Valdes Thesis

Universidad Autnoma de Barcelona
Departamento de Qumica
Estudio de la influencia de parmetros fsicos en la construccin de modelos de calibracin en la Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano
Autor: Dmarih Valds Calvio Director: Dr. Marcelo Blanco Romia
Bellaterra, 2005
A mis padres, eterna fuente de inspiracin.
Nada sugiere tanta y tan hermosa literatura como un prrafo de ciencia. Jos Mart
Agradecimientos
Haber terminado este trabajo ha sido muy gratificante y ha estado lleno de momentos reconfortantes, pero tambin de momentos difciles. A lo largo de esta travesa he contado con el apoyo de muchsimas personas a las cuales les quiero expresar mi gratitud, pues sin ellas seguramente este barco no habra llegado exitosamente a tierra firme. Expresar los sentimientos con palabras es una tarea difcil, pero me aventuro a ello. Al Dr. Marcelo Blanco por haberme dado la oportunidad de iniciar este trabajo y haberme abierto las puertas del maravilloso universo de la espectroscopia NIR. Igualmente quiero agradecer a los profesores Hortensia Iturriaga, Jordi Coello y Santiago Maspoch por sus aportes cientficos a lo largo de estos aos. Concluir este trabajo ha sido tambin posible gracias a mis profesores Dr. Miguel Catass y Dra. Roser Rubio, ambos han sido un eslabn importante en mi formacin profesional. Admiro en ellos su gran nivel cientfico y su excelente calidad humana, que hacen posible que me sienta cerca de ellos a pesar del paso del tiempo. Agradezco a mis compaeros del Grupo de Quimiometra Aplicada (a los pasados y a los presente; a los catalanes, castellanos, andaluces y de toda la pennsula ibrica) pues hemos compartido muchas horas en el laboratorio y con cada uno he aprendido algo. A Manel quiero agradecerle de modo especial, no solamente por sus contribuciones cientficas a lo largo de esta etapa, sino tambin por su maravillosa amistad que me ha abierto las puertas de Catalua y ha hecho posible que me sienta como en casa. Gracias tambin a su familia, pues tener el amor de una familia cuando se esta lejos de casa, es un valiossimo tesoro. Al personal de Secretaria de Qumica, muy especialmente a Cecilia Inchausti, Puri Motta y Angels Solvas quiero agradecerles por su eficiente y humana gestin administrativa. Gracias tambin a Jos Manuel Cataln un buen laborante con un especial sentido del humor. No podra dejar de mencionar a mis adorados amigos, que son la familia que la naturaleza no me dio, pero afortunadamente gan en el camino de la vida. A Giselle, la de los aos, la de siempre a Yencita, por su ternura y su paz a Pio, por seguir siendo mi eterno amigo de la Universidad a Yovn, por sus exquisitas comiditas y por algn que otro craqueo al estilo pinareo a Xavi, por compartir esa gran pasin hacia Barcino a
Agradecimientos
Wilfre, por su poder meditico en aras de la comprensin y la conservacin de la amistad a Suany y Tamo, por mantener el cuarteto del bachillerato a Osvi, Julio, Carlos E., Dacal, Daniel, etc. por las noches inolvidables en nuestra amada Habana a F. Juncal, porque siempre, siempre, ests ah a Lisy y la pea mdica de Manrusia, por su gran calidad mdica y humana. Por favor el orden de los factores no altera el producto, para cada uno hay un espacio inmenso dentro de mi corazn!!! Quiero agradecer especialmente a mi familia de Santa F, Nuevo Vedado, Vedado y 502 que si bien estamos separados por un inmenso ocano, nos mantenemos unidos por los lazos indestructibles del amor. Tambin quiero expresar mi gratitud hacia la familia de Gastn -que como muchos andamos desperdigados por el planeta- en la Florida, North Carolina y Le Danseuse. Un agradecimiento muy especial para mis abuelas Abue y Tatica, seres maravillosos en la vida de un ser humano, que tanta dulzura y proteccin me han brindaron desde la cuna. Tatica, donde quiera que ests, sabrs que esto ha sido posible tambin a tu ejemplo de disciplina y perseverancia. A mis hermanas Yai, Diani y Laura, quiero repetirles cuanto las quiero y cuan importante son para mi cada da, a pesar de ese maldito ocano. Por ustedes intento dar lo mejor de mi cada da. Engendrar a un ser humano es un acto maravilloso y a su vez difcil, pero ms aun es guiarlo por el arduo camino de la vida. Mami y papi, creo sinceramente que lo han hecho de forma excepcional y me faltan palabras para agradecerles todo lo que han hecho y siguen haciendo por m. La culminacin de esta tesis, es tambin una obra de ustedes. Por ultimo quiero agradecer de modo especial a Gastn por su colaboracin y fe en este proyecto, acompaado de buenas dosis de comprensin, paciencia e infinito amor. Empezar y terminar este proyecto juntos, ha sido un sueo para ambos y una motivacin para lanzarnos en la arriesgada pero gratificante aventura de ser padres.
A todos, de corazn, mi eterna gratitud. Dmarih
ndice
ABSTRACT OBJETIVOS ................................................................................................................................... 1 INTRODUCCION
1. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano .................................................................................... 3 1.1 1.2 1.3 Breve resea histrica.......................................................................................................... 3 Fundamentos tericos.......................................................................................................... 4 Instrumentacin .................................................................................................................. 10 1.3.1 Fuente de radiacin.................................................................................................... 11 1.3.2 Sistema de seleccin de longitud de onda .................................................................... 12 1.3.3 Compartimiento de la muestra .................................................................................... 13 1.3.4 Detectores................................................................................................................. 16 1.4 Aplicaciones de la Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano ...................................................... 16 2. Quimiometra ............................................................................................................................. 23 2.1 Anlisis Cualitativo............................................................................................................... 23 2.1.1 Mtodos de Reconocimiento de Pautas (PRMs) .............................................................. 24 2.1.1.1 Mtodos No Supervisados ................................................................................. 26 2.1.1.2 Mtodos Supervisados ...................................................................................... 30 2.1.1.3 Bibliotecas de Identificacin .............................................................................. 34 2.2 Anlisis Cuantitativo............................................................................................................. 35 2.2.1 Regresin Lineal Mltiple (MLR).................................................................................... 36 2.2.2 Regresin en Componentes Principales (PCR) ................................................................ 37 2.2.3 Regresin Parcial por Mnimos Cuadrados (PLS)............................................................. 39 2.2.4 Estrategias generales en el anlisis ............................................................................... 39 2.2.5 Validacin del mtodo de anlisis ................................................................................. 43
3. Polimorfismo .............................................................................................................................. 51
3.1 3.2 3.3 3.4 Definicin y propiedades ..................................................................................................... 51
Pseudo-polimorfos. Formas amorfas, solvatos e hidratos........................................................ 52

Mtodos de caracterizacin ................................................................................................. 53 Efecto del procesamiento farmacutico en frmacos polimrficos y solvatos ............................ 55
ndice
METODOLOGIA Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS 4. Introduccin ............................................................................................................................... 61
5. Metodologa ............................................................................................................................... 62 5.1 5.2 5.3 5.4 Descripcin y preparacin de las muestras............................................................................. 62 Instrumentacin .................................................................................................................. 63
Software ............................................................................................................................. 65
Procesamiento de datos ....................................................................................................... 66
6. Discusin de los Resultados ....................................................................................................... 71

6.1 Caracterizacin y anlisis de formas polimrficas.................................................................... 71 6.1.1 Introduccin ............................................................................................................... 71 6.1.2 Caracterizacin de pseudo-polimorfos por difraccin de Rayos X ..................................... 73 6.1.3 Anlisis de pseudo-polimorfos mediante espectroscopia en el infrarrojo cercano ............... 75 6.1.3.1 Modelos de calibracin (PLS)............................................................................. 76 6.1.3.2 Estudio de Estabilidad ...................................................................................... 81 6.2 Estudio y correccin del efecto de la temperatura en espectroscopia en el infrarrojo cercano ..... 85 6.2.1 Introduccin ............................................................................................................... 85 6.2.2 Estudio del efecto de la temperatura sobre los espectros NIR ......................................... 89 6.2.3 Estrategias para la correccin del efecto de la temperatura............................................. 92 6.2.3.1 Modelar el efecto de la temperatura .................................................................. 92 6.2.3.2 Eliminar el efecto de la temperatura .................................................................. 95
CONCLUSIONES .......................................................................................................................... 105 ANEXOS

Anexo I: Characterization and analysis of polymorphs by near-infrared spectrometry Anexo II: Application of NIR Spectroscopy in Polymorphic Analysis: Study of Pseudo-Polymorphs Stability Anexo III: Influence of temperature on the predictive ability of near infrared spectroscopy models Anexo IV: Suppressing the temperature effect in Near Infrared Spectroscopy by using Orthogonal Signal Correction
Abstract
In the last years there has been an increase in the use of near infrared spectroscopy, due to its multiple advantages: it is a non-invasive and non-destructive technique, it requires very little or no sample preparation, the ability to provide measurements and results in a highly expeditious manner, the low cost of analysis, an absence of reagents; as well as the possibility of making simultaneous determination of physical and chemical parameters. Nonetheless, the characteristic of the NIR signal requires the application of multivariate methods to obtain the desired information contained in the spectrum. The spectral variability produced by the insufficient control of physical parameters, gives rise to complex models of calibration as well as a poorer predictive capacity. In an industrial process experimental conditions can not always be strictly controlled and variations of the physical conditions of the system (temperature, pressure, moisture, etc.) often take place. The different arrangement from molecules in a crystalline structure gives rise to the polymorphism and this property complicate the models of calibration of samples in which this property is present. In the pharmaceutical industry is very common that active principles can exist in two or more different crystalline forms (polymorphs). We have taken advantage of these differences for the characterization and determination of different polymorphs of a substance. One of the objectives of this thesis is to develop new methodologies of analysis for the identification and characterization of polymorphs of azithromycin by means of NIR spectroscopy. Models of calibration were developed based on the algorithm of partial least-square (PLS) regression for the determination of a polymorphic form in the presence of another and were validated for their application in the
Abstract
pharmaceutical industry. In addition, a study of stability under high temperature and moisture conditions was carried out to establish the stability of different forms. Temperature changes alter the intensity of absorption bands and shift their position in the NIR spectra for liquid samples. The second objective is to study the effect of temperature on NIR spectra on the ingredients of an esterification reaction over the range 25-90 C and to construct calibration models to determine the concentration of the components of the mixtures within the temperature range with a correct predictive capacity. Two strategies were used; one consists of modeling and the other in eliminating the temperature effect. In order to model the temperature effect calibration models were constructed, that implicitly include the variable temperature in different ranges, using the partial least-square (PLS) regression and stepwise principal component regression (MLR stepwise). Another strategy is to eliminate the temperature effect by means of the variable filtering method known as orthogonal signal correction (OSC). Once the spurious spectral information that is unrelated to the concentration of the components of the mixtures was removed, models of calibration are constructed based on the partial least-square (PLS) regression. In conclusion, this thesis provides analytical tools of interest applicable to the pharmaceutical industry for the characterization of polymorphs of azithromycin and the determination of polymorphs mixtures as well as providing a suitable method for the correction of the temperature effect in liquid samples.
Objetivos
Objetivos El desarrollo de nuevas metodologas de anlisis simples, rpidas y fiables es una de las demandas ms frecuentes de la industria. En los ltimos aos se ha producido un auge en el empleo de la espectroscopia en el infrarrojo cercano, debido a sus mltiples ventajas como son: rapidez y simplicidad en la obtencin de los espectros y de los resultados del anlisis, posibilidad de analizar muestras lquidas y slidas sin necesidad de pretratamiento alguno por lo que no se generan residuos, instrumentacin verstil y adaptable a las necesidades de las medidas (off-, at-, on-, in-line) en la industria, as como la posibilidad de determinar simultneamente parmetros qumicos y fsicos. Sin embargo, la baja selectividad y que el espectro sea una seal compleja, hace necesario el uso de tcnicas multivariables para extraer la informacin de inters analtico. En la presente memoria se estudia la influencia de parmetros fsicos en el desarrollo de modelos de calibracin, que si bien permiten determinar parmetros fsicos, tambin complican los modelos para determinar la composicin qumica. Se han estudiado dos problemticas diferentes: 1. Efecto de la forma de cristalizacin del analito que aumenta la complejidad del modelo de determinacin del mismo, pero que tambin permite el desarrollo de metodologas de anlisis para la identificacin y caracterizacin de distintas formas polimrficas. 2. Desarrollo de metodologas para la correccin del efecto que la temperatura ejerce sobre los espectros NIR. Se estudiaran diferentes estrategias para obtener modelos de calibracin con una correcta capacidad predictiva en todo el rango de temperatura en estudio.
Objetivos
INTRODUCCION
Captulo 1
1. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

1.1 Breve resea histrica 1.2 Fundamentos tericos 1.3 Instrumentacin 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.3.4 Fuente de radiacin Sistema de seleccin de longitud de onda Compartimiento de la muestra Detectores
1.4 Aplicaciones de la Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano
Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano
1. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano 1.1 Breve resea histrica Friedrich Wilhelm Herschel en el ao 1800 observ que exista energa despus del rojo y como l no poda observarla, le nombr infrared (IR), usando el prefijo latn
infra- que significa antes [1].

Durante el siglo XIX se hicieron escasos progresos en este campo. En 1881 W. Abney y E.R. Festing registraron el espectro de lquidos orgnicos en el rango de 11.2 m [2]. Este trabajo tuvo una especial relevancia pues constituy la primera medida en el infrarrojo cercano y tambin las primeras interpretaciones. Desafortunadamente, la carencia de equipos de deteccin impeda hacer progresos reales fuera de la regin del visible. En los inicios del siglo XX, la naturaleza del espectro electromagntico ya era mucho mejor comprendida. En 1905 William Weber Coblentz, motivado por el trabajo de W. Abney y E.R. Festing, construy un espectrmetro empleando un prisma de sal de roca y una termopila conectada a un galvanmetro de espejo [3]. Durante la Segunda Guerra Mundial, se impuls el desarrollo de
semiconductores de PbS como detectores infrarrojos para la determinacin de calor. En la dcada de los 1950s finalmente la espectrometra en el infrarrojo cercano, contaba con detectores de buena sensibilidad [4]. Si bien la primera mitad del siglo XX fue escasa en publicaciones, a partir de la dcada de los 50s se produce un importante auge de las investigaciones en el infrarrojo cercano.
Finalmente, un aspecto de gran relevancia en la evolucin de la espectroscopia en el infrarrojo cercano (NIRS) ha sido el desarrollo de los ordenadores, no solamente por la facilidad para controlar y adquirir la informacin del instrumento, sino tambin para facilitar las calibraciones y el anlisis de datos.
1.2 Fundamentos tericos La regin del infrarrojo comprende las longitudes de onda de 780 a 106 nm y se divide en tres partes como se muestra en la Figura 1. Infrarrojo cercano (NIR) 780-2500 nm Infrarrojo medio (MIR o IR) 2500-40000 nm
Fig. 1 Regiones de la regin del infrarrojo.
Infrarrojo lejano (FIR) 4104-106 nm
Para absorber radiacin infrarroja, una molcula debe experimentar un cambio neto en el momento dipolar como consecuencia de los movimientos de vibracin o de rotacin. La fluctuacin de la densidad electrnica entorno de la molcula crea un campo elctrico que puede interaccionar con el campo elctrico asociado a la radiacin. Si la frecuencia elctrica de la radiacin iguala la frecuencia natural de vibracin de la molcula, se produce un cambio en la amplitud de la vibracin de la molcula y como consecuencia se absorbe la radiacin.
Las molculas diatmicas homonucleares (H2, O2, N2, Cl2, etc.) no absorben en la regin del infrarrojo, ya que no hay cambio en el momento dipolar de estas molculas. La vibracin de una molcula diatmica puede aproximarse a la de un oscilador armnico. Cuando se produce la vibracin, la energa potencial cambia continuamente, acercndose a cero cuando los tomos se acercan a la posicin de equilibrio y hacindose mxima cuando la distancia entre los tomos es mnima o mxima (Figura 2).
Energa Potencial
Energa de disociacin
v=2 v=1 v=0 Xequilibrio
Xmin
Xmax
Distancia interatmica
Fig. 2 Energa Potencial en el modelo del oscilador armnico.
La energa potencial en el oscilador armnico se define como:
E=
1 2 kx 2
(1.1)

