Alim. Nutr., Araraquara v.17, n.3, p.287-293, jul./set.

2006

ISSN 0103-4235

INFLUNCIA DOS ADITIVOS ALIMENTARES NA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO DE PRODUTOS DE ALHO*

Yara Severino de QUEIROZ** Deborah Helena Markowicz BASTOS** Geni Rodrigues SAMPAIO*** Rosana Aparecida Manlio SOARES** Emlia Yasuko ISHIMOTO** Elizabeth Aparecida Ferraz da Silva TORRES**

RESUMO: A atividade antioxidante em produtos de alho com e sem aditivos (cido ctrico, metabissulfito de sdio e benzoato de sdio) foi investigada. Extratos metanlicos de alho picado sem sal (AP), picado com sal (APS) e misto mistura do alho in natura com o desidratado (AM) - foram avaliados quanto ao teor de fenlicos totais e atividade antioxidante com os mtodos DPPH (1,1-difenil-2picrilhidrazil), sistema -caroteno/cido linolico e Rancimat. O teor de fenlicos totais do extrato em base seca foi significativamente maior (p<0,05) para todos os produtos que no continham os aditivos. Em relao atividade antioxidante, as amostras com aditivos apresentaram melhores resultados em todos os testes. Concluiu-se que, apesar do teor de fenlicos totais ser maior nas amostras sem aditivos, a presena de aditivos aumentou o potencial antioxidante dos produtos de alho. PALAVRAS-CHAVE: Alho; atividade antioxidante; aditivos alimentares; DPPH; Rancimat; sistema -caroteno/ cido linolico.

INTRODUO O alho (Allium sativum) foi descoberto no Egito, na data de 3.700 a.C., quando era empregado como medicamento.8,14 Este vegetal pertence famlia Liliaceae, que contm mais de 700 espcies, incluindo a cebola, o alhopor e a cebolinha.5 Segundo a Legislao10, o alho considerado uma especiaria. Por definio, especiarias so os produtos constitudos de partes (razes, rizomas, bulbos, cascas, folhas, flores, frutos, sementes e talos) de uma ou mais espcies vegetais, tradicionalmente utilizadas para agregar sabor ou aroma aos alimentos e bebidas. O consumo de produtos obtidos a partir do alho in natura aumentou nos ltimos anos, no s por ser apreciado

como especiaria, mas tambm devido s suas qualidades benficas como a atividade antioxidante.9,13,15,16,28 A atividade antioxidante das plantas da famlia Allium tem sido motivo de vrios estudos. Alho e seus extratos tm demonstrado propriedade antioxidante em diferentes modelos in vitro,15, 28, 30 a qual atribuda aos compostos organosulfurados e seus precursores,16,17 bem como as substncias fenlicas. Vrios estudos demonstraram que a alicina, S-alilcistena, Salilmercaptocistena, dialil sulfito (DAS), dialil dissulfito (DADS), e o dialil trisulfito so compostos volteis presentes no alho e que possuem atividade antioxidante.9,13,16 A principal perda de qualidade do processamento do alho causada pelo seu escurecimento que ocorre devido ao da enzima polifenoloxidase sobre os compostos fenlicos. Estes so oxidados ortoquinonas que se polimerizam em melaninas, os quais conferem a colorao escura ao produto.7 A indstria de alimentos tem sido beneficiada pelo desenvolvimento de novas substncias que podem ser adicionadas aos alimentos com o objetivo de melhorar a cor, o aroma, a textura e o sabor. Estas substncias so conhecidas como aditivos alimentares que correspondem a qualquer substncia presente por adio, intencional ou no, a um alimento, com finalidades tecnolgicas como conservao contra deterioraes bacterianas, proteo contra alteraes oxidativas e fornecimento de caractersticas sensoriais.6,23 O cido ctrico, aditivo normalmente adicionado ao alho, um acidulante verstil, hidrossolvel, sequestrante de ons metlicos (prevenindo reaes indesejveis de oxidao de cor e aromas), antioxidante, seguro na manipulao, incuo do ponto de vista de sade e pouco corrosivo para as instalaes industriais.23 Sua utilizao se constitui em uma alternativa simples e segura para o processamento industrial dos produtos de alho,7,18 nos quais tambm so adicionados os conservadores benzoato de sdio e metabissulfito de sdio. Tanto o cido ctrico quanto seus sais so eficazes contra bolores e leveduras. A maior

