PROTENAS ASOCIADAS A DISTROFINA Y DISTROFIA MUSCULAR.

La clonacin del gen de la distrofina en 1986 inici el periodo de mayor avance en el entendimiento de las bases genticas de las distrofias musculares. En el msculo, la distrofina se asocia con complejos de protenas del sarcolema, proveyendo soporte estructural a las fibras musculares. Mientras las mutaciones en la distrofina son la causa de las distrofias musculares de Duchenne y Becker, mutaciones en los genes codificantes de los otros miembros del complejo glicoproteico asociado a distrofina han sido asociadas con otros tipos de distrofias musculares. La comprensin de las funciones de las diferentes protenas y la identificacin de sus parejas de unin estn pavimentando el camino a nuevas estrategias teraputicas para tratar estas fatales enfermedades musculares. Las distrofias musculares representan un grupo heterogneo de desrdenes monognicos heredados que se caracterizan clnicamente por debilidad y degeneracin muscular progresivas. Recientemente, este gran grupo de condiciones fue clasificado de acuerdo a los patrones de herencia mendeliana. Sin embargo, con evaluaciones a travs de tcnicas moleculares de mapeo gentico, se hizo claro que estas condiciones clnicamente similares estn asociadas a una gran serie de locus genmicos. En las primeras investigaciones de las distrofias musculares de Duchenne y Becker, se identificaron mutaciones que identificaban al gen DMD localizado en el brazo corto del cromosoma X. Este gen codifica una larga protena del citoesqueleto, de 427 kDa, llamada distrofina, la cual entrega una unin estructural entre las miofibrillas y la membrana muscular (sarcolema). Mientras la mutacin en la distrofia muscular de Duchenne resulta en la completa ausencia de distrofina, en la atrofia muscular de Becker, una forma ms suave de la enfermedad, han sido observados bajos niveles de distrofina en una forma alterada. Correspondientemente, en la atrofia muscular de Duchenne, la enfermedad es severa. Comnmente los pacientes son confinados a una silla de ruedas a los doce aos y mueren siendo adolescentes o en una edad cercana a los veinte aos por complicaciones respiratorias dadas por debilidad de los msculos intercostales o infecciones respiratorias. En contraste, en la atrofia muscular de Becker, los pacientes tienen un comienzo tardo de la enfermedad y una sobrevivencia larga. En adicin a las anormalidades del gen DMD asociadas con estas enfermedades, han sido identificadas mutaciones en otros genes que codifican otros componentes del complejo proteico asociado a distrofina. Este complejo de membrana contiguo a la distrofina, forma un puente desde el citoesqueleto del msculo a la matriz extracelular (MEC). Estas mutaciones resultan en otras formas de distrofia muscular como las distrofias musculares de cinturas (limb girdle) o distrofias musculares congnitas Avances recientes han comenzado a dilucidar las funciones, a menudo relacionadas, de los tantos productos diferentes codificados por estos genes. sta bsqueda ha llevado a la luz los mecanismos moleculares responsables de varios tipos de distrofias musculares. En este artculo, revisaremos lo que ha sido aprendido acerca de la patognesis molecular de las distrofias musculares y examinar las potenciales estrategias teraputicas destinadas a corregir la fisiologa celular anormal resultante de estos defectos genticos primarios. Conexiones del citoesqueleto le dan soporte a las fibras musculares. El msculo esqueltico normal consiste en un sistema altamente organizado de clulas y tejidos especializados, lo que los hace particularmente susceptibles a efectos de mutaciones. Pequeos cambios resultado de mutaciones son propagados a travs del sistema msculo esqueltico, llevando los efectos a toda su extensin. Las mutaciones que afectan las protenas estructurales y contrctiles del sarcmero son particularmente cruciales. El sarcmero consiste en una coleccin de fibras musculares, as como de retculo endoplsmico, mitocondria; y conexiones entre miofibrillas y el sarcolema, y entre el sarcolema y la MEC. Protenas especializadas del citoesqueleto y de membrana, ayudan en las funciones contrctiles del msculo a travs de la unin de miofibrillas individuales al sarcolema y a la MEC. Estas conexiones ocurren a varios niveles a lo largo del sarcmero y son ms