donde k es la constante de la fuerza y x el desplazamiento de los tomos.
La frecuencia natural de vibracin de un sistema constituido por dos masas unidas por un muelle perfectamente elstico se puede expresar mediante la Ley de Hooke:
1
1 = 2
k (m1 + m2 ) mm 1 2
(1.2)
donde es la frecuencia natural de la vibracin, k la constante de la fuerza, m1 y m2 la masa de cada tomo. Sin embargo, los postulados de la mecnica cuntica plantean que la energa de vibracin de dos tomos es discontinua y las transiciones solo pueden ocurrir entre niveles discretos de energa. Por tanto las ecuaciones descritas anteriormente no describen completamente el comportamiento de las partculas atmicas. La energa vibracional, resolviendo ecuaciones cunticas se pueden expresar como:
1 E vib = + h 2
(1.3)
donde es el nmero cuntico vibracional (que solo puede tener valores enteros), h la constante de Planck y la frecuencia de la vibracin. Combinando las ecuaciones 1.2 y 1.3 se obtiene:
1
E vib
1 h = + 2 2
k (m1 + m2 ) mm 1 2
(1.4)
Este modelo del oscilador armnico que tiene en cuenta consideraciones cunticas, resulta incompleto para describir molculas reales. Cuando dos tomos se acercan aparece una repulsin coulmbica entre los dos ncleos pero en sentido contrario del movimiento, lo que implica un aumento ms rpido de la energa potencial. Por otra parte, cuando los tomos se alejan, la distancia interatmica se acerca a la distancia de rotura del enlace, con la consiguiente disminucin de la energa potencial. Las molcula reales se acercan ms al comportamiento de un oscilador anarmnico (Figura 3). Las curvas armnicas y anarmnicas son muy similares a energas bajas, por lo que las molculas entorno a la posicin de equilibrio tienen un comportamiento armnico.
Energa Potencial
Energa de disociacin
v=2 v=1 v=0 Xmin Xequilibrio Xmax
oscilador armnico oscilador anarmnico
Distancia interatmica
Fig. 3 Energa Potencial en el modelo del oscilador anarmnico.
La energa vibracional corregida con trminos que explican la anarmonicidad de las molculas se define como:
2 3
1 1 1 E vib = + h + hy + hy '... 2 2 2
(1.5)
donde y, y, son las constantes de anarmonicidad. Para valores pequeos de , el tercer trmino y siguientes pueden ser ignorados. En el modelo anarmnico los niveles de energa no estn igualmente espaciados. A niveles de energa ms altos, la energa entre niveles consecutivos es menor. Como resultado de la anarmonicidad, no solo es posible observar la banda fundamental ( = 1), sino tambin pueden observarse las bandas denominadas sobretonos (primer y segundo sobretono) correspondientes a transiciones = 2, 3, En el modelo anarmnico, los niveles de energa no estn igualmente espaciados, a niveles superiores de energa el incremento de energa entres niveles consecutivos es menor, por lo que los sobretonos aparecen a frecuencias ligeramente menores que las correspondientes a mltiplos de las frecuencias fundamentales. Adems de los sobretonos, en la regin NIR aparecen otro tipo de bandas de absorcin. En las molculas poliatmicas pueden darse cambios simultneos en la energa de dos o ms modos de vibracin y la interaccin entre ellos da lugar a las
bandas de combinacin cuyas frecuencias son sumas o restas de mltiplos de cada una de las frecuencias que interaccionan:
comb = n1 1 + n2 2 + n3 3 + ...
(1.6)
donde ni son nmeros enteros y i son las frecuencias de las transiciones que contribuyen a las bandas de combinacin. Las bandas de combinacin ms frecuentes son aquellas en que n1=n2=1. El origen de la absorcin de las bandas en la regin NIR es el mismo que en la regin IR; la molcula absorbe la radiacin si la energa de sta corresponde a la diferencia de energa entre dos niveles energticos vibracionales de la molcula y si se produce un cambio en su momento dipolar. Las bandas NIR no son tan bien definidas como en la regin del IR medio, ya que son el resultado del solapamiento de sobretonos y bandas de combinacin. Las bandas en esta regin son poco intensas, ya que dependen de la anarmonicidad del enlace. El tomo de H es el mas ligero, por lo que la vibracin que contenga este tomo tendr una mayor amplitud que en otro enlace donde hayan tomos ms pesados. Al ser las vibraciones ms amplias, las desviaciones del modelo del oscilador armnico sern mayores. Por esta razn, las principales bandas en la regin del NIR son las debidas a los enlaces en los que intervienen tomos ligeros como C-H, O-H, N-H, S-H, En la Figura 4 se muestran las regiones del NIR donde absorben los diferentes enlaces, as como si pertenecen al primer, segundo o tercer sobretono o a combinaciones de frecuencias de vibracin de diferentes enlaces.
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Fig. 4 Asignacin de bandas en la regin del infrarrojo cercano.
Los sobretonos del enlace C=O aparecen a longitudes de onda mayores que los sobretonos de los otros enlaces, debido a que la frecuencia fundamental de la vibracin streching del enlace C=O aparece a 1750-1550 cm-1, dependiendo del grupo funcional. La banda correspondiente al grupo CHO que aparece a 2200 nm corresponde a la combinacin de las vibraciones de los enlaces C-H y C=O del grupo aldehdo.
1.3 Instrumentacin A finales de 1960, Karl Norris considerado como el padre de la espectroscopia NIR, demostr el valor potencial de esta regin espectral en el anlisis cuantitativo [5]. El
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nico instrumento comercial disponible era el desarrollado para medidas en las regiones del ultravioleta y visible, con la posibilidad de medir en el infrarrojo cercano como caracterstica adicional. Norris y col. decidieron disear un instrumento para medir especficamente en la regin del infrarrojo cercano. Los instrumentos pueden clasificarse de diversas formas [5]. Los fabricantes suelen remarcar las ventajas de sus instrumentos, pero el consumidor tiene que ser lo ms objetivo posible para hacer una correcta seleccin acorde con su problemtica. Los instrumentos se disean o bien para un tipo especfico de muestra o para hacer medidas diversas. En el trabajo de investigacin la eleccin ms apropiada, es un instrumento con amplias capacidades. El esquema bsico de un instrumento NIR es similar al de cualquier espectrofotmetro. Sus componentes son: fuente de radiacin, sistema de seleccin de longitud de onda (SLO), compartimiento de muestra y detector.
1.3.1 Fuente de radiacin La fuente de radiacin ms empleada es la lmpara de halgeno de filamento de tungsteno con ventana de cuarzo que proporciona un espectro continuo de 320-2500 nm. Otra fuente de radiacin son los LED (Ligth Emiting Diodes) que emiten radiacin en regiones estrechas del espectro [6]. Los instrumentos que incorporan este ltimo sistema no requieren de un sistema de seleccin de longitudes de onda.

1.3.2 Sistema de seleccin de longitud de onda
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Los instrumentos poseen un sistema para la seleccin de las longitudes de onda que es un factor importante para obtener un buen nivel de sensibilidad. En funcin del dispositivo empleado para la seleccin de longitudes de onda pueden clasificarse en: instrumentos de filtros, monocromadores e instrumentos de transformada de Fourier. La seleccin de longitudes de onda mediante filtros se realiza interponiendo entre la fuente de radiacin y la muestra, materiales que permiten el paso de determinadas longitudes de onda [5]. Los ms sencillos son lo de absorcin que transmiten longitudes de onda de forma selectiva segn el material de que estn hechos. Otro tipo de filtros son los de interferencia ptica que filtran longitudes de onda segn el ndice de refraccin del filtro y su grosor. Los monocromadores son dispositivos que descomponen la luz policromtica que proviene de la fuente de radiacin en longitudes de ondas discretas. La radiacin entra en forma de haz estrecho y un elemento dispersante (prisma o red de difraccin) la descompone. Los ms utilizados son las redes de difraccin ya que son ms baratos, proporcionan mejor separacin de longitudes de onda y dispersan linealmente la radiacin [7]. Otro monocromador es el llamado optoacstico (AOTF:
Acousto-Optic Aunable Filters) que aprovechan el cambio de ndice de refraccin de

un material (TeO2) cuando es atravesado por una onda sonora, convirtindose el material en una red capaz de difractar ciertas longitudes de onda de un haz incidente [8]. Los instrumentos de Transformada de Fourier dividen la luz en dos haces desfasados, recombinndolos posteriormente. De esta manera, los haces
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recombinados pueden crear interferencias constructivas y destructivas. Mediante la Transformada de Fourier se convierte el interferograma (representacin de la seal en dominio tiempo) en el espectro (en dominio frecuencias) [7].
1.3.3 Compartimiento de la muestra Para registrar el espectro de una muestras, sta se coloca en un compartimiento que se encuentra entre el sistema de seleccin de longitudes de onda y el detector. Dependiendo de la naturaleza de la muestra, sta deber ser presentada de distinta forma. Las muestras slidas se miden en modo reflectancia y las muestras lquidas se miden por transmisin de la radiacin. Un caso intermedio es la medida por transflectancia, en el que una parte de la radiacin es reflejada y otra parte atraviesa la muestra y es reflejado por un material colocado en la cara opuesta de la muestra. En la Figura 5 se muestran los esquemas bsicos de los diseos ms comunes, que dependen del tipo de medida NIR (transmitancia, reflectancia, transflectancia). Cuando la radiacin interacta con la muestra puede ser absorbida, transmitida o reflejada. En todos los casos, la seal NIR obtenida es una funcin compleja, de la que hay que extraer la informacin deseada. A continuacin se exponen los fundamentos de cada tipo de medida NIR.
14
Fig. 5 Diseos de los espectrmetros NIR.
Medidas por transmisin La absorcin de la radiacin (A) sigue la ley de Lambert-Beer [9]. La transmitancia de la solucin (T) es la fraccin de radiacin incidente transmitida por la solucin. Ambas medidas se relacionan en la siguiente expresin:
A = log
P 1 = log 0 = abc T P
(1.7)
donde A es la absorbancia de la muestra, T la transmitancia, P0 la intensidad de la radiacin incidente, P la intensidad de la radiacin transmitida, a la absortividad molar, b el camino ptico y c la concentracin.
15
Pueden producirse desviaciones del cumplimiento de esta ley debidas a causas muy diversas (reflexin y/o dispersin de la radiacin, concentraciones muy elevadas, interacciones qumicas de la muestra, etc.)
Medidas por reflectancia La reflexin de la radiacin puede ser especular o difusa. La reflectancia especular descrita por las leyes de Fresnel [10] no aporta informacin sobre la composicin de la muestra, por lo que solo contribuye al ruido. La reflectancia difusa tiene lugar en todas las direcciones como consecuencia de los procesos de absorcin y dispersin. Cuando los materiales son dbilmente absorbentes a la longitud de onda incidente y cuando la penetracin de la radiacin es grande en relacin con la longitud de onda, predomina la reflectancia difusa. Debido a la complejidad del proceso de reflectancia difusa, no existen teoras rigurosas, sino aproximaciones entre las cuales la ms importante es la de KubelkaMunk [11]. Otra expresin empleada con mucha frecuencia es una aplicacin emprica de la relacin entre la concentracin y la reflectancia relativa, similar a la ley de Lambert-Beer:
A = log
1 = a' c R
(1.8)
donde A es la absorbancia aparente, R la reflectancia relativa (R = Rmuestra/Restndar), c la concentracin y a la constante de proporcionalidad.

1.3.4 Detectores
16
En la regin del infrarrojo cercano, los detectores ms habituales son los construidos con semiconductores (InGaAs, InAs, InSb, PbS, Si, ). Hasta 1100 nm el semiconductor ms empleado en los detectores es el Si y en la regin entre 1100 y 2500 nm el material ms utilizado es el PbS. Para medidas por transmisin en slidos se utilizan detectores de InGaAs, que es operativo en la regin de 600 a 1900 nm.
1.4 Aplicaciones de la espectroscopia en el infrarrojo cercano (NIRS) La espectroscopia NIR se ha mostrado, en los ltimos aos, como una tcnica analtica de gran inters en el control analtico de procesos industriales, en virtud de sus caractersticas tales como la no necesidad de reactivos, la escasa o nula preparacin de la muestra, la rapidez de trabajo y la capacidad de proporcionar informacin de varios parmetros (analitos) simultneamente. El objetivo de este epgrafe es ilustrar el amplio campo de aplicacin de la espectroscopia NIR en la industria, lo cual ha sido plasmado por algunos autores de forma satisfactoria [12]. En la Figura 6 se muestran algunos ejemplos de la aplicacin de la espectroscopia NIR en el anlisis cualitativo y cuantitativo.
17
Agricultura & Alimentacin [13, 14]
Imagen Qumica [23]
Petroqumica [15]
Farmacia & Cosmtica [21, 22]
Sectores
Medio Ambiente [16]
Biomedicina & Clnica [18]
Textil [17]
Fig. 6 Aplicacin de la espectroscopia NIR en diversos sectores.
El primer sector donde se emple la espectrometra NIR fue en la agricultura. En 1974 la Comisin de Granos Canadiense adopt esta tcnica en sustitucin del mtodo tradicional (Kjeldahl) para determinar protenas en trigo, lo cual supuso una disminucin de los costes y redujo el vertido de productos [13]. D.C. Slaughter y col. [14] emplearon la espectroscopia NIR para la determinacin no destructiva del contenido de slidos solubles en frutas de papaya. El registro de los espectros NIR de la fruta se realiz con un espectrmetro NIR con sonda de fibra ptica y se construy un modelo PLS para la determinacin del contenido de slidos solubles.
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En las refineras petroleras es cada vez ms importante reducir los costes del proceso. Macho S. y Larrechi M.S discuten algunas consideraciones a tener en cuenta en la aplicacin de la espectroscopia NIR en la determinacin de propiedades de inters en la industria petroqumica [15]. Los autores, presentan dos ejemplos de aplicaciones: 1- determinacin de hidrocarbonos y densidad en muestras de nafta y 2- determinacin de etileno y viscosidad en copolimeros polipropilenicos. Estas aplicaciones reflejan dos problemas diferentes: la nafta es la fuente de alimentacin del proceso de craqueo y el anlisis de nafta permite monitorear el proceso, sin embargo las propiedades fsicas y qumicas del polipropileno son analizadas en el control de calidad. Un sector de gran auge en los ltimos aos es el del medio ambiente. El desarrollo de instrumentos porttiles permite llevar a cabo medidas in-situ. Stallard B.R. y col. desarrollaron una metodologa mediante espectroscopia NIR para la determinacin del grado de contaminacin del suelo por aceites de motor [16]. La industria textil tambin se ha beneficiado de las ventajas de la espectroscopia NIR. El trabajo desarrollado por Cleve E. y col. presentan una variedad de aplicaciones de la espectroscopia NIR en la industria textil como son: la identificacin de textiles, la determinacin de humedad y el control del proceso [17]. El carcter no-invasivo de la espectroscopia NIR permite hacer diagnsticos sin necesidad de biopsias o cirugas. Rempel S.P. y col. presentan una resea con 70 referencias bibliogrficas, referentes al uso de la espectroscopia NIR y la imagen qumica en el campo mdico, haciendo especial nfasis en los avances hechos en los
19
ltimos aos [18]. Se presentan aplicaciones exvivo e invivo que permiten ilustrar el potencial de esta tcnica espectroscpica. La fabricacin de productos farmacuticos es un sector industrial muy regulado tanto por organismos nacionales como por instituciones internacionales como son la European Medicines Agency (EMEA) [19] y la International Conference on Harmonisation (ICH) [20]. La espectroscopia NIR es una tcnica analtica que cumple muchas de las condiciones para su fcil y rpida aplicacin en el control en la industria farmacutica, ya que permite no slo la caracterizacin de las diferentes formas de un principio activo sino tambin la determinacin de la pureza polimrfica tanto del producto puro como de las preparaciones finales. Son cada vez ms las compaas farmacuticas que emplean la espectroscopia NIR como herramienta de anlisis (cualitativo y cuantitativo) y alternativa a las tcnicas habituales que generalmente son ms laboriosas. Blanco M. y col. han publicado una revisin del uso de la espectroscopia NIR en la industria farmacutica [21]. El trabajo incluye la discusin de un gran nmero de referencias relacionadas con el anlisis cualitativo (identificacin de materias primas y productos finales, estudios de homogeneidad, polimorfismo e isomera ptica) y cuantitativo (determinacin de parmetros fsicos, contenidos de humedad, principios activos y excipientes). Cada ao la industria cosmtica invierte numerosos recursos para la creacin y mejora de productos para la piel y el cabello, como son los limpiadores, hidratantes y acondicionadores. Muchas investigaciones estn encaminadas a conocer la estructura y composicin de la piel y el cabello, as como de las interacciones que se establecen entre estos y los productos elaborados. Kathleen M. presenta una descripcin del
20
empleo de las tcnicas espectroscpicas IR, Raman y NIR; en el estudio de propiedades estructurales y funcionales de piel y cabello [22]. En muchos casos estas tcnicas pueden ser aplicadas directamente in-vivo o in-situ para obtener informacin del estado de la piel y el cabello, antes y despus de aplicar los productos cosmticos. La imagen qumica es un rea del conocimiento relativamente nueva. La imagen NIR es la combinacin de la espectroscopia NIR con el procesamiento de imagen digital. Un sistema de imagen NIR est compuesto por una fuente de iluminacin, un sistema de imagen de ptica, un codificador espectral que selecciona las longitudes de onda y un plano focal de series lineales (focal plane array, FPA). El haz de luz proveniente de la fuente de iluminacin del espectrmetro NIR incide sobre la muestra. La imagen de reflectancia difusa de la muestra es recogida por un sistema de imagen ptica, cuya configuracin depende del tamao y del tipo de muestra. Para las imgenes macroscpicas o microscpicas se utiliza una lente focal o un objetivo microscopio, respectivamente. La coleccin de datos se lleva a cabo registrando una serie de imgenes en el FPA del infrarrojo cercano (es decir InSb o InGaAs) en cada posicin de la longitud de onda seleccionada mediante un codificador espectral. El resultado es un conjunto de datos tridimensionales, conocido como hipercubo espectral, donde el eje X e Y representan la informacin espacial y el eje Z representa la informacin espectral [23]. A pesar de las grandes ventajas que ofrece esta nueva herramienta de anlisis, el nmero de trabajos que describen su uso prctico es limitado, siendo el campo de mayor aplicacin la industria farmacutica.

Referencias 1. 2. 3. W. Herschel. Philos. Trans. R. Soc. 90, 255-283 (1800). W. Abney and E.R. Festing. Philos. Trans. R. Soc. 172, 887-918 (1881). W.W. Coblentz.
21
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Publication No. 35 (1905). 4. R.C. Nelson and W.R. Wilson. High resolving power infrared recording spectrometer. Proceedings of the National Electronics Conference 3, 579-86 (1947). 5. D.A. Burns and E.W. Ciurczak. Handbook of Near-Infrared Analysis, 2nd Ed by D.A. Burns and E.W. Ciurczak. Marcel Dekker, Inc. pp. 53-128 (2001). 6. 7. A.S. Bonano and P.R. Griffiths. Appl. Spectrosc. 49, 1590-1597 (1995). D.A. Skoog, F.J. Holler, T.A. Nieman. Principios de anlisis instrumental, 5a Ed by D.A. Skoog, F.J. Holler, T.A. Nieman. McGraw-Hill (2001). 8. 9. C.D. Tran. Anal. Chem. 64, 971A-981A (1992). J.H. Lambert. Photometria sive de mensure et grodibus luminis colorum et
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15. S. Macho and M. S. Larrechi. TrAC, Trends Anal. Chem. 21, 799-806 (2002).

