Actividades proteolticas, hemorrgicas y coagulantes del veneno

Los venenos de Viperidae contienen diversas actividades enzimticas como son las fosfolipasas, fosfodiesterasas, fosfomonoesterasas, alfa-aminoacidooxidasas, acetilcolinesterasas, enzimas proteolticas de la serina-proteinasa y varias clases de metaloproteinasas, arginina-esterasa, 5'nucleotidasa, hialuronidasa y NAD nucleosidasas. No todas las enzimas estn presentes en todos los venenos. Entre los pptidos encontrados estn las neurotoxinas presinpticas y post-sinpticas. Los canales de potasio son importantes en la actividad de las neurotoxinas, citotoxinas, miotoxinas, cardiotoxinas y los inhibidores de agregacin plaquetaria (desintegrinas) (Markland., 1998). En lo que respecta a las actividades hemorrgicas y proteolticas de serpientes suramericanas (Monterrey, 2000), ellas existen casi exclusivamente en los venenos botrpicos y lachsicos. Sin embargo, en los ltimos aos, se han comenzado a describir estas actividades en algunas especies de crtalos venezolanos (Rodriguez-Acosta et al., 1998; Aguilar et al., 2001). El volumen de veneno inyectado determina la severidad de la lesin, pero en todos los casos de accidente ofdico por Bothrops se produce necrosis de los tejidos blandos. En adicin, la accin proteoltica produce aminas y pptidos vasoactivos, tales como: bradiquinina, histamina y serotonina que causan lesin capilar, lo cual se traduce por hemorragias petequiales, hematuria, hematemesis, epistaxis y hemorragias viscerales (Toro et al., 1983). La actividad de los venenos bothrpicos tiene componentes citotxicos y fibrinolticos, los cuales producen necrosis y hemorragias en tejido nervioso y por supuesto en otros tejidos. Ellos en su mayora, poseen una accin tipo trombina: se consume fibringeno, para formar un monmero de fibrina, poco estable e incapacitado para polimerizar y formar cogulos sanguneos (Gutirrez et al., 1980). El colapso sistmico observado en algunos pacientes hace sospechar una actividad sobre las glndulas suprarrenales, la cual ha sido poco descrita desde el punto de vista ultraestructural. Su actividad sobre los tejidos musculares, sistema nervioso central (SNC) y perifrico (SNP) tampoco ha sido extensamente estudiado. En el sistema nervioso central existen pocos estudios morfolgicos con microscopa de luz en otros gneros de serpientes con fuerte actividad hemorrgica de su veneno (Than et al., 1989). No se encontraron estudios ultraestructurales en una revisin bibliogrfica de los ltimos 20 aos sobre el tema.

Algunas serpientes Viperidae contienen enzimas, tales como: batroxobina de Bothrops asper, marajoensis y moojeni; la reptilasa de B. atrox y la mutasa de Lachesis muta (Kamiguti et al., 1991). Dentro de la misma familia, los venenos Bothrpicos son mezclas complejas que contienen diferentes enzimas, toxinas y sustancias, entre ellas: proteinasas, particularmente la enzima semejante a la trombina (Figura 1) responsable de la coagulacin de fibrina en la fase de coagulacin de la sangre (Zaganelli et al., 1996).