evidentes en las bandas circunferenciales que rodean las fibras musculares llamadas lneas Z, y, en menor grado, las lneas M. Las estriaciones a lo largo de las lneas Z, ricas en protenas como la -actinina, vinculina, talina y las integrinas, receptoras de adhesin transmembrana, han sido llamadas costameros. Los costameros se definen como regiones de unin del sarcolema con la MEC y son importantes en la transmisin de la fuerza durante la contraccin muscular. Esto previene de daos a la membrana muscular y de una consiguiente cascada inflamatoria. Otras regiones de conectividad en el msculo incluyen las uniones miotendinosas y neuromusculares. En estas regiones se encuentran tres subconjuntos de complejos de protenas de la membrana citoesqueltica, que ayudan a formar uniones basadas en espectrina, en distrofina y en integrina. Las mutaciones que afectan muchos de estos sistemas conllevan a un gran rango de enfermedades musculares. Histolgicamente, el msculo fetal de pacientes con distrofia muscular aparece normal, excepto por fibras eosinfilas hipercontraidas ocasionales. Fibras necrticas o degeneradas aparecen postnatalmente, incluso antes de que se observe debilidad muscular. Las fibras en degeneracin son observadas con frecuencia en grupos (clusters) (necrosis agrupada); estudios de secciones transversales y longitudinales de msculo revelan que este proceso es a menudo confinado solo a segmentos de la fibra muscular. Estas fibras necrticas son sometidas a fagocitosis; en biopsias musculares de pacientes con distrofia muscular de Duchenne se muestra la presencia de clulas inflamatorias, predominantemente macrfagos y linfocitos CD4+ en el tejido conectivo que rodea la fibra muscular. Un signo secundario de necrosis muscular, al menos en las etapas tempranas de las distrofias musculares, es la regeneracin activa de msculo para reemplazar o reparar prdida o dao de fibras. Eventualmente, se pierde la capacidad de regeneracin del msculo y las fibras musculares son reemplazadas gradualmente por tejido adiposo y tejido conectivo fibroso, dando lugar a la apariencia clnica de pseudohipertrofia seguida de atrofia. La combinacin de la progresiva fibrosis y prdida de fibra muscular resulta en desgaste muscular y en ltima instancia en debilidad muscular. La distrofina se une a un complejo proteico a lo largo de toda la membrana El progreso inicial en la comprensin de la patofisiologa de las distrofias musculares se produjo en 1986. Como parte de un largo esfuerzo multinacional, Louis Kunkel y sus colegas de Harvard usaron tcnicas de clonacin posicional para establecer el gen defectuoso responsable de la severa y comn distrofia muscular de Duchenne ligada al cromosoma X. A la fecha, el gen MDM es el ms largo del genoma humano, abarcando aproximadamente 2,5 Mb del cromosoma X. El producto gentico, la distrofina, es igualmente grande- una protena del citoesqueleto de 427 kDa que se produce en la cara citoplasmtica de la membrana de la clula muscular. Esta es expresada principalmente en el msculo esqueltico y cardiaco y en pequeas cantidades en el cerebro. La distrofina se encuentra ausente en los msculos de los pacientes con distrofia muscular de Duchenne. En pacientes con distrofia muscular de Becker, una forma menos severa, las mutaciones dan como resultado una reduccin de la expresin de la distrofina, o una expresin en la que las formas funcionales de la protena se encuentran parcialmente alteradas. La distrofina se caracteriza por un NH 2 terminal seguido de una larga regin central que contiene unidades de repeticin como la espectrina. El N-terminal se une a la actina F del citoesqueleto muscular, y se piensa que las unidades de repeticin le dan a la molcula una estructura rgida en forma de vara, similar a la de la espectrina- . La prxima pieza importante a resolver en el puzzle involucra el dominio C-terminal de la distrofina y sus compaeros de unin en la membrana celular del msculo. Un subsiguiente anlisis molecular y gentico, ha revelado la participacin de varias de estas protenas en distintas formas clnicas de distrofia muscular.