16. B.R. Stallard, M.J. Garcia, S. Kaushik. Appl. Spectrosc. 50, 334-338 (1996). 17. E. Cleve, E. Bach, E. Schollmeyer. Anal. Chim. Acta 420, 163-167 (2000).
22
18. S.P. Rempel and H.H. Mantsch. Can. J. Anal. Sci. Spectros. 44, 171-179 (1999). 19. http://www.emea.eu.int/pdfs/human/qwp/330901en.pdf, Note for Guidance on the Use of Near Infrared Spectroscopy by the Pharmaceutical Industry (2003). 20. http://www.ich.org/ich5q.html, ICH Guidelines: Q2A Text on Validation of Analytical Procedures 1994, Q2B Validation of Analytical Procedures:
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Captulo 2
2. Quimiometra
2.1 Anlisis Cualitativo 2.1.1 Mtodos de Reconocimiento de Pautas (PRMs) 2.1.1.1 Mtodos No Supervisados 2.1.1.2 Mtodos Supervisados 2.1.1.3 Bibliotecas de Identificacin 2.2 Anlisis Cuantitativo 2.2.1 Regresin Lineal Mltiple (MLR) 2.2.2 Regresin en Componentes Principales (PCR) 2.2.3 Regresin Parcial por Mnimos Cuadrados (PLS) 2.2.4 Estrategias generales en el anlisis 2.2.5 Validacin del mtodo de anlisis
Introduccin. Quimiometra
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2. Quimiometra La Quimiometra es una disciplina que utiliza las matemticas, estadsticas y lgica formal para: (1) disear o seleccionar los procedimientos experimentales ptimos y (2) proveer la mxima informacin qumica relevante a travs del anlisis de los datos [1]. La espectroscopia NIR es una tcnica instrumental que proporciona un conjunto de datos que se define como seal analtica, la cual contiene informacin qumica y/o fsica de la muestra. Determinar la propiedad de inters analtico es un proceso complejo en la espectroscopia NIR, pues la seal es la contribucin de ms de una especie o propiedad. La aplicacin de los mtodos quimiomtricos a la espectroscopia NIR proporciona una serie de ventajas ausentes en el anlisis univariado. El objetivo de este epgrafe es resaltar los aspectos de mayor inters del anlisis cualitativo y cuantitativo, empleando para ello diversas tcnicas
quimiomtricas.
2.1 Anlisis Cualitativo Las tcnicas quimiomtricas empleadas en problemas de anlisis cualitativo son conocidas como Mtodos de Reconocimiento de Pautas (PRMs, Pattern Recognition
Methods) [2].
2.1.1 Mtodos de Reconocimiento de Pautas (PRMs)
24
Los PRMS se aplican para clasificar objetos desconocidos en categoras o para separar objetos en categoras. La mayora de estos mtodos se basan en la medida de la similitud, que es la medida en que un objeto (espectro) es idntico a otro. La similitud (S) entre objetos i e i, se expresa en trminos de correlacin o distancia, tal como se muestra en la Figura 7.
Similitud
Distancia Sii = 1- Dii/Dmax
Correlacin Sii = r(ii)
Dii2
Mahalanobis = (xi-xi)T C-1 (xi-xi)
Dii2
Eucldea = (xi-xi)T (xi-xi)
Fig. 7 Criterios de similitud en los PRMs.
Los PRMS se clasifican en mtodos supervisados y no supervisados, dependiendo si se conoce o no, a priori, si el objeto pertenece a una clase determinada. Los mtodos no supervisados buscan agrupamientos (espacio ndimensional) sin conocer las clases a las cuales pertenece el objeto. En los mtodos supervisados, se conocen las clases y se decide en cual de ellas un objeto debe ser clasificado. Es recomendable, incluso cuando el objetivo sea el desarrollo de un modelo supervisado, usar las tcnicas no supervisadas para obtener un conocimiento
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previo de los datos. En la Figura 8 se resumen los mtodos ms relevantes los cuales se discutirn a continuacin.
Anlisis en Componentes Principales Anlisis de agrupamientos
No Supervisados
rbol de Expansin Mnima Redes Neuronales de Kohonen
PRMs Mtodos Discriminantes
Anlisis Discriminante k vecino ms cercano
lineal cuadrtico
Mtodo de las Funciones Potenciales
Supervisados
Distancia Correlacin
Eucldea Mahalanobis
Mtodos de Modelado
Varianza Residual Redes Neuronales Artificiales Supervisadas
Fig. 8 Clasificacin de los PRMs.
Las tcnicas quimiomtricas utilizadas en problems de anlisis cualitativo en la presente tesis han sido el Anlisis en Componentes Principales (PCA) para tener una informacin a priori de las caractersticas espectrales de las muestras y los mtodos supervisados, en particular los de modelado para la clasificacin de muestras.
2.1.1.1 Mtodos No Supervisados
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El objetivo de los mtodos no supervisados es evaluar cuantos grupos existen en un conjunto de datos, sin informacin acerca de la pertenencia a una clase. Esto permite revelar para un conjunto de muestras los grupos naturales definidos por las medidas.
" Anlisis en Componentes Principales (PCA) Los mtodos instrumentales generan un gran volumen de informacin, por lo que uno de los aspectos ms importantes dentro de la quimiometra es el desarrollo de mtodos capaces de reducir este gran volumen de informacin a un nmero reducido de variables. Uno de los mtodos de reduccin de variables ms empleados es el Anlisis en Componentes Principales (PCA, Principal Component Analysis) que puede definirse como:
El Anlisis en Componentes Principales (PCA) es un mtodo de compresin de datos que reduce un conjunto de datos registrados de M-variables y N-muestras a una representacin ms simple que emplea un menor nmero de variables comprimidas (A<<M), denominadas componentes principales (PCs) [3].
El PCA busca las direcciones que explican la mxima variabilidad de las muestras, utilizndolas como nuevos ejes de coordenadas, denominados
componentes principales (PCs). Los loadings son los cosenos de los ngulos que forman los nuevos ejes con los originales y los scores son las coordenadas de las muestras en los nuevos ejes.
La matriz X (datos espectrales) se descompone en sus componentes principales, X = TP t + E
27
(2.1)
donde T es la matriz de scores, P la matriz de loadings y E la matriz de residuales. Cada componente contiene informacin de diferente relevancia, as los primeros PCs describen la fuente de variacin ms importante de los datos. La representacin completa de la matriz X implica k vectores de loadings y scores, pero como al hacer la descomposicin se reduce la dimensionalidad del sistema, la matriz X resultante tiene a vectores donde a<k. La matriz X resultante seria:
t t t X = t1 p1t + t 2 p2 + t 3 p3 + ... + t a p a +E
(2.2)
No existe unanimidad en considerar el PCA como un mtodo de clasificacin, por el hecho de que no establece fronteras entre las diferentes clases ni aplica ningn criterio estadstico que permite discernir las clases. No obstante, es una tcnica de reduccin de variables que permite visualizar en un espacio de 2 3 dimensiones, cuan similares o diferentes son un grupo de muestras entre si. La interpretacin de los resultados obtenidos con el PCA para una clasificacin, se lleva acabo a partir de una representacin del score de un PC frente al score de otro(s). Si existe una relacin entre las muestras, en el grfico de los scores, los puntos aparecern agrupados; mientras que si las muestras no se asemejan entre si, los puntos aparecern dispersos entre si. En la Figura 9 se muestra un grfico de
scores (PC2 vs. PC1) de un PCA de un conjunto de muestras.
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Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
PC2
PC1
Fig. 9 Grfico de scores (PC2 vs. PC1) de un PCA.
En la Figura 9 se observa que las muestras se agrupan en tres grupos. Las muestras que conforman cada grupo son semejantes entre si; sin embargo, las muestras de los tres conjuntos se diferencian entre si.
" Anlisis de agrupamientos El anlisis de agrupamientos se utiliza para clasificar objetos en grupos, los cuales estn caracterizados por los valores de su conjunto de variables. Es una alternativa al PCA para describir la estructura de una tabla de datos. Existen dos formas de representar los datos, la primera es en forma de un rbol, tambin llamado dendograma y consiste en la elaboracin de una clasificacin
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jerrquica donde los grupos grandes se dividen otros ms pequeos. Esta tcnica examina la distancia entre los puntos de todas las muestras y representa esta informacin en un dendograma. La otra forma es la representacin de los datos en una tabla que contiene diferentes agrupamientos. El agrupamiento es una particin en grupos y se denominan no jerrquicas [4].
" rbol de Expansin Mnima Esta tcnica se basa en calcular la distancia entre un grupo de objeto. Los grficos, que representan los objetos unidos mediante lneas de conexin que a su vez significan las distancias, se denominan rboles (trees). El grfico para el cual la suma de las distancias es mnima se denomina Minimal Spanning Tree [5].
" Redes Neuronales de Kohonen Las redes neuronales de Kohonen pertenecen a la clase de mapas auto-organizados y estn diseadas para tareas de clasificacin. Las redes Kohonen consisten en una capa de neuronas ordenadas en un mapa poco dimensional (organizacin uno dimensional o matriz bidimensional). Cada neurona o unidad contiene un vector peso de la misma dimensin que la estructura de entrada. Para entrenar la red, se aplica la regla de aprendizaje de Kohonen. Despus del aprendizaje, cada uno de los vectores peso se orienta en tal direccin que la estructura de la topologia se representa lo mejor posible en el mapa
30
resultante. Cada objeto o estructura de entrada se asigna a la neurona con el vector peso ms similar. El objetivo de la redes Kohonen es determinar los objetos que son similares o vecinos a una de la neuronas [6].
2.1.1.2 Mtodos Supervisados Los mtodos supervisados son usados cuando el objetivo es construir un modelo para clasificar futuras muestras como pertenecientes a una clase determinada. Frecuentemente se hace una distincin entre los mtodos basados en la discriminacin y aquellos que se basan en el modelado de las clases. La mayora de los mtodos intentan encontrar de forma implcita o explicita, una frontera entre las clases.
Mtodos Discriminantes Estos mtodos establecen fronteras entre las clases y de esta forma clasifican un objeto como perteneciente a una clase o a otra, dependiendo del lado de la frontera en que se encuentra el objeto desconocido.
" Anlisis Discriminante Se basan en el concepto de que una funcin discriminante encuentra fronteras explicitas entre las clases y de esta forma el espacio queda dividido en regiones para
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cada una de las clases. Los dos mtodos ms conocidos son el anlisis discriminante lineal y el cuadrtico [7].
" k vecino ms cercano Es una tcnica de clasificacin que desde el punto de vista matemtico es muy simple, que calcula la distancia entre el objeto desconocido y cada uno de los objetos pertenecientes a las clases. Se seleccionan los k objetos ms cercanos al objeto desconocido y se aplica una regla de mayora, donde el objeto queda clasificado en el grupo donde ms vecinos tenga [8,9].
" Mtodo de las Funciones Potenciales En este mtodo cada objeto del conjunto de entrenamiento es considerado como un punto en el espacio rodeado por un campo de potencial. La clasificacin de un objeto dentro de una clase se determina mediante el potencial acumulado de la clase en la posicin del objeto desconocido. El potencial acumulado se calcula, sumando los potenciales individuales de los objetos de la clase en la posicin del objeto desconocido. Finalmente el objeto se clasifica dentro de la clase que da el mayor potencial acumulado [10].
Mtodos de Modelado
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Estos mtodos determinan el espacio que ocupa cada clase, de forma que cada una de ellas ser descrita por un modelo matemtico. De esta forma un objeto desconocido puede clasificarse como pertenecientes a una de las clases o a ninguna de ellas.
" Distancia El mtodo PRIMA (Pattern Recognition by Independent Multicategory Analysis) se basa en el concepto de la distancia Eucldea [11]. Para cada clase se define una distancia que se basa en el centro de gravedad y no homogeneidad de la clase, Esta distancia es la que se emplea en la clasificacin de objetos. Las condiciones para su aplicacin son menos rigurosas que otros mtodos y el algoritmo es simple. El mtodo UNEQ se aplica cuando solamente hay que considerar pocas variables [5]. Se basa en la distancia de Mahalanobis del centroide de la clase [12]. Cuando la distancia excede un valor de distancia, el objeto es considerado un
outlier y por tanto no se considera que forma parte de la clase.
" Correlacin Los mtodos basados en el coeficiente de correlacin, calculan la correlacin entre la muestra desconocida y las clases. Mientras mayor sea la correlacin de la muestra
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con la clase, mayor probabilidad de que esa muestra pertenezca a la clase y viceversa.
" Varianza Residual Estos mtodos se basan en el PCA de cada uno de los conjuntos, creando un modelo para cada uno de ellos [13]. Un espectro se reconstruye segn cada uno de los modelos y los residuales que se obtienen son utilizados para calcular la probabilidad de que pertenezca a una clase o a ninguna de ellas. SIMCA (Soft Independent
Modelling of Class Analogies) es el mtodo ms conocido de varianza residual [14].
" Redes Neuronales Artificiales Supervisadas Describiremos las consideraciones bsicas del funcionamiento de las redes neuronales en los procesos de clasificacin supervisados [2]. Una red neuronal es un mtodo de clculo iterativo que permite ajustar los datos experimentales a una respuesta determinada mediante algoritmos de aprendizaje. Una de las redes ms utilizadas son las Multi-Layer Perceptron (MLPs). La estructura de este tipo de redes consiste en una capa de entrada compuesta por tantos nodos como variables experimentales a modelar, la capa de salida consistente en la respuesta que se desee obtener y una capa oculta donde se realiza el proceso de aprendizaje. En el proceso de clasificacin se han de establecer valores de salida indicativos de la pertenencia de un objeto a una clase o no.
2.1.1.3 Bibliotecas de identificacin
34
Una de las aplicaciones de los PRMS en la tesis es la creacin de bibliotecas espectrales, en las cuales se emplean mtodos supervisados de modelado. A partir de los espectros NIR de muestras de identidad conocida se crean distintas clases, lo cual permite identificar muestras desconocidas como pertenecientes o no a una de las clases predefinidas. La identificacin se realiza comparando el espectro de la muestra desconocida con los espectros de las muestras que conforman la biblioteca. Los mtodos supervisados de modelado empleados en la construccin de las bibliotecas espectrales son: - Correlacin - Distancia Mxima - Distancia de Mahalanobis - Varianza Residual En todos los mtodos se busca un tipo y valor de umbral que define las fronteras de la clase. Para los mtodos de distancia Mahalanobis y varianza residual, es posible calcular la probabilidad de un espectro dado, de pertenecer a la distribucin representada por el espectro del producto. Por esta razn, para estos mtodos existen dos tipos de umbral: valor de coincidencia (representa distancia o varianza residual) y nivel de probabilidad. Para los otros dos mtodos (correlacin y distancia mxima) solo es posible como tipo de umbral el valor de coincidencia. Cuando se emplean los mtodos de distancia Mahalanobis y varianza residual, se ha de definir el nmero de factores o varianza residual (%). basados en el espacio de los componentes principales basados en el espacio de las longitudes de onda
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En este epgrafe hemos plasmado solamente los parmetros particulares de las bibliotecas espectrales, pues ms adelante se discutirn otros parmetros a tener en cuenta en la construccin de las bibliotecas que son generales tanto para el anlisis cualitativo como para el cuantitativo. De modo general, la cualificacin es una etapa previa a la cuantificacin.
2.2 Anlisis Cuantitativo En espectroscopia NIR, a diferencia de otras tcnicas instrumentales, se obtienen ms de una variable respuesta (matriz X) y estas a su vez pueden correlacionarse con propiedades fsicas y qumicas (matriz Y). Esto implica la necesidad de emplear mtodos de calibracin multivariables, que permitan mediante un modelo matemtico, correlacionar la matriz X con la matriz Y. Una vez establecido el modelo de calibracin, se podrn predecir propiedades de inters analtico en muestras desconocidas a partir de sus correspondientes seales instrumentales. Los mtodos de Calibracin Multivariables pueden clasificarse siguiendo diferentes criterios [2], lo cual se representa de forma esquemtica en la Figura 10. La seleccin del mtodo ms apropiado depender de la problemtica a analizar, del conocimiento previo del sistema y de los datos disponibles, entre otros. En la presente memoria solo discutiremos los mtodos lineales, que afortunadamente toleran cierto grado de no linealidad.
36
Calibracin Multivariable
Lineales
No Lineales
Clsicos (CLS) espectro=f(composicin)
Inversos (ILS) composicin=f(espectro)
Variables Originales
Variables Reducidas
CLS indirecto
CLS directo
MLR
PCR
PLS
PLS no lineal
ANN
Fig. 10 Clasificacin de los mtodos de Calibracin Multivariables.
Los mtodos clsicos de mnimos cuadrados (CLS, Classical Least Square) asumen el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer. Los mtodos inversos son los ms empleados en la espectroscopia NIR por lo que a continuacin discutiremos los aspectos ms relevantes de cada uno de ellos. En ningn caso se harn las descripciones matemticas de los mtodos, por ser este un aspecto ampliamente detallado en la bibliografa [1-2, 15-16].
2.2.1 Regresin Lineal Mltiple (MLR) El mtodo inverso (ILS, Inverse Least Square) ms simple es la Regresin Lineal Mltiple (MLR, Multiple Linear Regression) que asume una relacin entre la
37
absorbancia y la concentracin que es inversa a la ley de Lambert-Beer. En la ecuacin resultante la concentracin acta como variable dependiente y la absorbancia a cada longitud de onda son las variables independientes. La gran desventaja de este mtodo es que el nmero de muestras debe ser mayor que el nmero de variables, por lo que solo se pueden emplear un nmero reducido de longitudes de onda. La seleccin de las variables es compleja y adems la utilizacin de un nmero elevado de variables puede traer problemas de colinealidad, lo que disminuye la precisin de los resultados. Esto hace que este mtodo sea poco utilizado en la espectroscopia NIR para el anlisis cuantitativo.
2.2.2 Regresin en Componentes Principales (PCR) Los mtodos inversos que emplean la reduccin de variable (PCR, Principal
Component Regresin y PLS, Partial Least Square Regression), son los ms

empleados en la espectroscopia NIR y se basan en que la informacin contenida en las variables medidas se pueda concentrar en un nmero ms pequeo de variables (componentes principales), sin perder la informacin relevante. El proceso de calibracin se simplifica ya que el mtodo PCR aprovecha las propiedades de la descomposicin en componentes principales (PCA), realizando una regresin mltiple inversa (ILS) de la propiedad a determinar sobre los scores obtenidos en el PCA, en lugar de realizarla sobre los datos originales. Una de las ventajas de estos mtodos es que se puede usar el espectro completo y no hay necesidad de seleccionar previamente un nmero determinado de variables respuesta.
38
Un caso particular es el PCR de pasos sucesivos (PCR stepwise), donde se aaden en pasos sucesivos los scores que ms correlacionados estn con la propiedad de inters analtico e incluso combinaciones de ellos [1]. Se construye una matriz X con los scores (Si), el cuadrado de los scores (Si2) y combinaciones de los
scores (SiSj), como se representa en la siguiente ecuacin:

