Biotecnología Aplicada

Biotecnologa Aplicada a la Identificacin y Validacin de Dianas Teraputicas
Informe de Vigilancia Tecnolgica
Biotecnologa Aplicada a la Identificacin y Validacin de Dianas Teraputicas

Informe de Vigilancia Tecnolgica
BIOTECNOLOGA APLICADA A LA IDENTIFICACIN Y VALIDACIN DE DIANAS TERAPUTICAS
El presente informe de Vigilancia Tecnolgica ha sido realizado en el marco del convenio de colaboracin conjunta entre Genoma Espaa y la Fundacin General de la Universidad Autnoma de Madrid (FGUAM), entidad que gestiona el Crculo de Innovacin en Biotecnologa (CIBT), perteneciente al Sistema de Promocin Regional de la Innovacin MADRID+D.
Genoma Espaa y la Fundacin General de la Universidad Autnoma de Madrid (FGUAM) agradecen la colaboracin ofrecida a:
Dr. Miguel ngel Piris Pinilla Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas (CNIO) Dr. Arcadio Garca de Castro Andrews PharmaMar Dr. Luis del Peso Ovalle Hospital Universitario de la Princesa D. Rosario Ambite Domnguez Crculo de Innovacin en Biotecnologa
La reproduccin parcial de este informe est autorizada bajo la premisa de incluir referencia al mismo, indicando: Biotecnologa aplicada a la identificacin y validacin de dianas teraputicas. GENOMA ESPAA/CIBT-FGUAM.
Genoma Espaa no se hace responsable del uso que se realice de la informacin contenida en esta publicacin. Las opiniones que aparecen en este informe corresponden a los expertos consultados y a los autores del mismo.
Copyright: Fundacin Espaola para el Desarrollo de la Investigacin en Genmica y Protemica/Fundacin General de la Universidad Autnoma de Madrid. Autores: Marta Lpez (CIBT) Paloma Mallorqun (CIBT) Ion Arocena (CIBT) Jos Antonio Mesa (Genoma Espaa) Miguel Vega (Genoma Espaa) Edicin: Silvia Enrquez (Genoma Espaa) Referencia: GEN-ES05009 Fecha: Abril 2005 Depsito Legal: M-51618-2005 ISBN: 84-609-8741-8 Diseo y realizacin: Spainfo, S.A.
ndice de contenido
RESUMEN EJECUTIVO
1. INTRODUCCIN A LA VALIDACIN DE DIANAS
2. TCNICAS DE IDENTIFICACIN DE DIANAS 2.1. Anlisis de la expresin gnica 2.1.1. Anlisis serial de la expresin gnica (SAGE) 2.1.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) 2.1.3. Microarrays de ADN 2.2. Interacciones protena-protena 2.2.1. Microarrays de protenas 2.2.2. Sistema doble hbrido
11 11 12 13 13 14 15 16
3. TCNICAS DE VALIDACIN DE DIANAS 3.1. Modulacin de la expresin gnica 3.1.1. Oligonucletidos antisentido 3.1.2. ARN de interferencia 3.1.3. Ribozimas 3.1.4. Protenas de dedos de zinc 3.2. Inactivacin de protenas 3.2.1. Qumica gentica 3.2.2. Anticuerpos monoclonales 3.2.3. Aptmeros 3.2.4. Pptidos 3.2.5. Inactivacin por lser mediante cromforos y fluorforos 3.3. Anlisis de la expresin gnica in situ 3.3.1. Microarrays de tejidos 3.3.2. Microarrays de clulas 3.4. Modelos vivos de la enfermedad 3.4.1. Ratones knock-out y knock-in 3.4.2. Ratones transgnicos 3.4.3. Mutagnesis de ratones al azar 3.4.4. Levaduras como modelo de enfermedad 3.4.5. Otros organismos modelo 3.4.6. Clulas madre embrionarias 3.5. Tcnicas bioinformticas
17 17 17 18 20 21 22 22 23 24 24 25 25 26 26 27 28 29 30 30 31 32 34
4. ESTRATEGIAS DE VALIDACIN DE DIANAS
37
5. APLICACIONES DE LAS TCNICAS DE VALIDACIN DE DIANAS 5.1. Enfermedades que requieren nuevas dianas 5.1.1. Enfermedades neurodegenerativas 5.1.2. Enfermedades cardiovasculares 5.1.3. Enfermedades psiquitricas 5.1.4. Enfermedades metablicas 5.1.5. Enfermedades autoinmunes 5.1.6. Cncer 5.2. Naturaleza de las dianas teraputicas para los frmacos actuales 6. ENTORNO ECONMICO EN LA VALIDACIN DE DIANAS 6.1. Validacin de dianas en el desarrollo de frmacos 6.2. Estrategias de implantacin de validacin de dianas en la industria farmacutica 6.3. Estrategias comerciales en la validacin de dianas
40 40 40 42 43 45 46 48 49 51 52 54 55
7. EMPRESAS Y PROYECTOS EN VALIDACIN DE DIANAS 7.1. Empresas internacionales en validacin de dianas 7.2. Empresas espaolas en validacin de dianas 7.3. Proyectos de I+D espaoles en validacin de dianas
58 58 59 60
8. CONCLUSIONES
61
ANEXOS ANEXO ANEXO ANEXO ANEXO I. Proyectos de I+D espaoles en validacin de dianas II. Empresas internacionales en validacin de dianas III. Empresas espaolas en validacin de dianas IV. Principales dianas teraputicas
65 65 92 103 111
REFERENCIAS
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GLOSARIO
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Resumen ejecutivo
Las dianas teraputicas son molculas localizadas en cualquier parte de la clula, capaces de reconocer un frmaco y producir una respuesta celular que modifique el curso de una enfermedad. La evaluacin de dianas teraputicas constituye un proceso que incluye las etapas de identificacin, caracterizacin y validacin de dianas, siendo este ltimo el paso final en la determinacin de la implicacin de la diana en el proceso patolgico. La secuenciacin del genoma humano ha revelado la presencia de un gran nmero de potenciales dianas teraputicas, sin embargo, la mayora de estas dianas no han sido completamente caracterizadas ni se ha establecido su asociacin con una enfermedad concreta. Se ha estimado que el nmero de dianas potenciales teraputicas se encuentra en torno a 600 y 1.500, no obstante, los frmacos que actualmente se encuentran en el mercado actan sobre alrededor de 500 dianas diferentes. El reto actual consiste en seleccionar a partir del conjunto de genes del genoma humano aquellos genes que dan lugar a protenas que pueden llegar a ser dianas teraputicas. La tasa de fracaso a lo largo del proceso de investigacin farmacutica es elevada, ms del 80% de los proyectos se abandonan durante la fase de descubrimiento anterior a los ensayos clnicos, de modo que slo uno de cada cinco proyectos consigue iniciar los ensayos clnicos. Una Las tcnicas genmicas y protemicas que se emplean en la identificacin y validacin de dianas son de diversa naturaleza, y se emplean generalmente en combinacin con otras tcnicas complementarias. La identificacin de dianas se realiza principalmente mediante tcnicas de anlisis de la expresin gnica o bien mediante el anlisis de interacciones protena-protena, como los microarrays de ADN y microarrays de protenas respectivamente. En cuando a las tecnologas relacionadas con la validacin de dianas, la modulacin de la expresin gnica mediante tecnologas antisentido y el empleo de modelos vivos de la enfermedad como los ratones knock-out son las tcnicas ms relevantes. No obstante, otras tecnologas complementarias como los microarrays de clulas y tejidos, clulas madre embrionarias, y tcnicas de inactivacin de protenas como CALI/FALI, son alternativas cada vez ms empleadas en las etapas de validacin de dianas. correcta validacin de dianas teraputicas reduce por tanto el tiempo y coste necesario para el desarrollo de un frmaco eficaz, ya que se evita continuar con los esfuerzos empleados en el desarrollo de frmacos cuyas dianas no han sido validadas adecuadamente. De este modo, la industria farmacutica conseguira optimizar sus esfuerzos de I+D orientndolos hacia los proyectos basados en dianas validadas correctamente, con mayores posibilidades de salir adelante.
1. Introduccin a la validacin de dianas

El presente informe tiene por objeto el estudio de las tcnicas que se emplean en la actualidad en la validacin de dianas prestando especial atencin a las aplicaciones de las tcnicas genmicas y protemicas. Los frmacos se componen de sustancias activas o compuestos responsables del efecto teraputico, los cuales ejercen su accin sobre la enfermedad cuando el compuesto es absorbido y distribuido por el organismo. Las molculas que reconocen estos frmacos se denominan dianas teraputicas, y su modulacin permite modificar el curso de un proceso patolgico. Las dianas sobre las que actan los frmacos pueden ser de diferente naturaleza, pudiendo ser azcares, protenas o cidos nucleicos (ADN o ARN), sin embargo, la mayora de los frmacos que se encuentran en el mercado actan sobre dianas proteicas1.
Diana teraputica Molcula localizada en cualquier parte de la clula, capaz de reconocer a un frmaco y producir una respuesta celular que modifique el curso de una enfermedad.
El desarrollo de nuevos frmacos constituye un largo proceso que se puede dividir en una serie de fases, la primera de las cuales consiste en la identificacin de nuevas dianas teraputicas. La identificacin de compuestos activos con actividad biolgica relacionada con las dianas previamente descritas conforma la segunda etapa de este proceso. El ltimo paso consiste en el desarrollo y optimizacin del frmaco a lo largo de las distintas fases
preclnicas y clnicas. Por tanto, una buena caracterizacin de la actividad biolgica de las dianas moleculares que han sido identificadas en las primeras fases, es fundamental para la obtencin de un mayor nmero de frmacos. No obstante, debido a la complejidad de los procesos biolgicos que dan lugar a distintas patologas, no siempre es posible identificar una diana que permita desarrollar un frmaco eficaz.
Validacin de dianas Proceso que tiene por objeto demostrar que una determinada diana molecular est implicada en la aparicin y progresin de una enfermedad. La validacin de una diana permite establecer una relacin entre la alteracin de la diana y su potencial teraputico.
La validacin de dianas consiste por tanto en determinar si una diana molecular est implicada en una enfermedad concreta, y por tanto es potencialmente susceptible de ser considerada como diana teraputica a la hora de disear nuevos frmacos. Para algunos autores la validacin de una diana se consigue nicamente cuando un frmaco se emplea con xito para
alterar el curso de una enfermedad. Sin embargo, la validacin de dianas puede realizarse igualmente tanto a nivel molecular como gentico mediante herramientas genmicas y protemicas, que permiten relacionar una diana con un estado patolgico determinado. El grado de validacin de una diana estar por tanto relacionado con la cantidad de datos preclnicos y clnicos que se
Smith, M. B. (2003). Hitting the target. Nature, vol. 422, 341-347.
renan respecto al mecanismo biolgico de la diana y su relacin con la eficacia del frmaco2. El paso de una fase a otra del desarrollo de frmacos depende en gran medida del grado de validacin de la diana en cuestin y del avance en el descubrimiento de potenciales compuestos
activos3. Sin embargo, no se debe olvidar que en la realidad muy pocas dianas identificadas durante las primeras fases del proceso de I+D conducen al desarrollo de un frmaco eficaz, por lo que el grado de incertidumbre del proceso de desarrollo farmacolgico es muy elevado.
Descubrimiento de dianas
Descubrimiento de frmacos
Desarrollo de frmacos
Identificacin de dianas
Validacin de dianas
Seleccin de compuestos
Optimizacin de compuestos
Fase Preclnica
Fase Clnica
Figura 1. Fases principales del desarrollo farmacolgico. Fuente: Whittaker, P. A. (2003). What is the relevance of bioinformatics to pharmacology? Trends In Pharmacological Sciences, 24 (8):434-439.
La identificacin y desarrollo de frmacos ha sido tradicionalmente un proceso lineal que consista en la bsqueda de compuestos qumicos mediante ensayos sobre cultivos celulares, tejidos o animales4. Las dianas no se validaban con las tecnologas complejas que se emplean hoy en da, y se desconocan los mecanismos moleculares responsables de las enfermedades. Los avances en genmica y protemica han permitido a la industria farmacutica descubrir un gran nmero de frmacos por medio del estudio de las relaciones existentes entre los genes y las enfermedades. Como consecuencia, la validacin de dianas al nivel del genoma ha surgido como una necesidad que a su vez ofrece numerosas ventajas, ya que permite la posibilidad de conocer de antemano algunos de los efectos biolgicos de las protenas, que mediante las tcnicas clsicas de validacin no era posible anticipar5.
Los frmacos que actualmente se encuentran en el mercado actan sobre aproximadamente 500 dianas diferentes. Las estimaciones ms recientes calculan que existen entre 20.000 y 25.000 genes en el genoma humano, de los cuales en torno a 5.000 podran estar implicados en procesos patolgicos. De estos ltimos, slo ciertos genes y las protenas que codifican sern de inters para el desarrollo de frmacos que modifiquen el proceso patolgico. De este modo, el nmero de dianas teraputicas potenciales se estima en torno a 600 y 1.500 dianas6. La secuenciacin del genoma humano en el ao 20017 supuso el descubrimiento de la secuencia de un gran nmero de dianas teraputicas potenciales. El reto actual consiste en seleccionar a partir del conjunto de genes del genoma humano aquellos genes que dan lugar a protenas y que pueden llegar a ser dianas teraputicas.
6 7
Epstein, D. M., et al. (2002). Target Validation with Nucleic Acid Aptamers. Mimicking small molecule therapeutics by attacking the protein, and not the gene. Pharmaceutical Discovery and Development. PharmaVentures Ltd. Whittaker, P. A. (2003). What is the relevance of bioinfomatics to phamacology? Trends In Pharmacological Sciences, 24 (8), 434-439. Douglas S. A., et al. (2004). Techniques: Cardiovascular pharmacology and drug discovery in the 21st century. Trends in Pharmacological Sciences. Vol. 25 N 4: 225-233. Liu, R., et al. (2004). New approaches in identifying drugs to inactivate oncogene products. Seminars in Cancer Biology 14: 13-21. Hopkins. A. L. et Groom, C. R. (2004). The druggable genome. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 1 727-730. Lander, E. S., et al. (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409(6822), 860-921. Venter, J. C., et al. (2001). The sequence of the human genome. Science. 291(5507). 1304-51.
Genoma humano: 20.000-25.000 genes
5.000 frmacos que actan sobre el genoma
5.000 Genes implicados en patologas
600-1.500 dianas teraputicas
Figura 2. Estimacin del nmero de dianas teraputicas del genoma humano. Fuente: Adaptado de Hopkins, A. L. et Groom, C. R. (2004). The druggable genome. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 1, 727-730.
Debido a que existen mltiples tcnicas moleculares que permiten relacionar genes y protenas con un determinado efecto ligado a una enfermedad, las tcnicas con una aplicacin potencial a la validacin de dianas son muy diversas. Por esta razn, algunas tcnicas moleculares de identificacin de nuevas dianas teraputicas pueden emplearse en etapas
tempranas como tcnicas de apoyo en la validacin de dianas. El presente informe realiza una descripcin de estas ltimas tcnicas, para posteriormente describir con ms detalle las tcnicas de validacin de dianas relacionadas con la genmica y protemica, clasificadas en funcin de las estrategias empleadas.
Mltiples dianas candidatas
Interacciones protena-protena
Cribado virtual (in silico)
Anlisis de la expresin gnica
Algunas dianas potenciales
Validacin de dianas
Modulacin de la transcripcin
Inactivacin de protenas
Modelos in vitro
Modelos in vivo
Mltiples compuestos candidatos
Cribado de compuestos
Desarrollo clnico
Frmaco candidato
Seguridad
Dosificacin
Efectividad
Frmaco final
Figura 3. Papel de la validacin de dianas en el proceso de desarrollo de nuevos frmacos. Fuente: elaboracin propia.
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2. Tcnicas de identificacin de dianas

Al buscar un gen asociado a una enfermedad gentica, los investigadores se concentran generalmente en genes candidatos8. Se considera que un gen es candidato si la protena que codifica representa una posibilidad lgica de que est involucrado en la enfermedad, o bien si el gen est localizado fsicamente dentro de una regin del genoma asociada o ligada a la enfermedad. La segunda situacin se encuentra frecuentemente en proyectos de clonaje posicional, donde el gen buscado se identifica de acuerdo a su posicin dentro del genoma. En un proyecto de clonaje posicional tpico, se identifica primero una regin pequea del genoma que contiene el gen que estamos buscando. Entonces todos los genes ubicados en esa regin se convierten inmediatamente en posibles genes candidatos. Si se sabe o se puede deducir algo de la protena codificada de un determinado gen candidato o si se puede demostrar que la protena est involucrada en la enfermedad, entonces ese gen se puede considerar un candidato fuerte y se intensifican los esfuerzos para encontrar mutaciones en l9. Las tcnicas genmicas y protemicas ms destacadas que se emplean en la identificacin de nuevas dianas teraputicas se pueden clasificar en tres grupos en funcin de la estrategia que siguen. El anlisis de la expresin gnica, el estudio de las interacciones protena-protena, y el cribado virtual, son las tres estrategias principales descritas en el presente informe.
2.1. Anlisis de la expresin gnica

El estudio del perfil de expresin de genes engloba un conjunto de tcnicas que permiten identificar los genes implicados en el proceso patolgico mediante la observacin de su fenotipo10 molecular. La expresin gnica es el proceso por medio del cual la informacin codificada en el ADN se transforma en las protenas necesarias para el desarrollo y funcionamiento de la clula. Este proceso tiene lugar por medio de una molcula intermediaria que transmite la informacin gentica denominada ARN mensajero (ARNm)11.
Transcripcin ARNm
Traduccin
ADN
Protena
Anlisis de la expresin gnica al nivel de la transcripcin Figura 4. Anlisis de la expresin gnica en la validacin de dianas. Fuente: elaboracin propia.
Gen candidato: gen localizado en una regin de un cromosoma sospechosa de estar involucrada en una enfermedad y cuyos productos proteicos sugieren que podra ser el gen de la enfermedad en cuestin (http://www.conocimientosweb.net/portal/term1494.html). 9 ConocimientosWeb.net (http://www.conocimientosweb.net/portal/term1494.html). 10 Fenotipo: rasgos o caractersticas visibles de un organismo, determinado por su constitucin gentica (genotipo) y por el ambiente en el que crece y se desarrolla. 11 El ADN (cido desoxirribonucleico) es una molcula de gran tamao que se encuentra en todos los seres vivos y que es portadora de la informacin gentica. El ARN (cido ribonucleico) es una molcula parecida al ADN en cuanto a sus caractersticas qumicas, que tambin est relacionada con la transmisin de la informacin gentica, ya que acta como intermediario en el proceso de traduccin o formacin de protenas.
11
Aunque todas las clulas contienen la misma informacin gentica, los genes se expresan en diferentes momentos dependiendo de la funcin de la clula o tejido y de su estado fisiolgico. El anlisis del perfil de expresin de genes consiste en la identificacin y cuantificacin de los genes que se expresan en una clula o tejido concreto en un determinado momento. El estudio del perfil de expresin de genes se puede realizar a partir de la identificacin y cuantificacin del ARN o bien de las protenas expresadas directamente. Las tcnicas de anlisis de la expresin gnica emplean el primer tipo de abordaje, de modo que la comparacin de los genes expresados en muestras distintas permite descubrir los genes que se encuentran activados e inactivados en diferentes estados metablicos y patolgicos. Por tanto, comparando la expresin de genes de tejidos sanos y enfermos, es posible descubrir los genes implicados en el desarrollo y progresin de la enfermedad, as como establecer una asociacin entre el estado patolgico y determinados genes que se encuentran alterados en esa enfermedad, y por tanto validar posibles dianas teraputicas. Las principales tcnicas de identificacin de dianas basadas en el anlisis de la expresin gnica son los microarrays de ADN, el Anlisis serial de expresin gnica (SAGE), y la Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE). Otras tcnicas alternativas de anlisis de la expresin gnica son variantes de la PCR como RaSH, RDA, RSDD, DDRT-PCR12. La principal limitacin de estas ltimas radica en que son laboriosas y requieren la inversin de un tiempo considerable para identificar los genes que se
expresan de modo diferencial en dos muestras diferentes. Los resultados que se obtienen no proporcionan informacin acerca de la cantidad de ARNm y no se pueden comparar resultados obtenidos en experimentos distintos13. Por este motivo, aunque son de gran utilidad en las primeras etapas de identificacin de dianas, no se suelen emplear con el fin de validar dianas14.
2.1.1. Anlisis serial de la expresin gnica (SAGETM)

El anlisis serial de la expresin gnica (SAGETM) se basa en la presuncin por la cual un segmento corto procedente de ARNm posee una complejidad suficiente como para identificar un gen completo. Esta tcnica fue desarrollada por la empresa Genzyme como plataforma tecnolgica de descubrimiento de nuevas dianas oncolgicas15, y ha sido adoptada por el Instituto Nacional del Cncer (NCI) como mtodo de anlisis de la expresin gnica dentro del Proyecto Anatoma del Genoma del Cncer16. Estos segmentos cortos se obtienen mediante la accin de enzimas de restriccin, que cortan en lugares especficos el ADN complementario sintetizado a partir del ARN mensajero total de la muestra. Midiendo la cantidad de copias de cada fragmento especfico se puede estudiar el nivel de expresin de un gen concreto, identificar simultneamente miles de fragmentos de este tipo en una clula o tejido y cuantificar sus niveles de expresin. La comparacin de dichos perfiles en muestras sanas y enfermas permite asociar la presencia de genes con enfermedades concretas17.
12
13
14 15
16 17
Pillutla, R. C. et al. (2002). Target Validation and drug discovery using genomic and protein-protein interaction technologies. Expert Opinion on Therapeutic Targets, 6 (4): 517-531. Chanda, S. K. et Caldwell, J. S. (2003). Fulfulling the promise: drug discovery in the post-genomic era. Drug Discovery today. Vol. 8, N 4. 168-174. Allen, N. L. et al. (2003). Representational difference anlisis: critical appraisal and metod development for the identification of unique DNA sequences from prokaryotes. Journal of microbiological methods. 55: 73-81. Coleman, R. A. and Clark, K. L. (2003). Target validation using human tissue. Targets Vol. 2, No. 2: 58-64. Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), Genzyme (http://www.genzyme.com/research/gzmo/discovery/discoveryplatforms2_sage_gzmo.asp). SAGE Genie, Cancer Genome Anatomy Project, CGAP. (http://cgap.nci.nih.gov/SAGE). Serial Analysis of Gene Expression, Sagenet web page (http://www.sagenet.org).
12
2.1.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)

La electroforesis en gel de poliacrilamida es una tcnica que permite la separacin de protenas de una muestra compleja en funcin de su masa molecular mediante la aplicacin de corrientes elctricas. La distribucin de las protenas en el gel y la intensidad de los puntos permite obtener un perfil de la expresin de protenas as como la identificacin y cuantificacin de las mismas. Este ltimo paso se suele realizar mediante espectrometra de masas, una tcnica analtica que brinda informacin cualitativa y cuantitativa acerca de la composicin atmica y molecular de materiales inorgnicos y orgnicos. La comparacin de los perfiles de expresin en un tejido enfermo y uno sano permite analizar los cambios en la expresin de protenas. De esta forma, aquellas protenas implicadas en procesos patolgicos se expresarn en cantidades diferentes en tejidos enfermos en comparacin con los tejidos normales, y por tanto podran constituir dianas potenciales. La principal limitacin de esta tcnica se debe a que el procedimiento resulta laborioso y consiste en una tcnica de bajo rendimiento18.
2.1.3. Microarrays de ADN

Las tcnicas de anlisis de la expresin gnica mediante microarrays se basan en la capacidad de los cidos nucleicos para hibridar entre s, es decir, para unirse a otros cidos nucleicos de forma especfica mediante un fenmeno denominado complementariedad19. Los microarrays de ADN son herramientas moleculares que permiten analizar la expresin gnica por medio de la cuantificacin del ARN expresado en una muestra concreta20. Un microarray de ADN consiste en un soporte sobre el cual se inmovilizan en posiciones concretas pequeos fragmentos de ADN de secuencia conocida denominados sondas. El ARN procedente de la muestra que se desea analizar se transcribe a ADN copia mediante transcripcin inversa, ya que estas molculas son ms estables que el ARN y es posible aadir marcadores que permitan su deteccin. Mediante la hibridacin del ADNc procedente de muestras diferentes con las sondas inmovilizadas en el soporte, es posible identificar el gen concreto que se expresa en cada muestra. La intensidad de los puntos del microarray indicar la cantidad de ARN presente en ese punto. Las principales limitaciones de los microarrays se refieren a su elevado coste por unidad.
18 19
20
Kramer, R. et Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews. Vol. 3: 965-972. El ADN est compuesto por dos cadenas enrolladas alrededor de s mismas que forman una doble hlice, cada una de ellas formada por millones de bloques qumicos llamados bases, y denominadas por las letras A, T, G y C. Estas bases poseen la capacidad de unirse entre s de forma especfica, de modo que las uniones entre las bases A-T y G-C son complentarias entre s. Lpez, M.; Mallorqun, P.; Vega, M. (2002). Microarrays y Biochips de ADN: Informe de Vigilancia Tecnolgica. Genoma Espaa, Crculo de Innovacin en Biotecnologa y Fundacin General de la Universidad Autnoma de Madrid.
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Identificacin de dianas mediante tcnicas de anlisis de la expresin gnica

Tcnicas basadas en la PCR Tcnicas basadas en la secuenciacin Tcnicas basadas en la hibridacin
ARN Transcripcin inversa
ADN copia Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) Protena A

S-S
Anlisis serial de expresin gnica (SAGE)
Microarrays
Protena B ARN
Hibridacin sobre un soporte con sondas de ADN complementarias
Desnaturalizacin
Liberacin de fragmentos especficos de cada ARN
SH HS
Deteccin por fluorescencia
Secuenciacin
Cuantificacin
Separacin mediante electroforesis Fig. 5. Validacin de dianas mediante tcnicas de anlisis de la expresin gnica. Fuente: Velculescu, V. E. et al. (2000). Analysing uncharted transcriptomes with SAGE. Trends Genet. Oct;16(10): 423-5; University of Miami Department of Biology Homepage (http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255hist/ecbxp4xSDS.jpg).
2.2. Interacciones protena-protena

Las tcnicas genmicas anteriormente mencionadas determinan la expresin de los genes en una clula o tejido, pero no permiten el estudio de las interacciones entre protenas21. Las protenas son las molculas responsables de desempear las funciones controladas por los
genes presentes en el ADN. Dado que la mayora de las dianas de frmacos son protenas, su estudio resulta esencial en el proceso de validacin de dianas. La protemica permite comprender el funcionamiento de la clula a travs del estudio del conjunto de protenas que contiene una clula o tejido o proteoma22. Por medio de tcnicas protemicas es posible comparar perfiles de
21 22
Kramer, R. et Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews. Drug discovery. Vol. 3: 965-972. Lindsay, M. A. (2003). Target discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 2: 831-838.
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expresin de protenas de tejidos y clulas sanas con los perfiles de expresin en muestras enfermas, lo que permite asociar dianas proteicas a determinados procesos patolgicos. Por otro lado, existen tcnicas que permiten estudiar las interacciones entre protenas a gran escala y establecer redes de interacciones entre las protenas de la clula. El conocimiento de estas redes permite conocer las rutas implicadas en procesos patolgicos y el conjunto de las protenas implicadas en una determinada enfermedad, es decir, potenciales dianas teraputicas .
23
Los microarrays de protenas consisten en un soporte slido sobre el que se inmovilizan protenas especficas en posiciones concretas. Los microarrays de protenas y anticuerpos permiten el anlisis a gran escala de los perfiles de expresin de protenas y el estudio de las interacciones entre las mismas26. Por medio del empleo de muestras procedentes de tejidos sanos y enfermos, los microarrays de protenas permiten estudiar la expresin diferencial de protenas en tejidos enfermos y relacionar las diferencias en el perfil de expresin proteica con el fenotipo de la enfermedad, lo que permite identificar y validar dianas potenciales de una enfermedad. Existen tres tipos de microarrays de protenas en funcin de las molculas que interaccionan entre s. De esta forma, nos encontramos con microarrays de
2.2.1 Microarrays de protenas

Los microarrays de protenas se basan en la tecnologa desarrollada para la fabricacin de los microarrays de ADN. En este caso, en vez de cidos nuclicos, las molculas que se inmovilizan sobre el soporte son de naturaleza proteica, como anticuerpos24, enzimas o protenas de otro tipo25.
interacciones protena-protena, ADN-protena, y enzima-sustrato27. Las principales limitaciones tcnicas de los microarrays de protenas se refieren a la dificultad para detectar e identificar protenas de modo especfico en comparacin con los microarrays de cidos nuclicos, que no poseen esta limitacin28.
Interaccin prot-prot
Interaccin ADN-prot
Interaccin prot-molcula
Interaccin antic-prot
Interaccin enzima-sustrato
Figura 6. Interacciones de protenas en validacin de dianas. Fuente: Smith, M. G. & Snyder, M. (2005). Global analysis of protein function using protein microarrays. Mech. Ageing Dev. 126(1):171-5.
23
24
25 26 27 28
Brown, D. & Superti-Furga, G. (2003). Rediscovering the sweet spot in drug discovery. Drug Discovery today. 8 (23): 1067-1077. Pillutla, R. C., et al. (2002). Target validation and drug discovery using genomic and protein-protein interaction technologies. Expert Opin. Ther. Targets, 6(4): 517-531 Los anticuerpos son protenas especializadas producidas por el sistema inmunolgico que se unen a partculas extraas denominadas antgenos. Kramer, R. et Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews. Vol. 3: 965-972. Kumble, K. D. (2003). Protein microarrays: new tools for pharmaceutical development. Anal Bioanal Chem. 377: 812-819. Wang, S., et al. (2004). Tools for target identification and validation. Curr. Op. in Chem. Biol. 8: 371-377. Kramer, R. et Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews. Vol. 3: 965-972.
15
2.2.2. Sistema doble hbrido

El sistema doble hbrido es una herramienta molecular que permite el estudio a gran escala de las interacciones protena-protena a travs de las protenas que regulan la expresin gnica, denominadas factores de transcripcin29. Estas protenas son las encargadas de regular la expresin de los genes mediante su activacin o represin. La mayora de los factores de transcripcin presentan dos regiones o dominios, un dominio de unin al ADN y un dominio responsable de la activacin del gen. Ambos dominios son esenciales para que tenga lugar la expresin gnica, aunque no tienen porqu formar parte de una misma protena30.
La identificacin de dianas teraputicas mediante el sistema doble hbrido analiza las interacciones entre dos protenas diferentes, que se unen a los dominios de unin de ADN y activacin de un gen que se utiliza como indicador respectivamente. La unin de los dos dominios a travs de las protenas fusionadas permite la activacin de la expresin del gen indicador, por lo que su presencia pondr de manifiesto la existencia de una interaccin entre las dos protenas31. El sistema doble hbrido aprovecha la maquinaria celular de la levadura S. cerevisiae, que se utiliza como sistema de expresin de ambas protenas de fusin. Por otro lado, esta tcnica permite estudiar la interaccin entre protenas y construir redes de interacciones de todo el proteoma, proporcionando una visin global de la maquinaria molecular32.
Dom. Activ. Dom. Activ. Protena 1 Dom. unin ADN Promotor Protena 2 Protena 3 Protena 2
Expresin del gen indicador

Gen indicador
Dom. unin ADN Promotor
Sin expresin del gen indicador

Gen indicador
Figura 7. Funcionamiento del sistema doble hbrido. Fuente: Elaboracin propia.
La principal limitacin de esta tcnica radica en que no permite analizar las interacciones entre protenas localizadas en compartimentos diferentes de la clula, limitando por tanto su aplicacin. Por otra parte, es habitual la presencia de falsos
positivos provocados por la activacin del gen indicador por parte de otras protenas de la levadura, adems de falsos negativos debido a problemas en la unin de las dos protenas33.
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32
33
Factor de transcripcin: protenas que regulan la expresin de determinados genes, mediante la activacin o represin de su expresin. Coates, P. J. & Hall, P. A. (2003). The yeast two-hybrid system for identifying protein-protein interactions. Journal of Pathology 199:4-9. Pillutla, R. C. et al. (2002). Target validation and drug discovery using genomic and protein-protein interaction technologies. Target Validation and Drug Discovery. 6 (4): 517-531. Parsons, A. B. et al. (2003). Yeast genomics and proteomics in drug discovery and target validation. Progress in Cell Cycle Research. Vol 5. 159-166. Coates, P. J. & Hall, P. A. (2003). The yeast two-hybrid system for identifying protein-protein interactions. Journal of Pathology 199:4-9.
16
3. Tcnicas de validacin de dianas

A pesar de que las tcnicas anteriormente mencionadas arrojan informacin relevante sobre la funcin de las dianas, su objetivo principal radica en la identificacin a gran escala de nuevas dianas teraputicas y no en la validacin de las mismas. A continuacin se describen aquellas tcnicas empleadas en etapas posteriores del proceso de I+D, en las cuales es necesaria la validacin de la funcin de las dianas moleculares ya identificadas. Las principales estrategias estn encaminadas a la modulacin de la expresin gnica, la inactivacin de la funcin de las dianas proteicas, y el anlisis de la expresin gnica a gran escala. Por ltimo, se describen las tcnicas de desarrollo de modelos vivos de enfermedad. estrategia de validacin permite comprobar la existencia de modificaciones en el fenotipo de organismos o clulas en ausencia de expresin del gen. De este modo, se consigue reproducir el efecto que producira la ausencia o inactivacin de la protena, lo que resulta de suma utilidad para validar dianas al permitir relacionar el fenotipo asociado a la enfermedad con un gen en concreto. Otras tcnicas de validacin de dianas basadas en la modulacin de la expresin permiten activar la expresin de genes especficos provocando la transcripcin de ARN a partir del ADN.
3.1.1. Oligonucletidos antisentido
3.1. Modulacin de la expresin gnica

La tcnicas de modulacin de la expresin gnica persiguen bloquear o activar de forma especfica la expresin de genes mediante diferentes estrategias a nivel del ARN mensajero, a travs del empleo de oligonucletidos modificados34. Estas modificaciones les permiten conseguir una serie de propiedades entre las que se encuentran la entrada al interior de las clulas, la resistencia a la degradacin y el aumento en la afinidad por la molcula de ARN. Las tecnologas antisentido se emplean en validacin de dianas sobre cultivos de tejidos o clulas, as como en modelos animales35. Las tcnicas de modulacin de la expresin gnica ms habituales consisten en el bloqueo de la expresin gnica a nivel del ARN impidiendo que un gen concreto se exprese y por tanto consiguiendo que la protena no se sintetice. Esta
Los oligonucletidos antisentido son pequeos fragmentos de nucletidos de unos 15 o 20 pares de bases de ADN o ARN de cadena sencilla, que son complementarios a un fragmento del ARN diana. Esta complementariedad permite su unin al ARN de forma especfica, bloqueando su expresin e impidiendo la produccin de la protena diana. Los oligonucletidos antisentido inhiben la expresin proteica mediante dos mecanismos diferentes. En algunos casos el ARN emparejado con el oligonucletido es fragmentado por accin de una enzima que reconoce el ARN emparejado con ADN. Tras este corte, el ARN queda daado y el oligonucletido antisentido en cambio no sufre alteracin alguna de modo que puede seguir unindose al ARN. En otros casos no se produce un corte en el ARN, pero el emparejamiento con el oligonucletido puede impedir procesos esenciales para la produccin de protenas a partir del ARN36.
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36
Los oligonucletidos son molculas de cido nuclico de longitud reducida que se pueden emplear para bloquear el ARN mensajero e impedir su funcin. Ilag, LL, et al. (2002). Emerging high-throughput drug target validation technologies. Drug Discovery Today 7(18 Suppl):S136-42. Stone, L. S. et Vulchanova, L. (2003). The pain of antisense: in vivo application of antisense oligonucleotides for functional genomics in pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews 55, 1081-1112.
17
Ribosomas
Comienzo de la sntesis de protenas

ARNm
Oligo antisentido
Unin de un oligonucletido antisentido
Corte del ARNm por la enzima Ribonucleasa H
Inhibicin de la expresin de la protena
Figura 8. Tecnologas de oligonucletidos antisentido en validacin de dianas. Fuente: Silencing code. Chemsoc, Royal Society of Chemistry (http://www.chemsoc.org/chembytes/ezine/1997/dna.htm).
En general, el empleo de oligonuclotidos antisentido es una herramienta de validacin de dianas que proporciona una elevada especifidad. Sin embargo, esta selectividad requiere como contrapartida el diseo detallado de oligonucletidos ya que existen numerosas variables que afectan a la especificidad de los oligos37. Otra desventaja que plantea el uso de los oligonucletidos antisentido es que son muy inestables y se degradan rpidamente en clulas y tejidos. Esta limitacin puede ser atenuada mediante modificaciones qumicas que mejoren su estabilidad. Asmismo, la administracin y distribucin de oligonucletidos a los cultivos celulares constituye un paso limitante y habitualmente es necesario combinarlos con compuestos que facilitan la entrada de los oligonucletidos a las clulas, como los liposomas38. La inhibicin de la expresin gnica mediante oligonucletidos antisentido es un proceso que tiene lugar de manera transitoria, lo que supone una limitacin en el silenciamiento de la expresin de protenas con una vida media de larga
duracin. Este problema se ha solucionado mediante el empleo de estructuras de ADN denominadas vectores de expresin, las cuales contienen la informacin necesaria para dirigir la sntesis de oligonucletidos antisentido en el interior de la clula. Estos vectores ofrecen la ventaja de ser ms estables que los oligonucletidos antisentido desnudos, por lo que se consigue una inhibicin de la expresin gnica ms prolongada39.
3.1.2. ARN de interferencia