Otras enzimas descritas son las fosfolipasas A2. Bothropstoxina I (Bthtx-I) y II ( BthtxII), que fueron purificadas y caracterizadas del veneno de Bothrops jararacussu. La fosfolipasa A2 miotxica fue aislada de Bothrops asper (Gutierrez et al., 1990 ), y la miotoxina bsica, del veneno de la Bothrops nummifer, (Gutierrez et al., 1980; Chaves et al., 1989). La miotoxina II purificada del veneno de Bothrops asper es una protena bsica, dimrica con un monmero de peso molecular de 13,3kDa, que de acuerdo con la composicin del aminocido contiene una alta cantidad de residuos de aspartato y lisina como los de los aminocidos hidrofbicos (Lomonte et al., 1989). Dos fosfolipasas A2 miotxicas bsicas fueron purificadas del homogenato del veneno de Bothrops godmani de Costa Rica, con pesos moleculares de 14,3 kDa (miotoxina I) y 13,4 kDa (miotoxina II), que se comportan como protenas anfifilicas y tienen composicin de aminocidos similares (Daz et al., 1992). Del efecto y acciones del veneno, los bothrpicos muestran actividades diferentes sobre diversos substratos tisulares, provocando una variedad de lesiones, tales como: hemorragias, desrdenes neuromusculares y destruccin de diversos tejidos (Rodrguez-Acosta et al., 1995). Las protenas y los pptidos biolgicamente activos de los venenos de serpientes interaccionan con componentes del sistema hemosttico humano, afectando la coagulacin sangunea, las clulas endoteliales y a las plaquetas (Markland F., 1998). La actividad coagulante del tipo trombina produce fibrina a partir de fibringeno o por activacin del factor X en presencia del calcio. La formacin de trombos es casi instantnea en la vecindad del rea de inoculacin y en cierta forma bloquea la difusin del veneno por va hemtica; existe sin embargo, difusin linftica y formacin de microtrombos de fibrina, especialmente en capilares pulmonares. El consumo de fibringeno puede producir coagulacin intravascular diseminada con la aparicin de hemorragias difusas (Toro et el., 1983).

Actividades estersicas y fosfolipsicas (hemolticas y miotxicas) del veneno

Las esterasas del veneno de serpiente no siempre inducen agregacin plaquetaria y no activan ni destruyen los factores V y VIII por lo cual la heparina no es til en estos casos. A ello se agrega la accin vascular directa de las hemorraginas, polipptidos no enzimticos que causan separacin de las uniones endoteliales. El edema local observado en las mordeduras de Bothrops se debe a la accin proteoltica del mismo. Esta es producida por varias enzimas que actan en substratos diferentes y se manifiestan en el paciente por dolor, edema, eritema, equimosis y flictenas en el sitio de la mordedura (Toro et al., 1983). Componentes como la fosfolipasa A2 (PLA2), cataliza la hidrlisis de la cadena de Sn-2 acil de los fosfolpidos de membrana resultando la prdida de la integridad y eventual muerte celular (Bortoleto et al., 1996). Desde el punto de vista histopatolgico, los venenos de muchas especies de serpientes causan dao en el tejido en el sitio de la inyeccin o mordedura y consisten en hemorragias, necrosis muscular y edema. En varios casos de envenenamiento puede producir perdida del tejido, incapacidad o amputacin (Rucavado et al., 1996). El veneno perteneciente al genero Bothrops es el responsable del 90% de las mordeduras que ocurren en el Brasil las cuales afectan al mecanismo hemosttico (Zaganelli et al., 1998). Investigaciones efectuadas en varios pases con el veneno del genero Bothrops (Gutierrez et al., 1980; Rodrguez-Acosta et al., 1993) han demostrado que causa un efecto local caracterizado por dolor, edema, equimosis, flictenas hemorrgicas y necrosis del tejido muscular. Los daos mencionados son producidos por algunos componentes del veneno como son las miotoxinas, que afectan a las fibras musculares, las hemorrginas que alteran la microvasculatura local y sistmica, as como otras sustancias que provocan edema con incremento de la presin tisular local. Aparte los venenos estudiados se pueden dividir en 3 grupos: Muy edematizante (B. Jararaca y B. jararacussu), medianamente edematizantes (B. Neuwiediidiporus y B. alternatus ) y con escasa actividad ( Crotalus durissus terrifucus ). El veneno que mostr mayor actividad hemorrgica fue el de B. Neuwiedii deporus seguido de B. Jararacussu, B. Alternatus y jararaca, Crotalus durissus terrificus no produjo actividad hemorrgica. El veneno de B. jararacussu provoc edema subcutneo, necrosis fibrinoide de los vasos sanguneos y reas pequeas de necrosis muscular. Con el veneno de B. jararaca se observ infiltrado inflamatorio, edema subcutneo con micro-hemorrgias, dilatacin de los vasos linfticos y necrosis de los vasos sanguneos. El veneno de B. Neuwiedii deporus produjo edema leve y no se detectaron lesiones en los vasos sanguneos; los venenos de B. alternatus y B. neuwiedii deporus causan edema y necrosis de las fibras musculares. La trombocitina, una serina proteinasa aislada del veneno de Bothrops atrox causa agregacin y secrecin de las plaquetas. (Glusa, E et al 1991). Orejuela et al 1991, encontraron edema local, hemorragias e hipotensin en casos humanos que sufrieron mordeduras por B. pictus y B. barnetti. Estudios realizados en ratas con batroxobina del veneno mostr "in vitro" una actividad fibrinolitica y un efecto inhibitorio sobre la agregacin plaquetaria. El desarrollo de la