Yanalito = b0 + bi S i + bii S i2 + bij S i S j
i i i, j n n n
(2.3)
donde bi,j son los coeficientes de regresin y Sij son los scores con ij. La inclusin de cada uno de los trminos de la ecuacin de regresin se evala mediante un anlisis de varianza de la regresin (ANOVA). Para ello se calcula la F parcial segn la expresin:
SS con SS sin df reg F parcial = SS con df res
(2.4)
donde SS es la suma de cuadrados y df son los grados de libertad. La inclusin o no de un trmino se realiza segn los siguientes criterios: F parcial > F(0.05,df(numerador),df(denominador)) el trmino se incluye en el modelo. F parcial < F(0.1, df(numerador),df(denominador)) el trmino se excluye del modelo.
2.2.3 Regresin Parcial por Mnimos Cuadrados (PLS)
39
En el mtodo PLS a diferencia del PCR, intenta contener la mayor informacin para la prediccin de las muestras en los primeros componentes principales. Para ello, durante la etapa de calibracin, el algoritmo PLS utiliza tanto la informacin contenida en la matriz X como la informacin contenida en la matriz Y, obtenindose unas variables auxiliares llamadas variables latentes, factores o componentes PLS. Tanto en el PCR como en el PLS, la eleccin del nmero de componentes es un aspecto esencial durante el desarrollo de los modelos de calibracin. Un nmero pequeo o elevado de factores en el modelo, implica modelos sencillos o complejos, respectivamente. Por esta razn es importante construir modelos que si bien deben ser lo ms sencillo posible, deben tener un nmero suficiente de factores para que tengan una buena capacidad predictiva. Unos parmetros muy tiles para seleccionar el nmero de componentes son la varianza explicada (EV) y la varianza residual (RV), donde la primera aumenta y la segunda disminuye a medida que aumenta el nmero de factores. Si bien los criterios ms empleados son el de Wold [17] y Haaland y Thomas [18], en la prctica se construyen modelos con variando el nmero de factores y se selecciona aquel que arroja una mejor capacidad predictiva.
2.2.4 Estrategias Generales en el Anlisis A continuacin se describe la estrategia general que suele seguirse en la construccin de los modelos, que si bien es similar tanto para el anlisis cualitativo como para el cuantitativo, cada uno de ellos tiene algunas particularidades.
1. Seleccionar el modelo quimiomtrico. Teniendo en cuenta
40 las
caractersticas del sistema objeto de estudio y lo que se pretende determinar, se selecciona un modelo quimiomtrico (mtodos cualitativos y/o cuantitativos). 2. Examinar los datos. Hacer un anlisis de los datos para ver si existen errores burdos. Estos errores pueden producirse tanto en las variables medidas (Ej. espectros) como en los valores de referencia (propiedades fsicas y/o qumicas), por lo que es importante examinar ambas variables. 3. Seleccin de las muestras de los conjuntos de calibracin y prediccin. Este es un aspecto de especial relevancia, ya que el conjunto de calibracin debe estar constituido por muestras que cubran el rango del parmetro a determinar y tambin la variabilidad espectral. Una forma habitual de hacer esta seleccin es a partir del grfico de los scores del PCA. Tambin se ha de seleccionar un segundo conjunto de muestras que conformaran el conjunto de prediccin, con las cuales se evaluar la capacidad predictiva del modelo construido. 4. Pre-tratamiento. Pueden existir fuentes de variacin aleatorias o sistemticas que enmscaran la variacin de inters. Estas variaciones indeseadas reducen la efectividad del modelo. La comprensin de la qumica y la fsica subyacente en este tipo de fuentes de variacin, ayuda a la seleccin de un pre-tratamiento espectral adecuado. Es importante tener en cuenta que los pre-tratamientos modifican las variables originales y si no se aplican correctamente pueden eliminar variaciones de inters analtico. Dentro de los ms empleados se pueden citar los siguientes:
41
- Promediado de espectros: El ruido de alta frecuencia es aleatorio, por lo que el promediado de varias seales de una misma muestra reduce la contribucin del ruido y por ende aumenta la relacin seal/ruido. - Suavizado espectral: Se aplica cuando el promediado de espectros no es suficiente ya que la relacin seal/ruido es pequea. Los mtodos ms habituales son los basados en los filtros de Savitzky-Golay [19] y en transformadas de Fourier [20]. - Correccin de lnea base: Intenta corregir determinadas tendencias en la lnea base que aumentan el ruido de la seal. Existen varios tipos de correccin de lnea base, dependiendo del efecto que se desea corregir. En espectroscopia NIR el ms empleado es el llamado ajuste de lnea base (DT,
De-Trending) que ajusta el espectro original a una funcin cuadrtica [21].

- Derivadas: Es uno de los pre-tratamientos ms empleados en espectroscopia NIR pues reducen los problems ms frecuentes de esta tcnica (solapamiento de bandas y variaciones de la lnea base). La primera derivada elimina los trminos constante a todas las longitudes de onda, es decir los
desplazamientos de la lnea base. La segunda derivada elimina los trminos que varan linealmente con la longitud de onda. No suelen utilizarse derivadas de orden superior. Los mtodos ms empleados son los propuestos por Norris [22] y Savitzky-Golay [19]. - Correccin del efecto multiplicativo de la dispersin (MSC,
Multiplicative Scatter Correction): Corrige las diferencias espectrales debido al

diferente tamao de partculas (scattering) de muestras slidas [23]. El
42
principal inconveniente de este mtodo es que si el conjunto de espectros originales es modificado, el espectro de referencia cambia, por lo que los clculos para aplicar el pre-tratamiento habra que hacerlos de nuevo. - Variable Normal Estndar (SNV, Standard Normal Variate): Es otro pretratamiento que se aplica a la correccin del tamao de partcula, pero con la ventaja que se aplica individualmente a cada espectro, sin depender de ningn espectro de referencia [21]. - Correccin Ortogonal de la Seal (OSC, Orthogonal Signal Correction): Es un mtodo desarrollado por Wold et. al. [24] basado en una idea simple, que consiste en eliminar solamente la informacin espectral (matriz X) que no esta correlacionada (es ortogonal) con la matriz Y. El mtodo se aplica a los espectros del conjunto de calibracin y posteriormente se emplea esta correccin en la prediccin de muestras nuevas. 5. Rango espectral. La seleccin del rango espectral no esta predefinida y depende de la situacin particular. En el caso particular de la determinacin de un analito, un posible rango espectral puede ser la regin donde el analito tenga bandas significativas. Sin embargo, este criterio tiene el inconveniente de que puede eliminarse una regin que contenga informacin importante de otras variables de las muestras. La eleccin es emprica y se har en funcin de los resultados obtenidos. 6. Evaluacin de los Modelos. La capacidad predictiva de un modelo se hace siempre con muestras externas que no han sido empleadas en el proceso de calibracin.
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En el anlisis cualitativo la capacidad predictiva se evala a travs del nmero de aciertos en la clasificacin de muestras pertenecientes a una clase definida, as como el rechazo de muestras que no pertenecen a ninguna de las clases definidas. En el anlisis cuantitativo se compara el valor estimado (PRED) con el mtodo de calibracin desarrollado con el valor terico o de referencia (REF). La diferencia entre estos dos valores es lo que habitualmente se conoce como residual. Existen numerosas maneras de expresar el error para un nmero n de muestras [16]. Dos de las expresiones ms comunes para evaluar los errores de calibracin y prediccin son:
(RSE, Relative Standard Error)
RSE (%) =
( PRED REF )
i =1
( REF )
i =1 n
100
(2.5)
(RMSE, Root Mean Square Error) RMSE =
( PRED REF )
i =1
(2.6)
2.2.5 Validacin del mtodo de anlisis Los mtodos de anlisis utilizados en el control de calidad, que no sean mtodos oficiales de anlisis, deben de ser debidamente validados a priori de su uso en rutina. La validacin de un mtodo de anlisis tiene como objetivo, demostrar su idoneidad antes de su uso en rutina.
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Existen numerosos textos que sirven de gua para la validacin de los mtodos analticos. Una de las normativas ms empleadas es la gua de la International
Conference on Harmonisation (ICH) [25], sin embargo esta gua se redact para la
validacin de mtodos cromatogrficos que eran los ms empleados en el control de calidad. En los ltimos aos se ha producido un auge en la aplicacin de la espectroscopia NIR [26] y una muestra de ello es que la European Medicines Agency (EMEA) en el ao 1991 elabor unas guas para el uso y validacin de procedimientos analticos mediante Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano en la industria farmacutica [27]. En los trabajos que se presentan en esta memoria, las validaciones se han realizado siguiendo la normativa de las guas ICH y EMEA evalundose los siguientes parmetros: selectividad, linealidad, rango, exactitud, precisin (repetibilidad y precisin intermedia), robustez, lmite de deteccin y cuantificacin. En la Tabla 1 se muestra de forma esquemtica los parmetros de calidad que suelen utilizarse en funcin del ensayo a realizar y a posteriori se detallan cada uno de ellos.
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Tabla 1. Parmetros de Calidad.

Parmetro Selectividad (1) Linealidad Rango Exactitud Precisin: Repetitividad Precisin Intermedia Lmite de Deteccin (LD) Lmite de Cuantificacin (LQ) Robustez Identificacin + + Determinacin del Test de impurezas contenido Cuantitativo Lmite + + + + + + (2) + + + + + + + (2) - (3) + + + + +
+ parmetro evaluado - parmetro NO evaluado (1) La falta de selectividad puede ser compensada con otros mtodos de anlisis. (2) No es necesaria si se evala la reproducibilidad. (3) Puede ser necesaria en algunos casos.
) Selectividad La selectividad es la capacidad de un mtodo para analizar el analito de inters y no otro componente. En espectroscopia NIR a diferencia de otras tcnicas instrumentales este concepto se aplica de un modo diferente. Los modelos de calibracin se desarrollan con muestras que contienen el analito a cuantificar y el resto de componentes de la muestra. Previa a la cuantificacin se realiza un anlisis cualitativo, que consiste en una identificacin mediante una biblioteca espectral preparada con muestras que pertenecen a la misma clase. Con esto se garantiza que las muestras que van a ser cuantificadas, son las que han sido identificadas correctamente.
) Linealidad
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La linealidad se demuestra obteniendo una respuesta proporcional entre la seal y la propiedad a determinar, en todo el intervalo. En las calibraciones univariadas la linealidad se obtiene una relacin lineal entre la seal y la concentracin. En las calibraciones multivariables se evala la linealidad mediante la relacin entre el valor de referencia y el valor estimado con el mtodo desarrollado. Se recomienda tener un mnimo de 5 niveles de concentracin que cubran todo el rango.
) Intervalo Es el intervalo entre los niveles extremos de concentracin, que depender de los estudios de linealidad, exactitud y precisin. Las guas ICH aconsejan cubrir intervalos de 80-120% para el anlisis cuantitativo y 70-130% para los tests de uniformidad de contenido. En espectroscopia NIR el intervalo depender tambin en gran medida de la finalidad del mtodo. En cada caso se debe evaluar que el intervalo establecido sea el adecuado.
) Exactitud La exactitud se evala por la semejanza entre el valor estimado y el valor de referencia, ya sea este ltimo obtenido por pesada o por un mtodo de referencia. Las guas ICH recomiendan realizar un mnimo de 9 determinaciones cubriendo 3 niveles de concentracin o bien 6 determinaciones al 100% de la concentracin. La
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exactitud quedara demostrada con un test-t de las diferencias, donde el promedio de estas diferencias deber ser significativamente igual a cero a un nivel de significacin establecido.
) Precisin La precisin es el error aleatorio o indeterminado asociado al mtodo de anlisis. Puede ser expresada como la desviacin estndar relativa o coeficiente de variacin (%). Existen tres niveles de evaluacin: Repetitividad: Es la precisin de un mtodo analtico bajo las misms condiciones de operacin en un espacio corto de tiempo. Se evala con un mnimo de 9 determinaciones a 3 niveles de concentracin o con un mnimo de 6 determinaciones al 100% de la concentracin. Precisin Intermedia: Expresa el grado de reproducibilidad de una serie de resultados, variando las condiciones normales de trabajo (das, operadores, temperatura, lotes de produccin, etc.). Se evala la influencia de estos factores mediante un Anlisis de Varianza (ANOVA) y se expresa el resultado con el coeficiente de variacin global (%). Reproducibilidad: Generalmente implica estudios interlaboratorios, ampliando la precisin intermedia con factor adicional distintos laboratorios. Este parmetro de calidad es obligatorio para aquellos mtodos que optan por el carcter de mtodo oficial de la farmacopea.
) Lmite de deteccin (LD)
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Se define como la mnima concentracin del analito que se puede detectar en una muestra, aunque no pueda ser cuantificada a ese nivel de concentracin. Las guas ICH recogen las formas ms comunes de estimar el LD.
) Lmite de cuantificacin (LQ) Se define como la mnima concentracin del analito que puede ser cuantificada con precisin y exactitud. Se suelen usar para su clculo los mismos parmetros que para el lmite de deteccin, pero con criterios ligeramente distintos.
) Robustez La robustez es el parmetro que evala la influencia de pequeos cambios en las condiciones analticas sobre la fiabilidad del mtodo analtico. De una manera ms amplia que la precisin intermedia, evala la susceptibilidad del mtodo respecto pequeas variaciones del procedimiento. En el caso de determinar que hay parmetros que afectan al mtodo de anlisis, estos debern ser controlados y el procedimiento del mtodo debe incluir recomendaciones para mantener bajo control estos parmetros.
Referencias 1.
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D.L. Massart, B.G.M. Vandeginste, L.M.C. Buydens, S. De Jong, P.J. Lewi, S. Smeyers-Verbeke. Handbook of Chemometrics and Qualimetrics: Part A, Ed by B.G.M. Vandeginste and S.C. Rutan. Elsevier pp. 1-20 (1997).
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Captulo 3
3. Polimorfismo
3.1 Definicin y propiedades 3.2 Pseudo-polimorfos. Formas amorfas, solvatos e hidratos 3.3 Mtodos de caracterizacin 3.4 Efecto del procesamiento farmacutico en frmacos polimrficos y solvatos
Introduccin. Polimorfismo
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3. Polimorfismo 3.1 Definicin y propiedades La capacidad de una sustancia de existir como dos o ms formas cristalinas que tienen ordenacin y/o conformaciones distintas de las molculas en el enrejado cristalino se conoce como polimorfismo [1]. Esto estrictamente significa que los polimorfos son diferentes formas cristalinas de una misma sustancia pura. Los slidos polimrficos tienen diferente tamao de celda y por ende diferentes propiedades fsicas tales como: empaquetamiento, termodinmicas, espectroscpicas, cinticas, de superficie y mecnicas [1]. Algunas de estas propiedades fsicas tienen una relacin directa sobre la efectividad teraputica y estabilidad del medicamento, otras permiten la identificacin y cuantificacin de las distintas formas polimrficas. Las diferencias en las dimensiones, configuracin, simetra, capacidad (nmero de molculas) y volumen vaco de las celdas unitarias de los diferentes polimorfos de una misma sustancia, hace que estos tengan diferentes propiedades fsicas (volumen molar, densidad, ndice de refraccin, conductividad elctrica y trmica,
higroscopicidad) como consecuencia de las diferencias en el empaquetamiento molecular. Cada polimorfo tiene su propia estructura cristalina y por ende su propia curva de energa potencial de Morse, donde existe una relacin entre la energa de interaccin molecular y la distancia intermolecular. La estabilidad relativa de los polimorfos y las fuerzas necesarias para la transformacin polimrfica a temperatura
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y presin constante, esta dada por la diferencia en la energa libre de Gibbs (G = H - TS). La forma polimrfica ms estable tiene la menor energa libre de Gibbs, fugacidad, presin de vapor, actividad termodinmica, solubilidad y velocidad de disolucin por unidad de rea en cualquier solvente, as como velocidad de reaccin, incluyendo la velocidad de descomposicin. Las tcnicas espectroscpicas basadas en las transiciones vibracionales, rotacionales y de spin nuclear, permiten la identificacin y cuantificacin de las formas polimrficas mediante diversas tcnicas espectroscpicas (IR, Raman, RMN). Las propiedades cinticas tales como velocidad de disolucin, velocidad de reaccin en el estado slido y estabilidad, son de gran importancia en la industria farmacutica porque si bien es necesario que el medicamento este biodisponible, es necesario que permanezca inalterable en las condiciones ambientales. Las propiedades mecnicas (dureza, fuerza de tensin, compactabilidad,
tableting, handling, fluidez, mezclado) se deben a las diferencias en el