A finales de los ochenta, los laboratorios de Kevin Campbell en Nueva York y Euiro Ozawa en Tokio, mostraron que la distrofina se una por su porcin C-terminal a un complejo de nuevas glicoprotenas incrustadas en la membrana de la clula muscular. Ms tarde se demostr que el complejo glicoproteico asociado a distrofina (DPC) contiene tres conjuntos de protenas. En el complejo, uno de los grupos de protenas involucra - y - distroglicanos, los cuales derivan desde una sola protena precursora por un proceso post-traduccional. El distroglicano, es una protena transmembrana, que ubica a su dominio C-terminal en el lado citoplasmtico de la membrana unido directamente a distrofina. El dominio extra celular del -distroglicano se une a un -distroglicano, el cual est altamente glicosilado, se encuentra por completo en la superficie extracelular del sarcolema y se une a laminina 2, un componente de la membrana basal. Este grupo de protenas, junto a la distrofina, completan una unin molecular directa entre F actinina del citoesqueleto de las miofibrillas y la MEC. Un segundo subconjunto en el DPC se asocia a -ditroglicano y comprende las glicoprotenas de membrana -, -, -, -, y -sarcoglicanos, y sarcospan. Las funciones de los sarcoglicanos no estn claras, pero la cercana asociacin entre stos y los otros miembros del DPC sugieren que las mutaciones en los genes que codifican para estas protenas podran causar otras formas de distrofia muscular. En efecto, han sido descritas mutaciones en genes que codifican sarcoglicanos, que causan su prdida de funcin y son causa, as, de varios tipos de distrofias musculares recesivas de cinturas (Limb Girdle) e inicio de graves distrofias musculares infantiles. En muchos casos se ha visto que la prdida de uno de los componentes del DPC lo lleva a una desestabilizacin completa y a una posterior disrupcin de la unin citoesqueletoMEC. De esta manera, una funcin del sarcoglicano podra ser el mantener la estabilidad del DPC. Finalmente, un tercer subconjunto de proteinas consiste en - y- sintrofinas, y distrobrevina, que son protenas intracelulares que se asocian con el C-terminal de la distrofina. Se cree que la sintrofina recluta a proteinas de sealizacin para el DPC, incluyendo NO-sintasa neuronal (nNOS). Los niveles de nNos en la distrofia muscular de Duchenne son reducidos, posiblemente por el reclutamiento alterado de sintrofinas. Se han descrito mutaciones no patognicas en los genes que codifican sintrofina y distrobrevina. La distrofina ayuda a disipar la fuerza en la contraccin muscular. Ha sido propuesto que la unin distrofina-distroglicano entre el citoesqueleto muscular y la MEC lleva a cabo una funcin muscular en el msculo. Esta provee al sarcolema de proteccin contra las fuerzas locales que se desarrollan durante la contraccin muscular. En respaldo de esta idea, la ausencia de distrofina hace al sarcolema susceptible a rupturas inducidas por la contraccin. A partir de esto, puede predecirse que los defectos de los otros componentes de la unin citoesqueleto-MEC pueden tambin resultar en degeneracin muscular. En efecto, ha sido mostrado que las mutaciones genticas que bloquean la produccin de la protena de membrana basal, laminina, generan una forma congnita de distrofia muscular en la que el fenotipo enfermo se extiende al sistema nervioso central y perifrico. Interesantemente, no ha sido descrita ninguna mutacin natural en el gen del distroglicano, y las mutaciones inhibidoras de distroglicanos efectuadas en ratones son letales en la embriognesis temprana. Sin embargo se han descrito en ratones, prdidas especficas de distroglicano en el msculo y disrupciones de la unin - distroglicano laminina mediadas por anticuerpos, siendo ambas causas de degeneracin muscular. Esto implica que el funcionamiento normal de los distroglicanos es esencial para mantener la integridad de la miofibrilla. Casi con toda seguridad, la distrofina lleva a cabo ms acciones que solo mantener la unin entre el citoesqueleto y la MEC. En el msculo con deficiencia de distrofina ocurren prdidas secundarias de DPC, y en los msculos de pacientes con atrofia muscular de Duchenne la distrofina se encuentra completamente ausente. En otras circunstancias, es posible separar la prdida de DPC de la prdida de distrofina. En ratones transgnicos en los que se anula largamente a la distrofina pero expresan el