El ARN de interferencia (ARNi) es una tecnologa que se basa en el empleo de molculas de ARN de doble cadena para bloquear la expresin de genes especficos. El mecanismo del ARNi est presente en la naturaleza y es una respuesta celular innata que permite combatir las infecciones virales regulando la expresin del ARN.
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38
39
Hall, J. (2004). Unravelling the general properties of siRNAs: strength in numbers and lessons form the past. Nature Reviews. Genetics 5: 552-557. Lee, L. K. et Roth, C. M. (2003). Antisense technology in molecular and cellular bioengineering. Current Opinion in Biotechnology. 14: 505-511. Dykxhoorn, D. M., et al. (2003). Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 4, 457467.
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En los ensayos de validacin de dianas, el ARNi de doble cadena se introduce en el interior de las clulas mediante distintos mtodos. Posteriormente, este ARNi de doble cadena es procesado enzimticamente dando lugar a molculas de ARN ms pequeas denominadas pequeos ARNs de interferencia o ARNsi (small interfering RNAs). Estos ARNsi son de doble cadena y estn por tanto formados por dos hebras complementarias y emparejadas. Los
ARNsi son reconocidos por el complejo RISC (RNA-induced silencing complex), el cual se une a molculas de ARNm complementarias, facilitando la degradacin de stas. Asimismo, es posible administrar directamente el ARNsi a la clula, en cuyo caso no sera necesaria ninguna de las etapas anteriores. De este modo, tanto el ARNi como el ARNsi son herramientas tiles para la inactivacin especfica de la expresin de genes40.
ARN de doble cadena
ARNi de doble cadena
Activacin del complejo RISC por ARNi de cadena sencilla
ARNm
Reconocimiento de la diana
Rotura del ARNm Figura 9. Tecnologas de ARNi en validacin de dianas. Fuente: Dykxhoorn, D. M., et al. (2003). Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. Vol. 4,457-467.
Las principales ventajas de los ARNi radican en su bajo coste y alta especificidad, por lo que constituyen una herramienta molecular que est sustituyendo a los oligonucletidos antisentido como mtodo de modulacin de la expresin gnica41. Por otro lado, el ARNi puede emplearse como herramienta para el estudio de la biologa de organismos completos a escala genmica mediante microarrays de clulas transfectadas con ARNi. Esta estrategia ha sido empleada con xito en lneas celulares procedentes de modelos animales, siendo inminente su aplicacin en clulas humanas42.
El empleo de ARNi presenta bsicamente los mismos problemas que las tecnologas antisentido y se refieren principalmente a las dificultades de administracin y distribucin en cultivos celulares y tejidos, vindose agravada la situacin en estudios in vivo. Estos problemas se han solucionado en parte mediante el empleo de vehculos de administracin como liposomas, o vectores de expresin como plsmidos y virus43. Por otra parte, las tcnicas de ARN interferente pueden dar lugar a efectos inespecficos debidos a la unin de alguna de las dos hebras del ARNsi a molculas de ARNm distintas del ARN diana44.
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Wang, S., et al. (2004). Tools for target identification and validation. Current Opinion in Chemical Biology. 8: 371-377. Lindsay, M. A. (2003). Target discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. 2: 831-838. Gunsalus, K. C. & Piano, F. (2005). RNAi as a tool to study cell biology: building the genome-phenome bridge. Curr. Op. in Cell Biology 17:3-8. Cocks, B. G. & Theriault, T. P. (2004). Developments in effective applicaction of small inhibitory RNA (siRNA) technology in mammalian cells. DDT: Targets. Vol. 3(4):165-171. Lee, L. K. & Roth, C. M. (2003). Antisense technology in molecular and cellular bioengineering. Current Opinion in Biotechnology. 14: 505-511.
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Como solucin a este tipo de problemas se han diseado molculas de ARN interferente modificadas qumicamente que evitan la aparicin de efectos no especficos45. Por otra parte, mientras que la tecnologa de ARNi ha sido aplicada con xito in vitro en numerosas ocasiones en la validacin de dianas teraputicas, su empleo in vivo todava no ha alcanzado el mismo grado de desarrollo. Otro tipo de mejoras que se estn desarrollando en tecnologas de ARN interferente incluyen la administracin directa de ARNsi de cadena sencilla en clulas, que ha demostrado ser efectivo en muchos tipos celulares aunque de forma transitoria. Para solucionar este problema se ha recurrido a los ARNsh (short hairpin), molculas de ARN con secuencias repetidas invertidas que forman estructuras en forma de horquilla, y que dan lugar a una inhibicin mucho ms estable de la expresin gnica46.
Similitudes y diferencias entre Oligonucletidos antisentido y ARNsi47 Similitudes Fragmentos cortos de cidos nucleicos (aprox. 20 bases). Metodologa comn para la administracin a cultivos celulares. Inducen el silenciamiento de la expresin gnica mediante su unin al ARNm. Los ARNsi y ciertos oligos antisentido provocan la ruptura del ARNm. Sus propiedades pueden alterarse mediante modificacin de las bases. Perfiles de biodistribucin similares. Diferencias Dos hebras para el ARNsi, una hebra para oligos antisentido. ARN de doble hebra es ms estable que cidos nucleicos de una sola hebra. Las modificaciones qumicas no son tan necesarias para su administracin en cultivos celulares en el caso de los ARNi. Mediacin del complejo RISC en el ARNi. Activacin de la enzima ARNasa en oligos antisentido. Aplicacin ms extendida de la tcnica de ARNi.
3.1.3. Ribozimas
Las ribozimas son pequeas molculas de ARN que actan como enzimas y que pueden cortar otras molculas de ARN en sitios especficos. La unin entre el ribozima y el ARN diana se produce por complementariedad y apareamiento entre ambas molculas. De este modo, se pueden disear ribozimas que reconozcan cualquier ARN diana simplemente variando la regin de reconocimiento del ribozima.
ARNm
Ribozima
Figura 10. Ribozimas en la validacin de dianas. Fuente: Chattterton, J. E. et al. (2004). Ribozymes in gene identification, target validation and drug discovery. DDT: Targets, Vol. 3(1):10-17.
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Samarsk, D. & Datta, M. (2003). Expediting target identification and validation through RNAi. Expert Rev. Mol. Diagn. 4(1):11-14. Walgren, J. L. & Thompson, D. C. (2004). Application of proteomic technologies in the drug development process. Toxicol Lett. 149:377-85. Paroo, Z. & Corey, D. R. (2004). Challenges for RNAi in vivo. Trends in Biotechnology. Vol. 22, No. 8: 390-394.
20
Las principales limitaciones de los ribozimas se deben a su inestabilidad y sensibilidad a la degradacin, menor especificidad y restricciones en el diseo. Los ribozimas pueden ser modificados qumicamente para incrementar su estabilidad. Por otro lado, es posible introducir en la clula vectores que dirigen la sntesis de ribozimas de tal modo que dicha sntesis ocurra directamente en el interior de las mismas. En este caso, el nivel de produccin de ribozima en la clula ser de suma importancia para que se produzca una reduccin significativa en el nivel de ARN diana48.
bloqueo o activacin de la expresin gnica en cultivos celulares. Los dedos de zinc son regiones presentes en protenas tales como los factores de transcripcin que participan en la iniciacin de la transcripcin, es decir, el paso de ADN a ARN previo a la sntesis de protenas. Estos factores de transcripcin poseen unas estructuras caractersticas en forma de dedos unidos por un in de zinc, los cuales reconocen secuencias especficas del ADN. Esta particularidad es de gran utilidad en la validacin de dianas ya que se pueden disear protenas con dedos de zinc que reconozcan especficamente la secuencia de ADN que se desea bloquear o activar. La activacin o represin de la expresin gnica se consigue mediante la unin de dominios activadores o represores respectivamente a las protenas de dedos de zinc. La asociacin entre la modulacin de la expresin gnica de la diana con el fenotipo o estado patgico, ser la que determine finalmente la validacin de la diana49.
3.1.4. Protenas de dedos de zinc

Una alternativa a las anteriores tcnicas de modulacin de la expresin gnica es el diseo de protenas de dedos de zinc como agentes de
Activacin de la expresin gnica
ADN
Bloqueo de la expresin gnica Protena de 3 dedos de Zinc ADN
Figura 11. Modulacin de la expresin gnica mediante protenas de dedos de Zinc. Fuente: Jamieson, A.C. et al. (2003). Drug discovery with engineered zinc-finger proteins. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 2: 361-368.
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Chatterton, J. E., et al. (2004). Ribozymes in gene identification and drug discovery. Drug Discovery Today: Targets, vol. 3, No. 1, 10-17. Jamieson, A. C., et al. (2004). Drug Discovery with Engineered Zinc-finger Proteins. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 2, 361-368. Wang, S., et al. (2004). Tools for target identification and validation. Current Opinion in Chemical Biology. 8: 371-377.
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La principal ventaja de esta tcnica frente al resto de tcnicas de modulacin de la expresin gnica consiste en que es ms estable que las estrategias que emplean cidos nucleicos. Por otro lado, el diseo de estas protenas requiere la identificacin previa de las secuencias de ADN susceptibles de ser reconocidas por los dedos de zinc, que se corresponden con regiones del genoma de baja condensacin. Este mapeado se realiza mediante enzimas ADNasas, que reconocen regiones del ADN con baja condensacin y por tanto ms accesibles a los factores de transcripcin50. Otra limitacin a tener en cuenta es la dificultad en la administracin de protenas de dedos de zinc, que afecta por igual a todas las tecnologas de modulacin de la expresin gnica mencionadas en el presente informe. Este problema se puede solucionar por medio del empleo de vehculos moleculares llamados vectores que permitan introducir genes en las clulas .
51
a la funcin de la protena completa. Por este motivo, las tcnicas basadas en la inactivacin de protenas son esenciales en la validacin de numerosas dianas teraputicas54. En el presente apartado se agrupan tcnicas que permiten el bloqueo o inactivacin de protenas especficas de modo que stas dejan de ejercer su funcin. El efecto observado tras la inactivacin de la protena diana permite relacionar dicha protena con su funcin concreta, y de esta forma resulta posible asociar un fenotipo determinado a una protena concreta.
3.2.1. Qumica gentica

La estrategia clsica de validacin de dianas o qumica gentica consiste en el empleo de pequeas molculas que se unen a las dianas de modo especfico provocando su inactivacin. De esta forma, se consigue inactivar la funcin de una protena especfica, lo que permite establecer una relacin entre la actividad de la misma y los efectos que se manifiesten en los cultivos de clulas, tejidos o animales55. A diferencia de las estrategias genticas, la qumica gentica permite la alteracin del fenotipo de forma directa y ocurre en tiempo real. Esta modificacin en la funcin proteica no es permanente, ya que su efecto es reversible si se eliminan los restos de estas molculas del medio. Este enfoque resulta muy til a la hora de validar dianas mediante el empleo de pequeas molculas, ya que permite asociar un fenotipo de inters con la accin de una determinada molcula sobre una diana concreta56. Adems de permitir analizar la funcin celular y validar dianas moleculares, estas pequeas molculas pueden emplearse como base para obtener potenciales frmacos. A partir del conocimiento de la estructura qumica del compuesto activo, es posible disear nuevas molculas de cara a su potencial aplicacin
3.2. Inactivacin de protenas

Debido a que la mayora de los frmacos que actualmente se encuentran en el mercado actan sobre protenas, parece lgico pensar que la validacin de dianas proteicas ha de ser una estrategia fundamental en el proceso de desarrollo de un frmaco52. La validacin de dianas mediante tcnicas de modulacin de la expresin gnica no siempre est relacionada de forma directa con la expresin de la protena. En numerosas ocasiones, se ponen en marcha una serie de mecanismos moleculares que modifican la protena hasta dar lugar a la molcula responsable del fenotipo final, y que por tanto seran imposibles de identificar nicamente mediante tecnologas de modulacin de la expresin gnica53. As mismo, algunas protenas estn formadas por varios dominios multifuncionales, por lo que la inhibicin de la expresin de uno de los genes que codifica un nico dominio no proporciona datos extrapolables
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Liu, P-G., et al. (2001). Regulation of an endogenous locus using a panel of designed zinc finger proteins targeted to accessible chromatin regions. Activation of vascular endothelial growth factor. J. Biol. Chem., 276:11323-11334. Peet, N. P. (2003). What constitutes target validation? Targets 2 (4): 125-127. Smith, M. B. (2003). Hitting the target. Nature, vol. 422, 341-347. Walgren, J. L. & Thompson, D. C. (2004). Application of proteomic technologies in the drug development process. Toxicol Lett. 149:377-85. Ilag, L. L., et al. (2002). Emerging high-throughput drug target validation technologies. DDT Vol. 7. N 18 (Suppl.) S136-142. Peet, N. P. (2003). What constitutes target validation? Targets. Vol. 2, No. 4: 125-127. Chanda, S. K., et al. (2003). Fulfilling the promise: drug discovery in the post-genomic era. Drug Discovery Today. Vol. 8, No. 4: 168-174.
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farmacutica. Una de las principales limitaciones de esta estrategia consiste en que requiere la disposicin de pequeas molculas que sean capaces de interaccionar de modo selectivo con protenas, lo que no es posible en todas las ocasiones57. Las estrategias de qumica gentica son de gran utilidad en aquellos casos en los cuales los genes de inters son esenciales para la supervivencia del organismo, y su alteracin es inviable para el funcionamiento de la clula. La principal limitacin de esta tcnica consiste en que no siempre se dispone de pequeas molculas que acten de modo especfico sobre la protena celular de inters.
3.2.2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos son protenas desarrolladas por el organismo con el fin de combatir infecciones mediante el bloqueo de agentes infecciosos de forma especfica. Esta seleccin y accin inhibitoria es de gran utilidad en la validacin de dianas proteicas, por lo que se han desarrollado diferentes tcnicas de fabricacin de anticuerpos monoclonales58 a gran escala como el phage-display y el doble hbrido59. En el caso de que las dianas se encuentren en el interior de la clula, es necesaria la administracin de anticuerpos mediante microinyeccin, o bien la expresin de los mismos en el interior de la clula mediante vectores de expresin, denominndose en este caso intracuerpos.
Anticuerpo intracelular
Protena diana
Interaccin de la Protena diana y el anticuerpo monocional
Figura 12. Inactivacin de protenas mediante anticuerpos, aplicacin en la validacin de dianas. Fuente: Iclectus Ltd. (http://www.iclectus.com/technology/intrabodies.htm#figure1).
Una de las limitaciones de los anticuerpos es su inestabilidad en el interior de las clulas, por lo que las estrategias que se estn desarrollando en la actualidad van encaminadas al diseo de anticuerpos ms estables y eficientes.
El principal problema que presentan los anticuerpos como agentes de validacin de dianas es el bajo nmero de estas molculas que dan lugar a una inactivacin efectiva de sus dianas proteicas60.
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Williams, M. (2003). Target validation. Curr Opin Pharmacol. 3(5): 571-7. Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos especficos que pueden ser producidos en grandes cantidades por clulas que se originan a partir de una lnea celular (hibridoma). Todos los anticuerpos monoclonales producidos por una clula hbrida son idnticos. Pillutla, R. C., et al. (2002). Target Validation and drug discovery using genomic and protein-protein interaction technologies. Expert Opinion on Therapeutic Targets, 6 (4): 517.531. Ilag, L. L., et al. (2002). Emerging high throughput drug target validation technologies. Drug Discovery Today 7 (18): 136-142.
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3.2.3. Aptmeros
Los aptmeros son nucletidos artificiales capaces de reconocer y unirse a molculas especficas debido a su particular estructura terciaria. Es posible disear y construir aptmeros que unan e inhiban prcticamente cualquier protena diana.
Aptmero
Protena diana
Interaccin de la Protena diana y aptmero
Figura 13. Inactivacin de protenas mediante Aptmeros, aplicacin en la validacin de dianas. Fuente: Archemix Corp. (http://www.archemix.com/tech_aptapp.html).
Los aptmeros presentan problemas de inestabilidad que se han solucionado mediante modificaciones qumicas que incrementan su estabilidad. Al igual que en el caso de los anticuerpos, una solucin al problema de administracin consiste en el empleo de vectores de expresin que permiten la sntesis de aptmeros en el interior de la clula61. Otra de sus principales limitaciones reside en la preferencia de unin de los aptmeros hacia formas determinadas de la superficie de las protenas, lo que implica una limitacin a la hora de validar dianas proteicas. Por otro lado, la naturaleza negativa de las molculas de cidos nucleicos que conforman los aptmeros supone un impedimento a la hora de bloquear protenas con dominios cargados negativamente62.
aptmeros se consigue mediante la construccin de aptozimas, aptmeros conjugados con dominios de ribozimas, o bien pares de aptmeros que reconocen simultneamente a la protena diana. En el primer caso, la unin de la aptozima a la diana provoca un cambio conformacional que altera la actividad de la ribozima. En el segundo caso, la unin de aptmeros adyacentes a la diana crea un puente de oligonucletidos que provoca el ligamiento del nucletido conector, que posteriormente es amplificado y detectado por PCR. Esta ltima estrategia ofrece una sensibilidad potencialmente superior al ELISA hasta 1.000 veces63.
3.2.4. Pptidos
Los aptmeros tambin pueden ser inmovilizados sobre microarrays de manera similar a los microarrays de ADN, con el objeto de ser empleados en la validacin de dianas proteicas. Las ventajas de esta tcnica radican en su alta especificidad y sensibilidad. La deteccin de los Los pptidos son fragmentos de protenas que pueden ser diseados como agentes de unin a dianas proteicas bloqueando su funcin o bien inhibendo su interaccin con protenas intracelulares64.
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Epstein, D. M., et al. (2002). Target Validation with Nucleic Acid Aptamers. Mimicking small molecule therapeutics by attacking the protein, and not the gene. Pharmaceutical Discovery and Development. PharmaVentures Ltd. Ilag, L. L., et al. (2002). Emerging high throughput drug target validation technologies. Drug Discovery Today 7 (18): 136-142. Walgren, J. L. & Thomson, D. C. (2004). Application of proteomic technologies in the drug development process. Toxicology Letters 149: 377-385. Ilag, L. L., et al. (2002). Emerging high throughput drug target validation technologies. Drug Discovery Today 7 (18): 136-142.
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Los pptidos presentan ciertas ventajas como agentes de validacin de dianas principalmente debido a su fcil produccin. Por otro lado, existen diversos sistemas que permiten identificar los pptidos que inhiben dianas concretas, entre las que cabe destacar la tcnica del doble hbrido y el phage display . La principal limitacin de los pptidos consiste en que presentan problemas de afinidad y selectividad, por lo que no es una tcnica que por s sola permita la validacin de una diana teraputica66.
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Al exponer estas molculas a luz lser, se inducen daos fotoqumicos en la protena diana de modo irreversible en las zonas de unin al anticuerpo, pptido o aptmero, inactivando la protena de modo especfico68. Esta tcnica de validacin de dianas ha demostrado ser eficaz en el caso de su empleo con anticuerpos, ya que se aprovecha de la selectividad de los anticuerpos y mejora sensiblemente su poder de inhibicin de la funcin de la protena diana69. Una alternativa a esta tcnica consiste en la utilizacin de fluorforos que reaccionan ante luz difusa y que por tanto no requieren fuentes de luz especiales. Esta tcnica se denomina FALI70 o inactivacin por lser mediante fluorforos71. La principal ventaja de esta tnica radica en que permite modificar un rea ms amplia de la protena, asegurando una inactivacin ms efectiva de la protena diana. Tras la inactivacin de la diana es necesario purificar el complejo formado por el anticuerpo unido al cromforo o fluorocromo junto con la protena diana, y posteriormente identificar esta ltima72.
3.2.5. Inactivacin por lser mediante cromforos y fluorforos

La tcnica CALI67 o inactivacin por lser mediante cromforos, consiste en el empleo de cromforos, molculas que absorben la luz de una determinada longitud de onda, unidos a un anticuerpo, pptido o aptmero.
Protena diana
Unin protena-ligando (anticuerpo, pptido o aptmero)
Emisin de luz lser
Inactivacin del dominio funcional de la protena diana
Figura 14. Inactivacin por lser mediante cromforos y fluorforos aplicado a la validacin de dianas. Fuente: Hanash, S. (2003) Disease proteomics. Nature 422, 226-232.
3.3. Anlisis de la expresin gnica in situ

Las tcnicas de anlisis de la expresin gnica como los microarrays de ADN permiten la identificacin de genes implicados en procesos patolgicos. Sin embargo, la mayora de los patrones de expresin obtenidos requieren de pasos posteriores de validacin que posibiliten realizar una asociacin entre la expresin de un gen y su fenotipo. Las tcnicas de anlisis de la expresin gnica mediante microarrays de tejidos y clulas son dos tcnicas empleadas en la validacin clnica y funcional de dianas respectivamente.
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66 67 68 69 70 71
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25
3.3.1. Microarrays de tejidos

Los microarrays de tejidos (TMAs, Tisssue Microarrays) consisten en colecciones miniaturizadas de hasta 1.000 muestras de tejidos inmovilizadas sobre un soporte, que permiten el anlisis in situ de dianas moleculares simultneamente (ADN, ARN o protenas). Prcticamente la mayora de los artculos publicados sobre microarrays de tejidos estn relacionados con el anlisis de tumores, aunque se ha demostrado su valor en otro tipo de patologas relacionadas en el sistema nervioso73.
Las principales ventajas que ofrecen los microarrays de tejidos frente a otras tcnicas de validacin se basan en la naturaleza in vivo del ensayo, que posibilita observar cambios fenotpicos que no son obvios mediante tcnicas moleculares. En la actualidad, los principales desarrollos encaminados a mejorar esta tcnica se centran en la mejora de la instrumentacin dedicada a la inmovilizacin de los tejidos en el array, automatizacin de la obtencin de imgenes digitalizadas, as como almacenamiento, anlisis y estandarizacin de la informacin obtenida74.
Caractersticas de los Microarrays de Tejidos en la validacin de dianas: Determinacin de la distribucin celular y subcelular de las dianas. Integracin de la informacin procedente del anlisis de las dianas a nivel del ADN, ARN y protenas. Confirmacin de los resultados obtenidos mediante tcnicas de validacin in vivo basadas en modelos animales y microarrays de ADNc. Anlisis de la prevalencia de dianas en diferentes etapas de progresin de la patologa (ej.: progresin tumoral). Correlacin de los datos moleculares con los datos clnicos.
3.3.2. Microarrays de clulas

Hasta la fecha, el anlisis in vivo de la expresin gnica se realizaba nicamente gen a gen, por medio de la introduccin de un gen en una clula, y la posterior observacin de su efecto fisiolgico o fenotipo. Los microarrays de clulas permiten el anlisis de la expresin gnica in vivo a gran escala en clulas humanas, y por tanto son una herramienta valiosa a la hora de validar dianas teraputicas . La estrategia empleada para su diseo consiste en el cultivo de clulas sobre fragmentos de ADN inmovilizados en un microarray. Estos fragmentos de ADN se transfectan o
75
introducen en las clulas, que posteriormente expresan las protenas codificadas por su secuencia. Los cambios fenotpicos que se observen en las clulas sern empleados para valorar la implicacin de las dianas teraputicas de inters76. Una estrategia alternativa consiste en transfectar las clulas inmovilizadas en el array con ARN interferente, de modo que en vez de activarse la expresin de un gen, se produzca el silenciamiento del mismo. Este bloqueo de la expresin gnica define un conjunto de puntos en el array que se correspondern con la expresin del fenotipo esperado77.
73 74
75 76
77
Sauter, G., et al. (2003).Tissue microarrays in drug discovery. Nature Review: Drug discovery 2: 962-972. Mousses, S., et al. (2001). Clinical and functional target validation using tissue and cell microarrays. Curr. Op. in Chem. Biology, 6: 97-101. Wang, S., et al. (2004). Tools for target identification and validation. Curr. Op. in Chem. Biol. 8: 371-377. Mousses, S., et al. (2001). Clinical and functional target validation using tissue and cell microarrays. Curr. Op. in Chem. Biology, 6: 97-101. Ziauddin, J. & Sabatini, D. M. (2001). Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature 411:107-110. Silva, J. M., et al. (2004). RNA interference microarrays: High-throughput loss-of-function genetics in mammalian cells. PNAS 101, n 17: 548-6552.
26
Microarrays de Tejidos
b a c a
Microarrays de Clulas
d c
Inmovilizacin de clulas en un Microarray de ADNc
Transfeccin de las clulas con mltiples genes de inters
Inmovilizacin de secciones de tejidos en un array e
Visualizacin de la expresin de los genes en las clulas in vivo
Figura 15. Esquema de funcionamiento de un microarray de tejidos aplicado a la validacin de dianas. Fuente: Sauter, G., et al. (2003). Tissue microarrays in drug discovery. Nature Reviews. Drug discovery 2: 962-972; Ziauddin, J. & Sabatini, D. M. (2001). Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature 411: 107-110.
3.4. Modelos vivos de la enfermedad

El avance en el conocimiento del genoma de diferentes organismos que se ha producido a lo largo de los ltimos aos ha puesto de manifiesto la existencia de un alto grado de conservacin de la secuencia del ADN y protenas, as como una similitud en la funcin de los genes y rutas de sealizacin en diferentes organismos. Este elevado grado de conservacin permite el empleo de otros organismos diferentes del ser humano como sistemas modelo en el proceso de desarrollo de frmacos. De hecho, se ha descubierto que existe un elevado grado de similitud con las rutas moleculares implicadas en enfermedades humanas, lo que hace que el valor de los organismos modelo en la validacin de dianas sea mayor78.
Vertebrados Ratn Pez cebra Mosca de la fruta
Invertebrados
C. elegans
Unicelulares
Levadura
Figura 16. Principales sistemas modelo en validacin de dianas. Fuente: Lindsay, M. A. (2003). Target discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. 2: 831-838.
78
Doan, T. N. (2004). High-throughput target validation in model organisms. Drug Discovery Today: Targets. Vol. 3, N 5: 191-197.
27
En lo concerniente a la validacin de dianas, la obtencin de un modelo animal que reproduzca la enfermedad humana constituye de por s un proceso de validacin de la diana. Al tratarse de un organismo completo, se puede as demostrar la implicacin de la diana en la enfermedad in vivo, y
proporciona un grado elevado de evidencia de que un gen en concreto est implicado en el proceso de inters. Por otro lado, el modelo animal obtenido es de gran valor para estudios posteriores necesarios para el desarrollo del frmaco, como son los estudios farmacolgicos y toxicolgicos79.
Caractersticas de un modelo animal ideal80 Facilidad de cra en cautividad. Tiempos de reproduccin cortos. Descendencia numerosa. Disponibilidad de mtodos de manipulacin gentica y experimental. Elevado nmero de genes conservados respecto al ser humano.
3.4.1. Ratones knock-out y knock-in

Los ratones knock-out son ratones a los que se les ha inactivado uno o varios genes mediante tcnicas de ingeniera gentica , por lo que carecen de una determinada funcin gnica. Los ratones knock-out permiten estudiar la funcin fisiolgica de genes de mamferos y son sistemas modelo valiosos sobre los que estudiar la eficacia de los frmacos. Se ha demostrado que el fenotipo de los ratones knock-out para una determinada diana se corresponde con los efectos de los frmacos que actan sobre la diana y la bloquean82. Los ratones knock-in, en cambio, son ratones que sobreexpresan el gen de inters mediante la introduccin de varias copias del gen durante el desarrollo embrionario del ratn. Una estrategia alternativa consiste en el desarrollo de ratones knock-out y knock-in especficos de tejido o inducibles. Los primeros consisten en ratones en los que la expresin de un gen determinado se encuentra inhibida en un
81
tejido concreto. Los knock-out inducibles permiten interrumpir la expresin de inters en el momento deseado administrando una sustancia determinada. En este caso, el gen se expresa con normalidad hasta que se administra el compuesto concreto83. Los ratones knock-out suelen presentar problemas de letalidad de los embriones para determinados genes. En ocasiones se ponen en marcha mecanismos de compensacin en el embrin que hacen que la ausencia del gen no de lugar a los efectos esperables ya que otros genes compensan al gen inactivado. Los knock-out inducibles permiten inactivar el gen cuando el ratn ya se ha desarrollado y por tanto evitan que se den estos mecanismos de compensacin y letalidad embrionaria. La principal limitacin de los ratones knock-out y knock-in se refiere al tiempo y coste que requiere la manipulacin gentica de estos organismos, lo que dificulta la manipulacin de ratones a gran escala84.
79/80
81 82
83
84
Kramer, R. & Cohen, D. (2004). Functional Genomics to new Drug Targets. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 3: 965-972. Abuin, A., et al. (2002). Full-speed mammalian genetics: in vivo target validation in the drug discovery process. Trends in Biotechnology. Vol. 20, N 1: 36-42. La ingeniera gentica es una tecnologa que permite introducir cambios en el genotipo de un organismo. Zambrowicz, B. P., et al. (2003). Predicting drug efficacy: knockouts model pipeline drugs of the pharmaceutical industry. Current Opinion in Pharmacology. 3: 563-570. Trnell, J. & Snaith, M. (2002). Transgenic systems in drug discovery: from target identification to humanized mice. Drug Discovery Today. Vol. 7 No. 8: 461-470. Hardy, L. W. & Peet, N. P. (2004). The multiple orthogonal tools approach to define molecular causation in the validation of druggable targets. Drug Discovery Today. 9(3): 117-26. Baumeister, R. (2002). The worm in us - Caenorhabditis elegans as a model of human disease. Trends in Biotechnology. Vol. 20, N 4: 147-148.
28
3.4.2. Ratones transgnicos

Los ratones transgnicos son ratones a los que se les ha introducido un gen procedente de otro organismo diferente durante el desarrollo embrionario. De este modo, se puede introducir en el animal transgnico un gen que codifique para la diana teraputica que se desee validar, sobreexpresando dicha diana en el modelo animal. Los ratones transgnicos ms fciles de obtener son aquellos en los que el transgn se expresa de modo continuo en todos los tejidos del organismo, aunque tambin es posible obtener ratones que expresen el transgn en un tejido determinado al igual que ocurre con los ratones knock-out y knock-in. Asimismo, se pueden emplear ratones transgnicos inducibles, y en este caso el transgn slo se expresa al inducir la expresin mediante la administracin de un compuesto concreto85. Las tecnologas de transgnesis permiten introducir genes humanos en ratones transgnicos de modo que se puede estudiar la
funcin de protenas humanas en ratones transgnicos. De este modo se obtienen ratones humanizados que expresan dianas humanas que permiten estudiar los efectos debidos a la expresin de la diana humana en el modelo animal. La principal limitacin de los ratones transgnicos se refiere al tiempo y coste que requiere la manipulacin gentica de los ratones, haciendo imposible el empleo de esta tcnica a gran escala. El clonaje de expresin en cultivos celulares es una alternativa al empleo de modelos animales transgnicos. Esta tcnica se basa en introducir genes en clulas con objeto de que los genes se expresen en su interior y den lugar a las protenas. Posteriormente se estudian las alteraciones en el fenotipo de las clulas de modo que se puede asociar una alteracin concreta a la expresin de un gen determinado. Sin embargo, esta tcnica no ofrece las ventajas de los modelos animales transgnicos, los cuales proporcionan informacin sobre la funcin desempeada por un gen in vivo86.
Tecnologa knock-out/transgnica Bloqueo total de la expresin del gen. Limitado a un nmero de especies. Efectos generalmente irreversibles. Elevado precio. Proceso lento. Instalaciones adecuadas para animales. Requiere el control de efectos compensatorios y de desarrollo. Laborioso si se desea modificar varias dianas. Fenotipos letales para algunos genes. Es posible generar modelos animales que sobreexpresen el gen.
vs.
Tecnologa Antisentido87 Modulacin de la expresin del gen. Aplicable a numerosas especies incluyendo a humanos. Efectos reversibles. Precio moderado. Proceso rpido. No requiere instalaciones especiales. Requiere el control de efectos debidos a la inespecifidad del ADN. Posibilidad de modificar mltiples dianas. Toxicidad de altas dosis de oligos antisentido. No es posible sobreexpresar el gen.
85
86
87
Trnell, J. & Snaith, M. (2002). Transgenic systems in drug discovery: from target identification to humanized mice. Drug Discovery Today. Vol. 7 No. 8: 461-470. Hardy, L. W. & Peet, N. P. (2004). The multiple orthogonal tools approach to define molecular causation in the validation of druggable targets.Drug Discov Today. 9(3): 117-26. Chanda, S. K., et al. (2003). Fulfilling the promise: drug discovery in the post-genomic era. Drug Discovery Today. Vol. 8, No. 4: 168-174. Stone, L. S. & Vulchanova, L. (2003). The pain of antisense: in vivo application of antisense oligonucleotides for functional genomics in pain and analgesia. Advances Drug Delivery Reviews 55: 1081-1112.
29
3.4.3. Mutagnesis de ratones al azar

Las mutaciones consisten en cambios en la secuencia del ADN debidas a la sustitucin de una base nucleotdica o unidad estructural por otra. Mediante agentes mutagnicos qumicos es posible crear mutaciones al azar. La lnea germinal masculina que dar lugar a espermatozoides puede ser sometida a mutagnesis y los ratones macho que producen espermatozoides mutados se cruzan con hembras dando lugar a una generacin de ratones mutada. A partir de esta descendencia se pueden seleccionar los ratones que presentan el fenotipo de inters, es decir una sintomatologa similar a la de la enfermedad de inters. Mediante el estudio de las mutaciones ocurridas en estos ratones, se pueden identificar los genes mutados, que por tanto estarn asociados a la aparicin de la enfermedad. Existen otras tcnicas capaces de obtener ratones mutados al azar sin necesidad de emplear agentes qumicos. La captura de genes o Gene trapping es un mtodo que permite la mutacin al azar mediante insercin de un elemento de ADN en el gen que interrumpe la transcripcin del mismo.
de ADN que se inserta en el genoma ya que ste es de secuencia conocida y puede ser localizado88.
3.4.4. Levaduras como modelo de enfermedad

La levadura Saccharomyces cerevisiae89 es un organismo ampliamente estudiado y de fcil crecimiento en condiciones de laboratorio. A pesar de la distancia evolutiva que separa al ser humano de las levaduras, stas poseen miles de protenas de secuencia similar a las protenas humanas. De hecho, muchas de las mutaciones que se observan en tumores humanos pueden ser modelizadas en levaduras, y los frmacos que actan sobre protenas humanas ejercen una accin similar en sus equivalentes en las levaduras. Es posible obtener mutantes de S. cerevisiae a los que se les haya eliminado un gen concreto, lo que permite crear un modelo del efecto biolgico debido a la inactivacin del gen. De este modo, se puede reproducir el efecto de un frmaco que acte inhibiendo esa diana en concreto. Por otro lado, tambin es posible sobreexpresar genes concretos y observar su efecto en el fenotipo celular, lo que resulta de utilidad a la hora de establecer relaciones entre genes y enfermedades. La principal desventaja de la levadura como modelo se debe a que se trata de organismos simples formados por una sola clula, por lo que no permiten el estudio de procesos ms complejos caractersticos de mamferos como el ser humano. Resulta imposible por tanto el estudio de fenotipos complejos, limitando su utilizacin a la validacin de dianas de determinados tipos de enfermedades siendo una de las principales el cncer90.
Sin embargo, estas tcnicas no permiten crear mutaciones precisas ya que stas ocurren al azar. Las mutaciones no siempre dan lugar a la inactivacin del gen, y por tanto pueden no detectarse mutaciones en genes de inters. En el caso de la mutagnesis qumica, la identificacin del gen mutado resulta muy difcil ya que requiere la bsqueda de cambios a lo largo de toda la secuencia del genoma debido a que no existe informacin previa acerca del gen que se ha mutado. La captura de genes, en cambio, facilita la localizacin del gen mutado a partir del fragmento
88
89 90
Abuin, A., et al. (2002). Full-speed mammalian genetics: in vivo target validation in the drug discovery process. Trends in Biotechnology 20 ( 1): 36-42. Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org). Parsons, A. B., et al. (2003). Yeast genomics and proteomics in drug discovery and target validation. Progress in Cell Cycle Research Vol. 5, 159-166. Carroll, P. M. & Fitzgerald, K. (2003). Model Organisms in Drug Discovery. Edited by John Wiley & Sons, Ltd.
30
3.4.5. Otros organismos modelo

Existen otros organismos modelo de origen animal diferentes del ratn que se pueden emplear en validacin de dianas. Los ms importantes son la mosca de la fruta o Drosophila melanogaster, el nemtodo Caenorhabditis elegans y el pez cebra o Danio rerio.
mutaciones pueden ser creadas por mutagnesis qumica al azar o empleando mutaciones ya conocidas. De este modo, se pueden identificar rutas nuevas que estn relacionadas con enfermedades conocidas, lo que permite relacionar nuevas dianas y rutas con enfermedades91. El nematodo intestinal (C. elegans) fue el
La mosca de la fruta (D. melanogaster), es una mosca de pequeo tamao que se ha empleado durante el ltimo siglo en investigacin gentica y genmica, debido a que se han descrito un gran nmero de mutantes que permiten estudiar la herencia de los genes y las caractersticas controladas por los mismos. Mediante la introduccin de genes procedentes de otros organismos es posible conseguir que la expresin de los genes introducidos vare en funcin de los tejidos o estados del desarrollo. Por tanto, la mosca de la fruta se puede emplear para identificar nuevos componentes de rutas asociadas a enfermedades concretas. La validacin de dianas en la mosca de la fruta puede realizarse empleando tecnologas antisentido como el ARNi y el ARNsi, por medio de modificaciones que permiten introducir un transgen que codifique para el ARN de interferencia. De este modo se consigue silenciar la expresin de un gen en un organismo completo de modo estable, sin necesidad de aadir ARN de interferencia de manera constante. La mosca de la fruta se ha empleado para validar dianas implicadas en la diabetes y en la enfermedad de Alzheimer mediante la bsqueda de modificadores genticos. Esta estrategia consiste en crear fenotipos de enfermedad ya conocidos mutando dianas ya descritas y estudiadas, para posteriormente buscar mutaciones que modifiquen el fenotipo. Las
primer organismo multicelular cuyo genoma fue secuenciado92 y consiste en un buen modelo para estudiar la funcin de genes asociados a la enfermedad, y por tanto para validar dianas. Esto se debe a que existe una elevada similitud entre su secuencia y los genes humanos (65%), y sus protenas son responsables de funciones y rutas metablicas similares93. El ARN de interferencia fue descubierto en este organismo como un mecanismo regulador de la transcripcin, responsable del silenciamiento de genes de forma especfica de secuencia. El silenciamiento de genes concretos mediante tecnologas de ARN de interferencia da lugar a cambios fenotpicos que permiten asociar rutas y dianas a enfermedades concretas94. Por otro lado, las tcnicas de transgnesis descritas para otros sistemas modelo tambin pueden ser empleadas en C. elegans como mtodo de validacin de dianas. Como modelo animal, C. elegans ha sido empleado con frecuencia para el estudio de enfermedades humanas como el cncer, la depresin, la enfermedad de Alzheimer y la muerte celular95. La ruta que controla la apoptosis o muerte celular fue dilucidada en C. elegans y esta ruta tiene implicaciones importantes para el estudio del cncer. En el caso del Alzheimer, C. elegans posee equivalentes a los genes humanos implicados en esta patologa, lo que permite estudiar su funcin en este modelo96.
91 92 93
94 95 96
Kramer, R. & Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol 3: 965-972. WormBase (http://www.wormbase.org). Baumeister, R. (2002). The worm in us - Caenorhabditis elegans as a model of human disease. Trends in Biotechnology. Vol. 20, N 4: 147-148. Jain, K. K. (2004). RNAi and siRNA in target validation. Drug Discovery Today. 9 (7): 307-309. Carroll, P. M. & Fitzgerald, K. (2003). Model Organisms in Drug Discovery. Edited by John Wiley & Sons, Ltd. Baumeister, R. (2002). The worm in us - Caenorhabditis elegans as a model of human disease. Trends in Biotechnology. Vol. 20, N 4: 147-148.
31
El pez cebra (Danio rerio) es un organismo modelo que se ha comenzado a usar recientemente en validacin de dianas. Sin embargo, este organismo es un modelo ampliamente conocido debido a que sus embriones son transparentes y permiten estudiar el desarrollo embrionario con facilidad, son fciles de criar, tienen un ciclo de vida corto y su desarrollo es rpido. Debido a que el pez cebra es un organismo vertebrado, posee numerosas similitudes con los mamferos, lo que ha permitido desarrollar modelos representativos de enfermedades humanas97. En este sentido, han sido desarrolladas varias tcnicas que permiten modular la expresin
gnica en el pez cebra por medio de mutaciones, la sobreexpresin de genes del pez cebra, y la introduccin de genes procedentes de otros organismos. Por otra parte, existen tecnologas basadas en el empleo de oligonucletidos antisentido sintticos especialmente adecuados para su empleo en pez cebra, siendo las ms empleadas los oligonucletidos tipo morfolino y los pptidos nucleicos o PNAs98. Los oligos tipo morfolino son oligonucletidos antisentido modificados que presentan un esqueleto con una estructura qumica determinada que se denomina morfolino, mientras que los PNAs son oligonucletidos antisentido modificados con un esqueleto peptdico de carga negativa.
Tecnologa antisentido
Naturaleza cido nucleico sinttico con un esqueleto de morfolino cido nuclico con un esqueleto peptdico de carga negativa.
Funcionamiento
Ventajas
Oligonucletidos tipo morfolino
Unin al ARNm especfico y bloqueo de la sntesis de la protena
Mayor estabilidad
Peptidos nucleicos (PNAs)
Unin de alta afinidad al ARNm de la protena
Mayor especificidad Menor toxicidad
Tabla 1. Comparativa de las dos principales tecnologas antisentido empleadas para validar dianas en pez cebra. Fuente: Doan, T. N. (2004). High-throughput target validation in model organisms. Drug Discovery Today: Targets. Vol. 3(5): 191-197.
Actualmente, el pez cebra se emplea como modelo para enfermedades humanas y procesos biolgicos de inters como la angiognesis o creacin de vasos sanguneos, procesos inflamatorios, metabolismo de lpidos, regulacin de la insulina y mecanismos implicados en la adiccin a las drogas99.
inters creciente se ha considerado necesario dedicarles un apartado en el que se expone su aplicacin en la validacin de dianas, junto con sus ventajas respecto a la validacin mediante otros cultivos celulares. Las clulas madre embrionarias son clulas procedentes del embrin en su fase temprana que conservan la capacidad de convertirse en toda
3.4.6. Clulas madre embrionarias