empaquetamiento y en la energtica de las interacciones moleculares.
3.2 Pseudo-polimorfos. Formas amorfas, solvatos e hidratos Muchos slidos farmacuticos presentan formas amorfas, que por sus caractersticas distintivas se tratan como polimorfos y a menudo se denominan pseudo-polimorfos. Las formas amorfas a diferencia de los verdaderos polimorfos, tienen una disposicin desordenada de las molculas y por lo tanto no poseen un enrejado cristalino distinguible, ni celdas unitarias [1]. Termodinmicamente, la ausencia de una energa
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del enrejado estable provoca que la energa molar interna o la entalpa molar de las formas amorfas, excedan a las del estado cristalino. Adems, la menor estabilidad y mayor reactividad de los slidos amorfos, indica que la energa libre de Gibbs excede a la de las formas cristalinas. Algunos slidos farmacuticos presentan diferente grado de solvatacin con las molculas del disolvente (agua, alcoholes, etc.) en el seno del cual se ha realizado el proceso de cristalizacin que son conocidos como solvatos y que no deben considerarse estrictamente como polimorfos y por ende tambin se les denomina pseudo-polimorfos. Los cambios del estado de hidratacin de las sustancias cristalinas (medicamentos y excipientes) pueden producirse durante todo el proceso de desarrollo. El comportamiento de hidratos farmacuticos se ha convertido en objeto de atencin durante la pasada dcada, sobre todo debido al impacto de stos en el proceso de desarrollo y eficacia de la dosificacin del medicamento. Las sustancias son hidratos/anhidros como resultado de cambios ambientales, en el procesamiento o por el paso del tiempo si es una forma termodinmicamente metaestable. Los hidratos cuando son sometidos a un proceso de deshidratacin, se convierten en hidratos inferiores (menor nmero de molculas de agua) e incluso anhidros.
3.3 Mtodos de caracterizacin Uno de los aspectos de mayor inters en el estudio de los polimorfos y pseudopolimorfos, es la metodologa analtica para llevar a cabo la caracterizacin de estos
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compuestos. Byrn y col. definieron los tipos de formas slidas que pueden encontrarse para un medicamento determinado [2]. Polimorfos: Formas que tienen la misma composicin qumica, pero diferentes estructuras cristalinas. Solvatos: Formas que contienen molculas del solvente dentro de la estructura cristalina. Solvatos desolvatados: Formas que cuando se les extrae el solvente de un solvato especfico, mantienen la misma estructura cristalina. Amorfos: Formas que no tienen una ordenacin molecular de largo alcance. De todos los mtodos disponibles para la caracterizacin fsica de los compuestos slidos, los ms empleados se presentan en la Tabla 2.
Tabla 2. Mtodos para la caracterizacin de los polimorfos. Mtodos Estructurales Tcnicas Instrumentales Difraccin de rayos X de simple haz Difraccin de polvo de rayos X (XRPD) Morfolgicos Microscopia de luz polarizada Microscopia trmica Trmicos Termogravimetra (TG) Anlisis trmico diferencial (DTA) Calorimetra diferencial de barrido (DSC) Espectroscpicos Infrarrojo (IR) Raman Resonancia Magntica Nuclear (NMR)
Los mtodos que se presentan en la Tabla 2 permiten la caracterizacin de slidos y por ende asegurar la existencia de una forma polimrfica.
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La difraccin de rayos X tiene un importante inconveniente para su utilizacin en rutina debido a su lentitud, necesidad de preparacin de la muestra, etc. La industria necesita disponer de tcnicas rpidas que puedan aplicarse al control del proceso y de los productos acabados. La espectroscopia NIR es una tcnica instrumental que cumple muchas de las condiciones para su fcil y rpida aplicacin en este tipo de controles, ya que permite no slo la caracterizacin de las diferentes formas de un principio activo sino tambin la determinacin de la pureza polimrfica tanto del producto puro como de las preparaciones finales.
3.4 Efecto del procesamiento farmacutico en frmacos polimrficos y solvatos La conversin de los polimorfos y la desolvatacin de los hidratos, son fenmenos indeseados que pueden ocurrir durante el procesamiento farmacutico. Condiciones ambientales de elevada humedad y temperatura, no son inusuales durante la fabricacin en rutina de los medicamentos. Frecuentemente, las diferencias entre las temperaturas de fusin de los distintos polimorfos cristalinos son inferiores de 1kcal/mol, con una temperatura de transicin por debajo de la temperatura de ebullicin del agua. En el caso de los hidratos, remover el agua de la estructura cristalina requiere ms energa, pero depende mucho ms de las condiciones de temperatura y humedad a que ha sido sometida la sustancia. A continuacin discutiremos como son posibles una gran variedad de conversiones de fases cuando
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se exponen los slidos a condiciones energticas como son el almacenaje a granel, secado, molido, granulacin hmeda, secado en estufa y compactacin.
" Produccin y almacenaje a granel El primer momento donde puede ocurrir un cambio en la forma polimrfica o grado de solvatacin, es en el paso final de la cristalizacin en la sntesis del medicamento a granel. Existen numerosos parmetros que pueden afectar el proceso de cristalizacin como son: composicin del solvente y polaridad, concentracin del medicamento y grado de sobresaturacin, temperatura y velocidad de enfriamiento, presencia de cristales madre y/o sitios de nucleacin, aditivos que alteran el habito del cristal o aaden tensin al enrejado cristalino, agitacin, pH o la presencia de molculas formadoras de sales. Existe la posibilidad de que ocurran cambios en la forma del polimorfo cuando el proceso es escalado, movido a un sitio nuevo o ejecutado por un nuevo operador.
" Reduccin del tamao de partcula El ltimo paso en la produccin del medicamento a granel, implica un molido para reducir la distribucin del tamao de partcula. Esto se lleva a cabo usando las condiciones ms delicadas posibles para obtener muestras homogneas o empleando molidos mas rigurosos con el objetivo de reducir el tamao de partculas primarias y de esta forma mejorar la homogeneidad de la formulacin, disolucin y biodisponibilidad. En el ltimo paso del proceso se emplea una cantidad mayor de
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energa, lo cual puede traer como resultado cambios polimrficos o la generacin de sustancias amorfas. Siempre que se empleen procesos de molidos es necesario un anlisis cuidadoso para detectar los posibles cambios en la cristalinidad o forma del cristal.
" Granulacin Cuando una formulacin requiere de un paso de granulacin, este representa una ocasin para que se produzcan cambios en el cristal del medicamento. El problema se acenta cuando es una granulacin hmeda, debido a que la adicin a la mezcla del principio activo y excipientes de un solvente, potencia la transformacin polimrfica. Las mezclas se homogenizan en fase hmeda y posteriormente se secan a una temperatura determinada. La granulacin mejora los procesos de mezclado y fluido, permitiendo la compresin de tabletas a altas velocidades. La granulacin hmeda puede ser considerada como una suspensin del medicamento en una mezcla de solventes y excipientes. Si tenemos en cuenta que un solvente habitual es el agua, se pueden obtener una serie de conversiones entre anhidros e hidratos o entre hidratos con diferentes nmeros de molculas de agua. Es evidente que la transformacin ser siempre hacia la forma ms estable.
" Secado
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Cuando se seca una formulacin que contiene el medicamento, existe la posibilidad que se produzcan cambios en la estructura cristalina. Las formas anhidras y amorfas se forman por simple desolvatacin de un solvato y estas reacciones pueden ocurrir durante la etapa de secado.
" Compactacin Frecuentemente se asume que la forma cristalina de un medicamento se mantiene inalterable durante la etapa de compactacin. El fundamento de esta hiptesis es que los excipientes blandos se deforman preferiblemente antes que las formas cristalinas que son mas duras. Al aumentar las velocidades de tableting disminuye el tiempo de exposicin a altas presiones disminuye. En la produccin de la mayora de los medicamentos esto es cierto, sin embargo existen numerosos ejemplos que no siguen esta regla general y se producen cambios en la forma del polimorfo o del solvato durante la etapa de compactacin. Como se puede apreciar, existen mltiples etapas durante la fabricacin donde se pueden producir transformaciones polimrficas. Es importante que durante la etapa de desarrollo de un frmaco, los investigadores estudien minuciosamente la posibilidad del frmaco de presentar formas polimrficas. La eleccin de la forma termodinmicamente ms estable es lo ms aconsejable, pero en caso de no ser esta la forma de mayor biodisponibilidad, se necesita disponer de herramientas de anlisis
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para tener un control riguroso de la estabilidad y poder detectar posibles transformaciones durante el proceso de produccin y almacenaje.
Referencias 1.
60
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2.
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Metodologa y Discusin de Resultados
Captulos 4 & 5
4. Introduccin 5. Metodologa
5.1 Descripcin y preparacin de las muestras 5.2 Instrumentacin 5.3 Software 5.4 Procesamiento de datos
Metodologa y Discusin de los Resultados
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4. Introduccin La espectroscopia en el infrarrojo cercano es una tcnica rpida y fiable que permite reducir el tiempo de anlisis y asegurar la calidad del producto. Por otra parte, el espectro NIR contiene no solamente informacin qumica que se emplea para la determinacin de la composicin, sino tambin informacin fsica que permite determinar caractersticas fsicas de las muestras. Sin embargo, esta tcnica tiene algunas desventajas como son la baja selectividad, sensibilidad y una seal compleja que requiere el uso de tcnicas multivariables para extraer la informacin de inters analtico. El objetivo de esta tesis es el estudio de la influencia de parmetros fsicos en el desarrollo de modelos de calibracin mediante la espectroscopia en el infrarrojo cercano y la influencia de los parmetros fsicos sobre los espectros NIR, puede complicar la construccin de los modelos de calibracin. Algunas de estas situaciones se estudian en la presente tesis. La memoria consta de dos partes, una primera parte donde el efecto de la estructura cristalina de los compuestos (polimorfismo) sobre los espectros NIR hace que los polimorfos se comporten espectralmente como compuestos distintos, lo que se aplica a la determinacin de mezclas de formas polimrficas de un frmaco (azitromicina) y una segunda parte en que se estudian diferentes estrategias para la correccin del efecto de la temperatura sobre los espectros NIR, usando como modelo mezclas de los compuestos implicados en un proceso de esterificacin. En la primera parte, la diferencia en la estructura de los polimorfos, permite la identificacin y cuantificacin de uno en presencia de otro. Sin embargo, en la
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segunda parte una propiedad fsica como es la temperatura tiene un efecto no deseado sobre el espectro NIR que afectan negativamente la capacidad predictiva de los modelos para la determinacin del contenido de los componentes de las muestras. En los siguientes epgrafes se indican los detalles referentes a la preparacin de las muestras, los instrumentos empleados as como el registro de los espectros NIR, los programas utilizados y finalmente el procesamiento de los datos.
5. Metodologa 5.1 Descripcin y preparacin de las muestras Las formas polimrficas de la azitromicina utilizadas en el desarrollo de los modelos son: amorfa (A), monohidrato (MH) y dihidrato (DH). Se prepararon en el laboratorio mezclas binarias de A+DH y MH+DH por pesada en balanza analtica en el rango de 0-10% de DH y se homogenizaron manualmente. Para comprobar la homogeneidad de las muestras se registraron los espectros NIR de la misma y cuando los espectros consecutivos eran idnticos, se consideraba la muestra homognea. Los valores de las pesadas fueron tomados como valores de referencia. Con el objeto de observar el efecto de la temperatura y la presencia de contenidos variables de DH y humedad, se mantuvieron las muestras en diferentes condiciones: 1) ambiente de laboratorio, 2) en desecador con P2O5(s) y 3) en estufa a 60C con 100% de humedad.
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Para la determinacin de los compuestos implicados en el proceso de esterificacin, se prepararon en el laboratorio por pesada en balanza analtica 9 mezclas binarias, 4 ternarias y 14 cuaternarias, de cido actico glacial (HAc), 1-butanol (BuOH), n-butilo acetato (BuAc) y agua, en un rango de fraccin molar (C) comprendido entre 0-0.8. Las mezclas (binarias, ternarias y cuaternarias) y los compuestos puros se sometieron a un calentamiento gradual a partir de 25 C hasta 90 C y se registraron los espectros NIR a intervalos de 5 C. El recipiente con las disoluciones se coloca sobre una placa calefactora, se le introduce un agitador magntico y se sumerge un termmetro y la sonda de fibra ptica de inmersin para registrar los espectros NIR.
5.2 Instrumentacin Los registros de los espectros NIR de las muestras se han realizado con dos mdulos de registro, que fueron seleccionados en funcin del tipo de muestra. El registro de los espectros de las formas polimrficas de la azitromicina se ha realizado en un Espectrofotmetro FOSS NIRSystems, Modelo 6500 provisto de un mdulo Rapid-Content Analyzer (RCA), en un intervalo de longitudes de onda de 1100-2500 nm. El registro de estos espectros se lleva a cabo en modo reflectancia; las muestras se colocan en una cubeta de vidrio, se remueven con una esptula y se registran (resultado de 32 scans) por triplicado en el rango de 1100-2500nm con una resolucin de 2 nm. El espectro de referencia se obtiene con la cubeta de vidrio vaca y una placa cermica incorporada al instrumento. La media de los tres espectros se utiliza para los posteriores tratamientos matemticos.
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El registro de los espectros de las muestras liquidas fueron realizadas en modo transflectancia en un espectrmetro FOSS NIRSystems 5000 equipado con una sonda de fibra ptica. El camino ptico se ajusta para que la absorbancia medida est siempre dentro de la zona lineal de respuesta (inferior 1.5 ua). Los espectros de todas las muestras se registraron (resultado de 32 scans) en el intervalo de longitudes de onda comprendido entre 1100 y 2500 nm con una resolucin de 2 nm. El espectro de referencia se mide con la sonda de fibra ptica en el aire antes de empezar el calentamiento de cada disolucin. En ambos espectrofotmetros NIR se realiza la comprobacin del correcto funcionamiento del instrumento mediante los test de Linearizacin de longitud de onda y de Funcionamiento. Estos test se hacen diariamente antes de comenzar el registro de los espectros de las muestras. La caracterizacin de las formas polimrficas de la azitromicina se realiza por difraccin de rayos X, utilizando un Difractmetro Seifert XDR 3000 T/T, trabajando con: tubo de Cu ( = 1.5418 ) a 50 kV y 40 mA, gonimetro MZVI con controlador de micropasos C3000, monocromador secundario de grafito y detector de centelleo geometra Bragg-Brentano. Los difractogramas se registraron en el rango de 2 = 5 - 25, con una amplitud de paso de 0.02 y un tiempo de irradiacin de 10 segundos en cada posicin. La determinacin de agua en las muestras de azitromicina se realiz mediante un valorador Karl-Fischer Methrom mod. 716 DMS Titrino. Se minimiza el tiempo transcurrido entre la valoracin y el registro del espectro NIR de cada muestra, para evitar la posible absorcin de humedad ambiental.

5.3 Software
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Diferentes programas fueron empleados en esta tesis, dependiendo del objetivo que se pretenda. A continuacin se presentan los programas y los algoritmos que en cada uno de ellos se utiliz. VISION v2.51 (FOSS NIRSystems, Silver Spring, MD, USA): Permite el control del instrumento, obtencin y gestin de los espectros NIR, as como la construccin de las bibliotecas de identificacin, que permiten llevar a cabo el anlisis cualitativo. UNSCRAMBLER v9.1 (Camo Process S.A., Trondheim, Norway). Incorpora algoritmos que permiten aplicar los pre-tratamientos de primera y segunda derivada de Savitzky-Golay, el anlisis en componentes principales (PCA) y la regresin por mnimos cuadrados parciales (PLS). SPSS v11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Se emple para la construccin de los modelos de calibracin usando la regresin MLR stepwise. SIMCA-P v8.0 (Umetrics AB, Ume, Sweden). Incorpora los algoritmos de los pre-tratamientos espectrales Standard Normal Variate (SNV) y Orthogonal Signal Correction (OSC), el anlisis en componentes principales (PCA) y la regresin por mnimos cuadrados parciales (PLS).

