatura ambiente. Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo. Prueba negativa: sin cambio de color. Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h ms a 35 2C. o Prueba de rojo de metilo (RM) Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubacin de dos a tres gotas de solucin de rojo de metilo. Interpretar los resultados inmediatamente. Prueba positiva: desarrollo de color rojo. Prueba negativa: desarrollo de color amarillo. Caldo malonato o Inocular un tubo conteniendo el medio. o Incubar 40 2 h a 35 2C. Prueba positiva: desarrollo de color azul.

 Prueba negativa: sin cambio de color. Caldo manitol o Inocular un tubo conteniendo el medio. o Incubar 24 2 h a 35 2C. Prueba positiva: desarrollo de color amarillo. Prueba negativa: sin cambio de color.