Las clulas madre de origen embrionario no constituyen una tcnica de validacin por s mismo sino que son un sistema sobre el que aplicar las diferentes tcnicas de validacin que se han tratado en apartados anteriores. Debido a su
clase de clulas del organismo. Al cultivarlas en laboratorio, estas clulas pueden ser mantenidas en un estado no diferenciado o pueden diferenciarse a algn tipo celular en condiciones adecuadas. En la validacin de dianas se emplean tanto clulas madre no diferenciadas, como clulas diferenciadas procedentes de ratn debido
97
98 99
Doan, T. N. (2004). High-throughput target validation in model organisms. Drug Discovery Today: Targets. Vol. 3, N 5: 191-197. PNA: Peptide Nucleic Acid. Walgren, J. L. & Thompson, D. C. (2004). Aplication of proteomic technologies in the drug development process. Toxicology Letters 149: 277-385. Kramer, R. & Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol 3: 965-972.
32
a los problemas legales que hay en torno a las clulas embrionarias humanas. Recientemente, la Comisin de Donacin y Utilizacin de Clulas y Tejidos Humanos ha autorizado los cuatro primeros proyectos de investigacin con clulas madre embrionarias en Espaa a partir de embriones sobrantes de los procesos de fertilizacin100. Las clulas madre no diferenciadas pueden ser manipuladas para eliminar la expresin de un gen con el objeto de evaluar la funcin del mismo en la clula dando lugar a clulas madre knock-out, o bien a clulas madre knock-in que sobreexpresen el gen de inters. Por otro lado, se pueden disear clulas madre transgnicas modificadas genticamente mediante la introduccin del gen que codifique para la diana potencial que se desea validar, de modo que sta se exprese en la clula. Entre las ltimas aplicaciones de las clulas madre para la validacin de dianas se encuentra la tranfeccin de RNA interferente a cultivos de estas
clulas, provocando el silenciamiento de la expresin gnica101. Las clulas madre pueden diferenciarse posteriormente mediante su cultivo en condiciones controladas, dando lugar a clulas adultas con una fisiologa similar a las clulas diferenciadas del organismo. De este modo se pueden diferenciar clulas madre a las que se les ha eliminado la expresin de un gen concreto y obtener clulas de un tipo celular determinado en las que estudiar la funcin de los genes concretos. Otro tipo de estrategia de validacin de dianas consiste en la implantacin de clulas madre no diferenciadas en ratones, que dan lugar a teratomas o tumores formados por clulas de origen embrionario. Estos teratomas son de utilidad para evaluar el papel de genes concretos en la proliferacin celular y la diferenciacin, de modo que pueden resultar de inters como dianas teraputicas frente al cncer.
Tipo celular
Estabilidad gentica Alteraciones cromosmicas
Crecimiento
Disponibilidad
Variabilidad celular Cambian a lo largo del cultivo Dependiente del donante
Manipulacin gentica
Tumoral o transformada
Anormal
Ilimitada
Muy limitada
Clulas primarias Clulas madre embrionarias
Normal
No proliferan
Limitada
No
Normal
Normal
Ilimitada
Uniforme
Si
Tabla 2. Caractersticas de tipos celulares empleados habitualmente en validacin de dianas. Fuente: McNeish, J. (2004). Embriogenic stem cells in drug discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol 3: 70-80.
Las clulas madre embrionarias presentan ciertas ventajas en comparacin con los dems tipos de cultivos celulares que se emplean en validacin de dianas. Las clulas madre embrionarias son genticamente estables, uniformes en cultivo celular, y presentan un crecimiento normal aunque se dividen sin lmite, lo que permite mantenerlas en cultivo indefinidamente y disponer de ellas en cantidades ilimitadas. Por otra parte,
estas clulas son las nicas que pueden ser manipuladas genticamente con facilidad debido a su habilidad para sufrir recombinacin homloga con una frecuencia mayor que el resto de tipos celulares. Todas estas caractersticas confieren ventajas a las clulas madre embrionarias sobre las clulas primarias o las lneas celulares procedentes de tumores, ya que combinan las caractersticas deseadas de ambos102.
100
101
102
La Comisin de Donacin y Utilizacin de Clulas y Tejidos Humanos da luz verde a los primeros proyectos de investigacin con clulas madre embrionarias en nuestro pas. Nota de prensa: 23 de febrero 2005, Ministerio de Sanidad y Consumo (http://www.msc.es/gabinetePrensa/notaPrensa/desarrolloNotaPrensa.jsp?id=268). Cocks, B. G. & Theriault, T. P. (2004). Developments in effective applicaction of small inhibitory RNA (siRNA) technology in mammalian cells. DDT: Targets. Vol. 3(4): 165-171. McNeish, J. (2004). Embriogenic stem cells in drug discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol 3: 70-80.
33
3.5. Tcnicas bioinformticas

La bioinformtica consiste en el uso de las matemticas y de las tcnicas informticas para resolver problemas biolgicos por medio de programas informticos y modelos matemticos. Las herramientas bioinformticas ms relevantes son las bases de datos, las cuales permiten el almacenamiento y manejo de la informacin biolgica, y los algoritmos, que permiten elaborar relaciones de asociacin entre datos contenidos en las bases de datos. La bioinformtica permite por tanto el estudio de una elevada complejidad de datos mediante el uso de herramientas con gran capacidad de almacenamiento y poder de clculo. Los principales objetivos de la bioinformtica durante las fases iniciales de desarrollo de un frmaco se centran en desentraar la informacin contenida en las secuencias de ADN, ARN y protenas. Las tcnicas bioinformticas presentan tres aplicaciones fundamentales para la validacin de dianas, la identificacin de genes homlogos
103
El primero es de utilidad a la hora de asociar frmacos potenciales a las dianas, ya que permiten la prediccin de la estructura de las protenas a partir de su secuencia. El conocimiento de la estructura tridimensional de las protenas sirve para comprender mejor sus funciones e identificar compuestos de bajo peso molecular que inhiban la protena de modo selectivo. La identificacin de genes homlogos en otras especies puede resultar de utilidad a la hora de asignar nuevas funciones a genes humanos, o bien confirmar la utilidad de modelos animales para experimentos in vivo. Asimismo, la identificacin de genes homlogos con funciones divergentes en el genoma humano puede ser til para valorar problemas de especificidad de dianas. Por otro lado, la identificacin de protenas con funciones similares mediante la construccin de mapas de interacciones de protenas es posible mediante herramientas bioinformticas de anlisis. Respecto al anlisis de perfiles de expresin, existe una amplia variedad de software que permite almacenar y analizar los diferentes patrones derivados de experimentos por medio de microarrays de ADN fundamentalmente104.
, el anlisis de mapas de protenas y
el anlisis a gran escala de perfiles de expresin.
La bioinformtica en la identificacin y validacin de dianas Mtodos comparativos basados en homologa (identificacin de genes homlogos que poseen similitud entre s en la misma especie o en distintas especies): La comparacin de la diana a nivel de secuencia de ADN o estructura de la protena con familias de protenas humanas u otros organismos arroja informacin relevante sobre la funcin de la diana. La identificacin de genes homlogos con funciones divergentes en el genoma humano puede ser til para valorar problemas de especificidad de dianas. El anlisis de mapas de protenas se emplea para asignar funciones a protenas. El anlisis de los perfiles gnicos obtenidos con microarrays puede servir para asignar funcin biolgica a determinados genes.
103
104
Genes homlogos: genes que poseen similitud entre s, tanto en la misma especie como entre distintas especies. Esta similitud puede derivarse de una ascendencia comn (genes ortlogos) asumindose que tienen la misma funcin, o bien surgir a partir de la duplicacin de un gen dentro de un mismo genoma (genes parlogos), que en este caso tendran diferente funcin o especializacin. Whittaker, P. A. (2003). What is the relevance of bioinfomatics to phamacology? Trends In Pharmacological Sciences, 24 (8), 434-439.
34
Tcnica Anlisis Serial de la Expresin Gnica (SAGE).
Ventajas Anlisis simultneo de niveles de expresin. No requiere conocer la secuencia del ARNm.
Desventajas Elevado coste. Un segmento corto no siempre se corresponde con un nico gen, y viceversa. Requiere cantidades elevadas de muestra. Bajo rendimiento. Coste elevado.
Anlisis de la expresin gnica
Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE).
Bajo coste.
Microarrays de ADN.
Multiplexado. Alto rendimiento. Requieren cantidades reducidas de muestra. Automatizable. Alto rendimiento. Detecta interacciones entre protenas a gran escala. Permite construir mapas de interaccin de protenas. Facilidad de obtencin. Resistentes a las nucleasas. Actan en el ncleo de la clula. Facilidad de obtencin. Requiere bajas concentraciones. Mayor estabilidad. Baja toxicidad. Puede expresarse intracelularmente. Facilidad de obtencin. Requiere bajas concentraciones. Evita el bloqueo no especfico de la sntesis proteica. Mayor estabilidad. Permiten activar o reprimir genes. Las molculas pueden emplearse como base para obtener potenciales frmacos. No requieren la alteracin gentica de la clula.
Interacciones protena-protena
Microarrays de protenas.
Baja especificidad en la unin de protenas. Elevado coste. Falsos positivos y negativos. No permite analizar protenas de membrana y factores de transcripcin. Problemas de administracin. Toxicidad. Inestabilidad. No puede expresarse intracelularmente. Problemas de administracin. Efectos no especficos. No acta en el ncleo de la clula. Inestabilidad in vivo. Problemas de administracin. Inestabilidad. Especificidad. Falta de experiencia in vivo. Problemas de administracin. Incapacidad de reconocer sitios no activos del genoma.
Sistema doble hbrido.
Oligos antisentido. Tcnicas de validacin de dianas
Modulacin de la expresin
ARN de interferencia.
Ribozimas
Protenas de dedos de zinc.
Genmica qumica.
Uniones no especficas. Requiere disponer de molculas de inhibicin.
Anticuerpos
Elevada especificidad.
Baja eficacia de bloqueo de la protena. Inestabilidad. Inestabilidad. Problemas de administracin. Baja afinidad por protenas cargadas negativamente. Baja afinidad. Baja selectividad. La inactivacin depende de la distancia entre el sitio activo y el sitio de unin.
(Contina en pgina siguiente)
Aptmeros
Posibilidad de diseo frente a cualquier diana. Se unen a los sitios activos de las protenas. Facilidad de produccin.
Pptidos
CALI/FALI
Alto poder de inhibicin y especificidad en conjuncin con anticuerpos monoclonales.
35
Tcnica Anlisis de expresin in vivo
Ventajas Ensayos in vivo. Correlacin de los datos moleculares con los datos clnicos.
Desventajas Requieren de la disponibilidad de muestras de tejidos.
Microarrays de tejidos.
Microarrays de clulas.
Ensayos in vivo.
Requiere la transfeccin de ADN a las clulas.
Ratones knock-out y knock-in
Visualizacin in vivo de los cambios fenotpicos. Modelos animales similares al ser humano. Visualizacin in vivo de los cambios fenotpicos. Modelos animales similares al ser humano. No requiere conocer la funcin de genes modificados. Alto rendimiento.
Laborioso y costoso. Letalidad de embriones. Bajo rendimiento.
Ratones transgnicos.
Laborioso y costoso. Bajo rendimiento.
Mutagnesis de ratones al azar. Tcnicas de validacin de dianas
Mutaciones no dirigidas. Dificultad de identificar genes mutados. Organismo simple que no permite el estudio de procesos complejos. Su uso se limita a ciertas enfermedades. Modelo invertebrado.
Sistemas modelo
Levaduras.
Genoma secuenciado. Facilidad de crecimiento.
Mosca de la fruta.
Numerosos mutantes desarrollados. Genoma secuenciado. Validacin de dianas mediante tecnologas antisentido. Modelo vertebrado con un ciclo de vida corto. Validacin de dianas mediante tecnologas antisentido. Estabilidad gentica, disponibilidad ilimitada y facilidad de manipulacin gentica. Permiten estudiar genes que causan mortalidad en fetos de ratones knock-out.
C. elegans.
Modelo invertebrado.
Pez cebra.
No existen knock-outs.
Clulas madre embrionarias.
Disponibilidad de clulas madre.
Bioinformtica
Herramientas bioinformticas.
Gran capacidad de almacenamiento y poder de clculo.
Requiere de datos experimentales o bases de datos.
Tabla 3. Comparacin de las principales tcnicas empleadas en validacin de dianas. Fuente: elaboracin propia.
36
4. Estrategias de validacin de dianas

El objetivo de la validacin de dianas consiste en demostrar la implicacin de una determinada diana en un proceso patolgico. En funcin de las tcnicas empleadas para validar una diana, el grado de validacin alcanzado ser diferente. El nivel ms alto de validacin de dianas se consigue mediante la demostracin de que la modificacin de una diana revierte la sintomatologa asociada a la patologa en cuestin, lo que slo ocurre cuando el frmaco ya se encuentra en el mercado. Por este motivo, se ha desarrollado un amplio abanico de tcnicas de validacin de Existen varias estrategias que se pueden emplear a la hora de desarrollar nuevos frmacos frente a enfermedades. El optar por una u otra estrategia depender del conocimiento previo que se posea acerca de las potenciales dianas, de la disponibilidad de muestras biolgicas procedentes de individuos tanto enfermos como sanos, y del dominio y disponibilidad de las tcnicas de validacin de dianas. dianas, fundamentales para la obtencin de frmacos eficaces en el menor tiempo posible105.
Estrategia inversa
Estrategia directa
Gen
ARN Genes Protena Protenas ARNs
Modificacin dirigida
Modificacin al azar
Fenotipo alterado
Fenotipo alterado
Bsqueda de la diana de inters
Asociacin de una diana con el fenotipo Figura 17. Estrategias de validacin de dianas. Fuente: Doan T. N., et al. (2004). High-throughput target validation in model organisms. Drug Discovery Today: Targets. 3 (5): 191-197.
105
Drews, J. (2000). Drug Discovery: A Historical Perspective. Science, 287: 1960-1964 .
37
En aquellas ocasiones en las que existe informacin previa acerca de las dianas potencialmente implicadas en una enfermedad concreta, es posible proponer su implicacin en el proceso patolgico. En estas ocasiones, se opta por una estrategia inversa o dirigida de validacin de dianas, en la cual se altera la expresin de un gen o protena conocida para demostrar su implicacin en el desarrollo de la enfermedad. Por tanto, para esta estrategia son de utilidad aquellas tcnicas que permiten alterar selectivamente la funcin de una diana concreta y observar los cambios debidos a estas alteraciones. Las tcnicas de modulacin de la expresin gnica como la tecnologa antisentido y las tcnicas de inactivacin de protenas como los anticuerpos monoclonales, permiten establecer la relacion entre el fenotipo y una diana concreta. En los casos en los que no se dispone de informacin acerca de las dianas implicadas en la enfermedad de inters, o bien se desea descubrir dianas novedosas para una enfermedad concreta, la estrategia ha de ser necesariamente diferente y se puede optar por el empleo de estrategias al azar tambin denominadas estrategias directas. Estas estrategias consisten en el estudio de los cambios en el fenotipo debidos a la modificacin de genes o protenas que se realiza al azar, de modo que se desconoce la funcin del gen o protena sobre la que se est actuando y se pretende validar. Como resultado, se obtienen clulas u organismos con alteraciones que dan lugar a fenotipos diversos, entre los que alguno puede estar relacionado con enfermedades interesantes. Una vez detectado el fenotipo de inters y dado que la modificacin que ha dado lugar al mismo es desconocida, se ha de buscar el gen o la protena diana, es decir el gen responsable del fenotipo de inters. De este modo se establece la relacin entre la diana y el fenotipo relacionado con la enfermedad. Existe una gran diversidad de tcnicas que permiten modificar genes o protenas al azar, siendo habitual el empleo de tcnicas como las tecnologas antisentido, las tcnicas de bloqueo de protenas y la mutagnesis al azar en organismos modelo. La principal desventaja de las estrategias directas o al azar consiste en que
en ocasiones resulta difcil identificar la diana sobre la que se ha actuado106. Las tcnicas moleculares que se emplean para validar dianas son muy diversas en cuanto a su naturaleza. De hecho, cualquier tcnica que permita asociar una protena o un gen a una caracterstica o a un fenotipo, es susceptible de ser aplicada en la validacin de dianas. Por otra parte, las tcnicas que se emplean en la validacin de dianas pueden ser de utilidad en otras etapas de la investigacin farmacolgica, como los ensayos preclnicos mediante cultivos celulares y modelos vivos de la enfermedad, los cuales se emplean prcticamente a lo largo de todo el proceso de investigacin farmacutica previo a los ensayos clnicos en humanos. Las diferentes tcnicas descritas en el presente informe se pueden aplicar en diversos momentos de los programas de I+D en funcin de los recursos de los que se disponga y del grado de validacin que se desee alcanzar. El desarrollo de nuevos frmacos por parte de la industria farmacutica se aborda habitualmente mediante una primera identificacin de un elevado nmero de dianas potencialmente asociadas a la enfermedad. Las tcnicas de validacin que se suelen aplicar en primer lugar han de ser rpidas, de alto rendimiento, coste reducido y capaces de eliminar las dianas no vlidas, en las cuales no merece la pena invertir mayores esfuerzos. Las tecnologas de anlisis de la expresin gnica, interacciones protenaprotena y el cribado virtual son las tcnicas que se realizan en las etapas iniciales ya que a pesar de que no permiten establecer una asociacin robusta entre la enfermedad y la diana, permiten identificar y descartar parte de las dianas con rapidez. Posteriormente, se aplican otras tcnicas que si bien requieren ms tiempo y presentan un rendimiento inferior, permiten establecer una asociacin ms concluyente entre la diana y la enfermedad. ste es el caso de las tcnicas de modulacin de la expresin y bloqueo de protenas diana, que se suelen aplicar sobre cultivos celulares o modelos animales. Los modelos vivos de la enfermedad constituyen el nivel superior de validacin de dianas y aunque su coste es muy elevado, se emplean tanto en validacin de dianas como en la investigacin preclnica previa a los ensayos en humanos.
106
Doan, T. N. (2004). High-throughput target validation in model organisms. Drug Discovery Today: Targets. Vol. 3, N 5: 191-197.
38
Validacin de dianas
Identificacin y optimizacin del compuesto
Investigacin preclnica
Ensayos clnicos
Anlisis de la expresin
Interaccin protena-protena Ensayos en animales Ensayos en humanos Fase I Fase II Fase III Fase IV
Cribado virtual
Modulacin de la expresin
Modelos vivos de enfermedad
Fig. 18. Aplicacin de las tcnicas de validacin de dianas a lo largo de la investigacin farmacutica. Fuente: Whittaker, P. A. (2003). What is the relevance of bioinformatics to pharmacology? Trends in Pharmacological Sciences. Vol. 24. N8: 434-439.
Por tanto, la validacin de una diana teraputica es un proceso en el cual estn implicadas ms de una nica tcnica, permitiendo establecer con la suficiente robustez la asociacin de la diana con una enfermedad concreta. Una adecuada validacin de dianas requerir entonces la combinacin de varias tcnicas entre s, de modo que se pueda asociar con un grado de certidumbre suficiente una diana y su enfermedad, y de este modo validar o descartar las potenciales dianas teraputicas identificadas. La eleccin de las tecnologas ms adecuadas vendr determinada por distintos factores. En el caso de que hubiese que adoptar tan solo dos tcnicas, sera recomendable emplear tecnologas que acten a nivel gnico y a nivel de protena respectivamente, ya que ofrecera una visin de conjunto ms completa acerca de la funcin de la diana. No obstante, las tcnicas elegidas vendrn determinadas en gran medida por el coste previsto del ensayo, el tiempo disponible, y los resultados obtenidos a partir de los ensayos de validacin previos107.
La aproximacin que hemos tenido en cuenta hasta el momento se basa en la presuncin de que un frmaco ejerce su accin nicamente sobre una diana, lo cual es bastante improbable debido a la complejidad biolgica de los procesos patolgicos. Un escenario ms parecido a la realidad sera aquel en el cual un frmaco interaccionara con mltiples dianas que estuvieran implicadas directamente en ciertas patologas. El frmaco ideal consistira en un compuesto dirigido frente a mltiples dianas, todas ellas relacionadas con el proceso patolgico de inters, de forma que el efecto teraputico se viera potenciado. El ejemplo ms caracterstico es el imanitib, comercializado por Novartis con el nombre Glivec como frmaco frente a la Leucemia Mieloide Crnica y tumores de ciertas clulas del estroma gastrointestinal. Este medicamento es capaz de frenar la expresin de determinadas protenas anormales caractersticas de estas patologas, pero tambin posee la capacidad de bloquear otras vas aberrantes de sealizacin celular relacionadas con la aparicin de tumores, confirindole al producto un extraordinario valor aadido108.
107
108
Hardy, L. W. & Peet, N. P. (2004). The multiple orthogonal tools approach to define molecular causation in the validation of druggable targets. Drug Discovery Today. 9(3): 117-26. Glivec (imatinib mesylate, USA Gleevec), Novartis Pharmaceuticals Corp. (http://www.glivec.com/espanol/content/site_disclaimer.jsp)
39
5. Aplicaciones de las tcnicas de validacin de dianas

El presente apartado pretende incidir en aquellas enfermedades para las cuales es esencial la identificacin de nuevas dianas teraputicas, as como la validacin de algunas dianas ya conocidas que forman parte de procesos biolgicos implicados en las patologas de inters. Por otra parte, se ha realizado una revisin de los principales tipos de dianas teraputicas descritas, junto con las estrategias tecnolgicas empleadas en su validacin.
5.1. Enfermedades que requieren nuevas dianas

Numerosas enfermedades de alta incidencia en la poblacin conllevan necesidades mdicas que no han sido resueltas por la medicina actual. Algunas enfermedades no poseen tratamientos eficaces para el paciente, mientras que para otras patologas tan slo existen tratamientos paliativos que poseen una eficacia limitada o bien dan lugar a efectos secundarios que limitan su uso generalizado. Gran parte de estos problemas se solucionaran mediante la identificacin y validacin de las dianas teraputicas implicadas en estas enfermedades. Por este motivo, la identificacin y validacin de nuevas dianas teraputicas es una necesidad a la hora de desarrollar nuevos y mejores frmacos.
Enfermedades para las que es necesario identificar y validar nuevas dianas109 Enfermedades neurodegenerativas: alzheimer, esclerosis mltiple, parkinson, esclerosis lateral amiotrfica. Enfermedades cardiovasculares. Cncer. Enfermedades psiquitricas: ansiedad, depresin, esquizofrenia. Enfermedades metablicas: obesidad, diabetes tipo II. Enfermedades autoinmunes: artrosis, diabetes de tipo I, psoriasis, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.
5.1.1. Enfermedades neurodegenerativas

Las enfermedades neurodegenerativas son un conjunto de enfermedades diversas que afectan al sistema nervioso central, caracterizndose por la prdida de tejido nervioso o neuronas en zonas concretas del cerebro. La mayora de las enfermedades neurodegenerativas se manifiestan en la vejez, y debido al incremento de la esperanza de vida, su incidencia se encuentra en ascenso.
La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa que causa demencia y afecta a 800.000 habitantes en Espaa110. Su incidencia se encuentra en crecimiento debido al envejecimiento de la poblacin y los tratamientos actuales son meramente paliativos y simplemente retrasan la aparicin de la enfermedad. La terapia habitual frente a la enfermedad de Alzheimer est dirigida a incrementar la transmisin nerviosa mediada por el neurotransmisor acetilcolina y a inhibir la toxicidad nerviosa del neurotransmisor glutamato. En la actualidad se estn investigando nuevas
109
110
Kaplan, W. & Laing, R. (2004). Priority Medicines for Europe and the World. World Health Organization. Department of Essential Drugs and Medicines Policy. AFAL, Asociacin de Enfermos de Alzheimer de Madrid. (www.afal.es).
40
dianas implicadas en la toxicidad del glutamato y existen varias rutas novedosas sobre las que se podra actuar para combatir el Alzheimer, evitando la acumulacin de las placas de `-amiloide y la formacin de fibras de proteina tau. La esclerosis mltiple es el desorden neurolgico ms habitual en adultos jvenes. Los tratamientos actuales van dirigidos a reducir la respuesta autoinmune que se produce en esta enfermedad mediante la administracin de sustancias que modulan el sistema inmune. Sin embargo, el tratamiento inmunosupresor es paliativo y retrasa la aparicin de la sintomatologa de la enfermedad. Recientemente la agencia estadounidense del medicamento ha autorizado un anticuerpo monoclonal, el natalizumab (Tysabri )
TM 111
La enfermedad de Parkinson es la enfermedad neurodegenerativa ms frecuente tras el Alzheimer, y da lugar a problemas de movilidad debido a la muerte de neuronas en un rea determinada del cerebro. Los tratamientos actuales consisten en estimular la actividad de las neuronas del sistema de la dopamina, mejorando de esta forma la sintomatologa. Sin embargo, estos tratamientos no evitan la muerte de neuronas, por lo que es necesario estudiar diferentes dianas que impidan la muerte neuronal, la inhibicin de la apoptosis, la produccin de NO en las clulas glia y el control de rutas proteolticas. La Esclerosis Lateral Amiotrfica se debe a la muerte de neuronas motoras responsables del control del movimiento. Los tratamientos actuales son paliativos y simplemente consiguen una mejora sintomtica limitada actuando sobre la ruta del glutamato e impidiendo su accin txica sobre las neuronas motoras. Se han propuesto varias dianas nuevas en el sistema del glutamato que se cree que podran impedir estas lesiones, actuando sobre enzimas implicadas en la detoxificacion de compuestos dainos y evitando la acumulacin de protenas que dan lugar a la muerte neuronal112.
, que acta inhibiendo
una molcula de adhesin de la superficie de linfocitos y monocitos denominada receptor de la integrina 4. El natalizumab en principio no impide la progresin de la esclerosis mltiple, pero reduce a un tercio el nmero de recadas. Las nuevas dianas teraputicas propuestas se centran en impedir la respuesta inmune daina que se produce a nivel del sistema nervioso central por medio de la modulacin en la presentacin de antgenos, inhibiendo la activacin de las clulas T, o bien impidiendo la migracin de las clulas inflamatorias al sistema nervioso.
111 112
TysabriTM (Natalizumab). Biogen Idec, Elan. (www.tysabri.com). Mathisen, P. M. (2003). Gene Discovery and validation for neurodegenerative diseases. Drug Discovery Today. 8 (1): 39-46.
41
Enfermedad
Tratamiento actual
Rutas/Dianas potenciales Evitar la acumulacin de `-amiloide (Disminucin de la formacin, fomento de la degradacin del precursor). Sistemas de transduccin de seales del precursor del `-amiloide (APP). Agregacin de la protena tau. Toxicidad del glutamato.
Enfermedad de Alzheimer.
Inhibidores de la acetilcolinesterasa. Inhibicin de la toxicidad mediada por el glutamato (Inhibidores del receptor del NMDA).
Modulacin del sistema inmune (inmunosupresores, interfern `). Esclerosis mltiple. Anticuerpos monoclonales frente al receptor de la integrina _4 (TysabriTM).
Inhibir la activacin de clulas-T. Presentacin de antgenos. Migracin de clulas inflamatorias al sistema nervioso central.
Enfermedad de Parkinson.
Fomento del sistema de la dopamina (Agonistas dopaminrgicos, levodopa).
Inhibir la muerte neuronal. Produccin de NO por clulas gla. Rutas proteolticas.
Enzima detoxificadora del superxido. Esclerosis lateral amiotrfica. Agentes bloqueantes del glutamato. Protenas filamentosas neuronales implicadas en la supervivencia neuronal. Toxicidad por glutamato.
Figura 19. Principales dianas teraputicas en enfermedades neurodegenerativas. Fuente: Maticen, P. M. (2003). Gene Discovery and validation for neurodegenerative diseases. Drug Discovery Today. 8(1): 39-46.
5.1.2. Enfermedades cardiovasculares

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en Europa y en los pases del primer mundo. El tabaco, la hipertensin arterial, los altos niveles de colesterol y grasas en sangre, la diabetes y la obesidad son los principales factores de riesgo de las enfermedades cardiovasculares. En la actualidad existen tratamientos para el tratamiento de la hipertensin y para los niveles elevados de grasas en sangre pero su eficacia es limitada y vara entre diferentes pacientes113. No obstante, se han propuesto nuevas dianas que permitirn en un futuro desarrollar frmacos ms eficaces y con menores efectos indeseables.
En la actualidad existen tratamientos de eficacia limitada para el tratamiento de la hipertensin como los diurticos, que favorecen la eliminacin de lquidos y sales del organismo, los betabloqueantes que bloquean la estimulacin del corazn, y los vasodilatadores que disminuyen la tendencia de las arterias a estrecharse. Las nuevas dianas propuestas se centran en fomentar la vasodilatacin actuando sobre nuevas dianas del sistema renina-angiotensina y el metabolismo del cido araquidnico. Los tratamientos actuales para combatir los niveles elevados de grasas y colesterol en sangre consisten principalmente en la administracin de frmacos que reducen la sntesis y absorcin del colesterol, y reductores de los triglicridos.
113
Kaplan, W. & Laing, R. (2004). Priority Medicines for Europe and the World. World Health Organization. Department of Essential Drugs and Medicines Policy.
42
Existen dianas novedosas implicadas en la sntesis del colesterol y en la regulacin de la homeostasis de los lpidos que han sido propuestas para el desarrollo de tratamientos ms eficaces y seguros114.
Enfermedad
Tratamiento actual Betabloqueantes. Diurticos.
Rutas/Dianas potenciales
Sistema de la renina-angiotensina. Metabolismo del cido araquidnico.
Hipertensin.
Vasodilatadores (Inhibidores del enzima convertidor de la angiotensina y bloqueantes del receptor de la angiotensina).
Inhibicin de la sntesis del colesterol (estatinas y cido nicotnico). Niveles elevados de grasa/colesterol. Inhibicin de la absorcin del colesterol (secuestrantes de cidos biliares). Reductores de triglicridos (cido fbrico).
Figura 20. Principales dianas teraputicas en enfermedades cardiovasculares. Fuente: Brown, D. et Superti-Furga, G. (2003). Rediscovering the sweet spot in drug discovery. Drug Discovery Today. Vol. 8 (23): 1067-1077.
Homeostasis de los lpidos. Sntesis del colesterol.
5.1.3. Enfermedades psiquitricas

Las principales enfermedades psiquitricas son los desrdenes de ansiedad, los trastornos depresivos y la esquizofrenia. Si bien las causas subyacentes pueden ser de diversa naturaleza, las enfermedades psiquitricas se caracterizan por la alteracin de la transmisin nerviosa a nivel del sistema nervioso central. La incidencia de los trastornos relacionados con el estrs tales como la ansiedad y la depresin se halla en constante crecimiento en la sociedad actual. Ambas enfermedades se encuentran muy relacionadas entre s, y los frmacos que se emplean en su tratamiento son habitualmente los mismos. Los desrdenes de ansiedad afectan a aproximadamente el 10% de la poblacin y los ansiolticos son el segundo grupo de frmacos ms consumidos115. Las terapias farmacolgicas actuales contra la ansiedad son las benzodiacepinas, las cuales actan sobre el
sistema neurotransmisor del GABA del sistema nervioso central y presentan efectos adversos tales como la sedacin excesiva y la dependencia, por lo que es necesario desarrollar nuevos frmacos para el tratamiento de la ansiedad. Se sabe que en los trastornos de ansiedad y en la depresin las rutas de transmisin nerviosa de neuropptidos estn alteradas, y por este motivo se ha propuesto actuar sobre las mismas para desarrollar tratamientos ms eficaces y con menores efectos indeseables116. La depresin afecta en torno al 5% de la poblacin y sobre todo a las mujeres. La estrategia actual ms habitual para el tratamiento de la depresin consiste en incrementar la concentracin de neurotransmisores de la familia de las monoaminas mediante inhibidores de la monoaminooxidasa e inhibidores de la recaptura de monoaminas, que tambin son empleados como tratamiento frente a la ansiedad. Por otro lado, existen frmacos alternativos que actan
114
115
116
Brown, D. & Superti-Furga, G. (2003). Rediscovering the sweet spot in drug discovery. Drug Discovery Today. Vol. 8 (23): 1067-1077. Gallen, C. C. (2004). Strategic Challenges in Neurotherapeutic Pharmaceutical Development. The American Society for Experimental NeuroTherapeutics. Vol. 1: 165-180. Holmes, A., et al. (2003). Neuropeptide systems as novel therapeutic targets for depresin and anxiety disorders. Trends in Pharmacological Sciences. Vol. 24. N 11: 580-588.
43
sobre otras dianas como son los antidepresivos tricclicos y heterocclicos117. Estos frmacos poseen numerosos efectos secundarios y no todos los pacientes responden adecuadamente al tratamiento, por lo que resulta necesario desarrollar nuevos medicamentos antidepresivos. En el caso de la depresin, tambin se aboga por actuar sobre los componentes de las rutas de neuropptidos para desarrollar nuevos frmacos118. La esquizofrenia es una enfermedad psiquitrica que se caracteriza por la aparicin de alucinaciones, delirios y comportamientos que conllevan la prdida de capacidad de trabajo, relacin social, afectividad y capacidad intelectual. La mayora de los tratamientos antipsicticos actuales actan sobre varias dianas a la vez siendo los ms comunes los receptores de
dopamina, cuyo mecanismo de accin se asocia a efectos no deseados. Por otro lado, los tratamientos actuales no son efectivos totalmente y, debido a los efectos secundarios que provocan, gran parte de los pacientes abandonan el tratamiento, por lo que existe una necesidad de identificar y validar nuevas dianas teraputicas que acten por vas diferentes119. Existen varios receptores y rutas neuronales de sealizacin sobre las que se investiga para desarrollar nuevos frmacos ms eficaces y con menores efectos secundarios, como por ejemplo un subtipo especfico de receptores de la serotonina y del glutamato. Por otro lado, se estudia la posibilidad de fomentar el efecto protector de los estrgenos sobre la esquizofrenia, y la posibilidad de actuar sobre el dao que se observa en las membranas neuronales mediante cidos grasos omega-3120.
Enfermedad
Tratamientos actuales Activacin de receptores GABA (ansiolticos).
Ansiedad.
Sistemas de neuropptidos.
Depresin.
Incremento de la concentracin de monoaminas (inhibidores de la recaptura de monoaminas e inhibidores de la monoaminooxidasa). Antidepresivos triclicos y heterocclicos.
Sistemas de neuropptidos.
Receptor de serotonina 5HT2. Receptor del glutamato NMDA. Esquizofrenia. Bloqueo de receptores de dopamina (antipsicticos tpicos y atpicos). Correccin de las membranas daadas (cidos grasos omega-3). Fomentar el efecto protector de los estrgenos.
Figura 21. Principales dianas teraputicas en enfermedades psiquitricas. Fuente: Weiden, P. J., et al. (2003). New Developments in Antipsychotic Therapy. J. Clin. Psichiatry (64)11: 1379-1381; Kuperberg, G., et al. (2002). Developments in the pharmacological treatment of schizophrenia. Expert Opin. Investig. Drugs. 11(10): 1-7; Hckfelt, T., et al. (2003). Neuropeptides: Oportunities for drug discovery. The Lancet Neurology. Vol. 2: 463-472. Holmes, et al. (2003). Neuropeptide systems as novel therapeutic targets for depresin and anxiety disorders. Trends in Pharmacological Sciences. Vol. 24. N 11: 580-588.
117
118 119
120
Garca, J. T. &. Rosete, E. M. (2002). Tratamiento farmacolgico de la depresin mayor. Rev Cubana Med Gen Integr 3/2002 (http://www.bvs.sld.cu/revistas/mgi/vol18_3_02/mgi09302.htm). Hckfelt, T., et al. (2003). Neuropeptides: Oportunities for drug discovery. The Lancet Neurology. Vol. 2: 463-472. Kuperberg, G., et al. (2002). Developments in the pharmacological treatment of schizophrenia. Expert Opin. Investig. Drugs. 11 (10) 1-7. Weiden, P. J., et al. (2003). New Developments in Antipsychotic Therapy. J. Clin. Psichiatry (64)11: 1379-1381.
44
5.1.4. Enfermedades metablicas