coagulopatia o hemorragia fue estudiado 2 horas despus de la inyeccin con batroxobina y se encontr que la sangre era incoagulable con bajos niveles de fibrinogeno. La inyeccin de la hemorragina produjo daos severos al endotelio vascular, msculo esqueltico y hemorragias en los riones, pulmones e hgado (Kamiguti et al., 1991). En humanos el veneno de la B. Jararaca caus sntomas locales, tales como: hinchamiento, equimosis y necrosis tambin desarrollaron manifestaciones sistemicas atribuibles a la actividad de la trombina, del factor X, de la protrombina activante de un componente de la agregacin plaquetaria (Kamiguti et al., 1991 ). Los efectos de una fosfolipasa A2 de Bothrops asper sobre las miofibrillas del msculo esqueltico induce una necrosis despus de la inyeccin intramuscular en el ratn. La secuencia de estos cambios fue hipercontraccin con formacin de masas densas alternados con espacios desprovistos de miofilamentos en el citoplasma. Esta etapa inicial es el resultado de la entrada de calcio despus que la toxina induce dao al sarcoplasma. Un segundo cambio ocurre entre las 3 y 6 horas, aparecen " cambios hialinos " y los filamentos relajados tienen una distribucin uniforme en el espacio intraclular. Finalmente, entre las 24, 48 y 72 horas, la degradacin generalizada de protenas miofibrilares probablemente causada por proteasas provenientes de clulas inflamatorias, tales como: neutrofilos y macrfagos que aumentan en nmero durante este periodo (Gutirrez et al., 1990). La actividad hemorrgica es causada por metaloprotenasas de veneno que degradan protenas de la membrana basal en la pared de los vasos sanguneos. Esta accin conduce a la prdida de la integridad de los capilares con resultados hemorrgicos del sitio. Las toxinas hemorrgicas son metaloprotenasas, poseen un solo mol de zinc por molcula de protenasa, son capaces de degradar protenas de membrana basal incluyendo fibronectina, laminina y colgeno tipo IV degradando tambin gelatina y fibrinogeno. Bjarnason y Fox (1994) han dividido las metaloprotenasas hemorrgicas en tres clases basadas en el tamao molecular de la protenasa. En estudios de protenas jararhagina C que se asl y se caracteriz de veneno de Bothrops jararaca, contiene unos dominios semejantes a desintegrinas y rico en cisteina. Las jararhaginas C tambin inhiben agregacin plaquetaria inducida por colgeno y ADP. As, estas acciones de la jararhagina contribuye a estimular la va fibrinolitica pueden tambin contribuir con el sistema hemorrgico observado en vctimas envenenadas con el veneno de Bothrops jararaca.