_________________
* Trabalho elaborado com auxlio financeiro da Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP - Processo no 04/01187-8). ** Departamento de Nutrio da Faculdade de Sade Pblica - Universidade de So Paulo - Campus de So Paulo - 01246-904 - So Paulo - SP - Brasil. *** Departamento de Nutrio - Programa Interunidades (PRONUT- FCF/FEA/FSP) - Universidade de So Paulo - Campus de So Paulo - 05508-900 - So Paulo - SP - Brasil.

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solubilidade em gua e a no interferncia na colorao tornam o benzoato de sdio o mais utilizado. Os benzoatos tm a propriedade de serem incuos para o emprego em alimentos, em um nvel mximo de 0,3 g/100 g.2,6,12,23,26 Outro conservador muito utilizado em alimentos o dixido de enxofre (SO2) e seus derivados. Atualmente esse gs raramente utilizado, sendo substitudo por outros compostos geradores de dixido de enxofre (SO2) como o sulfito de sdio (Na 2 SO 3 ), sulfito cido de sdio (NaHSO 3 ) e metabissulfito de sdio (dissulfito de sdio - Na2S2O5). Os sais de sulfito possuem a vantagem de serem facilmente manuseveis e quando dissolvidos em gua formam cido sulfuroso, on bissulfito e on sulfito, que agem sobre bactrias e fungos. Os metabissulfitos so mais estveis que os bissulfitos.2,6,12,23,26 O metabissulfito de sdio, alm de atuar como antimicrobiano, antioxidante por prevenir a oxidao (seqestrador de oxignio e agentes redutores), inibidor das enzimas proteases, oxidases e peroxidases, tambm atua como agente quelante.22 A busca por produtos prontos para consumo cresceu na ltima dcada, incentivando o desenvolvimento de tecnologias que permitissem a fabricao do alho com qualidade. O processamento do alho em pasta ou picado pronto para consumo, de modo que se mantenha estvel temperatura ambiente, facilita a sua utilizao pelo consumidor. A tecnologia empregada permite que o alho e seus produtos apresentem como vantagens a segurana microbiolgica e manuteno das caractersticas sensoriais. Apesar do uso de aditivos ser permitido nos produtos de alho, estes devem ser utilizados na menor dose possvel.2,23 Neste estudo, o objetivo foi avaliar a influncia dos aditivos alimentares utilizados normalmente nos produtos de alho sobre a atividade antioxidante.

MATERIAL E MTODOS As amostras de alho in natura (Allium sativum) foram obtidas da Companhia de Entrepostos e Armazns Gerais de So Paulo (CEAGESP). O local de plantio das amostras foi na regio de Curitibanos - SC no perodo de julho de 2004 e a colheita em dezembro do mesmo ano. A classificao do produto grupo - nobre; subgrupo - roxo; classe - 7. Posteriormente, estas amostras foram enviadas para uma empresa processadora de alho em escala industrial, onde as amostras foram processadas, conforme descrito na Figura 1. As caractersticas especficas dos produtos de alho esto apresentadas abaixo: Alho picado sem sal (AP): alho in natura picado; Alho picado com sal (APS): alho in natura picado adicionado de 2% de sal (m/m); Alho misto (AM): este produto uma mistura do in natura picado com o desidratado, na proporo 1:5 (m/m). O alho desidratado proveniente da China cujas informaes sobre a sua variedade botnica no foram disponibilizadas pela empresa fornecedora das amostras, pois a mesma no dispunha deste dado. Obteno dos extratos A obteno do extrato metanlico para avaliar a atividade antioxidante e o teor de fenlicos totais dos produtos de alho baseou-se no mtodo descrito por Nuutila et al.21 com modificaes. Foram pesadas 3 g de amostra e adicionados 20 mL de metanol. A amostra foi mantida por uma hora sob agitao e posteriormente ultrassonificada (ultrasson marca Thornton) por 20 minutos, sendo em seguida

alho in natura aquisio CEAGESP amostras com aditivos* amostras sem aditivos

alho picado sem sal

(AP)

alho picado sem sal

(AP)

alho picado com sal - 2%

(APS)

alho picado com sal - 2%

(APS)

alho misto
(AM)

alho misto
(AM)