Las enfermedades metablicas afectan al equilibrio metablico del organismo y suponen problemas sanitarios de primer orden, ya que constituyen factores de riesgo para otras enfermedades de gran importancia como son las patologas cardiovasculares. Las enfermedades metablicas ms habituales son la obesidad y la diabetes, y los frmacos de los que se dispone actualmente estn dirigidos al control a largo plazo del peso corporal y del nivel de glucosa en sangre, aunque tan slo alivian los sntomas de manera transitoria y dan lugar a efectos secundarios importantes. Por tanto, resulta necesario identificar mecanismos y nuevas dianas que den lugar al desarrollo de nuevos frmacos para tratar e incluso prevenir las enfermedades metablicas121. La diabetes tipo II es una enfermedad metablica caracterizada por un elevado nivel de glucosa en sangre. El 90% de los diabticos sufre diabetes tipo II, consistente en la produccin insuficiente de insulina, o bien en la generacin de resistencia a su accin. La diabetes de tipo II se acompaa a menudo de obesidad y colesterol alto
en sangre122. Los tratamientos actuales se dirigen a impedir la produccin de glucosa a nivel del hgado, fomentar la cantidad de insulina en sangre y combatir la resistencia a su accin. Existen varios procesos sobre los que se podra actuar para desarrollar nuevos frmacos, principalmente activando la funcin del pncreas, inhibiendo la sntesis de glucosa, incrementando la respuesta a la glucosa a nivel de diferentes tejidos y actuando a nivel de la funcin del tejido graso. La obesidad es la enfermedad metablica ms frecuente en la poblacin del primer mundo, e incrementa el riesgo de enfermedad y muerte por diabetes, apopleja y enfermedades coronarias. La incidencia de la obesidad se encuentra en ascenso y supone un serio problema en los pases industrializados, por lo que se est investigando activamente en el desarrollo de frmacos para combatirla123. Los tratamientos actuales consisten en ciruga, control de la dieta, ejercicio y la administracin de frmacos que incrementan la sensibilidad de los adipocitos a la insulina. Las estrategias propuestas actuaran a nivel de la funcin del tejido graso y sobre la disipacin de la energa para desarrollar nuevos tratamientos frente a la obesidad124.
Enfermedad
Tratamientos actuales Incremento de la sensibilidad de los adipocitos a la insulina (activacin del PPAR-a). Inhibicin de la produccin de glucosa a nivel del hgado (Metformina GlucophageTM). Activacin de la sntesis y liberacin a nivel de pncreas (secretagogos, anlogos del GLP-1, inhibidores de la DPP-IV). Incremento de la sensibilidad de los adipocitos a la insulina (activacin del PPAR-a). Control diettico y ejercicio. Ciruga reductora del estmago.
Regulacin de la adipognesis y funcin de adipocitos. Respuesta del msculo esqueltico a insulina. Inhibicin de la sntesis de glucosa a nivel del hgado. Activacin de la funcin del pncreas.
Diabetes tipo II.
Obesidad.
Regulacin de la adipognesis y la funcin de adipocitos. Activacin de la disipacin de la energa en el tejido graso (UCPs).
Figura 22. Principales dianas teraputicas implicadas en diabetes tipo II y obesidad. Fuente: Dormn, C. E. (2004). Target discovery in metabolic disease. Drug Discovery Today. 9 (18): 785-794.
121 122
123
124
Dohrmann, C. E. (2004). Target discovery in metabolic disease. Drug Discovery Today. 9(18): 785-794. Diabetes mellitus no insulinodependiente (DMNID). Enciclopedia mdica en espaol. Medline Plus. Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000313.htm). Obesidad. Enciclopedia mdica en espaol. Medline Plus. Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos. (http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003101.htm). Dohrmann, C. E. (2004). Target discovery in metabolic disease. Drug Discovery Today. 9 (18): 785-794.
45
5.1.5. Enfermedades autoinmunes

Las enfermedades autoinmunes son un conjunto de patologas producidas por el reconocimiento de los propios tejidos como agentes extraos por parte del sistema inmune, provocando una respuesta de defensa que puede afectar a diversos rganos y tejidos. Las principales enfermedades autoinmunes son la artritis reumatoide, la diabetes de tipo I, lupus, miastenia gravis, enfermedad de Crohn y psoriasis. Los tratamientos tradicionales consisten en el empleo de frmacos que producen alivio de la sintomatologa como pueden ser analgsicos, antiinflamatorios e inmunosupresores. Adems de su reducida eficacia, estos frmacos reducen la capacidad inmunolgica de los pacientes y favorecen la aparicin de infecciones. La artritis reumatoide se desarrolla cuando el sistema inmune ataca el tejido que cubre las articulaciones dando lugar a dolor, inflamacin, y prdida de movilidad. Los tratamientos habituales tienen por objeto reducir el dolor y la inflamacin de las articulaciones por lo que se suelen administrar analgsicos y antiinflamatorios. Por otro lado, los inmunosupresores pueden aliviar la sintomatologa y ralentizan la progresin de la enfermedad. Recientemente han sido autorizados varios anticuerpos monoclonales e inhibidores biolgicos frente a dianas implicadas en la inflamacin para el tratamiento de la artritis reumatoide125. Existen varios niveles sobre los que se ha propuesto actuar para el desarrollo de nuevos frmacos, regulando la funcin de las clulas T, mastocitos y el sistema hormonal esteroideo. La diabetes de tipo I es una enfermedad en la que el sistema inmune ataca a las clulas del pncreas productoras de insulina. Debido a ello el organismo no es capaz de producir insulina, el nivel de glucosa en sangre deja de estar bajo control y se altera el metabolismo de los hidratos de carbono, lpidos y protenas. El tratamiento actual consiste en controlar la dieta, seguir hbitos de vida adecuados y el suministro diario de insulina mediante inyecciones. Las inyecciones de insulina han de administrarse de por vida y a pesar de ello los enfermos de diabetes suelen sufrir problemas de salud debido a la
dificultad que supone la regulacin de los niveles de glucosa en sangre126. Las futuras terapias irn dirigidas a evitar la destruccin de las clulas beta o bien a la recuperacin de su funcin actuando sobre las distintas rutas implicadas en la respuesta inmune daina, ya que de este modo se conseguira mejorar ostensiblemente la calidad de vida de los pacientes. La psoriasis es una enfermedad crnica de la piel caracterizada por una invasin de la misma por parte de clulas inflamatorias y en consecuencia una proliferacin excesiva de las clulas de la piel. Los tratamientos actuales se centran en el control de los sntomas y en impedir infecciones secundarias mediante tratamientos tpicos, fototerapia, y en casos severos frmacos inmunosupresores o retinoides127. Recientemente se han autorizado nuevos tratamientos basados en la administracin de anticuerpos monoclonales o derivados de los mismos que actan sobre dianas implicadas en la respuesta inflamatoria, que de este modo modulan la respuesta inmune excesiva128. Existen mltiples rutas y dianas que han sido propuestas como dianas potenciales de futuras terapias frente a la psoriasis, entre las que cabe destacar las molculas de adhesin celular, receptores de factores de crecimiento y molculas inflamatorias129. La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa se producen debido al ataque del sistema inmune sobre el intestino que origina un proceso inflamatorio. Ambas enfermedades son muy similares aunque existen diferencias en cuanto a la afectacin del intestino y profundidad de las lesiones. El tratamiento actual consiste en la administracin de frmacos que suprimen la respuesta inflamatoria como antiinflamatorios, inmunosupresores y corticosteroides, lo que permite controlar los sntomas y reducir los brotes de la enfermedad. Recientemente se ha autorizado el uso de un anticuerpo frente a una diana implicada en la respuesta inmune para el tratamiento de la enfermedad de Crohn130. Existen varias dianas sobre las que se podra actuar para tratar estas patologas, principalmente a nivel de la funcin de clulas T, los sistemas de reparacin y defensa del intestino, molculas inflamatorias y procesos relacionados con la apoptosis131.
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126 127
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130
131
Instituto Nacional de la Artritis y enfermedades musculoesquelticas y de piel. Instituto Nacional de la Salud de Estados Unidos de Amrica. (http://www.niams.nih.gov/hi/topics/arthritis/rahandout.htm). Diabetesjuvenil.com (http://www.diabetesjuvenil.com/documentos_html/dj_investigacion.asp). Psoriasis. Medline Plus. Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos. (http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/psoriasis.html). Fundacin Nacional de la Psoriasis de los Estados Unidos de Amrica. (http://www.psoriasis.org). Igney, H. G., et al. (2004). Techniques: Species finest blend-humanized mouse models in inflammatory skin disease research. Trends Pharmacol Sci. 25 (10): 543-549. Enfermedad de Crohn. Medline Plus. Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos. (http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/crohnsdisease.html#tratamiento). Fundacin Americana de la Enfermedad de Crohn y Colitis. CCFA. (http://www.ccfa.org/).
46
El lupus es una enfermedad autoinmune sistmica que afecta al tejido conectivo daando mltiples rganos como los riones y el corazn. Los tratamientos actuales se basan en el empleo de frmacos analgsicos, inmunosupresores, antiinflamatorios y anticoagulantes que controlan la sintomatologa pero que presentan serios
efectos secundarios en tratamientos a largo plazo132. Se han propuesto varias dianas para desarrollar frmacos ms eficaces que acten a nivel de protenas de adhesin, molculas implicadas en procesos inflamatorios, antgenos, factores de crecimiento, necrosis y la activacin de las clulas B133.
Enfermedad
Tratamientos actuales Analgsicos. Antiinflamatorios (no esteroideos y corticosteroides). Frmacos inmunosupresores modificadores de la enfermedad: metotrexato. Anticuerpos inhibidores del TNF-_: (etanercept, Infliximab, Adalimumab). Inhibidor de la interleuquina (Anakinra). Control diettico y ejercicio. Administracin de insulina inyectada. Inmunosupresores (ciclosporina, esteroides). Vitamina D3. Retinoides. Anticuerpo monoclonal frente a TNF-_ (etanercept). Anticuerpo monoclonal frente a CD11a (efalizumab). Anticuerpo de fusin anti-CD2 (alefacept).
Artritis reumatoide.
Funcin de la clulas T. Funcin de los mastocitos. Regulacin del sistema hormonal esteroideo.
Diabetes tipo I.
Funcin de clulas beta (Interleuquinas, rutas del interfern, TNF-_, interaccin entre Fas y Fas-L).
Psoriasis.
Proteasoma. Regular la adhesin celular (selectina). Receptor del PAR_. Receptor del factor de crecimiento NGF. Regular rutas inflamatorias (leucotrieno, Inteleuquina-15).
Enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.
Antiinflamatorios como los aminosalicilatos y corticosteroides Anticuerpo quimrico frente a TNF-_ (Infliximab).
Funcin de la clulas T. Regular rutas inflamatorias (interleuquinas 10 y 14). Factor de necrosis tumoral (TNF`). Sistemas de defensa del epitelio intestinal. Mecanismos de dao y reparacin del intestino. Regulacin de la apoptosis (card15/NOD2). Molculas inflamatorias: interfern-1, Interleuquina-10, MIF. Estimulacin de clulas B: BLyS. Proteasas TIMP-3 y TIMP-4. Molculas de adhesin: caderinas P y R Factores de crecimiento y necrosis (TNF, CSF-1 CSF-1). Antgenos CD20 y CD154.
Lupus.
Antiinflamatorios (no esteroideos y corticosteroides). Analgsicos. Frmacos inmunosupresores. Anticoagulantes.
Figura 23. Principales dianas teraputicas en enfermedades autoinmunes. Fuente: elaboracin propia.
132 133
Fundacin Americana del Lupus (http://www.lupus.org/) . Rus, V., et al. (2004). Gene expression profiling in peripheral blood mononuclear cells from lupus patients with active and inactive disease. Clinical Immunology. 112: 231 234.
47
5.1.6. Cncer
El cncer consiste en un conjunto de ms de 100 patologas en las que se produce una proliferacin anormal de las clulas que da lugar a tumores que pueden invadir otros tejidos dando lugar a metstasis. Dado que diferentes tumores morfolgicamente idnticos pueden ser consecuencia de alteraciones en un gran nmero de rutas, las dianas sobre las que actuar sern de distinta naturaleza en funcin de cada tipo de tumor
134
Los tratamientos actuales ms habituales son la ciruga, quimioterapia y radioterapia, aunque no son eficaces en todos los casos, por lo que la tendencia actual va dirigida hacia una estrategia de terapia combinada frente a mltiples dianas implicadas en el proceso canceroso. Por otra parte, la mayora de los frmacos disponibles actualmente para el tratamiento del cncer presentan problemas de toxicidad, por lo que resulta una prioridad la bsqueda de nuevas . dianas teraputicas relacionadas con el cncer.
Enfermedad
Tratamientos actuales Ciruga. Radioterapia. Quimioterapia. Anticuerpos monoclonales frente al receptor del factor de crecimiento epidrmico humano (Transtuzumab). cido retinico. Inhibidor de la tirosina quinasa Bcr-Abl. (Imatinib). Inhibidor del proteosoma (Bortezomib).
Rutas/Dianas potenciales Muerte celular de las clulas tumorales. Inhibicin del crecimiento del tumor (inhibicin de la angiognesis, regulacin del ciclo y envejecimiento celular). Inhibicin de la migracin y la metstasis. Regulacin de la respuesta inmune (rutas antiinflamatorias, ruta del interfern).
Cncer.
Figura 24. Tratamientos actuales frente al cncer y rutas de inters para el desarrollo de nuevos frmacos con actividad antitumoral. Fuente: Brown, D. & Superti-Furga, G. (2003). Rediscovering the sweet spot in drug discovery. Drug Discovery Today. Vol. 8 (23): 1067-1077.
En los ltimos aos se han lanzado al mercado varios frmacos anticancergenos que actan sobre dianas teraputicas que han sido identificadas y validadas estudiando rutas moleculares que juegan un papel crucial en el cncer. El primero de ellos es un frmaco autorizado para el tratamiento del cncer de mama, Trastuzumab (Herceptina)135, que acta sobre el receptor del factor de crecimiento humano inhibiendo su funcin. El cido retinoico activa el receptor de cido retinico y ha sido establecido para el tratamiento de un tipo de leucemia. Por otro lado, el Imatinib (Glivec)136
inhibe la tirosina quinasa Bcr-Abl y se emplea en el tratamiento de tumores intestinales y un tipo de leucemia137. En ltimo lugar, cabe destacar el bortezomib (Velcade)138, frmaco que inhibe el proteosoma y que ha sido autorizado para el tratamiento del mieloma mltiple. Existen varias rutas y procesos sobre los que se podra actuar para el desarrollo de nuevos frmacos frente al cncer, ya sea impidiendo el crecimiento tumoral mediante la inhibicin de la irrigacin sangunea al tumor o mediante la regulacin del ciclo celular, promoviendo la
134 135 136 137
138
Sauter, G., et al. (2003). Tissue Microarrays in Drug Discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 2, 962-972. Genentech, Inc. HerceptinTM (http://www.herceptin.com/herceptin). Novartis. GlivecTM (http://www.glivec.com/content/home.jsp). Serrano, R. Investigacin y clnica oncolgica deben disear frmacos selectivos. Diario Mdico. 23 de mayo de 2002 (http://www.diariomedico.com/edicion/noticia/0,2458,148513,00.html). Millenium Pharmaceuticals y Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development. VelcadeTM. (http://www.mlnm.com/products/velcade/index.asp).
48
muerte de las clulas cancerosas, impidiendo la migracin o metstasis, o bien favoreciendo la respuesta de defensa del organismo frente al tumor. Debido a que el cncer es un conjunto de enfermedades diferentes debidas a alteraciones diversas, los tumores que presentan una misma morfologa no tienen porqu presentar las mismas alteraciones ni las mismas dianas, por lo que hay que considerar que frmacos desarrollados frente a una diana pueden no ser eficaces en estos casos
139
modo que cabe decir que un nmero ostensible de dianas an no han sido explotadas. Las 500 dianas teraputicas conocidas pueden clasificarse en base a su estructura y su funcin en 130 familias de protenas, de las cuales los receptores acoplados a protenas G son las ms importantes en nmero, seguidas de las enzimas sern-treonin y tirosn quinasas. Cabe destacar la importancia en nmero de otros tipos de enzimas como las zinc peptidasas y las sern proteasas. Asimismo, los receptores nucleares de hormonas como los esteroides son una familia de dianas relevante en la farmacoterapia actual.
5.2. Naturaleza de las dianas teraputicas para los frmacos actuales

Los avances en genmica y protemica que se han producido en los ltimos aos han permitido estimar en 600-1.500 el nmero de dianas teraputicas sobre las que se podra actuar mediante frmacos. Por otro lado, se conoce que los frmacos de los que se dispone en la actualidad actan sobre menos de 500 dianas diferentes, de
Al comparar las dianas actuales con las dianas potenciales, se observa que existen diferencias en la distribucin de las dianas en familias de protenas. Cabe destacar que existen grandes familias de dianas potenciales para las que se dispone de relativamente pocos frmacos y, por tanto, se puede considerar que estas familias de dianas no han sido suficientemente explotadas. Entre estas familias se encuentran las sern treonn y tirosn quinasas que adems constituyen las familias de dianas potenciales ms numerosas140.
139 140
Sauter, G., et al. (2003). Tissue Microarrays in Drug Discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 2, 962-972. Hopkins, A. L. & Groom, C. R. (2002). The druggable genome. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol 1: 727-730.
49
A)
GPCRs 25%
119 familias diferentes y dianas nicas 44% Ser-Thr/Tyr kinasas 10% Zn peptidasas 4% NHRs 3% Cys proteasas 2% Canales inicos 2% Enzimas C. P450 2% Canales catinicos 2% Ser proteasas 3% Fosfodiesterasas 3%
B)
Ser-Thr / Tyr kinasas 22%
114 familias diferentes y dianas nicas 40% GPCRs 15%
Deshidrogenasas/ reductasas 2% a-carboxilasas 2% NHRs 3% Enzimas C. P450 2% Zn peptidasas 2%
Canales catinicos 5% Ser proteasas 4% Protein fosfatasas 4%
Figura 25. Familias de dianas teraputicas actuales (A) y potenciales (B). Fuente: Hopkins, A. L. et Groom, C. R. (2002). The druggable genome. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol 1: 727-730. Acrnimos: GPRCs: Receptores acoplados a la proteina G, Ser: Serina, Thr: Treonina, Tyr: Tirosina, Cys: Cisteina, Zn: Zinc, NHR: Receptores Nucleares de Hormonas, C. P459: Citocromo P450.
El Anexo IV del presente informe contiene una revisin de diversos enfoques que se han empleado con xito en la validacin de dianas. Gran parte de dichas dianas han dado lugar al desarrollo de nuevos frmacos que ya han sido lanzados al mercado o que se encuentran en diferentes etapas de los ensayos clnicos. En la actualidad, los ratones knock-out siguen siendo los sistemas preferidos a la hora de validar
dianas y han dado lugar al descubrimiento de un gran nmero frmacos. Por otro lado, las tecnologas antisentido estn cobrando fuerza en los ltimos aos y estn siendo ampliamente usadas para validar dianas teraputicas. No obstante, se ha de destacar que las tcnicas que figuran en la tabla anterior no son las nicas que se han empleado para validar cada una de las dianas descritas, sino que suelen ser varias las tcnicas empleadas de forma combinada.
50
6. Entorno econmico en la validacin de dianas

La investigacin en la industria farmacutica se caracteriza por ser una investigacin de larga duracin, altamente arriesgada, muy costosa, y sometida a gran competencia. La duracin media de la investigacin previa al lanzamiento de un compuesto es de 10-12 aos141 y se estima que el coste medio de la investigacin y desarrollo de un nuevo frmaco ronda en torno a los 800 millones de dlares, de los cuales el 40% se debe a las fases preclnicas mientras que el 60% restante se corresponde con las fases de investigacin clnica142. La tasa de fracaso a lo largo del proceso de investigacin farmacutica es elevada y ms del 80% de los proyectos fracasan durante la fase de descubrimiento anterior a los ensayos clnicos, de modo que slo uno de cada cinco proyectos llega a iniciar los ensayos clnicos. Durante la fase de desarrollo, ms del 90% de los proyectos se abandonan, de modo que en total tan slo uno de cada 50 proyectos comenzados llega a lanzar un frmaco al mercado. Por otro lado, debido a la Al analizar los proyectos de I+D que fracasan se observa que el abandono de estos proyectos tiene lugar principalmente en tres momentos clave del proceso de desarrollo de un frmaco. En algunos casos, dianas que no han sido suficientemente validadas fracasan en etapas tempranas del proceso de descubrimiento de frmacos o durante las fases clnicas de desarrollo. En ambos casos, el fracaso est estrechamente ligado a una incorrecta validacin de las dianas teraputicas. Por otro lado, los errores en la identificacin y optimizacin de compuestos teraputicos, as como la aparicin de efectos txicos de los compuestos seleccionados son los otros dos factores que explican la mayora de los fracasos que se producen144. fuerte competencia en el sector, se estima que tan slo tres de cada diez medicamentos comercializados producen beneficios que superan los costes de I+D143.
Factores responsables del elevado ndice de fracaso en el lanzamiento de nuevos frmacos: Dianas insuficientemente validadas en las primeras fases de identificacin de dianas y durante las fases clnicas. Errores en la identificacin y optimizacin de compuestos. Toxicidad y efectos indeseados de los frmacos candidatos.
141
142
143
144
Jackson, L. K. & Phillips, M. A. (2002). Target Validation for Drug Discovery in Parasitic Organisms. Current Topics in Medicinal Chemistry, 2, 425-438. DiMasi, J. A. (2003). The price of innovation: new estimates of drug development costs. Journal of Health Economics, 22: 151-185. Esteve, A. Biotecnologa y Salud. I curso de formacin e informacin cientfica en biomedicina y biotecnologa para especialistas en comunicacin. 16 de diciembre de 2003. Fundacin Genoma Espaa (http://www.gen-es.org/06_news/docs7/aesteve161203.pdf). Brown, D. & Superti-Furga, G. (2003). Rediscovering the sweet spot in drug Discovery. Drug Discovery today. Vol. 8 No. 23. 1067-1077.
51
En los ltimos aos, el nmero de lanzamientos de nuevos frmacos no se ha incrementado a pesar de los avances que se han producido en el rea de la biologa molecular. En el grfico que figura a continuacin se puede apreciar que el nmero de nuevos compuestos que se lanzan al mercado no ha dejado de reducirse desde el ao 1999, mientras que los costes en I+D no dejan de incrementarse a
un ritmo superior al 5% anual. Por otro lado, se ha producido un incremento de fracasos en frmacos que alcanzan fases tardas en los proyectos de investigacin farmacutica, principalmente en la fase II de los ensayos clnicos a pesar del incremento de frmacos que entran en fase I145. Algunos autores sealan que esta tendencia se mantendr al menos hasta el ao 2008146.
60
N de molculas que llegan al mercado
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0 1992 1993 1994 1995 1996 1997

Ao Nuevos compuestos Inversin en I+D
0 1998 1999 2000 2001 2002 2003
Figura 26. Evolucin del lanzamiento de nuevos frmacos y de los costes de I+D en el mercado mundial durante el periodo 1992-2003. Fuente: CMR International, http://www.cmr.org.
6.1. Validacin de dianas en el desarrollo de frmacos

El proceso de validacin de dianas supone gran parte de la inversin que realiza la industria farmacutica en investigacin y desarrollo tanto en tiempo como en coste econmico. Se estima
que la duracin media de la fase de validacin de dianas en un proyecto de I+D para el desarrollo de un nuevo frmaco ronda los dos aos y que su coste asciende a 205 millones de dlares147. Por tanto, la validacin de dianas supone en torno a un quinto de la inversin econmica de los proyectos de I+D en la industria farmacutica.
145
146
147
Walker, M. J. A., et al. (2004). Functional pharmacology: the drug discovery bottleneck? Drug Discovery Today. Vol. 3, N 5: 208-215. Brown, D. & Superti-Furga, G. (2003). Rediscovering the sweet spot in drug Discovery. Drug Discovery today. Vol. 8 No. 23: 1067-1077. Altshuler, J., et al. (2001). A Revolution in R&D: How Genomics and Genetics are transforming the Biopharmaceutical Industry. The Boston Consulting Group.
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Inversin en I+D en billones de dlares
8 7 6
Duracin (aos)
5 4 3 2 1 0 Identificacin de dianas Validacin de dianas Identificacin del compuesto Optimizacin del compuesto Desarrollo preclnico Desarrollo clnico 1 0,4 2 1,6 2,7
300 260 250

Coste (millones de )
205 200 165 150 120 100 90
50
40
0 Identificacin de dianas Validacin de dianas Identificacin del compuesto Optimizacin del compuesto Desarrollo preclnico Desarrollo clnico
Figura 27. Coste y duracin del proceso de validacin de dianas y del resto de fases de desarrollo de un frmaco. Fuente: Altshuler, J., et al. (2001). A Revolution in R&D: How Genomics and Genetics are transforming the Biopharmaceutical Industry. The Boston Consulting Group.
Debido a que la inversin necesaria para el desarrollo de un frmaco se ha incrementado considerablemente durante los ltimos aos, la industria farmacutica ha tenido que idear estrategias para contener sus gastos. Por un lado, la industria farmacutica centra sus esfuerzos de I+D en dianas teraputicas para las que ya existen frmacos en el mercado. Esto se debe en gran medida al riesgo que supone trabajar con dianas que an no han sido validadas debido al elevado porcentaje de fracasos que ocurren. Las dianas para las que existen frmacos en humanos no suelen presentar estos problemas, lo que reduce considerablemente el tiempo e inversin necesario para el desarrollo de nuevos frmacos que acten sobre las mismas. Esta tendencia
queda patente al observar que la industria farmacutica y biotecnolgica ha lanzado al mercado una media de 2-3 frmacos por ao que actan sobre nuevas dianas, mientras que se aprueban entre 25-30 medicamentos que actan sobre dianas para las que ya existen frmacos en el mercado. No obstante, existen motivos tanto sociales como econmicos para investigar en nuevas dianas. A lo largo del presente informe se han expuesto diversas patologas que dan lugar a problemas sanitarios de primer orden para las cuales la sociedad demanda nuevos frmacos eficaces y seguros, y que por tanto acten sobre dianas
53
especficas para estas patologas. Algunas de estas enfermedades generan costes elevados que repercuten negativamente en el creciente gasto sanitario de los Sistemas Nacionales de Salud. Por otro lado, la disminucin que se ha producido en el lanzamiento de nuevos frmacos difcilmente podr ser superada si no se identifican y validan nuevas dianas teraputicas. Algunas de las enfermedades para las que no existen tratamientos eficaces afectan a amplios sectores de la poblacin, por lo que el descubrimiento de nuevas terapias permitira dirigirse a un pblico numeroso aportando nuevas oportunidades de mercado para las empresas farmacuticas148.
Cuanto ms se avance en el proyecto de investigacin y desarrollo, mayores son los costes acumulados a lo largo del proceso. Por tanto, cuanto ms tarde se produzca el abandono de los proyectos que van a fracasar, mayores sern los costes acumulados para la empresa farmacutica. Existe por tanto una necesidad de discriminar los proyectos que no van a conducir a un frmaco exitoso en fases tempranas de la investigacin. La validacin de dianas constituye un proceso clave que puede permitir rechazar proyectos abocados al fracaso en fases tempranas.
Validacin de dianas
Desarrollo del compuesto
Desarrollo preclnico
Desarrollo clnico Comercializacin
Diana A
Diana B
Diana C
Diana D
Figura 28. Beneficios de la validacin de dianas sobre el desarrollo de proyectos de I+D en la industria farmacutica. Fuente: Elaboracin propia.
De este modo, el abandono de proyectos en fases tempranas evitar el invertir recursos y tiempo en el desarrollo de compuestos activos que posteriormente demostrarn no ser eficaces. De esta forma, se liberaran recursos que podran ser empleados para finalizar proyectos con mayores posibilidades de conducir al lanzamiento de frmacos de exito y acortar por tanto la duracin de los mismos.
biotecnolgicas muestran gran dinamismo a pesar de su reducido tamao y recursos gracias a la especializacin tecnolgica y el dominio de reas tecnolgicas punteras que hace que su nivel de ingresos, ventas e inversin avance a ritmo slido a escala mundial. En consecuencia, el punto fuerte de las empresas biotecnolgicas consiste en el desarrollo de tecnologas innovadoras propias que las farmacuticas necesitan para validar dianas. Por este motivo, las compaas farmacuticas
6.2. Estrategias de implantacin de validacin de dianas en la industria farmacutica

El coste derivado del lanzamiento de un nuevo frmaco al mercado es elevado debido principalmente a los ensayos clnicos y, por tanto, tan slo las grandes compaas son capaces de realizar el proceso completo de desarrollo de nuevos frmacos. Sin embargo, las nuevas compaas
tradicionales buscan frmulas de colaboracin con las empresas biotecnolgicas con el fin de garantizarse el acceso a las nuevas tecnologas desarrolladas por estas ltimas. La incorporacin de tecnologas de validacin de dianas a la industria farmacutica puede producirse por medio de diferentes estrategias. Un gran nmero de empresas optan por la adquisicin de tecnologa de validacin de dianas desarrollada por empresas biotecnolgicas, mientras que en otros casos estas ltimas ofrecen
148
Zambrowicz, B. P., et al. (2003). Predicting drug efficacy: knockouts model pipeline drugs of the pharmaceutical industry. Current Opinion in Pharmacology. 3: 563-570.
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las dianas ya validadas en su cartera de productos. En otras ocaciones, las empresas farmacuticas recurren a alianzas estratgicas en busca de socios con tecnologa propia de validacin de dianas, o bien a la adquisicin de estas compaas biotecnolgicas especializadas.
Estrategias de implantacin de nuevas tcnicas de validacin de dianas en la industria farmacutica: Adquisicin de tecnologa desarrollada por empresas biotecnolgicas especializadas en validacin de dianas. Compra de potenciales dianas validadas por empresas biotecnolgicas. Alianzas estratgicas entre empresas biotecnolgicas y farmacuticas. Adquisicin de empresas biotecnolgicas especializadas en validacin de dianas.
6.3. Estrategias comerciales en la validacin de dianas

Las principales empresas farmacuticas multinacionales han optado por establecer colaboraciones con empresas biotecnolgicas para hacer frente a su dficit de innovacin y reforzar sus lneas de I+D. A continuacin detallamos algunos de los principales acuerdos que han establecido las grandes multinacionales farmacuticas con las empresas biotecnolgicas ms relevantes.
Empresa farmacutica
Empresa biotecnolgica ISIS Pharmaceuticals Inc.
Contribucin Tecnologas antisentido. Tecnologa knock-out. Tecnologa knock-out. Servicios de validacin. Tecnologas antisentido. Tecnologa knock-out. Dianas teraputicas validadas. Tecnologas de ARNsi y de dianas validadas. Servicios de validacin. Tecnologa knock-out. Tecnologa knock-out. Tecnologa para validar dianas del sistema nervioso. Tecnologa CALI. Servicios de validacin. Desarrollo de un modelo de trombosis en pez zebra. Tecnologa antisentido.
(Contina en pgina siguiente)
Pfizer
Lexicon Genetics Inc. Deltagen CuraGen ISIS Pharmaceuticals Inc. Deltagen
GlaxoSmithKline Cytokinetics Galpagos Genomics Beyond Genomics Johnson & Johnson Lexicon Genetics Lexicon Genetics BioVex Aventis Xerion Pharmaceuticals Zygogen Atugen
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Empresa farmacutica
Empresa biotecnolgica
Contribucin Tecnologa. Plataforma de diseo y sntesis de ARNi. Servicios de validacin. Dianas teraputicas validadas. Tecnologa CALI. Servicios de validacin. Bases de datos. Servicios de validacin. Tecnologa knock-out. Acceso a su base de datos. Servicios de validacin. Validar dianas concretas con antisentidos. Tecnologa. Vectores para transferir genes. Servicios de validacin. Tecnologas antisentido. Tecnologa. Tecnologa knock-out. Tecnologa antisentido. Tecnologa. Tecnologa knock-out. Tecnologas relacionadas con microarrays. Tecnologa y servicios de validacin. Bases de datos, validacin de dianas con tecnologa propia. Tecnologa de ARNi. Tecnologa. Base de datos de fenotipos de knock-outs. Tecnologa knock-out. Tecnologa. Software. Tecnologa. Software para plataforma de validacin. Tecnologa. Ribozimas. Servicios de validacin basados en tecnologas antisentido. Tecnologa knock-out. Tecnologas antisentido. Dianas teraputicas validadas.
Compugen Ltd. Beyond Genomics Immusol Xerion DeCode Roche Curagen Lexicon genetics Atugen Oxford Biomedica Astrazeneca Pharmagene ISIS Pharmaceuticals Inc. BioVex Lexicon Genetics ISIS Pharmaceuticals Inc. Merck & co. Biovex Deltagen Cellomics Inc. Pharmagene Bristol Myers Squibb Sequitur Lexicon Genetics Lexicon Genetics Eli Lilly Pangea Sistems Lion Bioscience Schering Plough Atugen Galapagos Lexicon Genetics Atugen Curagen
Novartis
Bayer
Tabla 5. Principales acuerdos de colaboracin entre empresas farmacuticas y empresas biotecnolgicas relacionadas con la validacin de dianas. Fuente: BioCentury Publications, Inc; http://www.biocentury.com.
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En cuanto a las tecnologas que son objeto de colaboracin entre las principales empresas farmacuticas y las biotecnolgicas ms importantes, destacan las tecnologas antisentido y los modelos vivos, especialmente los ratones knock-out. De hecho, la totalidad de las farmacuticas ms importantes han establecido acuerdos que implican alguna de las dos tecnologas mencionadas para garantizarse el acceso a las mismas. Entre las empresas que desarrollan animales modelo cabe destacar los casos de Lexicon Genetics, que desarrolla ratones knock-out y transgnicos y presta servicios de validacin de dianas, y Deltagen, que desarrolla ratones knock-out y dispone de bases de datos de genes de inters clnico obtenidos a partir de los mismos. Ambas empresas ofrecen sus modelos y sus servicios a la mayora de las multinacionales farmacuticas ms importantes. Por otro lado, Atugen e ISIS Pharmaceuticals son las empresas especializadas en tecnologas antisentido que han establecido mayor cantidad de colaboraciones con las grandes farmacuticas. Atugen oferta productos y servicios de validacin de dianas
basados en oligonucletidos antisentido propios y ARNsi, e ISIS Pharmaceuticals presta servicios de validacin de dianas basados en tecnologas antisentido. Ambas empresas estn investigando activamente en el desarrollo de terapias basadas en tecnologas antisentido con el objeto de poder desarrollar frmacos antisentido. En los ltimos aos, gran parte de las empresas especialistas en tecnologas de validacin de dianas han aprovechado su conocimiento en tecnologas punteras para realizar otras fases de la I+D y lanzarse al desarrollo de frmacos. Debido a su falta de experiencia en la totalidad del proceso de desarrollo, algunas compaas biotecnolgicas han optado por colaborar con compaas farmacuticas para desarrollar conjuntamente nuevos tratamientos, lo que les ha permitido adquirir el conocimiento necesario para lanzarse al desarrollo en solitario de nuevos frmacos. De este modo las biotecnolgicas consiguen obtener mayores ingresos, lo que les permite rentabilizar al mximo sus esfuerzos en I+D.
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7. Empresas y proyectos en validacin de dianas

En el presente apartado se comentan las principales empresas que ofrecen productos y servicios relacionados con la validacin de dianas que operan a nivel internacional y aquellas otras empresas de carcter nacional relacionadas con la validacin de dianas. Se mencionarn las actividades principales de estas empresas que prestan servicios o productos de validacin de dianas, as como la evolucin que han sufrido las mismas en los ltimos aos. Por otro lado, se estudian los proyectos de I+D espaoles en validacin de dianas que emplean las tecnologas y tcnicas expuestas a lo largo del presente informe, as como las tecnologas empleadas y las patologas en las que se centra la I+D nacional. reactivos para el uso de la tecnologas antisentido en investigacin. Algunas de estas empresas han desarrollado tecnologas y plataformas con marcas propias diferenciadas de la competencia, como es el caso de los oligonucletidos de baja toxicidad resistentes a endonucleasa Geneblock de Atugen y la plataforma de alto rendimiento de ARN interferencia HT-RNA de Cenix. En segundo lugar en nmero se encuentran las empresas especializadas en modelos vivos de la enfermedad, siendo los ratones y el pez cebra los modelos ms empleados en validacin de dianas. En este caso, las empresas ms importantes son Exelixis, compaa que emplea modelos animales diversos en su I+D de dianas para cncer, Deltagen que comercializa bases de datos de la funcin de genes elaborados a partir de ratones knock-out, Ingenium Pharmaceuticals a travs del desarrollo de una plataforma basada en la estrategia directa de validacin en ratones y Lexicon Genetics, cuya estrategia de validacin de dianas a escala genmica emplea ratones knockout para 5.000 genes. Cabe destacar el elevado nmero de colaboraciones y acuerdos que han establecido dichas empresas con compaas farmacuticas, lo que es sntoma del inters que despiertan las tecnologas y plataformas desarrolladas por las mismas. En cuanto a las empresas cuyo negocio consiste en validar dianas para enfermedades o reas teraputicas concretas, stas han desarrollado metodologas de validacin de dianas que son capaces de integrar la informacin obtenida mediante diferentes tcnicas de validacin. Debido a ello, estas compaas han desarrollado plataformas de validacin de dianas que combinan varias tcnicas como el anlisis de la expresin gnica, las tecnologas antisentido, las tcnicas de bloqueo de protenas, los animales modelo y la bioinformtica que aplican de acuerdo a una metodologa propia. ste es el caso de la empresa Devgen, que ofrece bases de datos de fenotipos de mutantes y knock-outs y servicios de validacin con tecnologas de ARN interferencia en modelos vivos como C. elegans. En el caso de Pharmagene, dispone de la base de datos TargetEvaluatorTM de expresin de genes en tejidos normales y patolgicos que puede ser empleada para validar y priorizar dianas, adems de ofrecer servicios de genmica qumica y
7.1. Empresas internacionales en validacin de dianas

En el anexo II del presente informe figuran las principales empresas internacionales en validacin de dianas con los productos y servicios que ofrecen y las colaboraciones que han establecido con otras compaas del sector. En cuanto a la actividad principal y la misin de las empresas detalladas, gran parte de ellas desarrollan tecnologas aplicables a la validacin de dianas en general, mientras que otras validan dianas con objeto de descubrir nuevas dianas frente a determinadas enfermedades. La mayora de las empresas se han especializado en tecnologas concretas de desarrollo propio que comercializan como herramientas de validacin de dianas. Las empresas especializadas en tecnologas antisentido son las ms numerosas, entre las que destacan ISIS Pharmaceuticals y Atugen debido a su amplia experiencia en oligonucletidos antisentido y ARN de interferencia respectivamente. Otras empresas destacadas en el campo de las tecnologas antisentido son Alnylam Pharmaceuticals que investiga activamente en nuevos tratamientos basados en el ARN de interferencia, Cenix Bioscience que presta servicios basados en la aplicacin del ARN de interferencia a clulas humanas y modelos animales, y Sequitur (perteneciente a Invitrogen) fabricante de kits y
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screening. Por otro lado, Xenogen est especializado en ratones y ratas transgnicas y knock-out que permiten visualizar la expresin de genes mediante emisin de luz gracias a su tecnologa LPTA. El caso de Xerion, la compaa es propietaria de la tcnica CALI, lo que le permite validar dianas y comercializar las mismas as como introducirse en el desarrollo de anticuerpos teraputicos. En los ltimos aos existe una tendencia clara en las empresas que han desarrollado y puesto a punto plataformas de validacin de dianas a dejar de ser meras proveedoras de servicios de validacin o de dianas validadas, para convertirse en empresas que desarrollan y comercializan frmacos. Es decir, existen compaas con plataformas de validacin de dianas que estn evolucionando hacia un modelo ms parecido al de las empresas farmacuticas y tienen en marcha proyectos de desarrollo de frmacos novedosos frente a enfermedades de inters. ste es el caso de Celera Genomics, Curagen y Deltagen, que emplean sus plataformas basadas en la integracin de tcnicas diversas para identificar y validar sus propias dianas, las cuales en su mayora estn relacionadas con el cncer. Por otro lado, Exelixis y Lexicon Genetics se han especializado en el desarrollo de modelos animales que emplean para validar dianas de sus reas teraputicas de inters y estn desarrollando compuestos frente a las mismas. Otro ejemplo claro lo constituyen Millennium Pharmaceuticals, Incyte Genomics y Myriad Genetics, que emplean plataformas basadas en la integracin mediante herramientas bioinformticas propias de la informacin obtenida a partir del anlisis de la expresin de genes y protenas149. Por otro lado, cabe resear el gran nmero de acuerdos relacionados con la validacin de dianas que se establecen entre empresas, tal y como se puede observar en el anexo II. Las colaboraciones pueden darse entre dos empresas biotecnolgicas o entre una empresa biotecnolgica y una farmacutica. De hecho, la mayora de empresas biotecnolgicas han establecido acuerdos con varias farmacuticas y biotecnolgicas en los ltimos aos, lo que refleja el dinamismo del sector y la importancia dada por las multinacionales farmacuticas a la validacin de dianas.
7.2. Empresas espaolas en validacin de dianas