Actividades neurotxicas del veneno

Con respecto al componente neurotxico de los venenos de serpientes, mayormente descritos en crotlidos en el anlisis de muchas de estas neurotoxinas, sabemos que en condiciones naturales no son capaces de penetrar la barrera hematoenceflica, sin embargo, bajo profundas alteraciones, ellas pueden alcanzar el SNC y originar cuadros patolgicas, hasta ahora mal descritos (Monterrey, 2001). Es interesante tambin, la identificacin de nuevas sustancias que, actuando sobre el sistema nervioso, pudieran tener potencial teraputico, de uso en humanos. Conocemos que las neurotoxinas son componentes clsicos de veneno, que afectan particularmente la unin neuromuscular y producen una parlisis flccida. Sin embargo, no todas las neurotoxinas tienen el mismo sitio ni modo de accin o producen similares efectos clnicos. La unin neuromuscular en msculo esqueltico existe en todos los msculos voluntarios y respiratorios. En la unin, una seal transmitida a travs del Sistema Nervioso Central, finalmente resulta en un potencial de accin en el axn terminal, con la activacin de canales inicos, liberando posteriormente el neurotransmisor acetilcolina. Esta es producida en el axn terminal y almacenada en vesculas sinpticas. Una vez liberadas, cruza el mnimo espacio extracelular para ir a unirse a receptores especficos en la superficie de la placa neuromotora. Luego del potencial de accin muscular, la acetilcolina es metabolizada por colinesterasa en el espacio extracelular, estos metabolitos se van a reciclar en el axon terminal para reelaborar nueva acetilcolina. Las neurotoxinas presentes en los venenos de serpientes actan sobre distintas estructuras, y de all que originan distintos cuadros clnicos y patolgicos. De acuerdo al sitio de accin pueden ser neurotoxinas presinpticas de la unin neuromuscular, que afectan el axn terminal, por un mecanismo no entendido totalmente. Producen ruptura de vesculas sinpticas, dao al axn terminal y cese de la descarga de acetilcolina, bloqueando completamente la transmisin neuromuscular. Esto causa parlisis flccida de los msculos afectados. Sin embargo, el proceso no es instantneo. La neurotoxina presinptica debe localizar la unin neuromotora, unirse a la membrana del axn terminal, y daar esta membrana. Entonces, ejercer el efecto de la toxina que inicialmente causa una descarga de acetilcolina, con algunas contracciones musculares, raramente notadas clnicamente, antes de pasar a destruir vesculas y bloquear la extensa descarga de este neurotransmisor. Experimentalmente, este proceso toma aproximadamente una hora. Clnicamente, debido al tiempo extra tomado para que la neurotoxina sea absorbida y alcance la circulacin, salga de nuevo al compartimiento extravascular y localize la unin neuromotora, el proceso puede tomar de media a varias horas. Es improbable la aparicin de la parlisis presinptica en menos de 12 horas posteriores a la mordedura de la serpiente. Normalmente se ve primero los rasgos clnicos de parlisis temprana en los nervios craneales, con ptosis (cada de los prpados superiores) como primera seal. Debido a que las neurotoxinas presinpticas causan dao al axon terminal, ellas son pobremente sensibles a la terapia con el antiveneno. As, una vez que la parlisis flccida severa se establece con envolvimiento respiratorio, el antiveneno se muestra ineficaz para invertir la parlisis.

Estas neurotoxinas han sido descritas en serpientes americanas ( Crotalus spp (crotoxina, crotamina), Micrurus spp (alpha y beta-neurotoxina), Lachesis spp). Adems en serpientes de otras reas geogrficas como Australia ( Elapidae (notexin, taipoxin, textilotoxin) y bbungarotoxin. Todas ellas probablemente relacionadas a la familia de las fosfolipasas, aunque altamente evolucionadas y algunas veces con multicomponentes. Las neurotoxinas postsinpticas de la placa neuromotora son ms comunes que las toxinas presinpticas, son menos potentes, pero ms rpidas en actividad, y potencialmente ms letales. Se unen al receptor proteico de acetilcolina o a sus adyacencias en el extremo terminal de la placa del lado del msculo, bloqueando as la seal que llega al msculo, produciendo una parlisis flccida. Debido a que ellas pueden actuar tan pronto como alcanzan la placa neuromotora, pueden causar parlisis ms rpido que las presinpticas. Como estas toxinas se hallan expuestas en la superficie celular, en el compartimiento extracelular, extravascular, ellas son accesibles a los antivenenos. As, las parlisis postsinpticas pueden revertirse con el antiveneno. Como una alternativa, si aumentamos la cantidad de acetilcolina liberada, ello puede sobrepasar la actividad de la neurotoxina postsinptica. Esto sobrepasa el bloqueo y restablece la transmisin en la placa. Las neurotoxinas postsinapticas de placa motora son muy frecuentes en los venenos de serpiente, sobre todo en los venenos elapdicos; el componente clsico es la alfabungarotoxina. Estas toxinas son ligeramente uniformes en estructura y tamao. Tienen una estructura compleja plegada con una configuracin clsica de "tres dedos" , estando el sitio activo en el "dedo" medio. Se subdividen en dos grupos principales, basados en el tamao; las toxinas de cadena corta y las de cadena larga. Las toxinas de cadena corta contienen 60-62 residuos de aminocidos, unidos por 4 puentes disulfuro. Las toxinas de cadena larga tienen 7074 residuos de aminocados, unidos por 5 puentes disulfuro y una gran afinidad para el receptor de acetilcolina (ref). Las dendrotoxinas, actan sobre la placa neuromotora, son presinpticas (diferentes de las bungarotoxinas), bloquean canales de potasio en la membrana del axn terminal, causando una sobreliberacin de acetilcolina, produciendo estimulacin inicial y luego bloqueo, generando una parlisis flccida. Las dendrotoxinas son polipptidos bsicos de cadena simple con 57-60 residuos de aminocidos, unidos por 3 puentes disulfuro. Hay otro grupo de neurotoxinas presinpticas: la fasciculinas o "angusticeps-like". Son estructuralmente similares a las neurotoxinas