dominio C-terminal en el msculo, mantienen el DPC en el sarcolema, pero an as desarrollan distrofia muscular. Esta observacin es consistente con que la unin MECcitoesqueltica efecta una funcin crucial. Sin embargo, la prdida de componentes del DPC en la presencia de una unin MECcitoesqueltica normal, puede dar lugar a una distrofia muscular. Por ejemplo, aunque no se reporten mutaciones en el gen humano de -distrobrevina, el bloqueo de la distrobrevina en ratones genera distrofia muscular, a pesar de que en el ratn, la unin citoesqueleto-MEC se mantenga ininterrumpida. El desarrollo de la enfermedad muscular puede ser atribuida a la ausencia o prdida de cruciales molculas seales del complejo -distrobrevina, pero datos recientes sugieren que la prdida de nuevas uniones citoesquelticas pueden ser un factor significativo. La sincoilina es un nuevo componente identificado en el DPC que interacta tanto con la -distrobrevina y la protena muscular desmina. La desmina es parte de una red de filamentos intermedios que unen el aparato contrctil del msculo al sarcolema. No estn claras las propiedades y funciones de la unin -distrobrevina-sincoilina-desmina, pero una nueva evaluacin podra revelar funciones adicionales del DPC. Observaciones como esta sugieren que las consecuencias de la deficiencia de distrofina son complejas y pueden ser causadas tanto por una perdida directa de las funciones citoesquelticas como por una prdida secundaria de los componentes del DPC. Existe cierta evidencia de que las fibras musculares distrficas presentan corrientes anormales de calcio trans-sarcolmico y concentraciones de calcio intracelular ms altas que en las fibras normales, pero no existe un consenso acerca de la presencia o naturaleza de tales cambios o si estos son primarios o secundarios a los daos musculares provocados por otros factores. Nuevos enfoques teraputicos son necesarios ms all de la terapia gnica. Con el descubrimiento de las bases moleculares de la distrofia muscular de Duchenne y algunos tipos de distrofia muscular de cinturas (limb girdle), se espera que la terapia gnica permita el reemplazo de los genes aberrantes por copias normales o funcionales, reparando as el normal fenotipo del msculo. Sin embargo, ese optimismo no ha sido recompensado. La administracin de transgenes teraputicos a todos los msculos en el cuerpo ha demostrado ser una tarea difcil. La respuesta inmune a la protena extranjera en un individuo que no posee una copia funcional del gen relevante tiende a acortar la expresin gnica. Y finalmente, la respuesta inmune a los componentes del vector y el gran tamao del cDNA de distrofina (14kb) han planteado problemas adicionales. Por estas dificultades, es necesario explorar otras estrategias para aliviar la progresiva debilidad muscular y desgaste que caracterizan a la distrofia muscular. Muchos de estos acercamientos se han desarrollado hacia tipos especficos de distrofia muscular, pero otros tienen una aplicacin general. La funcin de una protena ausente puede ser reemplazada por una protena diferente. Dos estrategias han sido concebidas para estudiar la posibilidad de un propsito teraputico. Primero, en vez de una sustitucin directa del producto gentico ausente, puede ser posible generar construcciones artificiales que alivien la patologa del msculo al realizar una funcin similar a la de la protena ausente. Un simple ejemplo es proporcionado por el uso de minigenes de distrofina alterados para una administracin mediada viralmente en la distrofia muscular de Duchenne. Un minigen basado en una gran delecin en el dominio con forma de vara encontrado en un paciente levemente afectado fue introducido dentro de adenovirus y mostr ser efectivo en la prevencin de la enfermedad en ratones mdx. Deleciones adicionales de este minigen resultaron en un microgen que podra ser administrado usando virus adeno-asociados (AAV), un vector viral potencial ms seguro que el adenovirus. Un acercamiento ms sofisticado fue descrito recientemente por Marcus Ruegg y sus colegas, quienes estudiaron en ratones dy w la deficiencia de 2-laminina, un modelo de la distrofia muscular congnita. La degeneracin muscular en este modelo resulta de la prdida de los ligandos de laminina para los -distroglicanos y la MEC.