5.4 Procesamiento de datos
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Las caractersticas de la seal en espectroscopia NIR, hace necesario el uso de mtodos multivariables para extraer la informacin cualitativa o cuantitativa. El primer paso es elegir el mtodo teniendo en cuenta el objetivo del anlisis y una vez elegido el mtodo multivariable se siguen una serie de pasos hasta la obtencin de un modelo con una correcta capacidad predictiva (ver epgrafe 2.2.4). En esta tesis se han empleado dos algoritmos de regresin, el de regresin parcial por mnimos cuadrados (PLS) y el de regresin lineal mltiple en pasos sucesivos (MLR stepwise). La regresin PLS es un algoritmo de uso frecuente en espectroscopia NIR, sin embargo, la regresin MLR stepwise no lo es. La relacin no lineal entre los scores del PCA de las muestras registradas a diferentes temperaturas, indujo a pensar que una regresin que incluyera trminos cuadrticos, podra modelar el efecto de la temperatura y por tanto se ensayaron modelos MLR stepwise con trminos cuadrticos de los scores y con productos de los scores. En cada regresin existen unos parmetros propios que deben ser ajustados adems del pre-tratamiento espectral y el rango de longitudes de onda. Los modelos PLS se construyeron por cross-validation (leave-one-out) seleccionando el nmero de factores correspondiente al mnimo en el grfico de varianza explicada vs. el nmero de factores PLS. Los modelos basados en el algoritmo MLR stepwise, se construyeron con los cinco primeros scores (Si), los cuadrados de los scores (Si2) y sus productos binarios (SiSj):
67
Yanalito = b0 + bi S i + bii S i2 + bij S i S j +

i i i, j
(5.1)
donde, bi,j son los coeficientes de la regresin y Si,j son los scores. La inclusin de cada uno de los trminos de la ecuacin de regresin se evala mediante un anlisis de varianza de la regresin (ANOVA). Para ello se calcula la F parcial segn la expresin:
SS con SS sin df reg F parcial = con SS df res

donde, SS es la suma de cuadrados y df son los grados de libertad. La inclusin o no de un trmino se realiza segn los siguientes criterios: F parcial > F(0.05, df(numerador), df(denominador)) el trmino se incluye en el modelo. F parcial < F(0.1, df(numerador), df(denominador)) el trmino se excluye del modelo.
(5.2)
Las caractersticas del espectro NIR hacen necesario de modo general, la aplicacin de pre-tratamientos espectrales que reducen las contribuciones
indeseadas de la seal. En el caso ideal las variaciones de la seal estn relacionadas nicamente con la propiedad de inters analtico. Desafortunadamente esto prcticamente no ocurre y generalmente la seal es el resultado de la composicin qumica (la concentracin de todos los componentes) y de las propiedades fsicas (tamao de partculas, presin, temperatura, etc.) de la muestra. Habitualmente a los espectros (matriz X) se les aplican pre-tratamientos espectrales (SNV, derivadas,
68
OSC, etc.). Las derivadas de primer y segundo orden se obtuvieron usando el algoritmo de Savitzky-Golay con un polinomio de orden 2 y una ventana de 11 puntos. En el algoritmo OSC es necesario seleccionar el nmero de factores-OSC (generalmente con 1 2 es suficiente) que eliminen o reduzcan en mayor medida la variabilidad espectral no correlacionada con la propiedad de inters analtico. La seleccin del rango espectral en los modelos de calibracin es emprica. Si se desea determinar la concentracin de un analito, un posible rango espectral es aquel donde el analito tenga las bandas ms significativas. El rango espectral que arroje los menores errores de calibracin y prediccin, ser el utilizado para la construccin de los modelos de calibracin. Otro aspecto de gran importancia es la deteccin de muestras anmalas (outliers) que son muestras que presentan desviaciones en los modelos respecto al resto de las muestras y que tienen un efecto perjudicial sobre los modelos de calibracin. Los grficos de scores de un PCA es una herramienta til para la deteccin de muestras que se encuentran muy alejadas del resto. Los grficos de residuales e influencia (leverage) de la regresin PLS son tambin tiles en la deteccin de muestras con desviaciones. En la prctica cuando se ha identificado a una muestra como un outlier, se intenta siempre que sea factible, repetir el registro del espectro NIR y/o la determinacin del valor de referencia. Una vez encontrado un modelo con parmetros de calibracin aceptables, se comprueba la capacidad predictiva del mismo con muestras externas que no han sido incluidas en la calibracin y de las cuales se conoce la identidad (anlisis cualitativo) o el valor de referencia (anlisis cuantitativo). Los resultados de la
69
calibracin y la prediccin se evalan mediante herramientas estadsticas que permiten comparar los resultados obtenidos con la espectroscopia NIR con los de referencia. Existen unas guas (ver Epgrafe 2.2.5) para la validacin de la metodologa desarrollada y su aplicacin al anlisis en rutina en la industria.
70
Captulo 6
6. Discusin de los Resultados

6.1 Caracterizacin y anlisis de formas polimrficas 6.1.1 Introduccin 6.1.2 Caracterizacin de pseudo-polimorfos por difraccin de Rayos X 6.1.3 Anlisis de pseudo-polimorfos mediante espectroscopia en el infrarrojo cercano 6.1.3.1 Modelos de calibracin (PLS) 6.1.3.2 Estudio de Estabilidad 6.2 Estudio y correccin del efecto de la temperatura en espectroscopia en el infrarrojo cercano 6.2.1 Introduccin 6.2.2 Estudio del efecto de la temperatura sobre los espectros NIR 6.2.3 Estrategias para la correccin del efecto de la temperatura 6.2.3.1 Modelar el efecto de la temperatura 6.2.3.2 Eliminar el efecto de la temperatura
71
6. Discusin de los Resultados Este captulo de la tesis tiene como objetivo recoger los aspectos ms relevantes de las metodologas de anlisis desarrolladas. Se pretende dar una visin ms detallada de cada uno de las metodologas y hacer una discusin de los avances que ellas representan.
6.1 Caracterizacin y anlisis de formas polimrficas En esta memoria se presenta un estudio de diferentes formas polimrficas de un frmaco (azitromicina). Se desarrollan modelos de calibracin que permiten determinar una forma polimrfica en presencia de otra. Complementariamente, se lleva a cabo un estudio de estabilidad de las formas polimrficas.
6.1.1 Introduccin La caracterizacin y determinacin de las formas polimrficas de un frmaco tiene un gran inters en la industria farmacutica. Los mtodos ms frecuentemente usados (Ej. la difraccin de rayos X) son laboriosos y lentos y por consiguiente poco apropiados para su aplicacin al anlisis en la industria. Si bien es importante poder caracterizar los diferentes polimorfos o pseudopolimorfos de una sustancia, tambin es necesario poder detectar posibles transformaciones que pueden ocurrir en el proceso de produccin, envasado y/o
72
preservacin. Las diferencias en la estructura de los polimorfos conduce a diferencias en propiedades de inters farmacutico, como es la biodisponibilidad, estabilidad qumica, etc. La azitromicina es el primero de una familia de antibiticos macrlidos derivados de la eritromicina A. Se han descrito dos formas cristalinas que corresponden a un mono- y dihidrato (MH y DH) y tambin una forma amorfa anhidra (A), que si bien son tratados como polimorfos se denominan pseudopolimorfos, ya que no cumplen estrictamente la definicin de polimorfismo (ver epgrafe 3.1). El peso molecular de cada una de las formas pseudo-polimrficas son diferentes (PMA=749, PMMH=767, PMDH=785), por lo que desde un punto de vista riguroso no podemos considerar las tres formas como una misma sustancia. Por otra parte, la forma amorfa tiene una disposicin desordenada de las molculas y por lo tanto no poseen un enrejado cristalino distinguible. En la Figura 11 se representa la frmula molecular de la azitromicina. Las frmulas moleculares de las formas hidratadas (MH y DH) son similares con la nica diferencia que tienen una y dos molculas de agua de hidratacin, respectivamente. Las formas cristalinas (MH y DH) poseen un contenido terico de agua de 2.3% y 4.6%, respectivamente; que corresponden al agua de hidratacin. Las formas A y MH son ligeramente higroscpicas y su contenido de agua puede variar entre 1-3% sin que se alteren la forma pseudo-polimrfica.
73
Fig. 11 Estructura molecular de la azitromicina (C38H72N2O12).
6.1.2 Caracterizacin de pseudo-polimorfos por difraccin de Rayos X Las tres formas pseudo-polimrficas fueron caracterizadas por difraccin de Rayos X (Figura 12). Se puede apreciar como las formas cristalinas (MH y DH) presentan perfiles de difraccin bien definidos con bandas agudas, mientras que la forma amorfa presenta bandas amplias y suaves debidas al scattering de los rayos X de la muestra. Se calcularon mediante calibracin univariada los lmites de deteccin y cuantificacin de la determinacin de DH en muestras de A y MH. El procedimiento seguido se detalla para la determinacin de DH en muestras de MH.
74
amorfa monohidrato dihidrato unidades arbitrarias 5
10
15 2Theta ( )
o
20
25
Fig. 12 Difractogramas de las tres formas pseudo-polimrficas de la azitromicina.
Se registraron los difractogramas de mezclas binarias de MH+DH con contenidos de DH entre 0 y 5%. Se calcul el valor de 2 para el cual la correlacin entre la intensidad y el contenido de DH (%) era mxima. El mayor coeficiente de correlacin (0.99) se obtuvo para 2=13.055. En la Figura 13 se muestra el grfico de regresin a 2=13.055, as como los parmetros de la recta. Los lmites de deteccin y cuantificacin se calcularon mediante las siguientes expresiones:
LD =
3 SDa b 10 SDa b
(6.1)
LD =
(6.2)

donde SDa es la desviacin estndar del intercepto y b es el valor de la pendiente.
75
Los valores obtenidos de lmites de deteccin y cuantificacin fueron 0.5% y 1.5% respectivamente y sern comparados ms adelante con los que se obtienen mediante la metodologa desarrollada con la espectroscopia NIR.
600 550 Intensidad (cuentas) 500 450 400 350 300 0 1 2 3 %DH 4 5 6
(2Theta = 13.055) y = 37.9(4.9)x + 345.5(13.8) r2 = 0.9851
Fig. 13 Grfico de regresin de Intensidad (cuentas) vs. %DH para 2=13.055.
6.1.3 Anlisis de los pseudo-polimorfos mediante espectroscopia en el infrarrojo cercano Las diferencias en la estructura de las tres formas pseudo-polimrficas, tambin se ponen de manifiesto en las diferencias de sus espectros NIR (Figura 14).
76
1.0
3
0.5
amorfa monohidrato dihidrato
2 Intensidad (SNV)
0.0
-0.5 1800
1900
2000
2100
2200
-1
1100
1300
1500
1700
1900
2100
2300
2500
Longitudes de onda (nm)
Fig. 14 Espectro NIR de las tres formas pseudo-polimrficas de la azitromicina.
Los espectros NIR de las tres formas pseudo-polimrficas muestran las principales diferencias en la regin de 1800-2200 nm donde se encuentra la banda ms intensa del agua (ver Figura 14). La forma A tiene una banda ancha y poco intensa que corresponde al agua de adsorcin, sin embargo las formas MH y DH tienen bandas intensas con uno y dos mximos de absorbancia, respectivamente que corresponden al agua de hidratacin.
6.1.3.1 Modelos de calibracin (PLS) Las diferencias espectrales de las formas pseudo-polimrficas que se manifiestan en la Figura 14, permiten desarrollar modelos de calibracin mediante regresin parcial
77
por mnimos cuadrados (PLS) para la determinacin del contenido de DH en muestras de A y MH. Tambin se desarrollaron modelos PLS para la determinacin del contenido de agua en dichas muestras. La posible absorcin de humedad en los pseudo-polimorfos, conduce a la necesidad de estudiar este efecto y su posible influencia en los modelos de calibracin para la determinacin del contenido de DH. Se prepararon mezclas de A y MH con contenidos variables de DH y se mantuvieron en diferentes condiciones de humedad: 1- estufa de vaco a 50C, 2desecador y 3-atmsfera hmeda. De esta forma se dispona de muestras con contenidos variables de DH y tambin de humedad. En la Figura 15 se representan los grficos de scores de un anlisis en componentes principales (PCA) de estas muestras. Los grficos del scores del anlisis en componentes principales (PCA) de la Figura 15, muestran que en ambas mezclas (A+DH y MH+DH) la mayor variabilidad queda explicada en el primer PC y est relacionada con el contenido de humedad. La variabilidad que explica el segundo PC, est relacionada con la variacin del contenido de DH. Estos hechos indican que para la construccin de modelos de calibracin, es necesario incluir en los conjuntos de calibracin mezclas polimrficas con contenidos variables de humedad. El rango de concentracin de DH establecido para la construccin de los modelos de calibracin fue de 0-10%.
78
aumenta %H2O 1-1 aumenta %DH PC2 (26%) 5-1 1-2 PC2 (4%) 1-3 5-2 5-3 10-1 10-2 PC1 (52 %) (a) 10-3 2-3 4-3 9-3 6-3 8-3
aumenta %H2O
3-5 5-5 7-5 2-4 1-4
aumenta %DH
3-5 8-5 4-4 5-5 6-5 7-5 9-4 10-5 PC1 (93%) (b)
Fig. 15 Grficos de scores (PC1 vs. PC2) del PCA de mezclas de: (a) A+DH, (b) MH+DH. El primer nmero de las muestras representa el contenido de dihidrato (%DH) y el segundo el contenido de humedad (%H2O).
Los valores de referencia del contenido de DH se obtienen directamente por la pesada en la balanza analtica y los del contenido de agua por valoracin con el mtodo de Karl-Fischer. Siguiendo las estrategias generales descritas en el epgrafe 2.2.4, se seleccionaron las muestras que conforman los conjuntos de calibracin y de prediccin, se ensayaron diferentes intervalos de longitudes de onda, pretratamientos espectrales, nmero de factores PLS y se evaluaron los resultados obtenidos. En la Tabla 3 se presentan los parmetros de calibracin y prediccin de los modelos PLS1 para las determinaciones de DH y agua, en los pseudo-polimorfos A y MH. La alta correlacin entre la intensidad de las bandas de absorcin de DH y H2O
79
en el rango 1800-2200 nm, nos llev a ensayar la aplicacin de modelos PLS2 para la determinacin conjunta de estos dos analitos, siendo los resultados muy similares a los obtenidos con los modelos PLS1. Tabla 3. Figura de mritos de los modelos PLS1 desarrollados para la determinacin de dihidrato y agua en muestras de amorfa y monohidrato.
DIHIDRATO
Muestras Rango de concentracin (%) Rango espectral (nm) Pretratamiento espectral No. de Factores PLS Calibracin No. de muestras Recta de regresin Coeficiente de correlacin RSEC (%) Prediccin No. de muestras Recta de regresin Coeficiente de correlacin RSEP (%) 42 25 44 26 30 17 39 33 amorfa 0 10.1 18002200 2 Derivada 2
a
AGUA
amorfa 1.2 4.8 18002200 1 Derivada 2
a
DIHIDRATO
monohidrato 0 13.3 11002500 2 Derivada 4
a
AGUA
monohidrato 2.9 5.4 18002200 2a Derivada 2
CNIR = 0.073 + 0.983CREF CNIR = 0.017 + 0.994CREF 0.992 7.8 0.997 3.1
CNIR = 0.069 + 0.986CREF CNIR = 0.097 + 0.977CREF 0.993 6.8 0.988 2.5
CNIR = 0.048 + 1.008CREF CNIR = -0.032 + 1.017CREF 0.992 7.9 0.993 5.2
CNIR = 0.058 + 0.988CREF CNIR = -0.124 + 1.029CREF 0.989 7.8 0.977 2.7
De los resultados de la Tabla 3 cabe destacar que en la mayora de los casos con el rango espectral de 1800-2200nm se obtienen los mejores modelos, que como se mostr en la Figura 12 es donde se encuentra la banda ms intensa del agua y donde existen las mayores diferencias espectrales entre las tres formas pseudopolimrficas. El modelo que determina el contenido de DH en muestras de MH, arroja los mejores resultados empleando el rango espectral de 1100-2500nm y adems
80
necesita un mayor nmero de factores-PLS que el resto de los modelos. Esto puede deberse a la mayor similitud espectral que existe entre las dos formas cristalinas. Se validaron ambas metodologas siguiendo las guas de validacin descritas en el epgrafe 2.2.5 para su aplicacin en la industria farmacutica (Tabla 4). Tabla 4. Resultados de las validaciones de las metodologas desarrolladas para la cuantificacin del contenido de dihidrato en muestras de amorfa y monohidrato.
AMORFA Selectividad Mtodo n Rango de concentracin (%) Pretratamiento espectral Rango espectral (nm) Umbral Linealidad n Rango de concentracin (%) Intercepto Pendiente Coeficiente de correlacin Exactitud n Promedio de residuales (%) Desviacin Estndar texp ttab (=0.05) Promedios (%) Varianza Residual en el espacio de los PC 36 0-2 1 Derivada 1800-2200 0.90 9 0-10 -0.09 0.19 1.04 0.04 0.9994 9 0.10 0.18 1.662 2.365 X1 = 0.9 X2 = 5.1 X3 = 9.0 CV1 = 3.1 CV2 = 1.1 CV3 = 2.6 CVTOTAL = 2.3 X = 5.0 CV = 3.6 0.2% 0.8% MONOHIDRATO Varianza Residual en el espacio de los PC 43 0-2 2 Derivada 1100-2500 0.74 8 0-10 -0.19 0.44 1.03 0.08 0.9968 8 -0.05 0.31 0.459 2.365 X1 = 3.1 X2 = 4.4 X3 = 6.8 CV1 = 2.7 CV2 = 4.4 CV3 = 3.5 CVTOTAL = 4.0 X = 4.4 CV = 4.8 0.2% 0.8%
Repetibilidad
Coeficientes de variacin (%)
Precisin intermedia
Promedio (%) Coeficiente de variacin (%)
Lmite de LD = 3.SDa / b Deteccin (LD) Lmite de LD = 10.SDa / b Cuantificacin (LQ)
81
Se evaluaron los parmetros de: selectividad, linealidad, exactitud, precisin, limites de deteccin y cuantificacin; cumplindose para todos los parmetros los criterios establecidos. A partir de las rectas de regresin obtenidas para la determinacin del contenido de DH en las otras dos formas pseudo-polimrficas, se han estimado los lmites de deteccin (LD) y de cuantificacin (LQ) por espectroscopia NIR, obtenindose en todos los casos valores inferiores a los obtenidos por difraccin de rayos X.
6.1.3.2 Estudio de Estabilidad Si bien es importante poder caracterizar los diferentes pseudo-polimorfos del frmaco, tambin es necesario poder detectar posibles transformaciones que pueden ocurrir en el proceso de produccin, envasado y/o almacenamiento. Se ha realizado un estudio de estabilidad de cada uno de los pseudopolimorfos de la azitromicina en condiciones de elevada humedad y temperatura mediante espectroscopia NIR, con el objeto de establecer la mejor forma de conservacin que asegure la existencia de una nica forma polimrfica. Se estudia tambin la influencia de la presencia de DH en muestras de A y MH, sobre la estabilidad de las formas polimrficas. Se prepararon muestras de A y MH con contenidos variables de DH (0%, 2% y 7%, respectivamente). Estas muestras se mantuvieron durante 60 das en dos condiciones de de humedad: en medio seco y saturado de humedad (100% HR) y
82
elevada temperatura (60C). En la Figura 16 se representa la evolucin de los espectros NIR en la regin 1800-2200nm de las formas A y MH puras y con contenidos variables de DH.
AMORFA
MONOHIDRATO
AMORFA + 2% DH
MONOHIDRATO + 2% DH
Intensidad (SNV)
AMORFA + 7% DH
Intensidad (SNV) MONOHIDRATO + 7% DH 1900 2000 2100 Longitudes de onda (nm) 2200 1800
1800
1900 2000 2100 Longitudes de onda (nm)
2200
Fig. 16 Evolucin de los espectros NIR (SNV) de las formas A y MH puras y con contenidos variables de DH. (1 da ---, 14 das - - -, 24 das - - -, 38 das -.-, 51 das -..-, 60 das )
83
El anlisis cualitativo de los espectros NIR muestra que cuando las formas
pseudo-polimrficas (A, MH, DH) se mantienen en condiciones de elevada