En cuanto a la situacin de las empresas de validacin de dianas a nivel nacional, cabe destacar el reducido nmero de empresas que realizan actividades relacionadas con la validacin de dianas. En el anexo III figuran las empresas espaolas que ofrecen la validacin de dianas en su cartera de servicios o que desarrollan tecnologas y herramientas dirigidas a la validacin de dianas. Las compaas biotecnolgicas Progenika Biopharma150, antes conocida como Medplant Genetics, y su filial Proteomika151 poseen proyectos de identificacin y validacin de dianas mediante tecnologas diversas como los microarrays de ADN y tejidos, anticuerpos bloqueantes, tecnologas antisentido, ratones transgnicos y knock-out. Ambas empresas se han especializado en enfermedades psiquitricas y cncer, y en el caso de Progenika tambin trabaja en esclerosis mltiple. Por otro lado, la empresa biotecnolgica Advancell152, valida dianas mediante anlisis de la expresin, tecnologas antisentido y tcnicas bioinformticas aplicadas al diseo y sntesis de frmacos. Dominion Pharmakine153 posee proyectos de validacin de dianas teraputicas mediante el empleo de microarrays de ADN, ARN de interferencia y ensayos sobre clulas tumorales. En este caso, la empresa dispone de colecciones de tejidos humanos y animales, as como arrays de tejidos y clulas que comercializa para diferentes aplicaciones entre las que se encuentra la validacin de dianas. La compaa Oryzon Genomics154 ofrece servicios de I+D mediante el uso de herramientas genmicas y protemicas, como microarrays de ADN y bioinformtica. La empresa Owl Genomics155 se centra en la identificacin de marcadores moleculares y agentes teraputicos para el diagnstico temprano y tratamiento de enfermedades hepticas, mientras que Neuropharma156 tiene por objetivo la identificacin y validacin de dianas teraputicas relacionadas con enfermedades neurodegenerativas. Otras compaas espaolas relacionadas con la identificacin y validacin de dianas son Necodex, Sistemas Genmicos y Biomedal157.
149 150 151 152 153 154 155 156 157
Gray, L. (2003). Genomics-based Approaches to Drug Target Validation. Business Communications Company, Inc. Progenika Biopharma, S. A. (www.progenika.com). Proteomika, S. L. (www.proteomika.com). Advancell, Advanced in Vitro Cell Technologies, S. L. (www.advancell.net). Dominion Pharmakine, S. L. (www.pharmakine.com). Oryzon Genomics S.A. (www.oryzon.com). Owl Genomics, S. L. (www.owlgenoics.com). Neuropharma, S. A. (www.neuropharma.es). Necodex (www.neocodex.es), Sistemas Genmicos (www.sistemasgenomicos.com), Biomedal (www.biomedal.es).
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En cuanto a las empresas espaolas que han desarrollado herramientas bioinformticas aplicadas a los microarrays, Bioalma, Ebiointel, Integromics o NorayBio158 son algunos de los ejemplos ms destacados. En la mayora de los casos, las empresas espaolas que ofrecen servicios o productos de validacin de dianas establecen colaboraciones principalmente con instituciones pblicas espaolas como hospitales del Sistema Nacional de Seguridad Social, Universidades Pblicas, centros dependientes del CSIC159 o el CNIO160. No obstante, existen notables excepciones que han establecido acuerdos con numerosas empresas privadas tanto nacionales como multinacionales lo que les permite acceder a financiacin privada. Cabe destacar la existencia de dos organismos vinculados a instituciones pblicas que realizan actividades relacionadas con la validacin de dianas. El primero de ellos es el Instituto de Farmacia Industrial161, dependiente de la Universidad de Santiago de Compostela, que ofrece servicios de validacin de dianas, identificacin de compuestos qumicos y optimizacin de los mismos. En segundo lugar, la Unidad Mixta Almirall Prodesfarma-PCB
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determinadas enfermedades como medio para identificar y validar dianas teraputicas novedosas. Los proyectos de investigacin se centran en aquellas enfermedades que en el presente informe se han identificado como prioritarias para el desarrollo de nuevos frmacos, principalmente cncer, enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer y el Parkinson y enfermedades cardiovasculares. Respecto a las tcnicas genmicas y protemicas que se emplean en los proyectos de I+D recogidas en el anexo I, se observa que la mayora de los mismos, en torno al 40% del total de los proyectos estudiados, emplean modelos animales para validar dianas, siendo los ratones transgnicos y knock-out los principales modelos utilizados. Cabe destacar la existencia de proyectos dirigidos especificamente al desarrollo de nuevos modelos animales para el estudio de enfermedades concretas como el cncer, la enfermedad de Alzheimer y Parkinson. Asimismo, el uso de tecnologas de anlisis de la expresin gnica est ampliamente extendido y en torno al 15% de los proyectos espaoles en validacin de dianas se basan en su utilizacin. La tcnica de anlisis de la expresin ms habitual la constituyen los microarrays de ADN, existiendo proyectos especficos dirigidos al desarrollo de nuevas tecnologas relacionadas con los mismos. Por otro lado, se ha observado un nmero reducido de proyectos que no llegan a suponer un 5% del total, y que emplean tecnologas de modulacin de la expresin en validacin de dianas. Finalmente, cabe subrayar el nivel bsico de la investigacin en validacin de dianas que se realiza en Espaa ya que la mayor parte de los proyectos van dirigidos al estudio de los mecanismos de la enfermedad, y se encuentran lejanos a su aplicacin prctica en la validacin de dianas. No obstante, la investigacin bsica existente se dirige hacia reas teraputicas de inters y puede constituir una slida base sobre la que realizar una investigacin aplicada de calidad en validacin de dianas.
consiste
en una iniciativa conjunta del Parque Cientfico de Barcelona y la empresa farmacutica AlmirallProdesfarma, que tiene como objetivo la identificacin y validacin de dianas para el desarrollo de nuevos frmacos frente a enfermedades relacionadas con procesos inflamatorios.
7.3. Proyectos de I+D espaoles en validacin de dianas