* Para cada 10 kg destes produtos foram utilizados 800 g de cido citrco, 15 g de metabissulfito de sdio e 6 g de benzoato de sdio.

FIGURA 1 - Esquema das amostras obtidas dos produtos de alho com e sem aditivos. 288

filtrada utilizando papel filtro (marca Nalgon, dimetro 12,5 cm e porosidade 3 Un). O sobrenadante foi recolhido em balo volumtrico de 50 mL. O resduo retido no filtro foi re-extrado, e o segundo sobrenadante adicionado ao primeiro. Outros 10 mL de metanol foram utilizados numa terceira extrao e, aps essa etapa, o resduo foi descartado. O volume final foi levado a 50 mL com metanol. Posteriormente, foi determinada a matria seca (em mg/mL) dos extratos pelo mtodo gravimtrico. O volume de 1 mL do extrato foi transferido para vidro relgio, previamente tarado, e este foi colocado em estufa a 105oC, por 16 horas, seguido de resfriamento em dessecador e pesagem, sendo a operao repetida at peso constante4. A finalidade de determinar a matria seca se deve padronizao da concentrao das diferentes amostras para avaliao da atividade antioxidante. Os extratos metanlicos foram condicionados em frascos mbar, secos sob atmosfera de nitrognio para evitar a oxidao e armazenados -18oC at o momento das anlises. Caracterizao dos extratos O teor de fenlicos totais presente nos extratos dos produtos de alho com e sem aditivos foi determinado de acordo com o mtodo descrito por Nuutila et al.21 utilizandose o reagente de Folin-Ciocalteu (Merck). Em tubos de ensaio, foram adicionados 400 L do extrato, 400 L de metanol, 400 L de Folin-Ciocalteu e 2000 L da soluo de carbonato de sdio (20% m/v). A mistura foi homogeneizada em agitador de tubos, sendo adicionados mais 800 L da soluo de carbonato de sdio (20% m/v). Posteriormente, as amostras foram centrifugadas (centrfuga marca ALC, modelo 4239R - Itlia) por 3 minutos a 14000 rpm e mantidas em repouso por 20 minutos temperatura ambiente. A anlise foi feita em espectrofotmetro UVvisvel, (Micronal, modelo B 542). Foi empregado como padro o cido glico. O clculo do teor de fenlicos foi realizado atravs da elaborao da curva padro do cido glico (0,005 a 0,03 mg/mL). Os resultados obtidos foram expressos em g equivalentes de cido glico/mg de matria seca. Atividade antioxidante Para todos os testes de atividade antioxidante (ensaio radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil - DPPH; sistema -caroteno/cido linolico; avaliao da capacidade protetora da oxidao lipdica utilizando o aparelho Rancimat), foi utilizada a concentrao de 1 mg de matria seca por mL de extrato. Ensaio com DPPH A capacidade das amostras em sequestrar radicais livres foi determinada atravs do ensaio DPPH (1,1-difenil2-picrilhidrazil), descrito por Yamaguchi et al. 27 com modificaes. Uma alquota de 1,5 mL da soluo metanlica de DPPH na concentrao de 20 mg/mL foi adicionada