temperatura (60C) no se producen transformaciones polimrficas. Sin embargo, el efecto combinado de humedad (100% de HR) y temperatura (60C), no produce cambios en el DH, la cual puede ser considerada la forma ms estable y provoca un comportamiento particular de las otras dos formas pseudo-polimrficas (A y MH). En estas mismas condiciones de humedad y temperatura, se estudi la influencia de diferentes contenidos de DH en la estabilidad de A y MH, ya que la presencia de cristales madre suele acelerar las transformaciones polimrficas. En la Figura 16 se aprecia que en las muestras de A se produce inicialmente un aumento en la intensidad de la banda del agua de adsorcin (1915 nm) y posteriormente empieza a aumentar la intensidad de la banda 1955 nm que corresponde al agua de hidratacin del DH, por tanto se ha producido la incorporacin de agua en la estructura cristalina y por ende la transformacin de la forma A en DH. La intensidad de la banda correspondiente a la formacin del DH es mayor a medida que aumenta el contenido de DH en las muestras de A, lo que significa que la presencia de DH acelera la transformacin polimrfica. El comportamiento del MH difiere del de la A. En esta forma pseudopolimrfica solamente se aprecia un aumento en la intensidad de la banda del agua en la primeras 24h, que despus permanece invariable, lo que significa que ha adsorbido agua y no se ha producido transformacin polimrfica en estas condiciones. La presencia de DH en MH, no altera la estabilidad de este pseudopolimorfo.
84
A continuacin discutiremos los resultados del anlisis cuantitativo que se lleva a acabo empleando los modelos PLS1 desarrollados (Tabla 3). El modelo para la prediccin del contenido de DH en A, tuvo que ser ajustado para expandir el rango de 0-100% DH. En la Figura 17 se muestran las predicciones de DH y agua en las muestras de A.
100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 das 40 50 60 A A + 2% DH A + 7% DH
5 A A + 2% DH A + 7% DH
4 % H2O
% DH
10
20
30 das
40
50
60
Fig. 17 Predicciones de los contenidos de DH y agua en muestras de A.
En la Figura 17 se aprecia que durante los primeros 14 das se produce un ligero aumento del contenido de agua, sin que se modifique el contenido de DH. Sin embargo, con el transcurso del tiempo el contenido de agua aumenta
significativamente ( 2.5%), as como el de DH que llega a valores del 80%. Estos resultados cuantitativos confirman que se ha producido una transformacin polimrfica de A en DH.
85
En las muestras de MH (0, 2, 7% de DH), solamente se produce un aumento del contenido de agua en las primeras 24h de aproximadamente 1.3%, que permanece prcticamente constante hasta el sexagsimo da. El contenido de DH no vara durante los 60 das del experimento, lo que significa que esta forma es estable en las condiciones establecidas. El anlisis cualitativo y cuantitativo demuestran que el MH y el DH son estables en las condiciones de humedad y temperatura establecidas, sin embargo la forma A se transforma en el DH que es la forma ms estable.
6.2 Estudio y correccin del efecto de la temperatura en espectroscopia en el infrarrojo cercano 6.2.1 Introduccin La variacin de la temperatura produce una variacin de la intensidad de las bandas de absorcin y un desplazamiento de la posicin de las mismas en los espectros NIR de muestras lquidas. Las caractersticas de las bandas de absorcin, posicin e intensidad, de los grupos funcionales OH, NH y SH dependen de las asociaciones intra- e intermoleculares, mientras que las caractersticas de las bandas de absorcin de las vibraciones CH estn fundamentalmente afectadas por los cambios de densidad. El cambio de temperatura ejerce un efecto ms marcado en las bandas de los grupos funcionales que presentan enlaces por puentes de hidrgeno, ya que produce
86
una disminucin del nmero promedio de puentes de hidrgeno por grupo OH y un aumento del nmero de OH libres. Estos cambios en las bandas de absorcin, trae como consecuencia que la construccin de modelos de calibracin con espectros registrados a una determinada temperatura o rango de temperaturas, no tiene una buena capacidad predictiva cuando se aplica a muestras que estn registradas a temperaturas fuera del rango de las del modelo de calibracin. En la literatura se discute el efecto que tiene las variaciones de temperatura en la calibracin multivariada y las diferentes metodologas aplicadas para la resolucin de este problema. Los mtodos propuestos se dividen en dos grupos, uno que intenta antes o durante la regresin de eliminar el efecto de la temperatura y otro que rene a un conjunto de mtodos de regresin puros donde se modela el efecto de la temperatura en vez de eliminarlo. Dentro del primer grupo se encuentra el algoritmo OSC que tiene la ventaja que no requiere conocer la temperatura a la cual han sido registradas las muestras y que discutiremos ms adelante. En esta memoria se lleva a cabo un estudio del efecto que la variacin de la temperatura ejerce en la prediccin de los productos implicados en la reaccin de esterificacin (HAc + BuOH ' BuAc + H2O) en un intervalo de temperatura entre 2590 C. Por una parte se realiza un estudio del efecto que la temperatura ejerce sobre los espectros NIR de muestras lquidas y por otra parte se proponen diferentes estrategias para la correccin de este efecto en los modelos de calibracin (Figura 18).
87
CORRECCIN DEL EFECTO

DE LA TEMPERATURA
Modelar
Eliminar (filtrado OSC)
Modelos PLS
Modelos MLR
stepwise
Modelos PLS
Fig. 18 Estrategias para la correccin del efecto de la temperatura en los modelos de calibracin.
Modelos
PLS
MLR stepwise
Modelo 1
Modelo 2
Modelo 3
Modelo 4
CALIB
PRED
CALIB
PRED
CALIB
PRED
CALIB
PRED
25C
25C
30-90C
25-50C
25-50C
55-90C
25 y 90C
25-90C
25-90C
25-90C
Fig. 19 Descripcin de los conjuntos de calibracin y prediccin de los modelos PLS y MLR
stepwise.
88
Como se muestra en la Figura 18, una estrategia seguida para la correccin del efecto de la temperatura es modelar el efecto de la temperatura y para ello se emplearon las regresiones PLS y MLR stepwise. En ambas regresiones se ensayaron diferentes intervalos de temperatura, de longitudes de onda y pretratamientos espectrales para conseguir modelos con la mejor capacidad predictiva en las diferentes situaciones experimentales. En la Figura 19 se presenta un esquema de los modelos ensayados con los respectivos conjuntos de calibracin y prediccin. En el Modelo 1 el conjunto de calibracin solamente contiene muestras registradas a 25C y el conjunto de prediccin se ha subdividido en dos: uno que contiene muestras a la misma temperatura que el conjunto de calibracin y el otro subconjunto que contiene muestras del resto del intervalo de temperatura (30-90 C). Para el Modelo 2 se construy un conjunto de calibracin con muestras del primer intervalo de temperatura (25-50 C) y los dos conjuntos de prediccin se construyeron con el mismo criterio del Modelo 1. El Modelo 3 tiene un conjunto de calibracin que contiene muestras de los extremos del intervalo de temperatura (25 y 90 C) y se predicen muestras en todo el rango de temperatura. El Modelo 4 contiene muestras en todo el intervalo de temperatura tanto en calibracin como en prediccin. La otra estrategia seguida para la correccin del efecto de la temperatura es la utilizacin del filtrado de variables conocido como orthogonal signal correction (OSC) con el objetivo de eliminar la variabilidad espectral debida a la temperatura y no correlacionada con la concentracin de los componentes implicados en la reaccin de
89
esterificacin. Una vez eliminada la informacin espectral con el algoritmo OSC, se construyen modelos de calibracin para la determinacin de cada componente individual (PLS1) y simultneamente de las cuatro especies implicadas (PLS2). Tambin se realiz un estudio de la informacin espectral eliminada (matriz XE) por el algoritmo OSC y de la informacin remanente (matriz XR) que se utiliza en la construccin de los modelos de calibracin.
6.2.2 Estudio del efecto de la temperatura sobre los espectros NIR Se estudi el efecto que la temperatura ejerce sobre los espectros NIR de los compuestos puros implicados en la reaccin de esterificacin, as como de mezclas de estos (Figura 20). El aumento de la temperatura provoca corrimientos hipsocrmicos de los mximos de absorbancia, sin cambios significativos en la intensidad de las bandas. El comportamiento de los cuatro compuestos puros ante el aumento de la temperatura difiere; presentando el espectro del agua las mayores alteraciones y el del acetato de butilo las menores. Los espectros del butanol y el cido actico estn ms afectados que el acetato de butilo pero menos que el agua. El efecto de la temperatura en la mezcla cuaternaria (ver Figura 20e) depende de las bandas que se consideren: el desplazamiento es importante en las bandas de OH y muy reducido en las de CH. Podemos deducir que el desplazamiento ms importante, unido a un estrechamiento de la banda, se produce en las bandas pertenecientes a los grupos susceptibles de formar enlace por puente de hidrgeno y este desplazamiento aumenta con la temperatura. Estos comportamientos indican que el efecto de la temperatura sobre
90
los espectros NIR, esta relacionado con la capacidad de los compuestos de formar enlaces por puente de hidrgeno y por tanto depender de la polaridad de los mismos.
1.4 1.2 1.0 Absorbancia 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 1100 1.2 (c) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 1100 1.4 1.2 1.0 Absorbancia 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 1100 (e) Absorbancia (a)
1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 1100 1.8 1.6 1.4 Absorbancia 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 1300 1500 1700 1900 2100 2300 2500 0.0 1100 1300 1500 1700 1900 2100 2300 2500 (d) (b)
1300
1500 1700 1900 2100 Longitudes de onda (nm)
2300
2500
1300
2300
2500
Absorbancia
Longitudes de onda (nm)
Longitudes de onda (nm) 20C 40C 60C 80C
1300
2300
2500
Fig. 20 Espectros NIR (SNV) registrados a diferentes temperaturas de: (a) HAc, (b) BuOH, (c) BuAc, (d) H2O, (e) mezcla cuaternaria (XHAc=0.26, XBuOH=0.24, XBuAc=0.25, XH2O=0.25).

Un anlisis en componentes principales (PCA) permite apreciar
91 las
caractersticas de estas variaciones espectrales. En la Figura 21 se muestra un grfico de scores (PC2 vs. PC1) de los cuatro compuestos puros y una mezcla cuaternaria.
0.15 mezcla cuaternaria HAc BuOH 60 BuAc H2O 90 75
0.10
40 20
0.05
0.00
-0.05 90 -0.10 90
6560 70 55 50 80 90 20 45 40 40 60 85 35 60 40 30 25
PC2
20
-0.15 -2 -1 0 PC1 1 2
Fig. 21 Grfico de scores (PC2 vs. PC1) de HAc, BuOH, BuAc y H2O a 20, 40, 60, 90 C y mezcla cuaternaria (XHAc=0.26, XBuOH=0.24, XBuAc=0.25, XH2O=0.25) a 25-90 C.
En el grfico de los scores representado en la Figura 21, para todos los compuestos los dos primeros scores explican casi la totalidad de la varianza espectral (>99 %). Se obtiene una curva parablica como resultado del aumento de la temperatura en todos los compuestos puros y la mezcla cuaternaria. Este mismo comportamiento se observa en todas las mezclas ternarias y cuaternarias. El H2O es el compuesto puro que muestra de forma ms acusada esta tendencia, seguido del HAc, el BuOH y en menor grado el BuAc. La mezcla cuaternaria tiene un
92
comportamiento similar al del H2O, tanto en magnitud como en signo y es tambin ms acusada en las mezclas con un alto contenido de H2O. Estos comportamientos indican claramente que los espectros NIR de los compuestos capaces de formar enlaces por puente de hidrgeno, estn ms afectados por el efecto de la temperatura.
6.2.3 Estrategias para la correccin del efecto de la temperatura 6.2.3.1 Modelar el efecto de la temperatura Con el objeto de modelar el efecto de la temperatura, se ensayaron modelos basados en el algoritmo de regresin parcial por mnimos cuadrados (PLS). La relacin parablica entre los scores de un PCA -como se mostr el la Figura 19-, sugiri que una regresin que incluyera trminos cuadrticos debera mejorar la capacidad predictiva de los modelos. Por esta razn, se ensayaron tambin modelos mediante regresin con los scores, los cuadrados de los scores y combinaciones de los scores en pasos sucesivos (MLR stepwise). En los modelos construidos con ambas regresiones, se ha incluido de manera implcita la variable temperatura en diferentes rangos -como se mostr en la Figura 17- y se ensayaron diferentes pre-tratamientos espectrales (derivadas y SNV), intervalos de longitudes de onda y factores. En la Tabla 5 se muestran los resultados de los modelos con ambas regresiones para cada uno de los analito.
93
Tabla 5. Parmetros de los modelos obtenidos con la regresiones PLS y MLR stepwise.
Regresin PLS Modelo Analito 1 1 1 1 HAc BuOH BuAc H 2O Pretrat. 2aD 1aD 2aD 1aD Fact. 4 4 5 4 RSEC RSEP1 RSEP2 % % % 2.6 3.0 4.1 5.1 3.1 3.6 4.6 5.1 10.0 10.7 7.4 15.9 Regresin MLR stepwise Fact. PC1, PC3, PC2, PC12, PC5, PC4 PC1, PC2, PC3, PC4, PC32, PC22, PC5 PC2, PC22, PC1, PC3, PC12 PC2, PC1, PC3, PC12, PC5 PC1, PC2, PC3, PC5, PC22, PC4, PC12 PC1, PC3, PC2, PC5, PC32, PC12, PC22 PC2, PC1, PC22, PC12 PC2, PC1, PC3, PC12, PC32, PC4, PC5, PC22 PC1, PC2, PC3, PC4, PC5, PC22, PC12 PC1, PC2, PC3, PC5, PC12, PC52 PC2, PC1, PC22, PC4, PC12, PC3 PC2, PC1, PC3, PC12, PC4, PC5, PC32 PC2, PC1, PC3, PC4, PC5, PC22, PC42 PC1, PC3, PC5, PC2, PC22 PC2, PC1, PC22, PC4, PC12, PC3 PC2, PC3, PC1, PC22, PC5, PC42 RSEC RSEP1 RSEP2 % % % 2.7 2.2 4.1 5.0 3.4 3.4 5.0 6.2 10.4 7.3 8.1 8.4
2 2 2 2
HAc BuOH BuAc H 2O
2aD 1aD 2aD 2aD/1aD*
5 5 5 5
3.2 3.0 4.2 4.3
3.9 3.9 4.2 4.3
9.4 9.2 5.5 7.8
4.2 3.1 5.3 3.6
4.9 3.5 5.3 4.0
10.5 6.7 6.8 6.8
3 3 3 3
HAc BuOH BuAc H 2O
2aD 1aD 2aD 1aD
5 5 5 5
5.0 3.7 6.3 5.8
7.7 4.6 6.7 12.4
5.7 5.5 5.5 6.6
7.4 7.3 5.4 8.9
4 4 4 4
HAc BuOH BuAc H 2O
2aD 1aD 2aD 1aD
5 5 5 5
5.3 3.7 4.7 6.0
5.7 3.6 4.7 5.8
6.3 5.6 5.6 5.4
6.2 5.4 5.7 5.1
Pretrat. Pretratamiento Espectral, Fact. Factores, * Es el nico caso donde el pretratamiento espectral que daba los mejores resultados no concordaba en las dos regresiones. En el modelo PLS se utiliz la 2aD y en el MLR stepwise la 1aD. Todos los modelos fueron construidos en el intervalo espectral 1100-2500 nm, que arroj los mejores resultados.
94
Como se puede apreciar en la Tabla 5, los mejores resultados se obtienen con espectros de derivadas en el intervalo de 1100-2500 nm. De forma general en los modelos PLS, la inclusin de muestras con diferentes temperaturas en los modelos de calibracin, aumenta en uno el nmero de factores PLS. En los modelos MLR stepwise, generalmente la seleccin de factores sigue el siguiente orden: primero los scores, despus los cuadrados de los scores y en ningn caso los trminos de combinaciones de scores. No se observa una clara relacin entre la incorporacin de la variable temperatura en los modelos y la inclusin de trminos cuadrticos en el modelo. Los modelos con espectros de una sola temperatura incluyen tambin trminos cuadrticos. Para todos los compuestos y en ambas regresiones, el error de prediccin de los conjuntos de muestras registradas a temperaturas no incluidas en las calibraciones son mayores que las que estn en el mismo intervalo de temperatura que las calibraciones (RSEP2 > RSEP1). Los modelos (PLS y MLR stepwise) del BuAc, que incluyen de forma parcial la variabilidad de la temperatura (Modelo 2 y Modelo 3), logran predecir correctamente el contenido de este analito en muestras registradas en todo el rango de temperatura. Este comportamiento singular del BuAc se debe a que es el analito menos influenciado por la temperatura, debido a la imposibilidad de formar enlaces por puente de hidrogeno.
95
Para el resto de los analitos es necesario construir modelos que contienen la variabilidad de la temperatura en todo el rango (Modelo 4), para lograr predicciones satisfactorias. Una excepcin la constituye el Modelo 3 basado en la regresin PLS, que permite predecir correctamente el contenido de BuOH. Estos resultados concuerdan con lo observado en los grficos de scores de la Figura 2, que indica que el H2O y el HAc son los analitos ms influenciados por la temperatura y el BuAc y el BuOH son los menos afectados. Los resultados de los modelos de calibracin PLS1 y MLR stepwise son similares y deben incluir parcial o totalmente el efecto de la temperatura para lograr predicciones correctas.
6.2.3.2 Eliminar el efecto de la temperatura La segunda estrategia para la correccin del efecto de la temperatura, consiste en eliminar o reducir el efecto de la temperatura, mediante el filtrado de variables denominado Orthogonal Signal Correction (OSC). Este pre-tratamiento espectral permite eliminar la variabilidad espectral no correlacionada con la concentracin de los analitos, como es la temperatura. Con la informacin espectral que esta correlacionada con la concentracin de los analitos y no con la temperatura, se construyen modelos de calibracin mediante la regresin PLS. Se han preparado dos modelos: uno constituido por muestras de calibracin registradas a una sola temperatura (Conjunto A) y el otro contiene muestras que
96
cubren el rango completo de temperaturas (Conjunto B). El resto de las muestras no usadas en la calibracin se utilizan en el set de prediccin. En la Figura 22 se representa el esquema seguido en el estudio, indicando las etapas de la construccin de los modelos de calibracin PLS1 y PLS2, despus de aplicar el pre-tratamiento espectral OSC.
Espectro (de los conjuntos A y B), matriz-X (ABS, SNV, 1aD, 2aD)
Valores de Referencia (de los conjuntos A y B), matriz-Y
Y1 Y2 Y3 Y4
= = = =
C(HAc) C(BuOH) C(BuAc) C(H2O)
Y=
C(HAc) C(BuOH) C(BuAc) C(H2O)
OSC1
OSC2
Matriz-XE
Matriz-XR
Matriz-XE
Matriz-XR
PLS1
PLS2
Fig. 22 Esquema seguido en la construccin de los modelos de calibracin mediante el algoritmo OSC. C(analito) Fraccin Molar de los analitos, matriz XE informacin espectral que es ortogonal a la matriz Y y que es eliminada con el OSC, matriz XR informacin espectral que queda remanente despus de aplicar el OSC.
97
A los espectros del conjunto de calibracin (matriz X) se les aplica el OSC y se extrae la informacin espectral ortogonal a la matriz Y (las matrices Y1, Y2, Y3, Y4 contienen las fracciones molares de cada uno de los analitos o de todos los analitos, matriz Y) de los datos analticos (matriz XE); la informacin espectral resultante de la eliminacin (matriz XR) se utiliza en la construccin de los modelos PLS. En cada caso, con la matriz resultante (matriz XR) se construyen los cuatro modelos basados en la regresin PLS1 para la determinacin de cada uno de los cuatro analitos o el modelo PLS2 para la determinacin simultanea de los cuatro analitos. Estas dos estrategias de trabajo se aplicaron a los conjuntos de muestras A y B. Al aplicar el algoritmo OSC a las muestras del conjunto A se obtienen, tanto con la regresin PLS1 como con la PLS2, modelos con buena capacidad predictiva en muestras registradas a 25oC (RSEP < 5%), sin embargo la prediccin de muestras registradas a temperaturas distintas a las de la calibracin conduce a errores importantes en todos los casos (RSEP > 10%). Sin embargo, la aplicacin al conjunto B, que contiene muestras registradas a todas las temperaturas, conduce a modelos PLS1 simples y con una buena capacidad predictiva. En la Tabla 6 se muestran las caractersticas de los modelos construidos con el conjunto B.
98
Tabla 6. Caractersticas del Modelo B para los cuatro analitos.