Un minigen basado en otro componente de la MEC, la agrina, a la que se le reconoci unirse a otros componentes de la membrana basal y tambin a -distroglicano, restaurando as la unin distroglicano-MEC. La sobreexpresin transgnica del minigen en los msculos de ratones dyw previno la degeneracin muscular, indicando que en un diseo racional, el producto de ingeniera gentica podra reemplazar la funcin de la protena faltante. Segundo, el reemplazo de la proteina auscente puede ser logrado a travs del incremento de la expresin de un homlogo endgeno. La distrofina tiene un paralelo autonmico, la utrofina, que es expresada en bajos niveles en msculo adulto pero en niveles mucho ms alto en el msculo fetal, donde es localizada en el sarcolema. Las dos protenas son funcionalmente redundantes; en experimentos transgnicos en ratones, al bloquear la distrofina, se evit la degeneracin muscular esperada cuando se administr un transgen que induca la sobreexpresin de eutrofina en el msculo. Una caracterizacin del proceso de la regulacin de la expresin de la utrofina en el msculo est en marcha, con el objetivo de identificar significados farmacolgicos para inducir su up-regulacin en msculos de pacientes con atrofia muscular de Duchenne. La sobreexpresin de otros genes como la clula T citotxica GalNAc transferasa (??) inhibe tambin la distrofia muscular en ratones mdx, posiblemente a travs de la upregulacin de utrofina. Gran parte de la patologa muscular tarda en la distrofia muscular de Duchenne est relacionada a una falla en la puesta en marcha de la regeneracin muscular, con una atrofia consiguiente. Intervenir en este proceso podra ser ventajoso en que los beneficios obtenidos a travs de una capacidad mio-regenerativa sostenida podran ser aplicables a un rango de enfermedades musculares. Nadia rosenthal y sus colegas de Boston, han mostrado recientemente que la sobreexpresin de una forma de insulina tejido-restringida como el factor de crecimiento 1 (IGF-1), expresada en el msculo esqueltico, es capaz de inducir hipertrofia prolongada y regeneracin en msculo envejecido. Estos hallazgos aumentan las expectativas de aliviar el dficit funcional en el msculo a travs de una prolongacin de su capacidad para renovar miofibrillas que son perdidas durante los procesos distrficos. Posiblemente, esto podra ser logrado a travs de la up-regulacin farmacolgica de la isoforma muscular de IGF-1, eludiendo la necesidad de administrar transgenes al msculo. La sobreexpresin e inhibicin de varias molculas diferentes han sido ahora mostradas para mejorar la enfermedad en el ratn mdx. Por ejemplo, Khurana y sus colegas han mostrado que bloquear la funcin de la mioestatina con anticuerpos tiene beneficios teraputicos en ratones. Finalmente. Un entendimiento detallado de las vas moleculares involucradas en la patognesis de cada una de las distrofias musculares podra permitir la identificacin de procesos especficos que fueran sometibles a intervencin bioqumica a travs de drogas. Este acercamiento no buscara corregir el dficit molecular existente pero si controlar sus efectos. El trabajo en esta rea ha comenzado con un reciente anlisis microarray dirigido a identificar grupos de genes cuyas expresiones puedan ser des-reguladas en una distrofia muscular. El resultado fue una desconcertante seleccin de genes aparentemente no relacionados que fueron up- o down-regulados en el tejido distrfico. La prxima tarea es alinear esos productos gnicos en series ordenadas de casacadas de expresin secundaria e identificar cuales son patognicos. Este trabajo es emocionante, porque la manipulacin farmacolgica de estas consecuencias secundarias de una mutacin gentica podra no requerir administracin de genes o cambios teraputicos forzados en la expresin gentica. En los pasados 15 aos, nuestro entendimiento de los procesos celulares que dan lugar a la distrofia muscular ha tenido un gran avance, pero los retos persisten. Nuestro conocimiento de los mecanismos moleculares que dan lugar a algunas formas de distrofia muscular siguen incompletos, y la elucidacin de las razones fundamentales de la degradacin muscular en enfermedades como la distrofia muscular fascio-escpulohumeral, es prioritaria. Entre las condiciones para las cuales hay establecido un defecto gentico primario, una mejor comprensin de la cascada patognica secundaria puede permitir la identificacin

de destinos genticos para las drogas. El desarrollo de formas efectivas para administrar transgenes teraputicos al msculo esqueltico permitira tratar muchas de las enfermedades directa o indirectamente con terapia gnica, y el desarrollo de mtodos farmacolgicos para la manipulacin de la expresin de genes endgenos podra permitir el alivio de la patologa muscular a travs de up-regulacin inducida de los genes homlogos de la enfermedad o la down-regulacin de las vas efectoras. En contraste a la situacin de hace dos dcadas atrs, hoy tenemos al menos una idea de los mecanismos dirigidos a la distrofia muscular y las estrategias a travs de las cuales podramos abordar los resultados de los procesos moleculares aberrantes.