750 L dos extratos das amostras. O decrscimo da absorbncia a 517 m foi monitorada em espectrofotmetro em diferentes intervalos de tempo (0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 e 20 minutos). Para se calcular a porcentagem da atividade antioxidante (AA) foi utilizado o valor de absorbncia no tempo de 20 minutos pela frmula abaixo: % AA = {[(abs. do branco do DPPH) - (abs. final da amostra - abs. do branco da amostra) ] / abs. do branco do DPPH} x 100 onde: abs. = absorbncia Branco do DPPH = 750 L de metanol + 1,5 mL da soluo de DPPH Branco da amostra = 750 L da amostra + 1,5 mL de metanol Sistema -caroteno/cido linolico

Para determinar a atividade antioxidante pelo sistema -caroteno/cido linolico, foi utilizada a metodologia descrita por Marco19 e modificada por Miller20 empregandose como substrato a soluo de -caroteno/cido linolico. Em 28 L da soluo de -caroteno foi adicionada 28 Lde cido linolico e 200 mg de Tween 40. Em seguida, o clorofrmio foi evaporado sob atmosfera de nitrognio e acrescentado 140 mL de gua oxigenada (gua destilada tratada com oxignio por 30 minutos). No tubo de ensaio, 5 mL desta soluo foi adicionada a 1 mL dos extratos. Aps ser homogeneizado, a leitura foi feita em espectrofotmetro a 470 m, sendo esta a leitura do tempo zero (tempo inicial). Os tubos foram ento colocados em banho-maria (50oC) e as prximas leituras foram feitas a cada 15 minutos, at atingir o tempo de 2 horas. A atividade antioxidante, expressa como porcentagem de inibio da oxidao lipdica (% IOL), foi calculada em relao a 100% da oxidao do controle (sem antioxidante) utilizando a frmula abaixo: % IOL = 100 - [(absorbncia inicial da amostra - absorbncia final da amostra)/ (absorbncia inicial do controle absorbncia final do controle)] x 100 Avaliao da capacidade protetora da oxidao lipdica utilizando o aparelho Rancimat Para avaliar a capacidade protetora utilizou-se o aparelho Rancimat 743, marca Metrohm, conectado ao programa PC: 743 Rancimat 1.0, onde foi medido o perodo de induo da banha de suno contendo o extrato metanlico, segundo Antolovich et al.1 Um miligrama de slidos solveis foram colocados nos tubos do aparelho Rancimat e evaporados sob atmosfera de nitrognio. Em seguida, 3g de banha de suno sem antioxidante foram adicionados em cada tubo e a mistura homogeneizada por 15 minutos em ultrasonificador. Depois, com a programao de temperatura de 110 oC 1,5 oC, fluxo de ar de 20 L/h, os tubos foram acoplados ao aparelho Rancimat, at que a curva de condutividade em relao ao tempo de induo 289

fosse finalizada para se calcular o ndice de Atividade Antioxidante (IAA). O controle foi testado com a banha de suno sem adio de antioxidante. Tratamento estatstico dos dados Os resultados foram apresentados como mdia desvio padro. Para comparar os produtos de alho com e sem aditivos foi realizado o teste t-student. Todas as anlises foram realizadas em triplicata, exceto o mtodo utilizando o aparelho Rancimat, para o qual realizaram-se em duplicatas. O nvel de significncia estabelecido para todos os testes estatsticos aplicados foi de 5% utilizando o "software" Statistical Package for the Social Sciences (SPSS), verso 10.0 for Windows.

RESULTADOS E DISCUSSO Na Tabela 1 esto apresentados os resultados dos teores de fenlicos totais dos extratos metanlicos dos produtos de alho com e sem aditivos. Todos os produtos com aditivos apresentaram menor teor de compostos fenlicos em relao queles sem aditivos (p < 0,05). Provavelmente ocorreu uma interao entre os aditivos e os compostos fenlicos do alho, uma vez que nenhum dos aditivos presentes no alho se classifica como composto fenlico. Segundo Arajo2 o aditivo metabissulfito reage rapidamente com vrios compostos. Este aditivo o principal composto utilizado na conservao de alimentos, gerando o dixido de enxofre (SO2) e seus nions bisulfito (HSO3-) e sulfito (SO32-). As reaes qumicas originadas quando o dixido de enxofre adicionado aos alimentos so complexas, sendo convertido, principalmente, a on