HAc PLS1 Modo Espectral Factores OSC Factores PLS RSEC (%) RSEP (%) Modo Espectral Factores OSC Factores PLS RSEC (%) RSEP (%) ABS 2 1 2.0 3.2 ABS 2 3 6.7 7.0 BuOH 2D 1 1 2.3 3.7 2aD 2 3 2.1 2.5
a
BuAc ABS 2 1 1.8 2.5 ABS 2 3 5.1 6.6
H2O ABS 2 1 3.2 4.3 ABS 2 3 5.6 6.2
PLS2
Todos los modelos fueron construidos en el intervalo espectral 1100-2500 nm, que arroj los mejores resultados.
El nmero de factores OSC necesarios para eliminar la informacin no correlacionada es el mismo en los dos pretratamientos (2 factores OSC). Los modelos PLS1 requieren un menor nmero de factores PLS que los modelos PLS2 y tambin la calidad de los modelos (PLS1) tanto en calibracin como en prediccin es mejor (Tabla 6). Esto demuestra la mayor efectividad del OSC1 frente al OSC2 en la eliminacin de la informacin espectral no correlacionada con la concentracin. Complementariamente a la aplicacin del algoritmo OSC con el objetivo de eliminar la variabilidad espectral debida al efecto de la temperatura, se llev a cabo un estudio para conocer el tipo de informacin espectral eliminada por la aplicacin del tratamiento OSC (matriz XE) y la que queda remanente (matriz XR) con la cual se construyen los modelos de calibracin PLS1 y PLS2, utilizando para ello los loadings OSC y los scores del modelo PCA.
99
L1-HAc-A L1-HAc-B r = 0.99
L2-HAc-A L2-HAc-B r = 0.77
L1-BuOH-A L1-BuOH-B r = 1.00
L2-BuOH-A L2-BuOH-B r = 0.98
Loadings del 2do factor-OSC (L2)
Loadings del 1er factor-OSC (L1)
L1-BuAc-A L1-BuAc-B r = 1.00
L2-BuAc-A L2-BuAc-B r = 0.82
L2-H2O-A L2-H2O-B
L1-H2O-A L1-H2O-B r = 0.98
r = 0.98
L1-todos los analitos-A L1-todos los analitos-B
L2-todos los analitos-A L2-todos los analitos-B
r = 0.94
r = 0.93
1100 1300 1500 1700 1900 2100 2300 2500 Longitudes de onda (nm)
1100 1300 1500 1700 1900 2100 2300 2500 Longitudes de onda (nm)
Fig. 23 Loadings del primer y segundo factor-OSC tomando como matriz-X las muestras de los conjuntos A y B y como matriz-Y las fracciones molares de cada uno de los analitos y de todos a la vez.
100
En la Figura 23 se muestran los loadings de los factores-OSC (L1, L2) para los conjuntos A y B. Como se puede apreciar, los loadings del primer factor-OSC (L1) para los modelos corregidos de los cuatro analitos son muy similares en los dos conjuntos A y B (los coeficientes de correlacin son superiores a 0.98). La similitud entre los loadings del primer factor-OSC en ambos modelos indica que este factor-OSC no elimina el efecto de la temperatura, ya que el conjunto A solo contiene espectros registrados a la misma temperatura. Ambos modelos eliminan el mismo tipo de contribuciones espectrales y para todos los analitos la informacin eliminada se asemejan al espectro de agua que es el analito con la contribucin mas importante al espectro de las mezclas. Cuando la correccin OSC se realiza usando la matriz Y (que contiene las fracciones molares de todos los analitos) el coeficiente de correlacin entre ambos loadings es algo menor (r=0.94), lo que indica que el primer
loading del conjunto B est corrigiendo en alguna medida el efecto de la

temperatura. Los loadings del segundo factor-OSC (L2) de los conjuntos A y B, tienen una menor similitud, con coeficientes de correlacin menores (0.77 para el HAc y 0.82 para el BuAc), lo que indica que este segundo factor corrige en mayor medida el efecto de la temperatura. Los perfiles de los loadings presentan un perfil muy semejante pero con desplazamientos de los picos que es el principal efecto que produce el cambio de temperatura sobre los espectros NIR y que demuestran la necesidad de un segundo factor-OSC para corregir el efecto de la temperatura. Estos hechos demuestran que la principal causa de variacin entre los espectros no es debido a la variacin de temperatura. Los segundos loadings de la
101
correccin OSC2 con ambos conjuntos A y B son ms diferentes entre si, lo que es indicativo de la importante correccin que produce el segundo factor OSC en el modelo del conjunto B. Las caractersticas de la informacin espectral remanente (matriz XR) despus de aplicar la correccin de dos factores OSC, puede observarse comparando los grficos de dispersin de scores (PC2 vs. PC1) de los espectros antes y despus de aplicar el algoritmo OSC a un conjunto de muestras registradas en todo el rango de temperatura (25-90C). En la Figura 24 se muestran los diferentes grficos de dispersin de scores PC2 vs. PC1 del PCA realizado con la matriz original X en los modos Absorbancia, SNV, 1aD 2aD y las matrices XR resultantes de aplicar el OSC1 y OSC2. Un PCA de la matriz X en modo absorbancia da lugar a una variacin parablica de los dos scores debido a la variacin de la temperatura en todas las mezclas, mas o menos acusada segn su composicin (ver Figura 24a). Al aplicar los pre-
tratamientos de SNV y derivadas (1aD y 2aD) se mantiene de modo general esta relacin parablica, siendo en algunas muestras ms acentuada que en otras (ver Figuras 24 b, c, d). Al aplicar el algoritmo OSC con dos factores-OSC, se obtiene una tendencia de los scores claramente diferente. El grfico de dispersin del PCA de la matriz XR (tomando la matriz Y con la fraccin molar de cada uno de los analitos, Figuras 24 e, f, g, h) indica que el valor del primer componente PC1 est directamente relacionado con la composicin de la muestra (fraccin molar del analito que ha sido seleccionado como matriz Y), mientras que el desplazamiento debido al segundo
102
componente PC2 est asociado con la variacin de la temperatura; esto demuestra que el OSC no elimina completamente su efecto. Sin embargo, el hecho de que el PC1 est directamente relacionado con la fraccin molar de los analitos, permite la construccin de modelos de calibracin muy simples (1 factor-PLS) con una adecuada capacidad predictiva. Despus de aplicar un OSC2 con dos factores, el PCA de la matriz remanente XR (la matriz Y contiene las fracciones molares de los cuatro analitos) desaparece esta variacin de los scores y las muestras de composicin semejante y registradas a diferentes temperaturas aparecen agrupadas en clusters compactos (Figura 21i) segn su composicin, lo que demuestra que se ha eliminado la variabilidad espectral debida a la variacin de temperatura. La posicin de las mezclas en el espacio bidimensional de los scores es la misma que antes de aplicar el algoritmo OSC2 (ver Figuras 24a y 24i), lo cual indica que solamente se ha eliminado la variabilidad espectral debida a la temperatura.
103
(a)
(b)
PC2
PC1 (c)
PC2
PC1 (d)
PC2
PC1
(e)
PC2
PC1
(f)
PC2
PC2
PC1 (g)
PC1 (h)
PC2
PC1 (i)
PC2
PC1
C(HAc) = C(BuOH) = C(BuAc) = C(H2O) C(BuOH) = 0.55 - 0.70 C(BuAc) = 0.34 - 0.68 C(H2O) = 0.38 - 0.50 PC2
PC1
Fig. 24 Grficos scores (PC2 vs. PC1) del PCA con las variables en modo: (a) Absorbancia, (b) SNV, (c) 1aD, (d) 2aD, (e) OSC1-HAc, (f) OSC1-BuOH, (g) OSC1-BuAc, (h) OSC1-H2O, (i) OSC2.
104
Conclusiones
Conclusiones Generales
105
CONCLUSIONES Del estudio de la influencia de parmetros fsicos en el desarrollo de los modelos de calibracin, se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1. Se demuestra que la espectroscopia NIR es una tcnica adecuada para la caracterizacin de tres formas polimrficas de la azitromicina y que presenta indudables ventajas sobre la difraccin de rayos X en rapidez y sensibilidad, lo que nos permite proponerla como tcnica alternativa en el control analtico. 2. La caracterizacin de cada una de las diferentes formas polimrficas se ha realizado a travs de la construccin de bibliotecas que tambin permiten fijar la calidad mnima necesaria para la utilizacin adecuada de cada una de las diferentes formas. 3. Los modelos desarrollados mediante el algoritmo PLS para la cuantificacin del contenido de dihidrato en muestras de amorfa y monohidrato poseen caractersticas de exactitud y precisin adecuadas para su aplicacin en el control de proceso en industria farmacutica. Previamente los mtodos se han validado siguiendo las guas propuestas. Tambin se han desarrollado modelos PLS para la determinacin del contenido total de agua que puede servir como indicativo de la forma polimrfica presente. 4. El anlisis cualitativo y cuantitativo de muestras mantenidas en condiciones de temperatura y humedad de transformacin acelerada indica que las formas cristalinas (monohidrato y dihidrato) son estables, en cambio la forma amorfa es ligeramente higroscpica y se transforma lentamente en el dihidrato.
106
5. El aumento de la temperatura produce en los espectros NIR de muestras lquidas un desplazamiento hipsocrmico de las bandas de absorcin y un estrechamiento de las mismas. Este desplazamiento es importante en las bandas de
combinacin de OH y muy reducido en las de CH y es menos acusado en los bandas de sobretodo. 6. Un insuficiente control de la temperatura durante el registro de los espectros produce un aumento de la complejidad de los modelos de calibracin y un importante efecto en la capacidad predictiva de los modelos, siendo este efecto mayor en compuestos polares que en los no polares. 7. La disminucin de la capacidad predictiva causada por la temperatura se puede corregir mediante dos estrategias diferentes que se basan en el modelado (inclusin en el conjunto de calibracin de espectros de muestras registradas a las diferentes temperaturas) o en la eliminacin del efecto de la misma
(aplicacin de un algoritmo que elimine la informacin espectral relacionada con la temperatura). 8. Los algoritmos PLS y MLR stepwise aplicados a la estrategia de modelado producen resultados similares y las regresiones deben incluir total o
parcialmente el efecto de la temperatura para lograr predicciones correctas. Los modelos resultantes son bastante complejos. 9. La estrategia de eliminacin de la informacin espectral no correlacionada con la temperatura se ha aplicado mediante el algoritmo OSC. El filtrado de variables OSC reduce en gran medida la informacin espectral relacionada con la temperatura, a diferencia de otros pre-tratamientos (derivadas y SNV). Para que
107
la eliminacin sea efectiva es necesario que los modelos construidos con el algoritmo OSC incluyan la variabilidad debida a la temperatura y son necesarios dos factores OSC para la eliminacin. Los modelos PLS construidos despus de la eliminacin son ms simples y poseen una mejor capacidad predictiva, que los de modelado. 10. Los loadings de los modelos OSC muestran las caractersticas de la informacin espectral eliminada y los scores de los modelos PCA la informacin remanente despus de aplicar el algoritmo OSC. El anlisis de los loadings demuestra la necesidad de dos factores OSC para corregir el efecto de la temperatura, mientras que un solo factor PLS es necesario para obtener una buena capacidad predictiva en los modelos PLS.
Anexos
Anexo I
Characterization and analysis of polymorphs by near-infrared spectrometry
M. Blanco, D. Valds, M.S. Bayod, F. Fernndez-Mart, I. Llorente
Analytica Chimica Acta Vol. 502, No. 2 (2004) 221-227.
Anexo II
Application of NIR Spectroscopy in Polymorphic Analysis: Study of PseudoPolymorphs Stability
M. Blanco, D. Valds, I. Llorente, M.S. Bayod
Journal of Pharmaceutical Sciences Vol. 94, No. 6 (2005) 1336-1342.
Anexo III
Influence of temperature on the predictive ability of near infrared spectroscopy models
M. Blanco and D. Valds
J. Near Infrared Spectrosc. Vol. 12, No. 2 (2004) 121-126.
Anexo IV
Suppressing the temperature effect in near infrared spectroscopy by using orthogonal signal correction
M. Blanco and D. Valds
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Universidad Autnoma de Barcelona

Autor: Dmarih Valds Calvio Director: Dr. Marcelo Blanco Romia

A mis padres, eterna fuente de inspiracin.

A todos, de corazn, mi eterna gratitud. Dmarih

Pseudo-polimorfos. Formas amorfas, solvatos e hidratos........................................................ 52

6. Discusin de los Resultados ....................................................................................................... 71

CONCLUSIONES .......................................................................................................................... 105 ANEXOS

1. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

1.4 Aplicaciones de la Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

infra- que significa antes [1].

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Infrarrojo lejano (FIR) 4104-106 nm

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

v=2 v=1 v=0 Xequilibrio

Fig. 2 Energa Potencial en el modelo del oscilador armnico.

La energa potencial en el oscilador armnico se define como:

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

v=2 v=1 v=0 Xmin Xequilibrio Xmax

oscilador armnico oscilador anarmnico

Fig. 3 Energa Potencial en el modelo del oscilador anarmnico.

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Fig. 4 Asignacin de bandas en la regin del infrarrojo cercano.

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Acousto-Optic Aunable Filters) que aprovechan el cambio de ndice de refraccin de

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Fig. 5 Diseos de los espectrmetros NIR.

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

donde A es la absorbancia aparente, R la reflectancia relativa (R = Rmuestra/Restndar), c la concentracin y a la constante de proporcionalidad.

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Agricultura & Alimentacin [13, 14]

Imagen Qumica [23]

Farmacia & Cosmtica [21, 22]

Biomedicina & Clnica [18]

Fig. 6 Aplicacin de la espectroscopia NIR en diversos sectores.

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Investigations of Infrared Spectra. Carnegie Institute

umbrae, Augustae Vindelicorum (1760).

Spectrosc. 7, 223-228 (1999).

Introduccin. Espectroscopia en el Infrarrojo Cercano

Distancia Sii = 1- Dii/Dmax

Correlacin Sii = r(ii)

Mahalanobis = (xi-xi)T C-1 (xi-xi)

Eucldea = (xi-xi)T (xi-xi)

Fig. 7 Criterios de similitud en los PRMs.

Anlisis en Componentes Principales Anlisis de agrupamientos

rbol de Expansin Mnima Redes Neuronales de Kohonen

PRMs Mtodos Discriminantes

Anlisis Discriminante k vecino ms cercano

Mtodo de las Funciones Potenciales

Fig. 8 Clasificacin de los PRMs.

scores (PC2 vs. PC1) de un PCA de un conjunto de muestras.

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3

Fig. 9 Grfico de scores (PC2 vs. PC1) de un PCA.

outlier y por tanto no se considera que forma parte de la clase.