En lo concerniente a los proyectos de I+D espaoles en validacin de dianas, cabe destacar que gran parte de los mismos se centran en el estudio de los mecanismos que conducen a
158
159 160 161 162
Bioalma, Alma Bioinformtica S.L. (www.almabioinfo.com); Ebiointel, S.L. (www.ebiointel.com); Integromics, S.L. (www.integromics.com); Noray Bioinformatics, S.L. (www.noraybio.com). Consejo Superior de Investigaciones Cientficas - CSIC (www.csic.es). Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas - CNIO (www.cnio.es). Instituto de Farmacia Industrial (www.usc.es/farmind). Unidad Mixta Almirall Prodesfarma-PCB (www.pcb.ub.es/homePCB/live/es/p516.asp).
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8. Conclusiones
La secuenciacin del genoma humano marc un antes y un despus en la investigacin farmacutica, logrndose la identificacin de decenas de miles de genes y protenas que pueden constituir dianas potenciales de frmacos. Debido a ello, el descubrimiento de frmacos ha dejado de ser el cuello de botella del proceso de I+D y la validacin de dianas se ha constituido en el principal cuello de botella del proceso. Por tanto, si la industria quiere ser capaz de desarrollar frmacos a partir de los conocimientos en genmica, ser necesario utilizar tcnicas de validacin de alto rendimiento que permitan seleccionar aquellas dianas en las que invertir mayores esfuerzos. La validacin de dianas se ha revelado como una etapa crtica a la hora de condicionar el xito o fracaso de los proyectos de I+D en el proceso de desarrollo de frmacos. El principal reto de la validacin de dianas consiste en asignar funciones a dianas concretas y abandonar aquellas dianas que no sean adecuadas a la hora de disear frmacos eficientes. Hay que tener en cuenta que un nmero elevado de dianas pueden estar asociadas a una enfermedad contribuyendo en cierto grado al fenotipo patolgico, y por lo tanto resulta necesario validar aquellas dianas que son cruciales para el desarrollo y mantenimiento de la enfermedad. La identificacin de dianas a gran escala permite a su vez conseguir un cierto grado de validacin, por lo que muchas de las tcnicas de anlisis de la expresin gnica como los microarrays de ADN y tcnicas de interacciones de protenas, como el sistema doble-hbrido, son de gran valor a la hora de asignar funciones a dianas hasta entonces desconocidas. Las tcnicas de validacin de dianas propiamente dichas se han clasificado en funcin de su estrategia molecular. Por un lado, las tcnicas de modulacin de la expresin se basan en la alteracin de la expresin de genes bien actuando sobre el ADN o el ARN, de modo que se activen o inactiven genes concretos. De este modo, al poner de manifiesto que la expresin alterada de un gen da lugar al estado patolgico, se puede establecer una asociacin entre una diana y una determinada enfermedad. El descubrimiento y optimizacin del ARN de interferencia ha promovido que tecnologas como los ribozimas hayan sido relegadas a un segundo plano ante las aparentes desventajas de los mismos. No obstante, los avances Las estrategias actualmente disponibles para facilitar la administracin del ARN de interferencia consisten en el empleo de reactivos lipdicos, modificaciones qumicas de los cidos nucleicos y su inyeccin intravenosa o intraperitoneal. A pesar del progreso realizado, an no est claro si el ARN de interferencia presenta ventajas respecto a los oligonucletidos antisentido para su aplicacin in vivo, y resulta indispensable abordar cuestiones de diseo qumico y farmacolgico que posibiliten la aplicacin del ARN de interferencia in vivo. En la actualidad se dispone de varias tcnicas que permiten modular la expresin de genes especficos bien bloqueando o activando los mismos. Los oligonucletidos antisentido son conocidos desde hace tiempo pero su uso se haba visto restringido debido a los problemas tcnicos asociados a su aplicacin. El descubrimiento de la tecnologa del ARN de interferencia y de las diferentes estrategias para su aplicacin, abri todo un abanico de posibilidades que permitan el silenciamiento especfico de genes concretos. La rapidez del diseo y produccin de ARNs de interferencia especficos de genes concretos y su reducido coste, hacen de la misma una de las tecnologas ms prometedoras en la validacin de dianas. Tanto el ARN de interferencia como los oligonucletidos antisentido permiten cribar genes candidatos en corto espacio de tiempo y obtener informacin acerca de su funcin con rapidez. Sin embargo, los problemas de administracin de los ARN de interferencia a clulas u organismos completos no han sido resueltos completamente. En el caso de los cultivos celulares de clulas de mamferos este problema ha sido resuelto con xito mediante el empleo de tcnicas disponibles para la introduccin de cidos nucleicos a las clulas. Sin embargo, la administracin in vivo sigue siendo una asignatura pendiente sobre todo en el caso de modelos de mamferos y la mayora de los estudios en este sentido se han realizado en dianas presentes en el hgado debido a la mayor accesibilidad de este rgano a la administracin de cidos nucleicos.
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tecnolgicos que recientemente se han producido en el diseo, eficiencia y administracin, posibilitan el empleo de ribozimas en la validacin de dianas de modo mucho ms efectivo, lo que permite afirmar que junto con el ARN de interferencia sigue siendo una tcnica con un futuro prometedor por delante. Las protenas de dedos de zinc permiten tanto silenciar la expresin de un gen concreto como incrementar la expresin del mismo. El incremento de la expresin no puede ser alcanzado por ninguno de los anteriores mtodos de modulacin de la expresin, mientras que las protenas de dedos de zinc han sido empleadas con xito en la validacin de dianas. Sin embargo, la relacin entre la expresin gnica y la funcin de la protena diana no tiene por qu ser causal, es decir, la diferencia de expresin de un gen concreto puede no ser la causa de la enfermedad. Por otra parte, las protenas sufren a menudo modificaciones que no vienen determinadas en los genes que las codifican, por lo que las tcnicas de modulacin de la expresin no siempre ofrecen informacin completa acerca de la funcin de las dianas. Por este motivo, las tcnicas basadas en la inactivacin de protenas consistentes en el bloqueo de la funcin de las protenas, son necesarias en numerosas ocasiones. Los anticuerpos monoclonales constituyen las primeras estrategias de validacin de dianas que fueron diseadas para interferir directamente con las protenas, y siguen siendo ampliamente empleados debido a su elevada especificidad y fcil produccin. De hecho, en los ltimos aos ha tenido lugar un resurgir de los anticuerpos monoclonales debido al desarrollo de frmacos basados en su empleo como terapia principalmente en cncer y enfermedades autoinmunes. En estos casos la validacin de dianas mediante anticuerpos monoclonales puede constituir la primera etapa del desarrollo de un potencial frmaco basado en anticuerpos teraputicos o sus derivados. El conocimiento de los anticuerpos monoclonales ha permitido el desarrollo de la tcnica CALI/FALI que permite una inactivacin funcional irreversible de la protena diana. Esta tcnica slo puede ser empleada en cultivos celulares y su elevado rendimiento hace que permitan validar dianas proteicas a gran escala, lo que facilita la industrializacin del proceso y su aplicacin en la empresa. Por otro lado, los aptmeros presentan problemas de administracin que siguen siendo limitantes a la hora de alcanzar
las dianas intracelulares tanto en cultivo celular como sobre todo en organismos modelo, por lo que el desarrollo de reactivos y mtodos de administracin sigue siendo una asignatura pendiente. Otras estrategias alternativas que se han descrito con detalle en el presente informe se corresponden con tecnologas de alto rendimiento basadas en el empleo de microarrays. Los arrays de tejidos ofrecen la posibilidad de analizar in situ los cambios fenotpicos en tejidos patolgicos por medio de su comparacin con tejidos sanos. La gran ventaja de esta estrategia radica en la visualizacin clnica de los cambios fenotpicos de los tejidos implicados en el proceso patolgico, por lo que aaden una informacin extra a la validacin de dianas que ninguna de las tcnicas actuales permite. Asimismo, los microarrays de clulas ofrecen la posibilidad de analizar la expresin gnica a gran escala sobre clulas vivas. Los modelos vivos de enfermedades constituyen sistemas sobre los que es posible aplicar las tcnicas mencionadas anteriormente, por lo que su desarrollo es primordial a la hora de validar dianas mediante un conjunto de tcnicas complementarias. El diseo de sistemas modelo adecuados para cada patologa es un proceso muy laborioso que no siempre es viable. El empleo de tcnicas genmicas para su desarrollo y la bsqueda de nuevos modelos ms sencillos constituyen las principales estrategias actuales. Los modelos animales permiten el estudio de la funcin de dianas teraputicas en organismos completos, lo que posibilita validar dianas en su contexto natural. La validacin de dianas mediante modelos animales proporciona el mayor grado de evidencia de la relacin existente entre una determinada diana y un estado patolgico. No obstante, la administracin de agentes moduladores de la expresin o inhibidores de protenas, sigue siendo uno de los grandes problemas de la validacin en modelos animales. Se han desarrollado enfoques que pretenden sortear estas limitaciones, bien mediante el empleo de nuevos reactivos, mtodos que faciliten la entrada en el organismo y en las clulas del mismo, o mediante tcnicas dirigidas a la sntesis de los mismos en el interior de la clula. Por otra parte, debido al elevado coste de los modelos animales, los esfuerzos actuales estn dirigidos al desarrollo de tcnicas de
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validacin de alto rendimiento en modelos animales y a la bsqueda de nuevos modelos animales ms sencillos. Otro factor que hasta la fecha no se tena en cuenta es la existencia de mltiples dianas para cada frmaco, por lo que es necesario el diseo de modelos animales adecuados que permitan el estudio completo de las bases moleculares de la enfermedad y los posibles efectos secundarios del frmaco. En la actualidad, los ratones siguen siendo el principal modelo animal en experimentacin farmacutica, debido a su similitud con el ser humano y facilidad de cra. Sin embargo, el coste temporal y econmico de obtener ratones knock-out/knock-in y transgnicos resulta muy elevado lo que imposibilita su empleo a gran escala. Existen tcnicas de alto rendimiento mediante la obtencin de ratones mutados al azar, que sin embargo no son tiles para la mayora de las estrategias de validacin, en las cuales se pretende validar una nica diana. La dificultad de emplear el ratn como modelo animal en la validacin de dianas con un elevado rendimiento, ha provocado que otros modelos animales hayan cobrado fuerza como herramientas de validacin de dianas. Cabe destacar el nemtodo C. elegans, modelo animal de fcil crecimiento en laboratorio, a partir del cual se pueden obtener knock-outs, puede ser sometido a transgnesis, o a ARN interferencia. La necesidad de desarrollar un nuevo modelo animal vertebrado ha sido cubierta por el pez cebra, de fcil cra y susceptible de ser manipulado de modo automatizado, a la vez que presenta la mayora de los rganos y sistemas presentes en humanos. En la actualidad an no es posible desarrollar knock-outs para pez cebra, aunque se han desarrollado mutantes de pez cebra y transgnicos. Existen tecnologas antisentido que han sido puestas a punto para su empleo en pez cebra como son los morfolinos y PNAs que permiten silenciar genes de modo especfico y eficaz por medio de su administracin en el medio. Por tanto, cabe afirmar que una vez puesto a punto el pez cebra, ste se consolidar como uno de los modelos animales ms relevantes en la validacin de dianas teraputicas. Por ltimo, las clulas madre embrionarias presentan ventajas respecto a otros tipos de sistemas celulares de validacin de dianas. En la
actualidad, debido a la rigidez legislativa que impide el uso de clulas madre humanas, se emplean clulas madre procedentes de embriones de ratn. Recientemente se han producido cambios en la legislacin espaola que pretenden posibilitar la investigacin mediante el empleo de embriones sobrantes de fecundaciones in vitro, lo que presagia un futuro prometedor a su empleo en investigacin farmacutica. Las tcnicas de validacin mediante ratones knock-out/knock-in y las tecnologas antisentido en general, son las principales estrategias que sigue la industria farmacutica a la hora de validar sus dianas candidatas. En el caso de los primeros, suponen una tecnologa consolidada que permite no slo su uso como herramienta de validacin, sino que es de gran valor como sistema modelo durante los ensayos preclnicos. Debido al alto coste y laboriosidad de los ratones knock-out y knock-in, las tecnologas antisentido como el ARN de interferencia estn cobrando fuerza en los ltimos aos. Debido a que sta es una tcnica barata, rpida y relativamente sencilla, ha sido adoptada en poco tiempo. No obstante, las tcnicas de ARNi todava se enfrentan a ciertos retos especialmente relacionados con la validacin in vivo en modelos animales de mamferos. La validacin de dianas in vivo sigue siendo el principal reto a superar, ya que hasta el momento no es posible realizarla a gran escala. A pesar del alto potencial de estas tcnicas y del valor predictivo de los modelos animales, el confiar excesivamente en un nica tecnologa en ocasiones puede conllevar dar por buenas dianas que fracasen en fases posteriores, o bien descartar dianas que podran dar lugar a proyectos exitosos. Por lo tanto, un punto crtico en la validacin de dianas consiste en decidir cundo se considera que una diana est suficientemente validada. En la actualidad, se aboga por combinar varias tcnicas para de esta forma poder establecer con mayor grado de certidumbre la asociacin entre una diana concreta y su importancia en la gnesis y desarrollo de una enfermedad. Sin embargo, cuanto mayor sea el nmero de tcnicas que se empleen para validar una diana teraputica, mayor ser el coste econmico asociado y el tiempo invertido. Por tanto, se tiende a combinar tcnicas que acten a diferente nivel, es decir, a nivel de modulacin de la expresin gnica e inhibicin de protenas, aplicadas ambas en modelos animales, de modo que la asociacin que se establezca entre una diana y una enfermedad
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sea ms robusta. En la prctica, las empresas farmacuticas se enfrentarn a tres factores clave a la hora de definir sus estrategias de validacin: Competitividad (lanzamiento de nuevos productos en respuesta a la competencia). Bajo coste (disminucin del coste de desarrollo de nuevos productos). Seguridad (frmacos ms seguros y efectivos). Cabe destacar el esfuerzo que las empresas farmacuticas estn empleando en la descripcin de nuevas rutas de sealizacin implicadas en las enfermedades ms destacadas, como son el cncer, enfermedades autoinmunes, metablicas, mentales, neurodegenerativas y cardiovasculares. Para muchas de estas enfermedades como la depresin y la ansiedad, el conocimiento de su biologa es muy escaso, por lo que la identificacin y validacin de nuevas dianas ir emparejada con un mejor conocimiento de estas rutas. Para otras enfermedades como la diabetes, el mecanismo patolgico es de sobra conocido, por lo que los esfuerzos actuales van encaminados a la validacin de dianas ya descritas pero para las que no existen frmacos actuales disponibles. El continuo descubrimiento de nuevas dianas moleculares complica a su vez el proceso de desarrollo de nuevos frmacos, ya que el nivel de complejidad de los sistemas biolgicos y patolgicos impide obtener una visin de conjunto. Por este motivo en los ltimos aos se empieza a hablar de la necesidad de emplear estrategias analticas que engloben todos los
elementos de un sistema biolgico, las cuales definan redes biolgicas que a su vez no slo transmitan informacin acerca de la genmica y protemica de un proceso, sino tambin de su perfil metablico. Esta novedosa aproximacin se ha denominado Biologa de sistemas, y requiere la integracin de varias displinas como la biologa, ingeniera y la informtica. El elevado inters que despierta la validacin de dianas para la industria farmacutica no slo reside en la relevancia de estos nuevos tratamientos, ya que es fundamentalmente una herramienta esencial para disminuir el elevado ndice de fracasos ligado al desarrollo de nuevos frmacos. Aunque existen varias razones que podran provocar la cada de un frmaco candidato durante su desarrollo, la ausencia de una validacin adecuada de las dianas implicadas en el proceso patolgico es uno de los principales motivos de fracaso. La inversin necesaria para sacar adelante un frmaco de xito al mercado se ha incrementado de forma paulatina en los ltimos aos, siendo el proceso de identificacin de dianas similar al desarrollo clnico en cuanto a coste, y al desarrollo preclnico respecto al tiempo necesario para su consecucin. No obstante, se ha demostrado que la validacin de dianas teraputicas involucradas en los procesos biolgicos que desencadenan una terapia efectiva, acortan el tiempo y coste necesario para el lanzamiento de un frmaco eficaz, ya que se evita continuar con los esfuerzos empleados en el desarrollo de frmacos cuyas dianas no han sido validadas correctamente.
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Anexos
Anexo I: Proyectos de I+D espaoles en validacin de dianas
Centro Ttulo Proyecto Gentica, patognesis y organismos inferiores modelo de la ataxia de Friedreich. Subproyecto 1: Gentica, biologa y fisiopatologa celular, y modelo en C. elegans de la ataxia de Friedreich. Aproximacin gentica al estudio de las enfermedades neurolgicas: genes, modelos animales y epidemiologa gentica. Biologa, clnica y terapia de las ataxias cerebelosas: gentica y genmica funcional y comparada. Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC) Unidad de Gentica Molecular Caracterizacin funcional de epitempina, el gen responsable de la epilepsia lateral temporal. Identificacin de dianas teraputicas relacionadas con la enfermedad de Parkinson. Anlisis de genes implicados en la diferenciacin celular en clulas de neuroblastoma humano mediante la tecnologa de los microchips de DNA. Estudio funcional mediante modelos animales del receptor de glucocorticoides (GR), su relacin con el complejo quinasa IkB (IBB) en inflamacin y tumorignesis de epidermis. Implicacin de estos factores en el sndrome de displasia ectodrmica (ED) Caracterizacin molecular y funcional de la interaccin entre el protooncogen c-fos y la protena estructural lamin A: implicaciones en la patologa cardiovascular. Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC) Unidad de Biologa Vascular Factores de riesgo, evolucin y tratamiento de las enfermedades cardiovasculares y sus mecanismos moleculares y celulares (Ayudas para el desarrollo de Redes Temticas de Investigacin Cooperativa, Red de Enfermedades Cardiovasculares). Patologa cardiovascular y proto-oncogen c-fos: papel de las interacciones con protenas estructurales de la matriz nuclear. The cellular fuel gauge AMP-activated protein kinase: a key player in type 2 diabetes, cardiovascular disease and the metabolic syndrome? Las levaduras como sistema modelo para estudiar las bases moleculares del proceso de sealizacin por glucosa en clulas pancreticas de tipo beta. Determinantes moleculares del metabolismo y la nutricin. Biocomunicacin hormonal. Nuevas estrategias teraputicas. Duracin Financiacin
2000-2003
CICYT
Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC) Unidad de Gentica y Medicina Molecular
2001-2003
FIS
2003
FIS
2002-2005
MCyT
2002-2005
Fundacin Ramn Areces
Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC) Unidad de Biologa de la Accin Hormonal
2001
GV
2002-2005
MCyT
2002-2003
GV
2003-2005
FIS
2001-2003
FIS
2001-2004
UE
Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC) Unidad de Sealizacin por Nutrientes
2002-2005
MCyT
2003-2006
FIS
65
Centro
Ttulo Proyecto Papel de SREB-1C en estados de resistencia a insulina. Estudio funcional mediante modelos animales del receptor de glucocorticoides (GR), su relacin con el complejo quinasa IkB (IBB) en inflamacin y tumorignesis de epidermis. Implicacin de estos factores en el sndrome de displasia ectodrmica (ED). Caracterizacin estructural de la glucoquinasa y su protena reguladora como posibles dianas teraputicas para el tratamiento de la diabetes. Oligonucletidos modificados con 8-aminopurinas: sntesis y estudio de sus propiedades formadoras de hlices triples. Mecanismos moleculares de accin de las protenas UEV1-Ubc13 y PTOV1. Estudio de su papel durante el desarrollo embrionario y en procesos neoplsicos, con especial nfasis en carcinoma de prstata. Utilizacin de la tcnica de arrays para determinar perfiles de expresin relativa de molculas efectoras de la lesin intestinal en la enfermedad celaca. Definicin de dianas teraputicas para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer a partir de los mecanismos de sealizacin bioqumica operativos en clulas de astrocitoma humano. Resistencia tumoral a mltiples frmacos y apoptosis celular. Mecanismos de modulacin y nuevas estrategias teraputicas. Validacin de una terapia contra la demencia de alzheimer. Diferenciacin celular y quimiorresistencia en cncer de colon. Identificacin de dianas moleculares y diseo de estrategias farmacolgicas. Interacciones lpido-protena y protena-protena en sistemas modelo de inters neurobiolgico: relevancia funcional y consecuencias estructurales. Caracterizacin molecular del centro de unin del activador de la protena desacoplante UCP2. Nuevas dianas de antibacterianos. Estudio de los sistemas de dos componentes de Streptococcus pneumoniae. Mecanismos moleculares de dao vascular: abordaje protemico y desarrollo de modelos animales. Caracterizacin de nuevas modificaciones lipdicas implicadas en la activacin de las protenas Ras. Evaluacin como potenciales dianas farmacolgicas.
Duracin 2003-2006
Financiacin MCyT
Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC) Unidad de Patologa Metablica Experimental.
2002-2005
MCYT
2001-2003
FIS
Instituto de Biologa Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC)
2003-2004
MCyT
2001-2004
MCyT
Instituto de Biologa y Gentica Molecular (IBGM-CSIC) Facultad de Medicina. Universidad de Valladolid
2004-2005
ACM
1999-2001
CICYT
2001-2003
FIS
2002
MTAS
Instituto de Biologa Molecular y Celular (IBMC-CSIC)
1999-2001
CICYT
1999-2001
DGESIC
1999-2002
MCyT
Centro de Investigaciones Biolgicas (CIB-CSIC) Dpto. de Estructura y Funcin de Protenas
2001-2002
CAM
2003
MCyT
2004
Fundacin La Caixa
66
Centro Centro de Investigaciones Biolgicas (CIB-CSIC) Dpto. de Biologa Celular y Desarrollo
Ttulo Proyecto Anlisis genmico en modelos animales y tumores humanos de la funcin del sistema de regulacin transcripcional polycomb. Silenciamiento gnico por RNA de interferencia en epitelio seminfero de ratn.
Duracin
Financiacin
2001-2004
MCyT
2003
MCyT
Centro de Investigaciones Biolgicas (CIB-CSIC) Unidad Regulacin de la Expresin Gnica
Efectos de neurotrofinas y ligandos de receptores nucleares en el proceso de mielinizacin: implicaciones teraputicas en mielinopatas perifricas.
2003
MCyT
Instituto de Microbiologa Bioqumica (IMB-CSIC)
Caracterizacin de la familia glucn sintasas de Schyzosaccharomyces pombe. Dianas tiles para el diseo de nuevos antifngicos. Estudio de subunidades catalticas responsables de la sntesis de (1-3) beta-d-glucano de la pared celular fngica. Dianas tiles para el diseo de nuevos antifngicos. Implicacin de P13k en la migracin celular de linfocitos T en inflamacin y metstasis. P13k como diana en procesos inflamatorios y linfoproliferativos. PI3K como diana teraputica y factor de riesgo de procesos tumorales. Estudio sobre la regulacin de la expresin de la tirosinasa mediante ratones transgnicos. Papel de la telomerasa en la estabilidad genmica, tumorignesis y envejecimiento: estudio de un ratn knock-out para la telomerasa. Obtencin de ratones transgnicos con expresin constitutiva de actividad telomerasa en tejidos adultos: implicaciones para terapia gnica de enfermedades asociadas al envejecimiento y terapia del cncer. Identificacin de dianas y mediadores de la senescencia y apoptosis dependiente de los telmeros. Anlisis de genomas in silico: desarrollo de un paquete software para la identificacin de genes y prediccin de su funcin. Estrategias para desarrollar mutaciones inducibles en el ratn utilizando el sistema CRE/LoxP. Anlisis de las interacciones protena-protena y los genes diana que median los efectos transcripcionales de DREAM.
2001-2003
2000-2003
CICYT
2001-2003
CAM
2001-2004
MCyT
1997-2000
MCyT
1998-2001
CICYT
Centro Nacional de Biotecnologa (CNB-CSIC)
2001-2003
MCyT
2002-2005
MCyT
1998-2000
MCyT
1999-2001
MCyT
2001-2004
CICYT
67
Centro
Ttulo Proyecto Los genes MEIS en desarrollo y enfermedad: anlisis en modelos de modificacin gentica dirigida en el ratn y clulas madre embrionarias. Regulacin por mutantes del represor dream de la neurodegeneracin inducida por excitotoxinas del procesamiento de la APP. Caracterizacin molecular de p62 como nueva diana teraputica en la activacin de NF-kB Estudio de la estructura y funcin de la presenilina-1 y de la influencia de mutaciones asociadas a la enfermedad de Alzheimer. Nuevas dianas teraputicas en la cascada PKC-MEK5. Anlisis bioinformtico de microarrays para la deteccin de rutas determinantes de la malignidad asociada a mutaciones del receptor de andrgenos en cncer de prstata. Selectividad molecular en diseo de frmacos basado en la estructura del receptor: desarrollo de nuevas dianas computacionales. Estudio del mecanismo patognico y de posibles nuevas estrategias teraputicas en un modelo transgnico condicional de la enfermedad de Huntington.
Duracin
Financiacin
2003
MCyT
Centro Nacional de Biotecnologa (CNB-CSIC)
2004
Fundacin La Caixa
2000-2003
CICYT
1997-2000
2001-2003
CAM
2001-2003
MCyT
2002-2005
FIS
2003
MCyT
Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa (CBM-SO-CSIC)
Desarrollo y validacin de nuevas tecnologas de protemica de segunda generacin. P62-ZPKC: nuevas dianas teraputicas en el tratamiento de metstasis seas. Contribucin de la sealizacin cooperativa por Notch y pre-TCR (pTa /TCR b) en la patognesis de las leucemias linfoides T: identificacin de marcadores moleculares y posibles dianas teraputicas. Control gentico de la morfognesis y proliferacin celular en Drosophila. Un modelo animal de la EA: ratones triples transgnicos con sobreexpresin de la protena tau y la enzima GSK-3 de forma condicional. Modelos transgnicos de la enfermedad de Alzheimer. Implicaciones patognicas de tau y GSK-3beta. Estudios bioinformticos de clasificacin estructural y relaciones secuencia-estructura en protenas. Activacin endotelial y angiognesis mediadas por VEGF y PGE2: implicaciones de la ruta calcineurina/NFAT y ciclooxigenasa-2
2003
MCyT
2003
MCyT
2003
Fundacin La Caixa
1999-2002
CICYT
2004
Fundacin La Caixa
2001-2003
MCyT
2001-2004
MCyT
2003
MCyT
68
Centro
Ttulo Proyecto Estudio del perfil de expresin gnica mltiple en tumores de Ewing como base para la bsqueda de nuevos marcadores y dianas teraputicas. Desarrollo de un microarray especfico para la identificacin de alteraciones genticas con valor diagnstico y pronstico en tumores slidos infantiles Diseo de un microchip de cDNA para la deteccin de resistencia a la quimioterapia en pacientes con cncer de pulmn. Estudio de los factores moleculares predictivos de respuesta al tratamiento de cncer no microctico de pulmn mediante anlisis del transcriptoma a travs de microarrays. Diseo de compuestos con actividad antitumoral que interfieran con el sistema de transmisin de seales inducida por oncogenes. Identification of Novel Targets for Cancer Treatment. Regulacin de la colino quinasa y su participacin en procesos de carcinognesis humana. Importancia de las protenas Rho en rutas de sealizacin y su funcin en la regulacin de la transformacin celular y la apoptosis. Regulacin de la expresin y actividad funcional de las cadherinas E y P durante la progresin tumoral en la carcinognesis de piel de ratn. Implementacin y aplicacin de una tcnica de cDNA microarrays para el estudio simultneo de la expresin de miles de genes. Papel de la hormona tiroidea y sus receptores en el desarrollo del encfalo: una aproximacin basada en el uso de animales modificados genticamente y en anlogos hormonales con potencial terapetico. Nuevos mtodos de screening para el descubrimiento de agentes antitumorales. Anticuerpos monoclonales PC2.27 y PA2.26 asociados a tumores. Estudio de su utilidad en cncer humano. Anlisis de los defectos de mielinizacin en ratones transgnicos sin receptores para hormona tiroidea, posible modelo de la enfermedades neurolgicas humanas.
Duracin
Financiacin
2000-2003
MCyT
2003-2003
MCyT
2001-2003
MCyT
Instituto de Investigaciones Biomdicas Alberto Sols (IIB-CSIC) Lab. de Biologa Molecular y Celular del Cncer
2002-2004
FIS
1998-2001
CICYT
2000-2003
Roche Diagnostics MCyT
2001-2003
2002-2005
MCyT
1995-1998
CICYT
2000-2002
MCyT
Instituto de Investigaciones Biomdicas Alberto Sols (IIB-CSIC) Lab. de Endocrinologa Molecular
2002-2005
MCyT
1996-1997
PN
Instituto de Investigaciones Biomdicas Alberto Sols (IIB-CSIC) Lab. de Sealizacin Celular
1997-1999
PN
2001-2004
MCyT
69
Centro
Ttulo Proyecto Estudio de genes humanos de funcin desconocida usando como sistema modelo el eucariota simple Dictyostelium discoideum. Aplicacin de la tecnologa de los microarrays de cDNA para analizar la expresin diferencial de genes entre mujeres afectadas de sndrome de ovario poliqustico y normales. Estudio genmico y protemico para analizar la expresin diferencial de genes y protenas en pacientes con sndrome de ovario poliqustico y obesidad. Estudio genmico mediante arrays de oligonucletidos de un modelo humano de resistencia insulnica: Sndrome de ovario poliqustico y obesidad. Dficit de glicosilacin del alfa-distroglicano. Implicacin en patologas musculares y neuromusculares, y utilizacin de animales modelo para su estudio. Defectos en la migracin neuronal causados por mutaciones en el gen POMT1. Estudios funcionales y generacin del ratn knock-out para estudiar futuras terapias.
Duracin
Financiacin
2003
MCyT
2001-2003
CAM
Instituto de Investigaciones Biomdicas Alberto Sols (IIB-CSIC) Lab. de Regulacin de la Expresin Gnica
2002-2005
FIS
2003-2004
CAM
2003-2006
FIS
2003-2004
CAM
Instituto de Investigaciones Biomdicas de Barcelona (IIBB-CSIC) Centro Nacional de Microelectrnica (CNM-CSIC) Dpto. de Dispositivos, Sensores y Biosensores
Caracterizacin en modelos celulares y animales de protenas de inters teraputico para la enfermedad de Alzheimer.
2001-2004
MCyT
Prototipo de un nanobiodispositivo para la deteccin de alteraciones en genes humanos (NANOBIOGEN).
2001-2004
MCyT
Integrated Opto-Nanomechanical biosensor for functional genomic anlisis (OPTONANOGEN). Centro Nacional de Microelectrnica (CNM-CSIC) Microsistema Biosensor Opto-nanomecnico para anlisis en genmica funcional. The application of functional genomic and proteomic technologies to the study of development and dissease. Instituto de Catalisis y Petroleoqumica (ICP-CSIC) Dpto. de Biocatlisis.
2002-2005
UE
2003-2006
MCyT
2002-2005
MCyT
Desarrollo de una plataforma tecnolgica de farmacogenmica funcional basada en DNA microarrays.
2001-2001
MCyT
70
Centro
Ttulo Proyecto Un modelo de enfermedad de Alzheimer por administracin de beta-amiloide 25-35: efectos comportamentales y neuroqumicos. Looking for new targets for antiepileptic therapy: focus on presinaptic glutamate receptors complexes. Anlisis molecular de genes implicados en la modulacin sinptica normal y patolgica. Ensayo y caracterizacin de distintas estrategias de diseo de RNAs inhibidores, Ribozimas y RNAs Antisense, para su uso como supresores gnicos. RNAs Catalticos una Nueva Herramienta para la Investigacin sobre VIH. Identificacin de Nuevas Dianas en el Genoma del Virus. Explotation of key enzymes in the isoprenoid biosynthetic pathway as drug targets in Leishmania.
Duracin
Financiacin
1999-2002
CICYT
Instituto de Neurobiologa Ramn y Cajal (INRC-CSIC)
2002-2004
CICYT
2003
MCyT
2000-2003
MCyT
2002-2005
FIPSE
2001-2004
UE
Instituto de Parasitologa y Biomedicina Lpez-Neyra (IPBLN-CSIC) Dpto. de Bioqumica y Farmacologa Molecular
Deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase as a drug target for the control of infectious diseases. Inactivacin especfica de molculas de RNA mediada por ribozimas. Ribozimas hairpin y RNAs antisentido como base para el desarrollo de inactivadores gnicos: diseo y caracterizacin in vitro de agentes antivirales. Ensayo y caracterizacin de distintas estrategias de diseo de RNAs inhibidores, ribozimas y RNAs antisense, para su uso como supresores gnicos. Inactivacin Gnica Mediada por RNAs Catalticos: Caracterizacin de Ribozimas de Segunda Generacin. Identificacin por tcnicas de protemica de los complejos sealizadores utilizados por los linfocitos T reguladores en las enfermedades autoinmunes. Determinacin de la expresin gnica global en clulas T implicadas en esclerosis mltiple.
2001-2005
UE
1994-1997
PN
1997-2000
CICYT
200-2003
CICYT
2003-2006
MCyT
2002-2005
MCyT
2002-2005
FIS
Instituto de Parasitologa y Biomedicina Lpez-Neyra (IPBLN-CSIC) Dpto. de Biologa Celular e Inmunologa
Study of the cellular and molecular mechanisms of AS602868 in a collagen induced arthritis model.
2002-2003
Serono Internacional S.A. Fundacin La Caixa
Efecto teraputico de VIP en un modelo de esclerosis mltiple. Mecanismos celulares y moleculares. Efecto teraputico de VIP en esclerosis mltiple. Estudio en el modelo de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE).
2004-2006
2004-2007
FIS
71
Centro
Ttulo Proyecto Mecanismos moleculares que gobiernan la gnesis y mantenimiento del cncer mesenquimal: funcin in vivo de protenas creadas por alteraciones cromosmicas, modelos de ratn, gentica del cncer y terapia gnica. Identificacin de las dianas moleculares en levaduras de compuestos antitumorales. Anlisis de alteraciones moleculares de los activadores de Ras en tumores usando la tecnologa convencional de RT-PCR y ampliada con la tecnologa de los chips microarrays. Obtencin de ratones mutantes deficientes en activadores de Ras (Sos2 y Grf2) mediante tcnicas de Gene Targeting.
Duracin
Financiacin
2003
MCyT
2001-2004
Pharmamar
2001
MCyT
2001
MCyT
Centro de Investigacin del Cncer de Salamanca (CIC-CSIC)
Caracterizacin molecular de alteraciones del gen Ikaros en leucemias agudas linfoblsticas B. Desarrollo de modelos animales portadores de anomalas del gen Ikaros. Clonacin y caracterizacin molecular del gen Aiolos humano. Estudio de su posible implicacin en enfermedades. Lnea de investigacin: desarrollo in vitro e in vivo de nuevos modelos para evaluar la actividad de frmacos antitumorales. Lnea de investigacin: empleo de microarrays de cDNA en el estudio de la progresin tumoral y farmacologa molecular. Valor Patogentico de la expresin de C-KIT en el tumor de Ewing. Una posible diana terapetica.
1999-2001
CICYT
2001-2003
FIS
2000-2005
FIS
Instituto de Neurociencias de Alicante (CSIC) Unidad de Neurobiologa Celular Instituto de Neurociencias de Alicante (CSIC) Unidad Neurobiologa del Desarrollo
Alteracin en la glicosilacin de acetilcolinesterasa en la enfermedad de Alzheimer y su implicacin en patognesis, diagnstico y tratamiento.
2003
Fundacin La Caixa
Identificacin y caracterizacin de nuevos genes de crecimiento y proliferacin en el desarrollo temprano del ojo en Drosophila. Implicaciones en la etiologa de aniridia y en cncer.
2003-2006
MCyT
Anlisis de la regulacin de la quimiocina SDF-1 en clulas dendrticas y su impacto en la infeccin por el VIH-1. Centro Nacional de Microbiologa (CNM-ISCIII) Caracterizacin de nuevas modificaciones lipdicas implicadas en la activacin de las protenas Ras. Evaluacin como potenciales dianas farmacolgicas. Antiguas y nuevas dianas para antimicrobianos en Streptococcus pneumoniae.
2003
FIPSE
2004
Fundacin La Caixa
2002
MCyT
72
Centro
Ttulo Proyecto Una nueva diana de antimicrobianos en Streptococcus pneumoniae: la ATPasa de protones de membrana.
Duracin
Financiacin
IM
Centro Nacional de Microbiologa (CNM-ISCIII)
Uso de Saccharomyces cerevisiae para la bsqueda de nuevas dianas teraputicas de VIH Inhibicin de Fosfodiesterasa 7 como terapia antiinflamatoria. Utilidad en un modelo animal de esclerosis mltiple. Validacin de dianas genmicas en cncer colorrectal y preparacin de anticuerpos humanos de inters diagnstico y teraputico a partir de libreras de anticuerpos expresadas en fagos. Humanizacin de sistemas modelo animales: induccin de tumores por oncogenes Ras. Lneas knockin de genes reporteros en genes especficos de endotelio para el estudio de la angiognesis tumoral in vivo mediante tcnicas no invasivas. Gentica y genmica en modelos experimentales del cncer humano. Identificacin genmica de nuevos marcadores del proceso tumoral en ratones knock in Cdk4 R24C. Estudio funcional de K-ras in vivo: knock-out condicional. Redundancia funcional de las quinasas dependientes de ciclinas Cdk2 y Cdk4: validacin como dianas teraputicas en tratamientos antiproliferativos. Genmica funcional del ratn: biochips y modelos genticos en cncer. Understanding human molecular physiology and pathology through integrated functional genomics in the mouse model. Diseo de una estirpe de ratn por reemplazamiento gnico necesaria para la generacin de mutantes condicionales: un til de uso universal para el desarrollo de la genmica funcional. Desarrollo de ratones genticamente modificados para el estudio del papel del oncogen k-ras in vivo y el ensayo de terapias antitumorales especficas. Identification, lead generation, structural biology and validation of targets for cancer therapy. An integrated methodological approach. Obtencin de ratones transgnicos con expresin constitutiva de actividad telomerasa en tejidos adultos: implicaciones para la terapia gnica de enfermedades asociadas al envejecimiento y terapia del cncer.
2002
FIPSE
2004-2006
Fundacin MMA
2003-2006
MCyT
2003-2006
MCyT
2003-2006
MCyT
2003-2006
Fundacin La Caixa CAM
2003-2004
2003-2004
CAM
Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas (CNIO-ISCIII)
2003-2006
FIS
2002-2005
MCyT
2002-2005
UE
2001-2004
MCyT
2001-2003
FIS
2000-2003
UE
2001-2004
MCyT
73
Centro
Ttulo Proyecto Uso de modelos animales para el estudio de la relacin entre la reparacin del dao en DNA y la funcin telomrica implicaciones para cncer, envejecimiento y su teraputica. Nuevos modelos animales para el estudio del cncer. Aplicacin de nuevas tecnologas al estudio del linfoma de Hodgkin: tissue arrays (matrices de multitejidos), microdiseccin y anlisis de expresin con microarrays de cDNA. Diferenciacin celular en linfomas B de clula pequea. Anlisis de expresin con microarrays de cDNA. Diferenciacin celular en linfomas B de clula pequea. Anlisis de expresin con microarrays de cDNA. Anlisis genmico en modelos animales y tumores humanos de la funcin del sistema de regulacin transcripcional polycomb. Patrones de expresin gentica en cncer de endometrio: estudio mediante microarrays de cDNA.
Duracin
Financiacin
2001-2004
CAM
2002-2005
MCyT
2002-2004
FIS
2002-2004
CAM
2001-2003
FIS
2002-2004
MCyT
2002-2004
FIS
Estudio mediante arrays de cDNA de los genes implicados en la sensibilidad y resistencia a paclitaxel. Identificacin de nuevas dianas de inactivacin epigentica (metilacin aberrante del DNA y alteraciones de la cromatina) en cncer humano usando microarrays y otras tcnicas genmicas. Aproximacin multidisciplinaria al cncer de mama hereditario no asociado a mutaciones en los genes BRCAs. Desarrollo de un biochip de expresin de cDNAs. Desarrollo de ensayos celulares basados en la va PI3K/Akt para el descubrimiento de molculas lder con potencial antitumoral. Identificacin de genes de susceptibilidad a la diabetes de tipo 2 mediante la aplicacin de transcriptmica. Redes temticas de grupos: Mieloma mltiple y otras gammapatas: de gnesis a la teraputica: 1) Gnesis y desarrollo de estas enfermedades, 2) Nuevos factores pronsticos y de monitorizacin de enfermedad, 3) Modelos teraputicos. Marcadores genticos del mal pronstico en leucemias mieloides agudas y mielodisplasias: anlisis por citogentica molecular y perfiles de expresin con cDNA arrays.
2002-2004
MCyT
2002-2004
MCyT
2002-2004
MCyT
2002-2005
MCyT
2002-2005
MCyT
2003
FIS
2002-2004
MCyT
74
Centro
Ttulo Proyecto Diseo y fabricacin de un biochip de DNA de baja complejidad para la evaluacin pronstica del cncer de mama. Desarrollo de metodologas de matrices de DNA en soportes interactivos (CD-ROM) para anlisis de polimorfismos y expresin gnica (CD-DNA) Obtencin y caracterizacin funcional de libreras de anticuerpos expresados en fagos con inters diagnstico y teraputico en cncer. Validacin de dianas genmicas en cncer colorrectal y preparacin de anticuerpos humanos de inters diagnstico y teraputico a partir de libreras de anticuerpos expresados en fagos. Utilizacin de libreras de anticuerpos expresados en fagos para la obtencin de nuevos anticuerpos de inters diagnstico y teraputico en cncer de vejiga. Genomic approaches to microarray data analysis. Lnea de investigacin: accin de los eicosanoides y NFAT en modelos de angiognesis tanto in vitro como in vivo y patologas caracterizadas por neovascularizacin mediada por VEGF. Lnea de investigacin: aproximaciones experimentales tanto en cultivos celulares como in vivo, para aportar nueva informacin sobre la integracin de las vas de sealizacin intracelular que gobiernan el proceso apopttico.
Duracin
Financiacin
2003
MCyT
2001
MCyT
2003-2004
CAM
2003-2006
MCyT
2003
MCyT
2003
ESF
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC-ISCIII)
Lnea de investigacin: estudio del mecanismo que asocia las seales de estrs oxidativo con la inhibicin de la unin al DNA mediante aproximaciones protemicas en clulas vivas. Regulacin i paper funcional dels factor de transcripci NFAT i NFATC en la resposta inflamatoria: studi in vivo i in vitro. xido ntrico y regulacin de la respuesta inmunitaria adaptativa: implicaciones fisiopatolgicas en modelos experimentales de inflamacin crnica. Sndrome de Walker-Warburg: estudios funcionales de POMT1, bsqueda de otros genes implicados y utilizacin de animales modelo para su estudio. Defectos en la migracin neuronal causados por mutaciones en el gen POMT1. Estudios funcionales y generacin en el ratn Knock out para estudiar futuras terapias. Identificacin de genes de susceptibilidad a la diabetes de tipo 2 mediante la aplicacin metrascriptomica. Genmica funcional y anlisis masivo de snps.
2004-2006
Fundaci la Marat de TV3
2005-2007
MSC
2003
MCyT
Universidad Autnoma de Madrid Facultad de Medicina Dpto. de Bioqumica
2003-2004
CAM
2002
MCyT
75
Centro
Ttulo Proyecto Estudio de la inhibicin de la sntesis de prostaglandina E2 sobre la inflamacin sinovial y el remodelamiento del hueso subcodral en la artrosis humana y experimental. Regulacin de la transduccin de seales por hidroxilacin de protenas. Aplicacin al desarrollo de nuevas terapias. Anlisis morflogico de las alteraciones de proteinas asociadas a microtbulos en degeneracin neurofibrilar de cerebros humanos y ratones transgnicos.
Duracin
Financiacin
Universidad Autnoma de Madrid Facultad de Medicina Dpto. de Medicina
2003
MCyT
2002
MCyT
Universidad Autnoma de Madrid Facultad de Medicina Dpto. de Morfologa Universidad Autnoma de Madrid Facultad de Ciencias Dpto. de Biologa
2002
MCyT
Modelos de ratn para la caracterizacin de genes supresores y modificadores en linfomas.
2002
FIS
Inhibicin de la neurodegeneracin en modelos de ataxia de Friedreich mediante transferencia gnica. Estudio del proteoma mitocondrial humano. Identificacin y funcionalidad de genes humanos implicados en el metabolismo celular. Utilizacion de ARN de interferencia en el diseo y experimentacin de terapias contra el cncer. Uso de Sacharomyces cerevisae para la bsqueda de nuevas dianas teraputicas de VIH. Estudio de la activacin por calcio de la lanzadera de NADH aspartato malato y su papel en la muerte neural por amiloide mediante clulas troncales neurales deficientes en aralar1. Estudios funcionales de aralar1: Activacin por calcio de la lanzadera de nadh aspartato-malato y papel en la supervivencia neuronal en modelos celulares. Univ. de Barcelona Facultat de Qumica Dpto. Bioqumica i Biologia Molecular Univ. de Barcelona Facultat de Farmcia Dpto. Farmacologia i Qumica Teraputica
2003
MCyT
2003-2006
MCyT
Universidad Autnoma de Madrid Facultad de Ciencias Dpto. de Biologa Molecular
2003
CAM
2002
FIPSE
2003
CAM
2002
MCyT
Explotacin de las diferencias metablicas entre la clula normal y tumoral en la bsqueda de nuevas dianas antitumorales.
2003
Fundacin La Caixa
Diabetes y estrs oxidativo. Estudio de los efectos de los agonistas PPAR (A y G) sobre la produccin de especies reactivas del oxgeno en modelos celulares y animales de diabetes mellitus tipo 2. Canvis bioqumics, mecnics i estructurals (3D) associats a isqumia cerebral en artries cerebrals de rates SHR. Paper del tractament farmacolgic.
2003
MCyT
2003-2006
MCyT
Univ. Autnoma de Barcelona Facultad de Medicina
Efecte de lexpressi i de la regulaci de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) en el broncoespasme i en la inflamaci pulmonar en un model dasma en el ratol. Identificacin de genes de susceptibilidad a la diabetes de tipo 2 mediante la aplicacin de transcriptomica, genmica funcional y anlisis masivo de SNPs.
2003-2006
FIS
2002-2005
MCyT
76
Centro Univ. Autnoma de Barcelona Unitat de Bioqumica de Medicina
Ttulo Proyecto Efecto antiapopttico del PF 9601N y derivados en neuroblastomas humanos tipo SH-SY5Y tratados con MPP+ como modelo de toxicidad dopaminrgica: implicaciones teraputicas en la enfermedad de Parkinson. Estudio de la va de la sealizacin de CD44 e identificacin de genes clave en los procesos de adhesin, migracin e invasin de melanoma.
Duracin
Financiacin
2003
MCyT
Univ. Autnoma de Barcelona Facultad de Veterinaria Institut de Biotecnologia i de Biomedicina (IIB-UAB) Unitat de Biologia Molecular Institut de Biotecnologia i de Biomedicina (IIB-UAB) Unitat de Citogentica
2003
MCyT
Lnea de investigacin: Bioinformtica: Disseny dalgorismes i programes per a lanlisi i predicci destructura/funci de protenes. Aplicaci de la Bioinformtica a lidentificaci de dianes teraputiques, vacunals i per a kits de diagnstic.
Lnea de investigacin: citogentica molecular de tumors slids: Hibridaci Genmica Comparada en microarrays de DNA.
Centre de Biotecnologia Animal i de Terpia Gnica (CBATEG-UAB)
Unitat de Producci dAnimals Transgnics: Especialitzada en el disseny i obtenci danimals transgnics per microinjecci de DNA a embrions i danimals knock-out totals o especfics de teixit, en criopreservaci dembrions de ratol, desperma i fecundaci in vitro i en rederiva danimals.
Univ. Pompeu Fabra Dpto. Cincies Experimentals i de la Salut Unidad de Gentica Univ. Pompeu Fabra Dpto. Cincies Experimentals i de la Salut Unitat de Neurofarmacologia Univ. Pompeu Fabra Dpto. Cincies Experimentals i de la Salut Unitat de Senyalitzaci Cellular Instituto Municipal de Investigacin Mdica (IMIM-Univ. Pompeu Fabra).
Etude molculaire du Syndrome de Williams: identification des gnes laide de ltablissement de corrlations clinique-molculaires et de la cration dun modle de souris.
2003-2004
Fondation Jerme Lejeune
Lnea de investigacin: bases neuroqumicas y neuroanatmicas de los fenmenos de dependencia de opiceos y cannabinoides, animales modificados genticamente, en particular ratones knock-out.
Lnea de investigacin: identification of the molecular targets of oestrogens and the mechanisms of action used by these oestrogenic compounds.
Lnea de investigacin: molecular targets of snail involved in epithelial to mesenchymal transition of tumor cells.
Univ. de Lleida Facultat de Medicina
Lnies de recerca: desenvolupament del sistema nervis, mort neuronal, excitotoxicitat, models desclerosi lateral amiotrfica.
Univ. de Girona Facultat de Cincies Grupo de Bioqumica del Cncer
Lnea de investigacin: desarrollo de molculas antitumorales que vayan contra dianas especficas de las clulas cancerosas.
77
Centro
Ttulo Proyecto La deficiencia de perlecan implica diversas patologas. Caracterizacin molecular y generacin de ratones condicionalmente deficientes en perlecan mediante la tcnica CRE/LOXP. Enfermedad de Parkinson: modelos animales e integracin de datos genmicos y protemicos. Plataforma bioinformtica NEUROGENMICA. Subproyecto del proyecto coordinado denominado Caracterizacin genmica y protemica de la enfermedad de Parkinson. Anlisis funcional y bioinformtico de modelos de neurodegeneracin parkinsoniana. Genmica Funcional y terapia celular en la enfermedad de Parkinson. Mecanismos moleculares de muerte neuronal en modelos animales y patologa humana.
Duracin
Financiacin
2003
MCyT
2004-2006
MCyT
Univ. de Valencia
2003-2006
MCyT
2004-2005
GV
2003-2005
FIS
2003-2005
FIS
Univ. de Zaragoza Fac. de Veterinaria Dpto. de Bioqumica y Biologa Molecular y Celular Univ. de Zaragoza Fac. de Veterinaria Lab. de Neurobiologa. Dpto. de Anatoma, Embriologa y Gentica Animal
Desarrollo de modelos animales de enfermedades provocadas por alteraciones del DNA mitocondrial.
2000-2003
MCyT
Enfermedad de Alzheimer: desarrollo de nuevos modelos animales.
2003
MCyT
Univ. Zaragoza Fac. de Veterinaria Lab. Gentica Bioqumica
Lnea de investigacin: creacin de animales transgnicos, para modelos de enfermedades humanas (en desarrollo). Mecanismos moleculares de la neuropatologa asociada a scrapie: anlisis de la apoptosis neuronal y de perfiles de expresin gnica a nivel genmico (diferencial display).
2003-2005
Univ. Salamanca Instituto de Neurociencias de Castilla y Len
Clonacin y caracterizacin de receptores opioides en Zebrafish II.
2000-2002
JCYL
Univ. de Vigo Facultad de Biologa Grupo de Investigacin Inmunoloxa
Lnea de investigacin: anticuerpos monoclonales humanos obtenidos a partir de ratones transgnicos portadores de genes de inmunoglobulinas humanas. Lnea de investigacin: desarrollo de ratones knockout.
Univ. de Vigo Facultad de Biologa Grupo de Investigacin Fisioloxia Endocrina e Neurofisioloxia
Lnea de investigacin: hormona de Crecemento (GH). Diabetes e obesidade. Modelos animais e humanos. GHRH, GRF, GHRP-6.
78
Centro Univ. de Oviedo IUOPA - Instituto Universitario de Oncologa Principado de Asturias Unidad Investigacin en Oncologa de Cabeza y Cuello
Ttulo Proyecto Modelo de progresin en el cncer de laringe. Estudio por hibridacin genmica comparativa. Genmica funcional aplicada al diagnstico y tratamiento de las neoplasias linfoides. Modelo de progresin en el cncer de laringe. Estudio por hibridacin genmica comparativa. Perfiles de expresin gnica, mecanismos moleculares de la regulacin e interacciones proteicas de las anexinas en modelos de diferenciacin celular. Diseo de modelos experimentales para el estudio de la farmacologa del dolor neoplsico. GPBP en la patognesis de la fibrosis tisular asociada a procesos autoinmunes: ensayos teraputicos en modelos murinos. Evaluacin in vivo e in vitro del efecto de nuevos inmunomoduladores sobre la funcin TH1/TH2 y el desarrollo de autoinmunidad.
Duracin 2002-2005
Financiacin FIS
2002-2004
FIS
2002-2005
FIS
Univ. de Oviedo Facultad de Medicina Dpto. de Bioqumica y Biologa Molecular
2002-2005
MCyT
2001-2002
FIS
Univ. de Cantabria Facultad de Medicina Grupo de Inmunopatologa Dpto. de Biologa Molecular
2003
MCyT
2000-2001
CYCIT
Univ. de Cantabria Facultad de Medicina. Grupo de Biologa Molecular de las Apolipoproteinas y la Aterosclerosis Dpto. de Biologa Molecular
Lnea de investigacin: estudio de la expresin del gen de la apolipoprotena E mediante ratones knock out como cultivos celulares.
Univ. de Cantabria Facultad de Medicina. Lab. de Neurobiologa del Desarrollo Dpto. de Fisiologa y Farmacologa
Estudio de los efectos de estrategias teraputicas farmacolgicas y conductuales sobre las alteraciones cognitivas y neuroqumicas observadas en el ratn TS65DN, un modelo murino de sndrome de down. Study of the therapeutic effects of acetylcholinesterase inhibitors and GVS-1 11 on the cognitive deficits, neurogenesis and apoptosis of TS65DN mice, a model of down syndrome. Proyecto bipo-med identificacin de marcadores moleculares y dianas teraputicas para los trastornos bipolares. Identificacin de marcadores moleculares y dianas teraputicas para la depresin mayor, basada en la tecnologa DNA - chip. Estudio en cerebro humano postmortem.
2002
MCyT
2004
Univ. de Cantabria Facultad de Medicina. Grupo de Receptores de Neurotransmisores Dpto. de Fisiologa y Farmacologa
2004
2004
Univ. Complutense de Madrid Facultad de Ciencias Biolgicas Dpto. de Biologa Molecular y Bioqumica I
Accin antitumoral de los cannabinoides: anlisis de la expresin gnica en gliomas mediante arrays de DNA.
2005-2006
CAM
79
Centro Univ. Complutense de Madrid Facultad de Medicina Dpto. de Bioqumica y Biologa Molecular III Univ. Complutense de Madrid Facultad de Medicina Dpto. de Farmacologa Univ. Complutense de Madrid Facultad de Medicina Dpto. de Bioqumica y Biologa Molecular IV Univ. de Alcal Facultad de Medicina Dpto. de Anatoma y Embriologa Humana
Ttulo Proyecto Lnea de investigacin: regulacin de la expresin del gen del receptor de insulina por distintas hormonas: mineralcorticoides, glucocorticoides, vitamina D y catecolaminas. Utilizacin de modelos in vivo e in vitro. Lnea de investigacin: farmacologa cardiovascular: estudios con animales diabticos, animales hipercolesterolmicos y Cultivos celulares de fibra vascular.
Duracin
Financiacin
Inhibidores de proteasas en Plasmodium falciparum para la identificacin de nuevas dianas teraputicas en malaria.
2003
MCyT
Receptor del pptido intestinal y vasoactivo (VIP) como posibles dianas de agentes citotxicos en cncer de prstata.
2002
Estudio del papel de las quimioquinas y sus receptores en el dao renal en un modelo de isquemia/reperfusin. Univ. de Alcal Facultad de Medicina Dpto. de Anatoma Patolgica Molculas de adhesin y enfermedad renal: evidencia funcional de las integrinas beta 1 activadas en un modelo de nefritis autoinmune. Quimioquinas y receptores de quimioquinas como potenciales dianas teraputicas en la nefritis experimental autoinmune. Papel de la protena relacionada con la parathormona en los mecanismos de lesin y reparacin renal. Estudio coordinado integral en nefropatas humanas y en modelos experimentales. Caracterizacin molecular, celular y electrofisiolgica de la degeneracin retiniana en ratones RD y de su posible atenuacin por (PRO) insulina. La cirrosis heptica como enfermedad inflamatoria. Anlisis de los mecanismos patognicos leucocitarios en modelos experimentales y en enfermedad humana. Anlisis de los perfiles de expresin de genes y protenas en ratones MAT1A KNOCKOUT: identificacin de marcadores moleculares de esteatohepatitis no alcohlica (NASH). Posible papel etiopatognico de la expresin disminuida del intercambiador de aciones AE2 en la cirrosis biliar primaria: produccin de ratones knock-out y bsqueda de alteraciones hepticas compatibles con la enfermedad.
2002-2004
CAM
2001-2004
FIS
2001-2004
MCyT
2001-2002
Univ. de Alcal Facultad de Medicina Dpto. de Fisiologa
2001-2004
MCyT
Univ. de Alcal Facultad de Medicina Dpto. Medicina
2003
MCyT
2001-2004
MCyT
Univ. de Navarra Clnica Universitaria de Navarra Dpto. de Medicina Interna
2001-2003
FIS
80
Centro Univ. de Navarra Clnica Universitaria de Navarra Dpto. de Medicina Interna
Ttulo Proyecto Utilidad de la transferencia gnica del gen de la timidina kinasa, del gen de la interleucina-12 y de clulas dendrticas transducidas con el gen de la interleucina-12 en el tratamiento de cultivos celulares y modelos animales singnicos de cncer de pulmn. Valor patogentico de la exposicin de c-kit en el tumor de Ewing. Una posible diana teraputica. Caracterizacin de la expresin gnica del carcinoma renal mediante anlisis protemico. Identificacin de nuevas protenas potencialmente tiles en el diagnstico, pronstico y tratamiento. Caracterizacin de la expresin gnica del hapatocarcinoma mediante anlisis protemico. Identificacin de protenas potencialmente tiles de diagnstico y pronstico.
Duracin
Financiacin
2001-2003
Fundacin Echbano
2002-2005
FIS
Univ. de Navarra Clnica Universitaria de Navarra Dpto. de Histologa y Anatoma Patolgica
2002-2005
FIS
2002-2005
GN
Univ. de Navarra Clnica Universitaria de Navarra Dpto. de Cardiologa y Ciruga Cardiovascular
Functional proteomics of heart failure in arterial hypertensin.
2002-2004
Empresa privada
Balance angiognico en melanoma humano. Estudio in vivo e in vitro de factores implicados en la coagulacin, metaloproteinasas e inhibidores, endostatina, angiogenina y PDGF. Valoracin de la eficacia del tratamiento con antitrombina III en un modelo de melanoma animal. Univ. de Navarra Clnica Universitaria de Navarra Dpto. Dermatologa Papel de la NADPH oxidasa, del xido ntrico y del NF-KB en la acantolisis del pnfigo vulgar en un modelo murino. Estudio de la conformacin estructural de la antitrombina plasmtica en pacientes con melanoma. Efecto antiangiognico de la antitrombina latente en un modelo murino de melanoma. Estudio del patrn diferencial de expresin gnica en tejido adiposo de pacientes obesos e individuos con normopeso mediante la tcnica de microarrays. Papel de la leptina en la regeneracin heptica. Estudio de la interaccin entre leptina y xido ntrico mediante la generacin de un ratn doble knockout ob/ob-INOS/.
2001-2002
GN
2002-2005
FIS
2002-2004
FUNA
Univ. de Navarra Clnica Universitaria de Navarra Dpto. Endocrinologa y Nutricin
2001-2002
GN
2004-2006
MCyT
Univ. de Navarra Clnica Universitaria de Navarra Dpto. Farmacia y Tecnologa Farmacutica Univ. de Navarra Clnica Universitaria de Navarra Dpto. de Hematologa y Hemoterapia
Diseo de vectores polimricos para la liberacin controlada de factores neurotrficos tipo GDNF en modelos animales de enfermedad de Parkinson. Perspectivas teraputicas.
2004-2006
GN
Anlisis protemico y funcional de las alteraciones inducidas por las protenas p210 y p190 dependientes del oncogen VER-ABL en la regulacin del ciclo celular y su papel en el mecanismo de transformacin.
2002-2004
GN
81
Centro
Ttulo Proyecto Animales transgnicos como modelos experimentales de las enfermedades de Parkinson y Alzheimer. Ratones transgnicos para UCH-L1 humana mutada (Ile93Met) como modelo in vivo de enfermedades neurodegenerativas humanas por cuerpos de Lewy. Efecto del tratamiento con trifusal en la prevencin/aclaracin del depsito de material amiloide humano como modelo in vivo de enfermedad de Alzheimer y neurodegeneracin.
Duracin
Financiacin Fundacin Echbano
2001-2003
2001-2004
GN
2002-2005
Empresa privada
Univ. de Navarra Clnica Universitaria de Navarra Dpto. de Neurologa y Neurociruga
Ratones transgnicos como modelos experimentales de patologas neurodegenerativas humanas. Coexpresin de las protenas precursoras del amiloide y tau humanas mutadas en el cerebro de ratones transgnicos como modelo in vivo de enfermedad de Alzheimer y neurodegeneracin. Identificacin, caracterizacin y determinacin ontolgica de nuevas dianas moleculares de la S-adenosilmetionina (AdoMet) mediante aproximaciones de Genmica Estructural. Ratones transgnicos como modelos experimentales de patologas neurodegenerativas humanas: enfermedad de Parkinson y demencia con cuerpos de Lewy.
2001
MCyT
MCyT
2003-2004
GN
2000
MCyT
Centro de Investigacin Mdica Aplicada (CIMA - Univ. de Navarra) rea de Oncologa
Significado de la sobreexpresin del gen EVI1 y diseo de nuevas estrategias teraputicas mediante siRNA (short interfering RNA) en pacientes con leucemia mieloide aguda.
2004
Fundacin Cientfica de la aecc. GN
Anlisis de la expresin vascular de la metaloproteinasa-10 (MMP-10) en un modelo murino de aterosclerosis. Centro de Investigacin Mdica Aplicada (CIMA - Univ. de Navarra) rea de Fisiopatologa Cardiovascular Anlisis de la expresin vascular de la metaloproteinasa-10 (MMP-10) en la aterosclerosis humana y murina. Implicacin del PPAR alfa en la transicin de la hipertrofia ventricular izquierda a la insuficiencia cardaca en la cardiopata hipertensiva humana y experimental. Protemica funcional del miocardio en la cardiopata hipertensiva. Estudio clnico y experimental. Centro de Investigacin Mdica Aplicada (CIMA - Univ. de Navarra) rea de Neurociencias
2004
SEA
2004
SEC
2004
Pfizer
2003
Pfizer
Terapia celular mediante clulas madre adultas en modelos experimentales de Enfermedad de Parkinson.
2003
GN
82
Centro
Ttulo Proyecto Caracterizacin funcional de la prohibitina. Implicacin en el desarrollo de enfermedades hepticas y hepatocarcinoma mediante tcnicas de protemica. Anlisis de ratones knock-out para el gen de cardiotrofina-1 en el desarrollo del hgado y en modelos de dao heptico.
Duracin
Financiacin
2004
MEC
2004-2005
GN
Centro de Investigacin Mdica Aplicada (CIMA - Univ. de Navarra) rea de Terapia Gnica y Hepatologa
Anticuerpos intracelulares frente a la protena del core del virus de la hepatitis C (VHC) como estrategia para el tratamiento de la hepatitis crnica C. Importancia de la metionina adenosiltransferasa en la iniciacin de la lesin heptica: estudio de un modelo de ratn knockout del gen MAT1A. Desarrollo y anlisis de la inhibicin especfica de la expresin gnica basada en snRNAs U1 modificados. Estudio del mecanismo de accin de U1 SNRNP y desarrollo de U1 SNRNPS modificados para la inhibicin de la expresin gnica.
2002-2005
FIS
2001-2004
FIS
2003-2006
MCyT
2000-2003
MCyT
Univ. Pas Vasco Facultad de Medicina Dpto. Biologa Celular y Ciencias Morfolgicas Univ. Pas Vasco Facultad de Farmacia Dpto. de Neurociencias Univ. de Santiago de Compostela Facultad de Medicina y Odontologa Dpto. de Ciencias Morfolgicas
Caracterizacin del microambiente pro-metastsico de la inflamacin y la angiognesis en modelos preclnicos de cncer diseminado.
2001-2003
UPV
Implicaciones de la muerte oligodendroglial excitotoxica en la esclerosis mltiple: una estrategia experimental para el descubrimiento de nuevas dianas teraputicas.
2001-2003
UPV
Potenciales sistemas de neuroproteccin en modelos experimentales de enfermedad de Parkinson y en neuroesferas de clulas precursoras pluripotenciales.
2003
MCyT
Univ. de Santiago de Compostela Facultad de Medicina y Odontologa Dpto. de Fisioloxa
Nuevas estrategias teraputicas en enfermedades respiratorias. Bsqueda de efectos teraputicos mediante la activacin de fosfodiesterasas. Estudio de la funcin supresora de tumores de p130rb2 y p107 en modelos murinos. Lnea de investigacin: mecanismos inflamatorios en la hipertensin arterial: modelo experimental en rata hipertensa.
2003
MCyT
2003
MCyT
Univ. de Santiago de Compostela Facultad de Medicina y Odontologa Dpto. de Medicina
Lnea de investigacin: penumbra isqumica: modelos experimentales. Lnea de investigacin: enfermedades genticas del rin. Poliquistosis Renal. Gen PKD1. Gen de la uromodulina. Lnea de investigacin: identificacin y validacin de dianas teraputicas en enfermedades reumticas.
83
Centro Univ. de Santiago de Compostela Facultad de Veterinaria Dpto. de Anatoma y Produccin Animal Univ. de Santiago de Compostela Complejo Hospitalario Universitario de Santiago Univ. da Corua Facultad de Ciencias Dpto. de Bioloxa Celular e Molecular Univ. da Corua Facultad de Informtica Dpto. de Tecnologas de la Informacin y las Comunicaciones Univ. da Corua Instituto de Ciencias de la Salud Unidad de Biologa del Desarrollo Univ. Castilla La Mancha Facultad de Qumicas/Centro Regional Investigaciones Biomdicas Univ. Alicante Facultad de Ciencias Dpto. de Biotecnologa
Ttulo Proyecto
Duracin
Financiacin
Envejecimiento cerebral en el perro. Un posible modelo natural de la enfermedad de Alzheimer.
2003
MCyT
Construccin de vectores y lneas celulares para el anlisis fenotpico de la infeccin por VIH.
2002
FIPSE
Sistema de determinacin de niveles de expresin gnica por microarray.
INBIOMED: plataforma de almacenamiento, integracin y anlisis de datos clnicos, genticos, epidemiolgicos e imgenes orientada a la investigacin sobre patologas.
2003
FIS
Marcadores moleculares de la patognesis de la cardiomiopata dilatada: estudio de la expresin gnica en el miocardio porcino y humano.
2001
MCyT
Nuevas dianas teraputicas en neuroproteccin: canales inicos y mecanismos antioxidantes.
2000
CICYT
Alteraciones celulares y moleculares en la retina de mamferos asociadas al Parkinson experimental y posible terapia. Diferenciacin celular y quimiorresistencia en cncer de colon. Identificacin de dianas moleculares y diseo de estrategias farmacolgicas. Caracterizacin y validacin teraputica de compuestos analgsicos y quimiosensibilizadores de extractos vegetales.
2003
MCyT
Univ. Miguel Hernndez Hospital Universitario Elche - Instituto Biologa Molecular y Celular
1999-2002
Aventis Pharma; MCyT
2003-2005
MEC
Univ. Miguel Hernndez Instituto de Neurociencias Univ. de Crdoba Facultad de Veterinaria Unidad Docente de Histologa y Anatoma Patolgica
Transcriptional regulation in synaptic plasticity, learning and memory under normal and pathological situations.
2004-2008
CE
Hormonodependencia de los carcinomas de mama caninos y felinos como modelo natural del carcinoma de mama humano.
1999-2002
MEC
84
Centro Univ. de Crdoba Facultad de Medicina Dpto. de Bioqumica y Biologa Molecular Univ. de Crdoba Facultad de Ciencias Dpto. de Biologa Celular, Fisiologa e Inmunologa Univ. de Len Facultad de Veterinaria Dpto. de Farmacologa y Toxicologa Univ. de Len Facultad de Biologa Dpto. de Bioqumica y Biologa Molecular
Ttulo Proyecto
Duracin
Financiacin
Lnea de investigacin: modelos experimentales de Alzheimer.
Lnea de investigacin: investigacin de los fenmenos de integracin neuroendocrina mediante clulas melanotropas (MSH) como modelo experimental. Estudios de aplicacin farmacolgica.
Bsqueda de dianas con potencial teraputico en el tratamiento de la criptosporidiosis.
2003
MCyT
Lnea de investigacin: purificacin y caracterizacin y localizacin de neurorreceptores de GABA A, dopamina y NMDA. Produccin de anticuerpos contra pptidos sintticos de sus subunidades. Estudio de la correlacin entre la evolucin clnica y pronstico, y la expresin de la p75 y TrkA en tumores de origen epitelial en humanos. Evaluacin terapetica del inhibidor de TrkA en tumores epiteliales.
Univ. Valladolid Facultad de Medicina Dpto. Anatoma y Radiologa
2001-2003
JCYL
Univ. Valladolid Facultad de Medicina Dpto. Bioqumica y Biologa Molecular y Fisiologa Univ. Valladolid Instituto de Biologa y Gentica Molecular (IBGM)
Nuevos modelos y estrategias para estudiar los quimiorreptores arteriales: preparacin in vitro de ratones modificados genticamente y aplicacin de microelectrodos sensibles a acetilcolina.
2001-2003
FIS
Nuevos blancos moleculares de drogas antiinflamatorias: modulacin farmacolgica de la funcin transcripcional de NFATI.
2003-2004
JCYL
Establecimiento de un modelo in vivo para el desarrollo de frmacos contra la enfermedad de Alzheimer. Identification of early markers of disease progression in a murine transgenic model of alzheimers disease. Caracterizacin molecular de cambios en el sistema GABArgico en el hipocampos de un ratn transgnico que expresa una mutacin APP. Cambios durante el envejecimiento en los sistemas GABArgico, colinrgico y glutamatrgico en modelos transgnicos de la enfermedad de alzheimer. Univ. de Sevilla Facultad de Farmacia Farmacologia Experimental y Farmacia Clnica. Dpto. de Farmacologa
2003-2005
MCyT
Univ. De Sevilla Facultad de Farmacia Dpto. Bioqumica, Bromatologa, Toxicologa y Medicina Legal
2003-2004
Aventis Pharma. RechercheDveloppement Aventis Pharma. RechercheDveloppement
2001-2003
2003-2005
MCyT
Lnea de investigacin: patognesis de la enfermedad inflamatoria intestinal y cncer colorrectal: mecanismos inmunoinflamatorios. Nuevas dianas teraputicas.
85
Centro Univ. de Sevilla Facultad de Biologa Grupo de Gentica Bacteriana. Dpto. de Gentica Univ. de Sevilla Facultad de Medicina Grupo de Expresin Gnica en Eucariontes. Dpto. de Gentica Universidad Pablo de Olavide Centro Andaluz de Biologa del Desarrollo Divisin de Neurociencias Univ. de Murcia Centro Regional de Hemodonacin de Murcia Univ. Extremadura Facultad de Medicina Dpto. de Farmacologa y Psiquiatra Univ. Granada Facultad de Farmacia Grupo de Comunicacin Intercelular Dpto. de Fisiologa Univ. Granada Facultad de Medicina Grupo de Inmunologa Microbiana Dpto. de Microbiologa U. Cdiz Servicio de Dermatologa. Hospital Universitario de Puerto Real Modelos cutneos de experimentacin de alergia, toxicologa y cancerologa Univ. Jan Grupo de Inmunobiologa Tumoral Dpto. de Ciencias de la Salud
Ttulo Proyecto Caracterizacin de nuevas dianas en el patgeno Salmonella enterica: anlisis gentico y molecular de funciones de virulencia en los regulones IgaARcsBC y Dam.
Duracin
Financiacin
2004
MCyT
Nuevas tcnicas de genmica funcional: anlisis mediante DNA-arrays de potenciales genes blanco de los immunosupresores en clulas linfoides y granulocticas.
2003-2005
FIS
Desarrollo de un modelo experimental de la enfermedad de Alzheimer en ratn.
Aventis-Pharma
Bsqueda de nuevos elementos genticos responsables de la malignizacin celular inducida por TGF-beta.
2003
MCyT
Modelling during drug development.
1998-2003
UE
Lnea de investigacin: estudios en modelos de Parkinson experimental, epilepsia experimental y en clnica peditrica.
Lnea de investigacin: modelos experimentales de inmunopatologa.
Lnea de investigacin: modelos de experimentacin en toxicologa y alergia cutnea.
Lnea de investigacin: modelos de experimentacin en oncologa cutnea y sus nuevas alternativas teraputicas.
Lnea de investigacin: estudio del proceso metastsico en modelos experimentales murinos.
86
Centro Univ. Mlaga Facultad de Ciencias Dpto. de Biologa Molecular y Bioqumica U. Mlaga Facultad de Ciencias Dpto. Bioqumica, Biologa Molecular y Qumica Orgnica
Ttulo Proyecto Lnea de investigacin: estudios a nivel molecular del metabolismo de aminas bigenas y de sus aplicaciones farmacolgicas potenciales. Aproximaciones genmicas, protemicas y bioinformticas.
Duracin
Financiacin
Anlisis gentico y funcional de la glutaminasa humana: terapia gnica basada en antisentidos de la enzima.
2003-2006
MCyT
Univ. Mlaga Facultad de Ciencias Dpto. de Biologa Celular
Alteraciones del epitelio ependimario como causa de hidrocefalia y procesos neurodegenerativos. Estudio en modelos animales y casos clnicos humanos. Estudio de la vulnerabilidad neuronal gabargica y su relacin con la inflamacin y el estrs de retculo en procesos neurodegenerativos asociados con la edad: envejecimiento y enfermedad de alzheimer. Papel del cido lisofosfatdico (LPA) en la neurognesis embrionaria y de adultos. Estudio de ratones mutantes para el receptor lpA1 aprendizaje y memoria. Lnea de investigacin: modelo experimental de hipertensin intraocular. Estudio inmunohistoqumico y ultraestructural de la degeneracin neuronal y su relacin con la microvascularizacin. Modificaciones en el transporte axoplstico.
Univ. Mlaga Facultad de Ciencias Dpto. de Biologa Animal
FIS
Univ. Mlaga Facultad de Medicina Dpto. de Histologa
Univ. Las Palmas de Gran Canaria Dpto. Bioqumica y Biologa Molecular, Fisiologa
COX-2, GTPasas Rho y STATs: su posible asociacin en tumorignesis y su estudio como posibles dianas teraputicas.
2002-2003
Lnea de investigacin: bases moleculares del cncer: estudio de las alteraciones de las vas de transduccin de seales y mecanismos de regulacin del ciclo celular que suceden como consecuencia de la actividad oncognica; nuevas dianas teraputicas y herramientas de diagnstico precoz. Regulacin gnica de la formacin de biofilms por Staphylococcos: identificacin de nuevas dianas para el tratamiento de infecciones persistentes sobre implantes. Desarrollo de un modelo animal de infeccin experimental y de nuevas estrategias para el tratamiento conservador de la infeccin asociada a dispositivos intravasculares. Accin antifibrtica del TNFalfa y fibrosis mediada por TGFbeta en arteria cartida de ratas espontneamente hipertensas normotensas.
FIS
2003-2005
MCYT
Univ. Cardenal Herrera-CEU
2003
Conselleria de Cincia i Tecnologa
2003-2004
87
Centro Centro Superior en Alta Tecnologa Cientfica (CSAT-FVIB) Lab. de Neurobiologa
Ttulo Proyecto
Duracin
Financiacin
Validacin teraputica y desarrollo de neuroprotectores de nueva generacin basados en trialquilglinas.
2002-2004
MCYT
Centro Superior en Alta Tecnologa Cientfica (CSAT-FVIB) Dpto. Inmunobiologa. Lab. de Patologa Autoinmune
Identificacin mediante qumica combinatoria de compuestos moduladores de la actividad de GPBP y utilizacin de los mismos con finalidad teraputica en modelos animales con lupus renal. GPBP en la patognesis de la fibrosis tisular asociada a procesos autoinmunes: ensayos teraputicos en modelos murinos.
2001-2004
CICYT
2004-2006
CICYT
Centro Superior en Alta Tecnologa Cientfica (CSAT-FVIB) Dpto. de Biologa Celular, Molecular y Gentica Lab. de Reconocimiento Molecular
Estudios de estructura-funcin de nuevas posibles dianas para la teraputica antimicrobiana: carbamato quinasa, acetilglutamatoquinasa y aspartoquinasa
2000-2003
DGESIC
Centro Superior en Alta Tecnologa Cientfica (CSAT-FVIB) Dpto. de Qumica Mdica. Lab. de Pptidos y Desarrollo de Ensayos
Caracterizacin de dianas moleculares para la regulacin de la apoptosis celular. Desarrollo de ensayos de alto rendimiento para la identificacin de moduladores con fines teraputicos en cncer y neurodegeneracin. Caracterizacin de dianas moleculares para la regulacin de la apoptosis celular. Desarrollo de ensayos de alto rendimiento para la identificacin de moduladores con fines teraputicos en cncer y neurodegeneracin. Inhibidores de CDK-2, caracterizacin de compuestos y protenas reguladoras. Lneas de investigacin: mecanismo de regulacin de la transcitosis por el retromero. Identificacin de dianas del retrmero y determinacin de su funcin. Diseo de frmacos que acten sobre las dianas del retrmero. Lneas de investigacin: identificacin de nuevas dianas farmacolgicas para su aplicacin dentro de los Programas de Cribado y Desarrollo Preclnico. Estudio de los mecanismos moleculares responsables de la accin antitumoral de compuestos, con un especial nfasis en dilucidar su potencial de activacin de las cascadas apoptticas (muerte programada) de la clula tumoral, sobre los procesos de proliferacin celular y en el proceso de vascularizacin del tumor (angiognesis).
2001-2003
Fundacin SALVAT Inquifarma
2002-2004
MCYT
2003
Merck Farma y Qumica SA
Centro Superior en Alta Tecnologa Cientfica (CSAT-FVIB) Programa de Genmica y Farmacoprotemica. Identificacin de Dianas Moleculares
88
Centro Centro Superior en Alta Tecnologa Cientfica (CSAT-FVIB) Programa de Genmica y Farmacoprotemica. Identificacin de Dianas Moleculares Institut de Recerca Oncolgica (IRO) Centro de Gentica Mdica y Molecular Fundacin Reina Mercedes para la Investigacin Sanitaria Hospital Universitario Virgen del Roco Fundacin Parque Cientfico de Barcelona CRG - Centre de Regulaci Genmica Genes and disease Instituto Canario de Investigacin del Cncer (ICIC) Seccin de Oncologa Molecular y Biologa del Cncer Instituto Canario de Investigacin del Cncer (ICIC) Seccin de Nuevas terapias para el cncer
Ttulo Proyecto Lneas de Investigacin: anlisis in vivo de la inflamacin y carcinognesis epiteliales: interferencia biolgica entre el receptor de glucocorticoides y NFkB. Mecanismos moleculares que median la accin de las hormonas glucocorticoides: identificacin de dianas teraputicas. Modelos animales transgnicos para el estudio de malformaciones epiteliales. Bases moleculares del sndrome humano Displasia Ectodrmica. Lnea de investigacin: estudio de la fisiopatologa de la cistinuria en el ratn knockout de Slc7a9. Lnea de investigacin: estudio de la funcin de los HAT mediante animales knockout.
Duracin
Financiacin
Caracterizacin del mecanismo sensor de glucosa en el cuerpo carotideo de rata y su modificacin en condiciones de hiperglucemia crnica.
2003
MCyT
Lnea de investigacin: Murine models of disease. Lnea de investigacin: Neurobehavioral phenotyping of mouse models of disease.
Aplicacin de la tecnologa de BIOCHIPS al estudio de los mecanismos moleculares de la hormona de crecimiento Identificacin de perfiles de expresin gnica inducidos por hormonas.
2003-2003
FULP
Micrometstasis seas de cncer de mama. Deteccin de dianas teraputicas en clulas tumorales presentes en sangre y mdula sea de pacientes de cncer de mama.
2002-2003
ACAETCA
Anlisis fenotpico y protemico de la inhibicin especfica de NF-KB en clulas malignas: implicaciones teraputicas. Papel fisiopatolgico de los eicosanoides derivados de la 5-lipooxigenasa y la ciclooxigenasa-2 en la inflamacin y fibrosis heptica. Estudios en ratones modificados genticamente. Dianas metablicas y moleculares del efecto del tungstato sdico sobre la prdida de peso en la obesidad.
2003
MCYT
Hospital Clnico y Universitario de Barcelona
2003
MCYT
2003
MCYT
89
Centro Hospital Univ. Vall dHebron Centre dInvestigacions en Bioquimica i Biologia Molecular (CIBBIM) Fundaci irsiCaixa. Hospital Universitari Germans Trias i Pujol Hospital La Fe Centro de Investigacin Unidad Hepatologa Experimental
Ttulo Proyecto
Duracin
Financiacin
Lnea de investigacin: Molecular profiling of target genes in tumors of the mutator phenotype.
Interferencia de RNA: aplicacin en la bsqueda de nuevas dianas antivirales.
2002
FIPSE
Desarrollo de un modelo hepatocelular humano diferenciado para estudios de metabolismo y potencial inductor de nuevos frmacos.
2003
MCYT
Hospital Clnico Universitario Valencia
Genmica funcional del linfoma Malt con un nuevo reordenamiento del oncogn Malt1: implicaciones como diana teraputica potencial. Patrn de expresin gnica mediante microarrays en las hiperlipemias genticas. Red temtica de investigacin cooperativa Estudio gentico, metablico, clnico, teraputico y epidemiolgico de las hiperlipemias hereditarias genticas en Espaa. Seleccin de oligonucletidos (Aptmeros) capaces de interaccionar de forma especfica con protenas reguladoras del proceso de apoptosis. Anlisis de la capacidad de los aptmeros seleccionados de modular la actividad de estas protenas en enfermedades neurodegenerativas. Seleccin de aptmeros frente a protenas especficas que intervienen en la regulacin de la apoptsis durante la infeccin por Leishmania infantum. Cardiomiopata hipertrfica familiar: caracterizacin de las mutaciones asociadas y desarrollo de un modelo experimental para el anlisis funcional de los genes mutados.
2004
Fundacin La Caixa
2003-2005
FIS
Hospital Ramn y Cajal
2002-2004
FIS
2003-2005
FIS
Hospital Universitario La Paz
CAM
Hospital Gregorio Maran Lab. de Biologa Celular
Mapas protemicos de leucocitos polimorfonucleares neutrfilos (PMNS). Modelos animal y humano.
Hospital Doce de Octubre
Papel del receptor cannabinoide CB1 en modelos animales de enfermedad de Parkinson y estudios de la eficacia y complicaciones del tratamiento con I-DOPA o agonistas dopaminrgicos en ratones desprovistos del gen del receptor cannabinoide CB1
2003
Fundacin La Caixa
Hospital General Universitario de Elche (HGUE) Grupo de Oncologa Molecular Unidad de Investigacin
Diferenciacin celular y quimiorresistencia en cncer de colon. Identificacin de dianas moleculares y diseo de estrategias farmacolgicas.
1999-2002
CICYT
90
Centro
Titulo Proyecto Modelo murino de infeccin pulmonar crnica por Pseudomonas aeruginosa: efecto de la hipermutacin sobre la adaptacin, virulencia y resistencia a antibiticos
Duracin
Financiacin
Hospital Son Dureta
2003
MCYT
Hospital Universitario Ntra. Sra. de Candelaria Fundacin privada Instituto de Investigacin del SIDA-Caixa
Bsqueda de nuevas dianas contra las infecciones causadas por estafilococos.
2000-2006
PDCAN
Inhibicin de la replicacin del VIH mediada por RNAs interferentes.
2003
MCYT
Owl Genomics
Diagnstico molecular y dianas teraputicas de la esteatohepatitis. Inhibidores de GSK-3. Una nueva estrategia teraputica para la enfermedad de Alzheimer y otros procesos neurodegenerativos. Identificacin de marcadores moleculares y dianas teraputicas en cncer de vejiga, empleando herramientas de protemica.
IMADE
Neuropharma
Proteomika SL
Fig. 29. Proyectos de I+D espaoles en validacin de dianas. Fuente: elaboracin propia. Acrnimos PN, Plan Nacional; FIS, Fondo de Investigaciones Sanitarias; MCyT, Ministerio de Ciencia y Tecnologa; CAM, Comunidad de Madrid; DGESI, MEyC, Ministerio de Educacin y Cultura; FRA, Fundacin Ramn Areces; CICYT, Comisin Interministerial de Ciencia y Tecnologa; UAB, Universidad Autnoma de Barcelona; UE, Unin Europea; PGI y DT, Plan Gallego de Investigacin y Desarrollo Tecnolgico; DGES, Direccin General de Enseanza Superior; FCRG, Fundacin Centro de Regulacin Genmic; CSIC, Consejo Superior de Investigaciones Cientficas; SEA, Sociedad Espaola de Arteriosclerosis; GV, Gobierno Vasco; MTAS, Ministerio de Trabajo y Asuntos Sociales; ACM, Asociacin de Celacos de Madrid; FIPSE, Fundacin para la Investigacin y la Prevencin del Sida; MMA, Mutua Madrilea Automovilista; MSC, Ministerio de Sanidad y Consumo; JCYL, Junta de Castilla y Len; GN, Gobierno de Navarra; SEC, Sociedad Espaola de Cardiologa; IMADE, Instituto Madrileo de Desarrollo.
91
Anexo II: Empresas internacionales en validacin de dianas