bissulfito (HSO 3-). Este on pode permanecer livre e disponvel para retardar a formao de compostos tpicos da reao de Maillard, como as melanoidinas, e pode tambm se ligar, reversivelmente, a certos compostos, como os grupos carbonilas de aldedos. 25 De acordo com Carbonell-Barrachina et al.11 quando o alho in natura picado ocorre a oxidao dos compostos fenlicos, formando as quinonas que apresentam colorao marrom. Os aditivos, como cido ctrico, bisulfito de sdio, entre outros, podem retardar a oxidao dos compostos fenlicos, inibindo a formao destes compostos indesejados (quinonas) que alteram a cor do produto. Tal no foi observado neste estudo. Na Tabela 2 esto apresentados os valores da atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH, dos extratos das amostras com e sem aditivos. O alho picado sem sal (AP) e o picado com sal (APS) com aditivos apresentaram melhor atividade antioxidante quando comparados s mesmas amostras sem aditivos. O alho misto (AM) com e sem aditivos no apresentou diferena estatisticamente significante. Apesar dos produtos com aditivos possuirem menor teor de compostos fenlicos do que os sem aditivos, os primeiros apresentaram melhor atividade antioxidante. Este resultado se justifica pela presena do cido ctrico e do metabissulfito de sdio, aditivos empregados nas amostras, os quais atuam como antioxidantes. O cido ctrico pode apresentar sinergismo com outras substncias que possuem ao antioxidante, conforme relatado por Silva.23 Assimopoulou et al.3 relataram que o cido ctrico apresentou sinergismo com os compostos antioxidantes presentes na resina Pistacia lentiscus, que um produto natural com proposta de uso farmacutico. Pelos resultados do sistema -caroteno/cido linolico (Tabela 3), constatou-se que as amostras de AP, APS e AM

Tabela 1 - Teores mdios e desvio padro (dp) de fenlicos totais dos extratos (em relao a matria seca) dos produtos de alho com e sem aditivos.

Alho

Alho picado (AP)

Alho picado com sal (APS)

Alho misto (AM)

com aditivos sem aditivos com aditivos sem aditivos com aditivos sem aditivos

Fenlicos totais do extrato ( g/mg/EAG*) em relao a matria seca 6,36 (0,54) 8,97 (0,25) 4,78 (0,37)

Nvel de significncia (p)** 0,000

0,000 6,13 (0,09) 6,21 (1,10) 0,005 8,36 (0,63)

* EAG = equivalentes de cido glico. ** p < 0,05 representa diferena estatisticamente significante.

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Tabela 2 - Valores mdios e desvio padro (dp) da atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH, do extrato metanlico dos diferentes produtos de alho com e sem aditivos.

Alho

Atividade antioxidante (%) com aditivos sem aditivos com aditivos sem aditivos com aditivos sem aditivos 28,80 (4,11) 17,16 (0,18) 23,11 (1,78) 19,08 (0,43) 24,92 (4,76) 25,36 (0,22)

Nvel de significncia (p)* 0,005 0,024 0,880

Alho picado (AP) Alho picado com sal (APS) Alho misto (AM)

* p < 0,05 representa diferena estatisticamente significante.

Tabela 3 - Valores mdios e desvio padro (dp) da porcentagem de inibio da oxidao lipdica (% IOL), pelo sistema -caroteno/cido linolico, dos produtos de alho com e sem aditivos.

Alho Alho picado (AP) Alho picado com sal (APS) Alho misto (AM) com aditivos sem aditivos com aditivos sem aditivos com aditivos sem aditivos

% IOL 34,42 (4,47) 30,21 (0,56) 38,11 (2,56) 26,51 (1,56) 40,94 (4,94) 37,38 (1,10)

Nvel de significncia (p)* 0,050 0,012 0,025

*p < 0,05 representa diferena estatisticamente significante.