postsinpticas, pero inmunolgicamente distintas y con una accin bastante diferente. Son potentes inhibidores de colinesterasas, causando fasciculaciones musculares. Son sinergsticas con las dendrotoxinas. Las fasciculinas incrementan la liberacin de la acetilcolina y las dendrotoxinas, inhiben su metabolismo. Otros tipos de neurotoxinas, no slo se confinan a la placa neuromotora, causando parlisis flccida. En venenos de serpiente hay una clase extensa de neurotoxinas, las kappa-toxinas que afectan el sistema nervioso autnomo. Existe tambin una serie extensa de neurotoxinas que causan hiperestimulacin de otras partes del sistema nervioso. El sistema nervioso central (SNC) trata de conservar su homeostasis a travs de estructuras que efectan una permeabilidad selectiva y son conocidas como la barrera hemato-enceflica (BHE) ejercida por las clulas endoteliales capilares del SNC, la barrera hemato-fluido cerebroespinal ejercida por los plexos coroides y los vasos piales as como tambin la barrera de la interfase epndimo- fluido cerebroespinal. El transporte a travs de estas barreras se realiza por varios mecanismos, como son: los canales inicos, transportes especficos, bombas dependientes de energa y endocitosis mediada por receptores ( Neuwelt et al., 1999). La exposicin humana a sustancias neurotxicas es por va ocupacional, ambiental, teraputica o en alimentos, y stas llegan al SNC por lesin de las diferentes barreras mencionadas o bien, por los mecanismos de transportes permitidos por ellas. Existen numerosas sustancias que producen daos en estructuras celulares neuroepiteliales, como por ejemplo el cadmio que produce glicogenosomas en axones por inhibicin de la a-glucosidasa (Hamada, 1981), el plomo orgnico induce dao neuronal con formacin de cuerpos densos multivesiculares y vacuolizacin del retculo endoplsmico liso (REL), la elevacin de niveles de fenitoina conduce a la proliferacin del REL en pre-sinapsis de axones de clulas de Prkinje, en la intoxicacin por Hg orgnico e inorgnico, se ha descrito dao de ribosomas y del retculo endoplsmico rugoso con la consecuente disminucin de sntesis de protenas, la sobre dosis de drogas como la cloroquina interfiere en la degradacin de lisosomas con la consecuente acumulacin de complejos lipdicos lisosomales y drogas como la adriamicina, que produce alteraciones nucleares en neuronas por probables enlaces con el DNA nucleolar y la consecuente muerte celular tarda. Existen sustancias que afectan la integridad de las clulas endoteliales de los capilares del SNC y en consecuencia a los elementos neuroepiteliales como ocurre con los arsenicales orgnicos, el cadmio, en la intoxicacin aguda por plomo inorgnico, enzimas fibrinolticas (Nagy et al., 1998) y otras. Adems, se han descrito lesiones en los capilares y los cambios estructurales observados en varios tejidos u rganos, que han sido atribuidos a fenmenos de isquemia (Gutierrez et al., 1998). En el conocimiento de los diferentes componentes que conforman a estos venenos y el efecto de los mismos en diversos tejidos, nos ha llamado la atencin la escasa literatura encontrada sobre el efecto de los mismos en el SNC y la hipfisis. En las autopsias de tres pacientes que murieron por mordedura de serpiente Vipera russeli, (Than et al., 1988) encontraron entre otras lesiones, edema y congestin cerebral marcados, as como hemorragia en la adenohipfisis. Sandbank et al., 1966; Sandbank et al., 1974 encontraron alteracin de la BHE por estudio histoqumico y ultraestructural, sin evidencia de sangramiento cerebral.