Empresa Productos Servicios Anticuerpos (XenoMouse XenoMax) Actividad Desarrollo de anticuerpos teraputicos principalmente frente al cncer Desarrollo de tratamientos basados en ARNi para Parkinson, degeneracin macular, VRS y lesin medular Anlisis de la expresin gnica (eXpress Profiling, Signature Discovery) Colaboraciones Lexicon Genetics Inc., Pfizer, Amgen, Ambit Biosciences, ScheringPlough, Celltech
Abgenix www.abgenix.com
Microarrays de tejidos
Alnylam Pharmaceuticals www.alnylam.com
Reactivos para siRNA
Merck
Althea Technologies www.altheatech.com
ARNsi para validar dianas
Servicios de apoyo en las diferentes fases de la I+D farmacutica
Expression Analysis, Inc.
Ambion www.ambion.com
Kits fabricacin de ARNsi Vectores de expresin de ARNsi (pSilencer 5.1) Reactivos ARNsi (Silencer) Microarrays
Proveedor de productos de biologa molecular basados en ARN
Cenix BioScience, Applied Biosystems, Caliper Technologies Corp., Sigma Aldrich Corp., Qiagen
Amgen www.amgen.com
Validacin de dianas mediante microarrays, protemica, ARNi
Desarrollo de frmacos y anticuerpos teraputicos frente a cncer, inflamacin, enfermedades metablicas, neurologa y hematologa Productos de biologa molecular dirigidos a investigacin bsica, farmacutica, y tests estandarizados
Abgenix, ISIS Pharmaceuticals, Cambridge Antibody Technology
Applied Biosystems www.appliedbiosyste ms.com
Kits para la sntesis de PNAs
Anlisis de la expresin gnica (TaqMan, arrays, LS*LIMS)
Myriad genetics, Ambion
Archemix www.archemix.com
Aptmeros (SELEX) Ribozimas (Riboreporter)
Aptmeros teraputicos frente a enfermedades crnicas y agudas
sirna Therapeutics
Ardais www.ardais.com
Arrays de tejidos (Ardais tissue arrays) Tejidos humanos
Proveedor de tejidos humanos y productos relacionados para investigacin farmacutica
Aventis, Xantos biomedicine, Astrazeneca, Bristol Myers Squibb, Affymetrix, Abgenix, Curagen Merck, Bayer AG, Sanofi-Aventis, Biovitrum, EVOTEC Neurosciences, Regeneron Pharmaceuticals, Schering AG, Boehringer Ingelheim, Aventis, Benitec
Artemis Pharmaceuticals www.artemispharmaceuticals.de
Ratones manipulados (ArteMice CONDITIONAL, ArteMice CONSTITUTIVE, ArteMiceHUMANIZED, ArteMice RNAi)
Servicios de generacin de ratones trangnicos y herramientas relacionadas
92
Empresa
Productos
Servicios
Actividad
Colaboraciones Aventis, Schering, ISIS Pharmac., MetaGen Pharmac., Byk Gulden, Astrazeneca, Kinetek Pharma, Novo Nordisc, Arena Pharma., Phogen ltd., Serono, Axys
Atugen www.atugen.com
GeneBloc ARNsi Vectores Reactivos de administracin
Diseo, seleccin y sntesis de antisentidos y reactivos a la carta
Desarrollo de ARNi teraputicos en oncologa y enfermedades hepticas
Aviva Biosciences Corporation www.avivabio.com
Microarrays de clulas
Productos y servicios dirigidos al descubrimiento de frmacos Desarrollo de nuevas terapias basadas en ARNsi y ddARNsi Desarrollo de nuevos tratamientos mediante su plataforma de farmacologa de sistemas Proveedor de sistemas de anlisis de interacciones entre protenas
Axon Instruments
Benitec www.benitec.com.au
Tecnologa propia de silenciamiento de ARNi (ddRNAi)
Acuerdos de investigacin
Artemis Pharmaceuticals, Promega AstraZeneca, GlaxoSmithKline, Novartis, DiaDexus, Boston Univ. School of Medicine
Beyond Genomics www.beyondgenomics .com
Validacin basada en protemica, genmica, metabolmica y software
Biacore www.biacore.com
Microarrays de estudio de interacciones entre protenas Kits antisentido prediseado Antisentidos a la carta Vectores para validar dianas del sistema nervioso (NeuroVEX) Software para identificacin y validacin (PharmaCarta, Biopendium, Chematica) Anticuerpos monoclonales para validacin
Biognostik www.biognostik.com
Servicios de diseo de antisentidos (R.A.D.A.R.)
Fabricante de kits de anlisis de la funcin de protenas
Promega, Tranzyme Inc., Antisense Pharma Merck & Co Inc., Astrazeneca, GlaxoSmithKline, Aventis Pharma, Wyeth
Biovex www.biovex.com
Desarrollo de vacunas para prevenir y tratar cncer y enfermedades infecciosas crnicas
Inpharmatica www.inpharmatica.co. uk
Bioinformtica aplicada al descubrimiento de nuevas dianas teraputicas y nuevos tratamientos Descubrimiento y desarrollo de anticuerpos monoclonales para terapia
Galapagos, Novartis, Serono S.A, Chiron Corp., Genentech
Cambridge Antibody Technology plc www.cambridgeantibo dy.com
Abbott, Lonza Biologics , Amgen , Merck, Pfizer, Chugai, Wyeth-Research Seattle Genetics Inc., Merck, Pfizer, BristolMyers, Genzyme, Pharmacia, Immunex, Oxagen, Seattle Genetics, ISIS Pharm., Somalogic, Aventis, Maxim Pharm., Abbott Laboratories, Seattle Genetics
Celera Genomics Corporation www.celera.com
Plataforma bioinformtica online (Celera Discovery System)
Desarrollo de nuevos tratamientos frente al cncer, enfermedades autoinmunes e inflamatorias
93
Empresa
Productos
Servicios
Actividad
Colaboraciones Becton Dickinson and Co., Norak Biosciences Inc., Wyeth-Ayerst Lab., Serono S.A., Discovery Partners International Inc., Boehringer Ingelheim, Abgenix, AstraZeneca, Aclara BioSciences, Merck, Carl Zeiss Jena.
Cellomics www.cellomics.com
Microarrays de clulas e instrumental (ArrayScan, KineticScan, CellSelect)
Plataforma de screening y anlisis de clulas a gran escala
Celltech www.celltechgroup. com
Anticuerpos monoclonales (Fab, SLAM)
Desarrollo de frmacos y anticuerpos monoclonales frente a enfermedades del sistema nervioso, enfermedades inmunes y cncer Servicios de investigacin basados en ARNi aplicado en clulas humanas, de Drosophila y C. elegans Herramientas y servicios de investigacin en protemica orientada al desarrollo de nuevos frmacos Genmica para desarrollo de nuevos frmacos, protenas y anticuerpos teraputicos en cncer, enfermedades inflamatorias y metablicas Desarrollo de agentes teraputicos de ADN
Atugen, Abgenix
Cenix Bioscience www.cenixbioscience.com
ARN para validacin a gran escala (HT-RNAi)
Ambion, Alnylam, Bayer, Schering
Ciphergen Biosystems www.ciphergen.com
Arrays de protenas (ProteinChip) Software
MediGene AG
Curagen Corporation www.curagen.com
Microarrays (CuraChip) y anlisis de interaccin de protenas
Sequenom, GlaxoSmithKline, Roche, Bayer, Ardais, Abgenix, Seattle Genetics, Bayer, TopoTarget
Cytogenix www.cytogenix.com
Servicios de validacin con tecnologa ssDNA
Endovasc Ltd., Omnimmune Corp. BioXell SpA, CombinatoRx Inc., Oxagen Ltd., KS Biomedix Ltd., Sosei Co. Ltd., ProSkelia, BioXell Pfizer, GlaxoSmithKline, Merck, Hyseq Inc., Eli Lilly and Co., Lexicon Genetics Inc., Vertex, Schering-Plough, Roche Bioscience, Tularik Inc.
DanioLabs www.daniolabs.com
Modelos de pez cebra
Servicios de validacin con pez cebra
Desarrollo de frmacos para enfermedades neurolgicas, oftalmologa, osteoporosis
Deltagen www.deltagen.com
Bases de datos de funcin de genes de mamferos (Deltabase)
Ratones knock-out y transgnicos a la carta (DeltaOne)
Herramientas y servicios de validacin para el descubrimiento de frmacos
Develogen AG. www.develogen.com
Dianas validadas
Servicios de validacin de dianas
Desarrollo de nuevos frmacos frente a enfermedades metablicas
Evotec OAI, DoubleTwist Inc.
94
Empresa
Productos
Servicios Servicios de validacin con ARNi, modelos vivos, C. elegans (Function Factory) y bases de datos (Pheno Base)
Actividad Identificacin y validacin de dianas y compuestos qumicos para enfermedades metablicas y cardiovasculares
Colaboraciones
Degven www.devgen.com
Base de datos (Pheno Base)
Genentech, Metabolex, Sumitomo Pharm. Co.
Dharmacon www.dharmacon.com
Kits, RNAs a la carta, grupos de siRNA validados (siGENOME, siARRAY, SMARTpool)
Proveedor de productos relacionados con ARNi y ARNsi
Bayer, Odyssey Thera Inc., Exelixis Inc., Upstate Group Inc.
Discovery Genomics, Inc. www.discoverygenomic s.net/morphant.phtml
Morfolinos en pez cebra (Morphant)
Desarrollo de herramientas de terapia gnica para enfermedades de la sangre Colaboracin con empresas farmacuticas para acelerar el desarrollo de tratamientos
AngioGenetics AB, Sequitur Inc., Techne Corp.
Entelos www.entelos.com
Validacin mediante bioinformtica (PhysioLab)
N.V. Organon, Johnson & Johnson, Zen-Bio Inc., Bristol-Myers Squibb, Aventis, Bayer AG, AstraZeneca
Eurogentec www.eurogentec.com
Microarrays (GEArray) siRNA, LAN, PNAs a la carta Anticuerpos, pptidos Microarrays de protenas Plataforma de validacin GPRCs (modelos vivos, anticuerpos, microarrays, AequoScreen) Identificacin y validacin de dianas (ARNi, modelos de Drosophyla, C. elegans, raton y pez cebra) LNA Microarrays de protenas (AQ-Link) Diseo y sntesis de oligonucletidos (ACCESSarray 4000)
Proveedor de herramientas genmicas, protemicas y biolgicas
SuperArray Bioscience Corp., Epoch Biosciences Inc., Mosaic Technologies Inc.
Euroscreen www.euroscreen.be
Lneas celulares (AequoScreen)
Investigacin en receptores acoplados a protenas G y desarrollo de frmacos
Exelixis www.exelixis.com
Desarrollo de frmacos frente a cncer basados en genmica
GlaxoSmithKline plc., Bristol-Myers Squibb, Protein Design Labs Inc., Pharmacia Corp., Bayer, AVI BioPharma
Exiqon www.exiqon.com
Comercializacin de tecnologas propias mediante licencias y colaboraciones Desarrollo de nuevos oligonucletidos antisentido y ARNsi
Proligo LLC
ExpressOn BioSystems www.expresson.co.uk
AstraZeneca, Auvation, Sankyo Pharma Boehringer Ingelheim, GlaxoSmithKline, Celgene, Wyeth, BioFocus, Bayer, Procter & Gamble, Inpharmatica, Exelixis, Euroscreen, Pharmacia, Incyte Genomics, Vertex Pharm, UCB Pharma
Galpagos www.galapagosgenom ics.com
Bases de datos (SilenceSelect, FleXSelect)
Validacin mediante ARNi y cultivos celulares
Descubrimiento de frmacos frente a osteoporosis, artritis reumatoide, Alzheimer y asma
95
Empresa
Productos
Servicios
Actividad
Colaboraciones Aventis, Solvay S.A., Wyeth, Takeda Chemical, Daiichi Pharm.l Co. Ltd., Artesian, Morphochem, UCB Pharma, GlaxoSmithKline, PsychoGenics, AstraZeneca, Sankyo Co. Ltd., LG Chemical Ltd, Japan Tobacco Inc., Procter&Gamble
Gene Logic www.genelogic.com
Bases de datos y software (Bioexpress, Ascenta)
Validacin bajo contrato
Servicios de I+D dirigidos a empresas farmacuticas y biotecnolgicas
Genentech www.gene.com
Tecnologas antisentido Anticuerpos monoclonales
Descubrimiento, desarrollo, fabricacin y comercializacin de nuevos frmacos para oncologa e inmunologa basados en el conocimiento del genoma humano Proveedor de oligonucletidos tipo morfolino para investigacin
Lexicon Genetics, Phenomix, Inpharmatica, Devgen
Gene Tools www.gene-tools.com
Oligonucletidos antisentido (Morfolinos)
Open Biosystems Inc., Mermaid Pharm., AVI BioPharma Inc. Altana AG, Degussa AG, MWG Biotech AG, Schering AG, Novartis AG, Affymetrix, Schering, Bayer
Genedata www.genedata.com
Software (Genedata PhylosopherR, ExpressionistRPro)
Proveedor de software para el descubrimiento de frmacos
Genmab www.genmab.com
Anticuerpos monoclonales (HuMax)
Desarrollo de anticuerpos humanos para tratamiento de enfermedades autoinmunes, infecciosas y cncer Desarrollo de herramientas para validar dianas y comercializacin de dianas validadas Produccin de anticuerpos monoclonales y policlonales por inmunizacin gentica
Roche, Amgen, Medarex Inc.
Genomics Collaborative www.genomicsinc.com
Muestras de suero, ADN y tejidos (GCI Tissue Access)
Bases de datos y software (GCI Access)
Genovac www.genovac.com
Anticuerpos prediseados y a la carta
Purificacin, marcaje de anticuerpos
Adquirido por Aldevron LLC
Genoway www.genoway.com
Ratones y ratas transgnicas (Safe DNA Transgenesis, Quick Knock-in, RNAi Transgenesis) ARNi in vivo (SAFE in vivo RNAi) Identificacin y validacin (Antisentidos, ARNi, OptiSense)
Desarrollo de modelos genticamente modificados de ratn y rata
Sanofi-synthelabo, SynX Pharma Inc., Laboratoires Servier, Altana Pharma
Genta www.genta.com
Desarrollo y comercializacin de nuevos tratamientos para cncer
Oasis Biosciences
96
Empresa
Productos
Servicios
Actividad Diagnstico de enfermedades y desarrollo de nuevos tratamientos para enfermedades genticas, cardiovasculares, inmunes y cncer
Colaboraciones
Genzyme www.genzyme.com
SAGE
Validacin de dianas y desarrollo de frmacos
Mirus, Imgenex, Celera, Myriad Genetics
Hybridon www.hybridon.com
Tecnologas antisentido (oligonucletidos sintticos)
I+D y comercializacin de nuevas terapias antisentido para cncer, asma/alergias e infecciones
Medtronic Inc., MethylGene, Isis Pharm. Inc., Aegera Therapeutics Inc., The Immune Response Corporation, Alnylam Pharm. Inc. Migenix Inc., Epignesis, Integrated DNA Technologies Inc. Servier Research Group, Mindsense Biosystems Ltd., Oxford GlycoSciences plc., Lynx Therapeutics Inc., Genome Express, Small Molecule Therapeutics Inc., Apoxis, Incyte , Merck, XTL Biopharm.
Hybrigenics www.hybrigenics.com
Estudio de interacciones de protenas (doble hbrido, PIM, LIMS) Modelos animales
Descubrimiento de frmacos mediante el estudio de interacciones proteicas, validacin funcional de dianas y screening de compuestos
Iclectus www.iclectus.com Anticuerpos ARNi Vectores (GeneSuppressor) Arrays de tejidos (Histo-Array)
Intracuerpos
Desarrollo de anticuerpos que funcionan en el interior de clulas Desarrollo y comercializacin de reactivos para estudio de enfermedades, kits de diagnstico y nuevos tratamientos Desarrollo de tratamientos frente a enfermedades infecciosas, metablicas y cncer Desarrollo de nuevos frmacos para cncer, VIH, enfermedades metablicas y autoinmunes
Imgenex www.imgenex.com
Genzyme Molecular Oncology, SuperBioChip Laboratories
Immusol www.immusol.com
Plataforma de validacin in vivo con ARNsi y microarrays
Affimetrix, Novartis, Medarex, Chugai, Pfizer
Incyte Corporation www.incyte.com
Base de datos de secuencias expresadas (LifeSeq)
Plataforma de validacin con animales modelo
Galapagos, Ingenium, Medarex, Lexicon Genetics Inc., Bayer, Pfizer, Pharmasset Ltd. Elan, Roche, Bayer AG, Incyte Corp., Merck, Gruenenthal GmbH, Wyeth, Molecular Engines Laboratories SA, Oxagen Ltd., Sequenom Inc., Incyte Genomics Inc., Lynkeus BioTech GmbH Promega Corp., Isis Pharm. Inc., Sequenom Inc.
Ingenium pharmaceuticals www.ingeniumag.com/
Identificacin y validacin de dianas en ratones (Deductive Genomics)
Desarrollo de tecnologas de validacin de dianas in vivo y de desarrollo de frmacos
Integrated DNA Technologies www.idtdna.com
Tecnologas antisentido a la carta: LNA, ARNi, ddARNi, miARN
Proveedor de oligonucletidos a la carta
97
Empresa
Productos ARNsi in vitro e in vivo Vectores ARNi (Stealth RNAi, BLOCK-iTTM ARNsi Modelos celulares (CellSensor) ARNsi Vectores (psiRNA) Software de seleccin de ARNsi (siRNA Wizard)
Servicios
Actividad Desarrollo de tecnologa de ARNi in vivo para terapia de cncer y otras enfermedades. Proveedor de tecnologas para investigacin bsica, desarrollo de frmacos y bioproduccin
Colaboraciones Qiagen, Sequitur, DirectGene, Europroteome
Intradigm Corporation www.intradigm.com
Validacin de dianas por contrato
Invitrogen (Sequitur) www.invitrogen.com
Anticuerpos y pptidos a la carta Doble hbrido
Procter&Gamble, Zyomix
Invivogen www.invivogen.com
Proveedor de herramientas para investigacin
ISIS Pharmaceuticals www.isispharm.com/f unc_genomics.html
Tecnologas antisentido
Desarrollo de frmacos que actan sobre ARNm, terapias antisentido
Alnylam, Amgen, Chiron, Abott, Pfizzer, GlaxoSmithKline, Merck, Aventis, Astrazeneca, Atugen, Sequitur, Amgen, Chiron Corp., Pharmacia, Johnson&Johnson, Celera
Jerini array technology www.jerini.com
Microarrays de pptidos (PepStar, PepSpots, RepliTope)
Pptidos a la carta y libreras de pptidos
Desarrollo de nuevos frmacos peptdicos y qumicos
Kalypsis www.kalypsys.com
Qumica gentica, bioinformtica
Descubrimiento y desarrollo de nuevos frmacos frente a cncer, enfermedades metablicas e inflamatorias Investigacin y desarrollo de frmacos para enfermedades del sistema nervioso central
Merck, CV Therapeutics Inc.
KeyNeurotek www.keyneurotek.de
Servicios a la carta Animales modelo, ensayos in vivo e in vitro (TELOMICS)
Evotec OAI
Lexicon genetics www.lexgen.com
Ratones knock-out y transgnicos (Genome5000, Gene Targeting, Gene Trapping)
Desarrollo de frmacos frente a enfermedades humanas mediante bsqueda de nuevas dianas a escala genmica
Bristol-Myers Squibb., Genentech Inc., Takeda Pharmaceutical Company Limited, Abgenix Inc., Pfizer, Johnson & Johnson, Aventis, Roche, Merck, Eli Lilly, Bayer, Immunex Incyte, Sangamo, Athersys, Pfizer, Ability, Biosite, Eli Lilly, Oxford GlycoSciences, Eos
Medarex www.medarex.com
Anticuerpos (TransPhageSM, UltiMAb)
Desarrollo de anticuerpos humanos para terapia de enfermedades auntoinmunes, infecciosas y cncer Microarrays de ADNc (PIQOR) Ratones transgnicos Bioinformtica Perfilado de la expresin mediante microarrays de ADNc
Memorec www.memorec.com
98
Empresa
Productos
Servicios Plataforma de descubrimiento de dianas y frmacos basada en genmica, protemica y bioinformtica
Actividad Descubrimiento de nuevos tratamientos a partir del conocimiento de los distintos procesos implicados en la enfermedad Descubrimiento y comercializacin de tecnologas y productos innovadores basados en cidos nucleicos Sntesis y purificacin de oligonucletidos y ARNsi a la carta
Colaboraciones
Millenium Pharmaceuticals www.mlnm.com
Roche
Mirus www.mirusbio.com
Tecnologas, herramientas y reactivos antisentido in vitro e in vivo (TransIT) Libreras de ARNsi y ARNsi a la carta (siMAX)
Servicios de laboratorio a la carta
Genzyme Corp., Transgene
MWG Biotech www.mwgbiotech.com
GeneData
Myriad Genetics www.myriad.com
Genmica, protemica y bioinformtica para identificacin y validacin de dianas. Kit de sntesis de ARNi ARNsi y reactivos (TransPass, ShortCut) Tecnologas de interferencia y vectores (eiRNA)
Desarrollo de frmacos frente a cncer y enfermedad de Alzheimer
Abbott, Bayer, Lilly, Searle, Genzyme, Applied Biosystems
New England Biolabs www.neb.com
Proveedor de productos de alta pureza para investigacin
RheoGene Inc., Dyax Corp.
Nucleonics www.nucleonicsinc.com
Desarrollo y comercializacin de terapias basadas en tecnologas de ARNi Proveedor de oligonucletidos a la carta Plataforma basada en datos clnicos, estudios de funcin biolgica y bioinformtica (CartaGena) Desarrollo de compuestos biofarmacuticos para dianas validadas en su plataforma gentica Desarrollo de terapias frente a cncer y enfermedades neurolgicas basadas en el conocimiento de la funcin de genes Ratones transgnicos y knock-out Desarrollo de ratones modificados genticamente
Apath LLC, Novosom AG, Wyeth
OligoEngine www.oligoengine.com
ARNsi a la carta y vectores (pSUPER RNAi System)
Oxagen www.oxagen.co.uk
Celera, Daniolabs, Ingenium Pharm.
Oxford BioMedica www.oxfordbiomedica. co.uk
Vectores para administrar tecnologas antisentido y genes (LentiVector)
AstraZeneca, Wyeth, Merck, Biogen Idec, Amersham, Molmed, Arius Research, Kiadis
OzGen www.ozgene.com
Pharmagene www.pharmagene.com
Software y base de datos de perfiles de expresin de tejidos (TargetEvaluator) Screening, qumica gentica (Phase ZERO)
Proveer herramientas que permitan acelerar el desarrollo de frmacos
Allergan , Bayer, BristolMyers Squibb, Cubist , Johnson & Johnson , Schering-Plough, Amersham, AstraZeneca, Bayer UK, Boehringer Ingelheim, GlaxoSmithKline, Janssen , Merck, Oxford Biomedica, Pfizer, Roche, Vernalis
99
Empresa Phenomix www.phenomixcorp. com
Productos
Servicios Mutagnesis de ratones al azar
Actividad Desarrollo de frmacos para enfermedades inmunes y metablicas Investigacin bajo contrato con pez cebra para desarrollo y screening de frmacos Proveedor de soluciones basadas en cidos nucleicos innovadores
Colaboraciones Genentech, Inc., Plexxikon Inc.
Phylonix Pharmaceuticals Inc www.phylonix.com
Pez cebra, morfolinos, anlisis de la expresin gnica, hibridacin in situ Oligonucletidos de ADN o ARN (LNA), y ARNsi Microarrays ARNi (CodeBreaker RiboMAX) Vectores (psiCHECK, siLentGene, siSTRIKE)
Proligo www.proligo.com
Inex Pharm. Corp.
Promega www.promega.com
Proveedor de reactivos biolgicos para investigacin y aplicaciones tecnolgicas
Integrated DNA Technologies Inc., Benitec, EraGen Biosciences Inc., Serologicals Corp.
ProQinase www.proqinase.com
Modelos in vitro e in vivo
Desarrollo de tratamientos para cncer que actan sobre proteinquinasas Tecnologas protemicas punteras aplicables a todo el proceso de I+D farmacutica Compaa biotecnolgica especializada en protemica y validacin de dianas Desarrollo y comercializacin de herramientas para investigacin biolgica, desarrollo de frmacos y diagnstico molecular Desarrollo y comercializacin de medicamentos para tratamiento de obesidad, artritis reumatoide Desarrollo de frmacos para tratamiento de asma/alergia, hepatitis C, artritis reumatoide y cncer Proveedor de ARN para uso in vitro e in vivo, ribozimas y aptmeros Eli Lilly Canada Inc., Cephalon Inc., Abgenix Inc., Agilent Technologies
Protana inc. www.protana.com
Estudio de expresin e interacciones entre protenas (PathMap, PhosMap)
Proteome Factory www.proteomefactory .com
Validacin de dianas en cultivos celulares y modelos de ratn
Qiagen www.qiagen.com
siRNA validados y a la carta, reactivos
Ambion, Affymetrix Inc.
Regeneron www.regeneron.com
ARNi, ratones transgnicos y knockout (Velocigene)
Sanofi-Aventis
Rigel Inc. www.rigel.com
Estudio de rutas implicadas en la progresin de la enfermedad
Novartis, Pfizer, Johnsons&Johnsons, Daiichi
RNA-TEC http://www.rnatec.com RNAx www.rnax.de
RNAi, ribozimas y aptmeros Experimentos con ARNsi sobre lneas celulares
Tecnologas de validacin de alto rendimiento basadas en ARNi
Proligo, Quiagen, Charit, metaGen Pharm.
100
Empresa
Productos
Servicios
Actividad Desarrollo de tecnologas de investigacin genmica y anlisis de datos para seleccin de dianas Desarrollo y comercializacin de nuevos frmacos para el tratamiento de cncer Proveedor de productos de anlisis gentico para investigacin biomdica, medicina molecular y agricultura Proveedor de herramientas y reactivos de biologa molecular Desarrollo de terapias basadas en la tecnologa del ARNi
Colaboraciones
Rosetta Inpharmatics www.rii.com
Microarrays y software de anlisis (Rosetta Resolver)
Filial de Merck
Santaris www.santaris.com
Tecnologas antisentido (oligonucletidos, LNA, ARNsi)
Sequenom www.sequenom.com
Microarrays (MassARRAY)
Validacin de dianas en cultivos celulares
CuraGen Corp., Morphochem AG, Autogen Ltd.
Sigma-Genosys www.sigmagenosys.com
Oligonucletidos antisentido Pptidos
Compugen Ltd.
Sirna Therapeutics www.rpi.com
ARNsi
Eli Lilly, Archemix, Abott
Somagenics www.somagenics.com
Tecnologas antisentido (oligos, ARNsi, ribozimas, RNA Lassos) Chips de aptmeros para deteccin de protenas
Tecnologas basadas en ARN para diagnstico y desarrollo de frmacos
Somalogic www.somalogic.com
Desarrollo de sistemas de diagnstico a partir del perfil de expresin de protenas Productos, herramientas y servicios de clonaje, screening de dianas y anlisis de la expresin de protenas Desarrollo y comercializacin de productos y tecnologas de biologa molecular, genmica, protemica frmacologa y toxicologa Identificacin y caracterizacin de protenas y estudio de su expresin Desarrollo y comercializacin de soluciones para I+D farmacutica, genmica, protemica y diagnstico Servicios para investigadores en terapia gnica, quimioterapia con nuclesidos, oligonucletidos y diagnstico
Celera
Spring Bioscience www.springbio.com
Kits de ARNsi, anticuerpos
Stratagen www.stratagene.com
ARNsi y reactivos de transfeccin
Affymetrix Inc.
Tecan www.tecan.com
Invitrogen, EMD Biosciences, Inc., Pierce
Trilink www.trilinkbiotech.com
Oligonucletidos modificados
101
Empresa
Productos
Servicios
Actividad Desarrollar productos de anlisis de la sealizacin celular, plataformas tecnolgicas, servicios de investigacin bsica y desarrollo farmacutico Servicios de desarrollo de frmacos y de toxicologa para la industria farmacutica y biotecnolgica Tecnologas de trangnesis e imagen dirigidas a la I+D farmacutica, biotecnolgica y qumica Compaa biotecnolgica especializada en protemica funcional y validacin de dianas que proporciona dianas validadas y anticuerpos teraputicos I+D preclnica y clnica de anticuerpos y protenas recombinantes para tratamiento de cncer, enfermedades inmunes e infecciosas
Colaboraciones
Upstate www.upstate.com
ARNsi (siRNA siAb, siRNA SMARTpools, pKD)
Estudio de interacciones proteicas (PathwayProfiler)
Phylos Inc., Dharmacon
VASTox limited www.vastox.com
Genmica qumica con pez cebra y Drosophila
xenogen www.xenogen.com
Modelos celulares (Bioware) y animales (LPTA Animal Models)
Servicios basados en ratones y ratas transgnicas y knock-out
Morphochem AG, Pfizer
Xerion Pharmaceuticals www.xerionpharma.com
Tecnologas protemicas y CALI
Stemline Therapeutics Inc., ARIUS Research Inc., ALTANA AG, PROCORDE GmbH, Xerion Pharm., Aventis
Xoma www.xoma.com
Anticuerpos monoclonales
Genentech Inc., Millennium Pharm. Inc., Alexion Pharm. Inc., Chiron Corp., Aphton Corp., Triton BioSystems, Zephyr Sciences Inc.
Znomics www.znomics.com
Modelos de pez cebra, librera de mutantes de pez cebra (ZeneMarkTM)
Desarrollo de frmacos con pez cebra como modelo de enfermedad y sistema de screening Desarrollo de modelos de pez cebra para preclnica de frmacos frente a enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas y cncer Desarrollo y comercializacin de plataformas de anlisis de protenas
Zygogen www.zygogen.com
Peces cebra transgnicos (Z-Tag, Z-Lipotrack)
Becton Dickinson and Co., Aventis, NuTec Sciences Inc., Ariad Pharm., Curis Inc.
Zyomix www.zyomyx.com
Microarrays de protenas
Invitrogen
Fig. 30. Empresas internacionales en validacin de dianas. Fuente: elaboracin propia.
102
Anexo III: Empresas espaolas en validacin de dianas163