Tabela 4 - Valores mdios e desvio padro (dp) do ndice de atividade antioxidante (IAA), medido pelo aparelho Rancimat, dos produtos de alho com e sem aditivos.

Alho Alho picado (AP) Alho picado com sal (APS) Alho misto (AM) com aditivos sem aditivos com aditivos sem aditivos com aditivos sem aditivos

IAA* 1,66 (0,13) 1,62 (0,08) 1,35 (0,08) 1,38 (0,13) 1,39 (0,12) 1,21 (0,07)

Nvel de significncia (p)** 0,642 0,704 0,071

* IAA = tempo de induo (h) da amostra / tempo de induo (h) do controle. ** p < 0,05 representa diferena estatisticamente significante.

com a presena de aditivos, apresentaram melhor eficincia na inibio da oxidao lipdica do que as amostras sem aditivos. Em relao ao ndice de atividade antioxidante (Tabela 4), no houve diferena significativa entre s amostras de alho picado sem sal, com sal e misto com a adio de aditivos quando comparadas as amostras sem aditivos. Assim, observou-se que no teste utilizando o aparelho Rancimat a presena do cido ctrico e do metabissulfito de sdio no causou o mesmo impacto verificado nos outros dois mtodos. possvel que a atuao do cido ctrico e do metabissulfito de sdio como antioxidantes seja dependente do perfil lipco do substrato ou das condies de oxidao do meio. No Rancimat

utilizada a banha de suno, rica em cidos graxos saturados (60%), enquanto que no sistema -caroteno/cido linolico utiliza-se somente o cido linolico, cido graxo poliinsaturado. Adicionalmente, no Rancimat h um fluxo contnuo de oxignio, que influencia a ligao do dixido de enxofre, podendo oxid-lo, irreversivelmente sulfato, diminuindo a atuao deste aditivo.29 Desta forma, a atividade antioxidante in vitro deve ser avaliada com diferentes testes. Contudo, todos estes ensaios baseados em reaes qumicas diferentes oferecem resultados diferentes, conforme verificado no presente estudo e por Sun & Ho,24 onde estes autores estudaram os diferentes extratos de trigo sarraceno utilizando trs mtodos para avaliar a atividade antioxidante.

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CONCLUSES A presena de aditivos na amostras de alho pode ter contribudo para a reduo do teor de fenlicos totais atravs de uma possvel interao destes aditivos com os fenlicos. A adio do cido ctrico e do metabissulfito de sdio nos produtos de alho contriburam de modo significativo para o efeito antioxidante avaliado pelos ensaios DPPH e sistema -caroteno/cido linolico. Tal no ocorreu com o mtodo que utiliza o aparelho Rancimat, provavelmente, devido aos diferentes perfis lipdicos dos substratos e s diferentes condies metodolgicas.

QUEIROZ, Y. S.; BASTOS, D. H. M.; SAMPAIO, G. R.; SOARES, R. A. M.; ISHIMOTO, E. Y.; TORRES, E. A. F. S. Role of additives in vitro antioxidant activity of garlic products. Alim. Nutr., Araraquara, v.17, n.3, p. 287-293, jul./set.2006. ABSTRACT: The antioxidant activity in garlic products with and without additives (citric acid, sodium metabissulfite and sodium benzoate) was investigated. Different methanolic extracts of garlic were evaluated: chopped with salt (CWS), chopped with no salt (CNS), fried (F) and mixed (M), i.e., in natura garlic with dehydrated garlic. Total phenolic compounds in the samples were measured, and the antioxidant activity were evaluated using three different methods: DPPH (1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl) assay, carotene/linoleic acid system and Rancimat method. The total phenolics content of the extracts in relation to the dried residue was significant higher (p<0,05) in all samples with no additives. Regarding to the antioxidant activity, the samples with additives showed better results in all tests. We concluded that, although the higher content of phenolic compounds in the samples with no additives, the presence of additives improved the antioxidant potential in garlic products. KEYWORDS: Garlic; antioxidant activity; food additives; DPPH; Rancimat; -carotene linoleic acid.

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