Advanced In Vitro Cell Technologies, S.L. rea de aplicacin Salud humana. Contribuir a la obtencin de nuevos medicamentos a partir de nuevas tecnologas adquiridas en universidades espaolas y/o desarrolladas por Advancell (modelos celulares in vitro). Servicios de validacin de dianas a la carta mediante modelos celulares ad hoc para el estudio de dianas concretas y screening de potenciales frmacos frente a las mismas. Modelos in vitro para estudios ADMET, administracin de frmacos, Cncer, dermatologa, inflamacin, cosmtica, biocompatibilidad, toxicidad, etc. Pharma Mar, Smith&Nephew, Merck, Cytochroma, Grifols, ICN, Lipotec S.A., DiverDrugs SL, NorayBio, Cognis, Myrurgia, Progenika, Crystax, Oryzon, Crystax y Laboratorios Esteve. Direccin: Parc Cientfic de Barcelona. Baldiri Reixac, 10-12. 08028 Barcelona. Web: http://www.advancell.net
Misin
Servicios relacionados con identificacin y validacin de dianas
I+D
Acuerdos y colaboraciones cientficas
Contacto
Bioalma, S.L. rea de aplicacin Misin Servicios relacionados con identificacin y validacin de dianas Salud humana. Bioinformtica.
Consultora, formacin y desarrollo de software aplicado a los microarrays de ADN.
I+D
Bioinfomtica aplicada a microarrays de ADN. Sistemas de extraccin de informacin.
CNIO, Genetrix.
Contacto
Direccin: Centro Empresarial Euronova. Ronda de Poniente, 4 - 2 planta, Unidad C-D. 28760 Tres Cantos, Madrid. Web: http://www.almabioinfo.com
163
Advancell (www.advancell.net) Bioalma (www.almabioinfo.com) Dominion Pharmakine (www.pharmakine.com) Instituto de Farmacia Industrial (www.usc.es/farmind/doc/servicios.htm) Oryzon Genomics (www.oryzon.com) Progenika (www.progenika.com) Proteomika (www.proteomika.com) Unidad Mixta Almirall Prodesfarma-PCB (www.almirall.eswww.pcb.ub.es)
103
Biomedal S.L. rea de aplicacin Salud humana. Desarrollo de tecnologas innovadoras para el progreso de la investigacin postgenmica y la produccin industrial eficiente de nuevas biomleculas tiles para la sociedad. Lectura y procesamiento de ADN arrays. Asesoramiento y gestin de proyectos de I+D en biomedicina (estudios de expresin semi-cuantitativa empleando tecnologas de DNA arrays). Desarrollo de vectores para genmica funcional en un amplio rango de organismos. Desarrollo de herramientas para mejorar la eficiencia en la expresin y purificacin de protenas. Desarrollo de herramientas para diagnstico molecular. Universidad de Sevilla, Universit Clermont-Ferrand, Universidad Miguel Hernndez, Universidad Pablo de Olavide, Centro de Investigaciones Biolgicas (CSIC), Instituto de Biomedicina Lpez Neyra (CSIC). Direccin: Avenida Amrico Vespucio, 5, Bloque E - Planta 1 Mdulo 12. Isla de la Cartuja, 41092 Sevilla. Web: http://www.biomedal.es
Misin
I+D
Contacto
Crystax Pharmaceuticals S.L. rea de aplicacin Salud humana. Empresa biotecnolgica que se dedica al desarrollo de molculas de inters teraputico a partir de la determinacin estructural de dianas farmacolgicas.
Misin
Servicios relacionados con identificacin y validacin de dianas I+D Acuerdos y colaboraciones cientficas
Determinacin de la estructura de dianas proteicas y complejos diana-ligando.
High-Throughput NMR, Fragment Screening.
Advancell, Oryzon Genomics, Uriach Laboratories.
Contacto
Direccin: Parque Cientfico de Barcelona. Josep Samitier, 1-5. 08028 Barcelona. Web: http://www.crystax.com
104
Dominion Pharmakine S.L. rea de aplicacin Salud humana.
Misin
Compaa biofarmacutica enfocada al desarrollo de productos y servicios que permitan avanzar en la investigacin, el diagnstico y tratamiento del cncer.
Productos relacionados con identificacin y validacin de dianas.
Arrays de tejidos: Human Hepatic Colon-Carcinoma Metastasis Tissue Array. Organ-Specific Metastasis Melanoma Tissue Array. Multi-Organ Animal Tissue-Arrays. Array de tejidos personalizado. Arrays de clulas: Array de clulas especfico de hgado (humano, rata, ratn). Array de lnea celular de melanoma humano. Array de clulas personalizado. Genmica funcional: Anlisis de la expresin gnica. Diseo de microarrays de ADN personalizados. Frmaco-genmica. Anlisis de sistemas de expresin modificados. Protemica funcional: Anlisis de la expresin proteica. Identificacin de protenas. Protemica comparativa. Frmaco-protemica. Fenmica funcional.
I+D Direccin: Parque Tecnolgico de Bizkaia, Edificio 801, 1 planta. Web: http://www.pharmakine.com
Contacto
Ebiointel, S.L. rea de aplicacin Salud humana. Desarrollo de plataformas bioinformticas para el anlisis de secuencias, de la diversidad gentica y de datos gnomicos en general, con el objetivo de simplificar y acelerar la investigacin biomdica. EbioSNP: plataforma para la representacin y anlisis de la diversidad gentica. Servicio de anlisis experto en los siguientes campos: asociacin de factores genticos y rasgos fenotpicos, bsqueda de dianas farmacolgicas, anlisis epidemiolgicos y filogenticos. Diseo de plataformas bioinformticas.
Misin
I+D Acuerdos y colaboraciones cientficas
Noray Bioinformatics.
Contacto
Direccin: Edifici M - Campus de la UAB, Vivero de Empresas de Biotecnologa y Biomedicina (VE3B). 08193 Bellaterra, Barcelona. Web: http://www.ebiointel.com
105
Genetrix S.L. rea de aplicacin Salud humana. Desarrollo de plataformas biotecnolgicas en las reas de medicina molecular y regenerativa, abordando programas de investigacin orientados a patologas inflamatorias, infecciosas y neurodegenerativas, entre ellas: Cellerix, centrada en el desarrollo de nuevas terapias en el campo de la ingeniera, reparacin y regeneracin de tejidos utilizando clulas madre. Biotherapix, enfocada al desarrollo de una plataforma de productos teraputicos dirigidos a enfermedades inflamatorias.
Misin
Productos relacionados con identificacin y validacin de dianas
Biotherapix: Generacin de nuevas molculas teraputicas basadas en anticuerpos para el tratamiento de enfermedades infecciosas, degenerativas e inflamatorias.
I+D en identificacin y validacin de dianas
Cellerix: Plataforma propia que combina libreras de anticuerpos producidas dentro de la empresa con tecnologa de clulas madre. Determinar nuevos factores y molculas capaces de iniciar y/o mejorar programas especficos de diferenciacin de clulas madre adultas. Consejo Superior de Investigaciones Cientficas (CSIC), Centro Nacional de Biotecnologa (CNB), Centro Nacional de Microelectrnica (CNM), Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa (CBM-SO), Centro de Astrobiologa (CAB), Centro de Investigaciones Biolgicas (CIB), Instituto de Ciencia y Tecnologa de Polmeros (ICTP), Instituto de Parasitologa y Biomedicina Lpez Neyra, Centro de Investigaciones Energticas y Medio ambientales (CIEMAT), Centro de Investigacin en Medicina Regenerativa, Instituto de Cermica de Galicia (ICG), Universidad Autnoma de Madrid (UAM), Universidad Complutense de Madrid (UCM), Universidad Francisco de Vitoria, Gene Expression Laboratory, Salk Institute, Centre Nationale de la Recherche Scientifique (CNRS), Hospital Donostia, Hospital Universitario La Paz, Hospital General Universitario Gregorio Maran, Hospital Universitario 12 de Octubre, Hospital Vall dHebrn, Sanatorio Virgen del Mar, Clnica Universitaria de Navarra, Fundacin Hospital Alcorcn, Evrogen, Logitest, Laboratorios INDAS, Keramat, Bionostra, Sensia, Biobide, Alma Bioinformtica, Fundacin Inbiomed, Asociacin de Epidermolisis Bullosa de Espaa (AEBE), INASMET. Direccin: Calle Marconi 1, Parque Tecnolgico de Madrid. 28760 Tres Cantos, Madrid. Web: http://www.genetrix.es
Contacto
106
Integromics, S.L. rea de aplicacin Salud humana. Proporcionar soluciones tecnolgicas que faciliten la adquisicin, manejo, procesamiento y anlisis de grandes volmenes de datos en la era post-genmica.
Misin
Servicios relacionados con identificacin y validacin de dianas I+D Acuerdos y colaboraciones cientficas
ArrayHub (gestin de datos de anlisis de la expresin gnica). Formacin en bioinformtica.
Applied Biosystems, Spotfire.
Contacto
Direccin: Parque Cientfico de Madrid, Ciudad Universitaria Cantoblanco, Einstein, 13, Pabelln C, 1 planta. 28049 Madrid Web: http://www.integromics.com
Neocodex S.L. rea de aplicacin Salud humana. Empresa dedicada a la investigacin y desarrollo en biomedicina y al diagnstico molecular de enfermedades humanas.
Misin
Servicios relacionados con identificacin y validacin de dianas I+D
Expresin gnica mediante microarrays de ADN.
Trazado de marcadores de susceptibilidad gentica en la poblacin espaola. Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas de Madrid (CNIO), Centro de Investigaciones Biolgicas de Madrid (CIB/CSIC), Hospital Clnico San Carlos, Hospital Doce de Octubre (Madrid), Hospital Virgen del Roco y Valme (Sevilla) Genetix (UK), Universidad de Utrech (Holanda), Universidad Tor Vergata (Roma). Direccin: Avda. Averroes, 8, Ed. Acrpolis, Mod. 110-111, Sevilla Web: http://www.neocodex.es
Contacto
107
Neuropharma S.A. rea de aplicacin Salud humana. Compaa bio-farmacutica participada por el grupo Zeltia, centrada en la investigacin y desarrollo de frmacos novedosos para el tratamiento y prevencin de enfermedades del Sistema Nervioso. Identificacin y validacin de dianas teraputicas especficas con el objeto de desarrollar una nueva generacin de frmacos que proporcionen tratamientos ms selectivos y efectivos para enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer. Universidad Autnoma de Madrid (Medicina), Universidad de Alcal de Henares de Madrid (Farmacia), Universidad Central de Barcelona (Farmacia), Universidad Miguel Hernndez (Instituto de Neurociencias), Universite de Rennes (Francia), Universidad de Vigo (Facultad de Qumicas), Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), Instituto de Investigaciones Biomdicas Alberto Sols (CSIC-UAM), Instituto de Qumica Fsica Rocasolano (CSIC), Instituto Ramn y Cajal (CSIC), Advancell, CEREP, Charles River Laboratories, CIDA (Centro de Investigacin y Desarrollo Aplicado S.A.L.), CIT (Centre Internacional de Toxicologie), Covance Laboratorios Ltd, Gaiker (Zamudio, Bizkaia), Gen Pharm Tox, Instituto Biomar S.A., JSW Research, KYMOS Pharma Services S.L., LONZA, reMYND, RTC (Research Toxicology Centre). Direccin: Avda. de la Industria, 52, Parque Tecnolgico de Madrid. 28760 Tres Cantos, Madrid Web: http://www.neuropharma.es
Misin
I+D
Contacto
Noray Bioinformatics, S.L. rea de aplicacin Salud humana. Diseo, desarrollo e implantacin de software a medida, con el objeto de servir como soporte en tecnologas de la informacin al sector de la biotecnologa. Genmica funcional: software para el anlisis correlacional de datos clnicopatolgicos con datos genmicos en estudios de cncer (BITIATM). Servicios: consultora bioinformtica, herramientas de gestin y explotacin de resultados de laboratorio, proyectos de outsourcing en bioinformtica. Bioinformtica
Misin
I+D Acuerdos y colaboraciones cientficas
Azeretia, H.U. La Paz, Dominion Pharmakine, Advancell, Owl Genomics, Aethia, Universidad de Barcelona, Biolex, Judo, PharmaDatum, eBiointel.
Contacto
Direccin: Parque Tecnolgico,801 A. 48160 Derio, Bizkaia Web: http://www.noraybio.com
108
Owl Genomics, S.L. rea de aplicacin Salud humana. Identificacin de marcadores moleculares y agentes teraputicos para el diagnstico temprano y tratamiento de enfermedades hepticas.
Misin Productos relacionados con identificacin y validacin de dianas I+D
Hepatochip: chip de ADN que permite conocer la presencia de esteatohepatitis no alcohlica (NASH) a partir de la coexpresin de 85 genes.
Diagnstico temprano de esteatosis heptica (EH) y esteatohepatitis no alcohlica (NASH). Universidad de Navarrra, Centro de Estudios e Investigaciones Tcnicas de Guipzcoa, Hospital Clnico de Barcelona, Hospital Gregorio Maran, Hospital Universitario Prncipe de Asturias, Hospital Italiano de Buenos Aires, Noray Bioinformatics, Progenika, Protemica. Direccin: Parque Tecnolgico de Bizkaia, Edificio 801, planta 2. 48160 Derio. Web: http://www.owlgenomics.com
Contacto
Progenika Biopharma, S.A. rea de aplicacin Salud humana. Identificacin y validacin de genes y protenas implicadas en procesos patolgicos, y su empleo en el desarrollo de nuevos frmacos y mtodos de diagnstico. Affymetrix genechip probe arrays Microarrays de Genotipado: Human Familiar Hypercholesterolemia DNA Array (Lipochip, comercializado). Human Blood genotyping DNA Array (Bloodchip). Inflammatory Bowel Disease DNA Array (IBDchip). Arrays de anlisis de la expresin gnica: Human Blood Neoplasias Classification Array (hematochip). Rat Genome 5K Microarray. Pseudomonas putida Genome Array. Pseudomonas aeruginosa Genome Array. Medplant Small Cell Lung Cancer Chemotherapy Resistance microarray (en fase de validacin clnica). Identificacin y validacin de genes y protenas relacionadas con enfermedades psiquitricas, neurolgicas y cncer.
Misin
Productos relacionados con identificacin y validacin de dianas
I+D
Owl Genomics.
Contacto
Direccin: Parque Tecnolgico de Zamudio, Edificio 801 -A48160 Derio, Bizkaia Web: http://www.progenika.com
109
Protemica S.A. rea de aplicacin Salud humana. Empresa subsidiaria de Progenika S.A. dedicada a la investigacin y desarrollo en el campo de la Protemica. Identificacin y validacin de marcadores de diagnstico y pronstico, as como dianas teraputicas en cncer y enfermedades psiquitricas.
Misin
I+D
Pepscan Systems BV, Algonomics NV, Proteomika, CNIO, University Louis Pasteur, UMC Utrecht.
Contacto
Direccin: Parque Tecnolgico de Zamudio, Edificio 801 -A-. 48160 Derio, Bizkaia. Web: http://www.proteomika.com
Sistemas Genmicos S.L. rea de aplicacin Salud humana y agroalimentacin. En el rea de la Biomedicina, el reto de la empresa consiste en integrar Ciencia y Tecnologa para crear y proveer a la sociedad de mtodos de diagnstico que mejoren la salud y la calidad de vida. En el rea de la Agroalimentacin, su reto es satisfacer aquellas necesidades analticas de las empresas del sector que nicamente pueden cubrirse mediante el anlisis de ADN de los alimentos.
Misin
Aplicaciones en el desarrollo de chips de ADN.
I+D
Secuenciacin de genomas. Desarrollo de nuevas herramientas de bioinformtica para el anlisis de secuencias a gran escala. Optimizacin de la PCR (Polymerase Chain Reaction) a tiempo real aplicada al diagnstico molecular. Generacin de una amplia base de datos de marcadores genticos que contiene especies de inters agronmico. Tecnologa de AFLPs. Tecnologa de Microsatlites. Aplicaciones basadas en el desarrollo de Chips de ADN, tanto en el rea del diagnstico molecular, como en el anlisis de alimentos. Direccin: Parque Tecnolgico de Valencia. Avda. Benjamn Franklin, 12. 46980 Paterna, Valencia. Web: http://www.sistemasgenomicos.com
Contacto
Tabla. 31. Empresas espaolas en validacin de dianas. Fuente: elaboracin propia.
110
Anexo IV: Principales dianas teraputicas

Principales dianas teraputicas Diana Frmaco Empresa Indicacin Estado del ensayo clnico Tcnica de validacin Clulas knock-out Ratones knockout
Receptor de ADP P2Y12
Clopidogrel (Plavix)
Sanofi
Trombosis
Comercializado
Receptor NK1
TAK-637 Aprepitant (Emend)
Abbott y Takeda Merck & Company
Antiemtico (prevencin de nusea y vmito), depresin, ansiedad Enfermedad cardiovascular
Comercializado
Ratn knock-out
Vasopeptidasa: enzima de conversin de angiotensina (ECA) + endopeptidasa neutra (EPN)
Omapatrilat
Vanlev y BristolMyers Squibb
Comercializado Ratn knock-out
Fasidotril
Lilly
Enfermedad cardiovascular Rinitis alrgica, asma Alergia al cacahuete Cncer de pulmn
Comercializado
Omalizumab (Xolair) IgE TNX-901 Erlotinib (Tarceva) Knock-outs Cetuximab (Erbitux) Receptor EGF GS-572016 Gefitinib (Iressa) CI-1033 bevacizumab (Avastin) Ranibizumab (Lucentis) Receptor VEGF Pegaptanib (Macugen) Vatalanib ZD-6474 Cicloxigenasa (COX) y Lipoxigenasa (LOX)
Genentech y Novartis Tanox, Genentech y Novartis Genentech y OSI Pharmaceuticals Merck & Company GlaxoSmithKline AstraZeneca Pfizer Genentech
Comercializado Ratn knock-out Fase II
Comercializado
Cncer colorrectal Cncer de pecho Tumores slidos Cncer de pecho Cncer colorrectal Degeneracin macular asociada a la edad Degeneracin macular asociada a la edad Cncer Cncer de pulmn
Comercializado Fase III Fase III Fase II Comercializado Ratn knock-out
Genentech
Fase III Ratn knock-out Fase III
Eyetech/Pfizer
Novartis AstraZeneca
Fase II Fase II
Licofelone
Merckle
Osteoartritis
Fase III
Ratn knock-out
111
Principales dianas teraputicas (continuacin) Diana Frmaco Empresa Indicacin Enfermedades cardiovasculares (Obesidad, Tabaquismo), psicosis, esquizofrenia, shock sptico Enfermedades autoinmunes (esclerosis mltiple, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide) Obesidad, diabetes Hiperlipidemia Arteriosclerosis Enfermedad pulmonar obstructiva crnica (EPOC), asma rinitis alrgica, artritis reumatoide Lesiones del sistema nervioso, mucosistis, Enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, lceras en la piel Obesidad Obesidad Dolor, migraa Diabetes no dependiente de insulina Enfermedad vascular perifrica, tromboembolismo, lcera, isquemia Glaucoma, fallo cardaco congestivo, Sndrome inadecuado de ADH (hormona antidiurtica), hipertensin Estado del ensayo clnico Tcnica de validacin
Receptor CB1
Rimonabant (Acomplia)
Sanofi-Aventis
Fase III
Ratn knock-out
Receptor de la integrina alfa-4
Natalizumab (Tysabri)
Biogen Idec y Elan Corporation
Fase III
Ratn knock-out Anticuerpos monoclonales.
Receptor Glp-1 ACAT-2
Exenatide, GLP-1 Avasimibe
Lilly Parke-Davis & Co Pfizer
Fase III Fase III
Ratn knockout Ratn knock-out
Roflumilast (Daxas) Fosfodiesterasa-4 Cilomilast (Ariflo)
Pfizer
Fase III Ratn knock-out Fase III
GlaxoSmithKline
Knock-outs
Factor de crecimiento de queratinocitos 2
Repifermin
GlaxoSmithKline y Human Genome Sciences
Fase III
Ratn knockout
Receptor 5-HT2C Receptor CCK1 Receptor Adenosina A1 Dipeptidil peptidasa V
BVT-933 GI-181771 GW-493838
GlaxoSmithKline y Biovitrum GlaxoSmithKline GlaxoSmithKline
Fase II Fase II Fase II
Ratn knockout Ratn knockout Ratn knockout
LAF-237 P32/98
Novartis Merck
Fase II
Ratn knockout
Receptor del tromboxano A2
Ifetroban (BMS-180291)
Bristol-Myers Squibb
Fase II
Ratn knockout
Receptor V2 de la vasopresina
SR-121463
Sanofi-Synthelabo
Fase II
Ratn knockout
112
Principales dianas teraputicas (continuacin) Diana Frmaco Empresa Indicacin Esclerosis multiple, transplantes de rganos, psoriasis, artritis reumatoide, enfermedades autoinmunes Enfermedad inflamatoria intestinal, artritis reumatoide Rinitis alrgica, asma Rinitis alrgica, asma Enfermedades autoinmunes, trasplante de rganos Osteoporosis Cncer Estado del ensayo clnico Tcnica de validacin
CTLA-4
BMS-188667 BMS-224818
Fase II
Ratn knockout
TACE Knock-outs
BMS-561392
Fase II
Ratn knockout
GW-559090 Integrina _4/`1 (VLA-4) R-411
GlaxoSmithKline
Fase II Ratn knockout
Roche
Fase II
Receptores EDG
FTY-720
Novartis
Fase II
Ratn knockout
Catepsina K RhoB
AAE-581
Novartis
Fase II Preclnica
Ratn knockout Ratn knockout ARNsi anti-Bcr-Abl en lneas celulares humanas sensibles a imatinib
Tirosina quinasa Bcr-Abl
Imatinib (Glivec)
Novartis
Cncer (Leucemia mieloide crnica)
Comercializado
LMB-2
National Cancer Institute Seragen y Ligand Pharmaceuticals Seragen y Ligand Pharmaceuticals
Psoriasis, leucemia y linfoma linfoma cutneo de clulas T Melanoma, cncer de rin Rechazo de rganos transplantados Leucemia
Fase II Fase I
Denileukin diftitox (Ontak) Tecnologas antisentido Denileukin diftitox (Ontak) CD25 Daclizumab Zenapax Daclizumab Zenapax Daclizumab Zenapax Bcl-2 GenasenseR (oblimersen)
Comercializado
Fase II ARNsi
Roche
Comercializado
Roche
Fase II
Roche Genta Incorporated
Infeccin por VIH Cncer (leucemia linfoctica crnica) Enfermedad cardiovascular (arritmia cardiaca) Infeccin de HIV-1
Fase I Oligonucletidos antisentido. Morfolinos en pez cebra
Fase III
Canales de potasio HERG
Dronedarone
Sanofi-Synthelabo
Fase III
Receptor CCR5
UK-427,857
Pfizer
Fase-III
ARNsi
113
Principales dianas teraputicas (continuacin) Diana Receptor CXCR4 Subunidad R2 de la ribonucletido reductasa Frmaco AMD11070 Empresa AnorMED Inc Lorus Therapeutics European Organization for Research and Treatment of Cancer Johnson & Johnson National Cncer Institute National Cncer Institute Chiron Corp. National Institute of Allergy and Infectious Diseases National Institute of Allergy and Infectious Diseases Neopharm Indicacin Infeccin de HIV-1 Estado del ensayo clnico Fase II Tcnica de validacin ARNsi Oligonucletidos antisentido
GTI-2040
Cncer renal
Fase II
Pptido E6 del virus del papiloma humano 16
Vacuna de pptido E6
Verrugas genitales, cncer genital: reduccin del crecimiento celular Leucemias y linfomas Cncer
Fase II
ARNsi
Oncogn Ras
Zarnestra (tipifarnib) Terapia gnica
Fase II
ARNsi
Fase II ARNsi
P53 Vacuna de pptidos p53 Antgeno p24 del VIH Vacuna de antgeno p24 Cncer Fase II
Infeccin por VIH
Fase I
ARNsi
Tecnologas antisentido
Protena rev del VIH
Vacuna rMVA-HIV y rFPV-HIV
Infeccin por VIH
Fase I
ARNsi
Tat
Vacuna rMVA-HIV y rFPV-HIV
Infeccin por VIH
Fase I
ARNsi
Oncogn Raf-1 Factor nuclear heptico HNF-1` 53bp1: proteina de unin a p53 P73Dn
LErafAON
Tumores slidos Carcinoma de ovario Cncer Neuroblastoma y otros tumores Hepatitis autoinmune
Fase I
Oligonucletidos antisentido ARNsi
...
...
Preclnica
...
...
Preclnica
ARNsi
...
...
Preclnica
ARNsi ARNsi, anticuerpos Microarrays de ADNc DDRT-PCR Oligonucletidos antisentido ARNsi ARNsi, expresin de ARNsi mediante plsmidos
Receptor Fas
...
...
Preclnica
COX17
...
...
Cncer de pulmn
Preclnica
Vif
Infeccin por VIH
Preclnica
114
Principales dianas teraputicas (continuacin) Diana LTR mRNA Protena estructural de la capside del poliovirus Tecnologas antisentido RNAP del polivirus Protena P del virus respiratorio sincitial (VRS) Protena F del VRS Protena 5B y ARNm de la polimerasa del virus de la hepatitis C Frmaco Empresa Indicacin Infeccin por VIH Estado del ensayo clnico Preclnica Tcnica de validacin ARNsi
Infeccin por poliovirus
Preclnica
ARNsi
Infeccin por poliovirus Enfermedad respiratoria por VRS Enfermedad respiratoria por VRS
Preclnica
ARNsi
Preclnica
ARNsi
Preclnica
ARNsi
Hepatitis C, cirrosis, cncer de hgado
Preclnica
ARNsi in vivo
Tabla 4. Principales dianas teraputicas mediante ratones Knockout y tecnologas antisentido. Fuente: Zambrowicz, B. P., et al. (2003). Predicting drug efficacy: knockouts model pipeline drugs of the pharmaceutical industry. Curr Opin Pharmacol. 3(5):563-70; Suzuki, C., et al. (2004). Identification of COX17 as a therapeutic target for non-small cell lung cancer. Cancer Res; 63(21):7038-41; Clinicalstudyresults.org (http://www.clinicalstudyresults.org/); Drugdevelopment-technology.com (http://www.drugdevelopment-technology.com). Acrnimos: EDG: VEGF: EGF: HMG-CoA: genes de diferenciacin endothelial; factor de crecimiento del endotelio vascular; factor de Crecimiento Epidrmico; 3-hidroxi-metil-glutaril-CoA.
115
Referencias
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Glosario
ADN (cido desoxirribonucleico): molcula de gran tamao que se encuentra en todos los seres vivos y que es portadora de la informacin gentica. Anticuerpos monoclonales: anticuerpos especficos que pueden ser producidos en grandes cantidades por clulas que se originan a partir de una lnea celular (hibridoma). Todos los anticuerpos monoclonales producidos por una clula hbrida son idnticos. ARN (cido ribonucleico): molcula parecida al ADN en cuanto a sus caractersticas qumicas, que tambin est relacionada con la transmisin de la informacin gentica, ya que acta como intermediario en el proceso de traduccin o formacin de protenas. Diana teraputica: molcula localizada en cualquier parte de la clula, capaz de reconocer a un frmaco y producir una respuesta celular que modifique el curso de una enfermedad. Dianas o genes homlogos: genes o dianas que poseen similitud entre s, tanto en la misma especie como entre distintas especies. Esta similitud puede derivarse de una ascendencia comn (genes ortlogos) asumindose que tienen la misma funcin, o bien surgir a partir de la duplicacin de un gen dentro de un mismo genoma (genes parlogos), que en este caso tendran diferente funcin o especializacin. Factor de transcripcin: protenas que regulan la expresin de determinados genes, mediante Vectores de expresin: molculas de ADN que contienen la informacin necesaria para dirigir la sntesis de oligonucletidos o protenas en el interior de la clula. la unin a los mismos activando o reprimiendo su expresin. Fenotipo: rasgos o caractersticas visibles de un organismo, determinado por su constitucin gentica (genotipo) y por el ambiente en el que crece y se desarrolla. Gen candidato: gen localizado en una regin de un cromosoma sospechosa de estar involucrada en una enfermedad y cuyos productos proteicos sugieren que podra ser el gen de la enfermedad en cuestin. Gen mutado: gen que contiene cualquier cambio respecto al gen original. Librera de compuestos: repertorio de compuestos que presentan variaciones entre s en cuanto a sus caractersticas y que muestran una potencial actividad de inters. Oligonucletidos: molculas de cido nucleico de longitud reducida que pueden ser de ADN, ARN o modificaciones qumicas de stos. Tecnologas antisentido: tecnologas basadas en el empleo de molculas complementarias a un fragmento del ARN diana que permiten su unin al ARN de forma especfica, bloqueando su expresin e impidiendo la produccin de la protena diana.
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Orense, 69, planta 2 - 28020 Madrid Telfono: 91 449 12 50 Fax: 91 571 54 89 www.gen-es.org

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Biotecnologa Aplicada a la Identificacin y Validacin de Dianas Teraputicas

Informe de Vigilancia Tecnolgica

Biotecnologa Aplicada a la Identificacin y Validacin de Dianas Teraputicas

BIOTECNOLOGA APLICADA A LA IDENTIFICACIN Y VALIDACIN DE DIANAS TERAPUTICAS

BIOTECNOLOGA APLICADA A LA IDENTIFICACIN Y VALIDACIN DE DIANAS TERAPUTICAS

1. INTRODUCCIN A LA VALIDACIN DE DIANAS

4. ESTRATEGIAS DE VALIDACIN DE DIANAS

BIOTECNOLOGA APLICADA A LA IDENTIFICACIN Y VALIDACIN DE DIANAS TERAPUTICAS

1. Introduccin a la validacin de dianas

Smith, M. B. (2003). Hitting the target. Nature, vol. 422, 341-347.

BIOTECNOLOGA APLICADA A LA IDENTIFICACIN Y VALIDACIN DE DIANAS TERAPUTICAS

Genoma humano: 20.000-25.000 genes

5.000 frmacos que actan sobre el genoma

5.000 Genes implicados en patologas

600-1.500 dianas teraputicas

Mltiples dianas candidatas

Cribado virtual (in silico)

Anlisis de la expresin gnica

Algunas dianas potenciales

Mltiples compuestos candidatos

BIOTECNOLOGA APLICADA A LA IDENTIFICACIN Y VALIDACIN DE DIANAS TERAPUTICAS

2. Tcnicas de identificacin de dianas

2.1. Anlisis de la expresin gnica

2.1.1. Anlisis serial de la expresin gnica (SAGETM)

BIOTECNOLOGA APLICADA A LA IDENTIFICACIN Y VALIDACIN DE DIANAS TERAPUTICAS

2.1.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)

2.1.3. Microarrays de ADN

Identificacin de dianas mediante tcnicas de anlisis de la expresin gnica

ARN Transcripcin inversa

ADN copia Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) Protena A

Anlisis serial de expresin gnica (SAGE)

Hibridacin sobre un soporte con sondas de ADN complementarias

Liberacin de fragmentos especficos de cada ARN

Deteccin por fluorescencia

2.2. Interacciones protena-protena

BIOTECNOLOGA APLICADA A LA IDENTIFICACIN Y VALIDACIN DE DIANAS TERAPUTICAS

2.2.1 Microarrays de protenas

2.2.2. Sistema doble hbrido

Expresin del gen indicador

Dom. unin ADN Promotor

Sin expresin del gen indicador

Figura 7. Funcionamiento del sistema doble hbrido. Fuente: Elaboracin propia.

BIOTECNOLOGA APLICADA A LA IDENTIFICACIN Y VALIDACIN DE DIANAS TERAPUTICAS

3. Tcnicas de validacin de dianas

3.1.1. Oligonucletidos antisentido

3.1. Modulacin de la expresin gnica

Comienzo de la sntesis de protenas

Unin de un oligonucletido antisentido

Corte del ARNm por la enzima Ribonucleasa H

Inhibicin de la expresin de la protena

3.1.2. ARN de interferencia

BIOTECNOLOGA APLICADA A LA IDENTIFICACIN Y VALIDACIN DE DIANAS TERAPUTICAS

ARN de doble cadena

ARNi de doble cadena

Activacin del complejo RISC por ARNi de cadena sencilla

BIOTECNOLOGA APLICADA A LA IDENTIFICACIN Y VALIDACIN DE DIANAS TERAPUTICAS

3.1.4. Protenas de dedos de zinc

Activacin de la expresin gnica

Bloqueo de la expresin gnica Protena de 3 dedos de Zinc ADN

3.2.1. Qumica gentica

3.2. Inactivacin de protenas

BIOTECNOLOGA APLICADA A LA IDENTIFICACIN Y VALIDACIN DE DIANAS TERAPUTICAS

3.2.2. Anticuerpos monoclonales

Interaccin de la Protena diana y el anticuerpo monocional