Microbiologa Industrial TP N5

TRABAJO PRACTICO N 5 Fundamentos de la esterilizacin. Preparacin del material. Medios de cultivo: preparacin y esterilizacin. En Microbiologa se considera estril a todo aquello que no posee seres vivos. Para trabajar en Microbiologa se debe disponer de material de vidrio estril, y de medios de cultivo estriles. Las tcnicas empleadas para esterilizar ambos son diferentes. En el laboratorio se utilizan distintas tcnicas de esterilizacin. 1- Llama directa: se utiliza para esterilizar ansas, rastrillos o pinzas. Los ansas se calientan directamente al rojo, en un mechero. Los rastrillos se sumergen en etanol y luego se los pasa por la llama. Este tipo de tratamiento provoca la destruccin de microorganismos por incineracin. 2- Calor hmedo: consiste en utilizar el calor en forma de vapor saturado a presin. La temperatura del vapor a presin es superior a la de ebullicin normal del agua. Para efectuar una esterilizacin por calor hmedo se utiliza el autoclave. El modelo clsico (Chamberland) consta de un recipiente cilndrico de metal, que resiste una presin de hasta 4 atmsferas. Posee una tapa hermtica con aberturas para el manmetro, una vlvula de seguridad y una vlvula para la salida de aire. Se calefacciona por medio de un sistema de mecheros ubicados en la parte inferior. El uso del autoclave se basa en que, a mayor presin, mayor es la temperatura de ebullicin del agua. Para esterilizar correctamente, es necesario desalojar todo el aire contenido en el autoclave, ya que la mezcla de vapor de agua-aire no alcanza la temperatura que alcanzara el vapor de agua, sometidos ambos a igual presin. En el autoclave se pueden esterilizar medios de cultivo cuyos componentes soporten la temperatura de trabajo. Generalmente se esteriliza a 121 C durante l5 minutos, o a 110 C durante 30 minutos segn el medio de cultivo que se trate. Los recipientes en que estn contenidos los medios de cultivo deben estar tapados (generalmente con tapn de algodn), y recubiertos con papel para que no se humedezcan. 3- Calor seco: para emplear el calor seco se usan estufas u hornos elctricos, u hornos de aire caliente (a gas). Se utilizan principalmente para el material de vidrio (cajas de Petri, pipetas, tubos de ensayo) y se trabaja a 160-180 C durante 90-120 minutos. Las cajas de Petri, limpias, se envuelven en papel; las pipetas pueden envolverse individualmente en papel, o bien esterilizarlas juntas en un pipetero de metal. En el extremo superior de la pipeta se introduce una pequea porcin de algodn, para filtrar el aire.

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4- Filtracin: este mtodo se utiliza para medios de cultivo lquidos que se alteran con la temperatura. Se los filtra a travs de membranas especiales, con poros de dimetro determinado (0.2 m-0.4 m), que retienen las bacterias. Las membranas se colocan en un embudo especial, con soporte de membrana, y un recipiente que recibe el filtrado. Tanto el embudo, como el recipiente y las membranas, deben esterilizarse previamente en autoclave. 5- Uso de sustancias antimicrobianas e inhibidores qumicos: con este trmino se indica, en forma general, cualquier compuesto capaz de destruir o inhibir a los microorganismos. Una sustancia antimicrobiana puede: -i) actuar en forma inespecfica, es decir, destruir varias estructuras celulares y al mismo tiempo anular muchas reacciones enzimticas de cualquier clula, o bien -ii) atacar en forma especfica slo una estructura o bloquear nicamente una enzima esencial de determinados microorganismos, haciendo que el complejo mecanismo celular deje de funcionar. Ejemplos: -i) Las bases fuertes, hipoclorito de sodio, alcohol etlico, compuestos con Hg, Ag, o Cu en altas concentraciones,etc. destruyen varias estructuras e inactivan todas las enzimas de cualquier microorganismo. -ii) Soluciones de compuestos (orgnicos o inorgnicos) de Hg en soluciones muy diluidas, pueden reaccionar con los grupos sulfhidrilos de ciertas enzimas, inactivndolas. La cuantificacin de la actividad microbiana se efecta midiendo la cantidad ms pequea de agente antimicrobiano necesaria para inhibir el desarrollo microbiano. Un mtodo comn es determinar la concentracin inhibitoria mnima (CIM) del agente antimicrobiano. Se prepara una serie de tubos con medio de cultivo, cada uno de los cuales contiene cantidades crecientes del antimicrobiano que se quiere cuantificar. Se siembran todos los tubos con igual inculo (igual microorganismo a igual concentracin), y se incuban. Luego, se verifica cual es la menor concentracin de antimicrobiano que ha inhibido el desarrollo. Se considerarn positivos los tubos en los que hubiere turbidez. Es necesario estandarizar todas las condiciones (tamao del inculo, composicin del medio, temperatura, etc.) para que este ensayo tenga validez. 6- Ozono: el ozono es un gas inestable, soluble en agua, con olor agradable en concentraciones inferiores a 2 ppm. Se produce naturalmente en las capas exteriores de la atmsfera por accin de las radiaciones UV sobre el oxgeno. Este gas es un producto oxidante, que se descompone espontneamente en el aire o agua, liberando O2. Se lo debe producir, por lo tanto, en el lugar donde se lo va a aplicar. Por esta razn, su accin antimicrobiana se localiza principalmente sobre superficies. En general, las bacterias son ms sensibles que las levaduras. Dentro de las bacterias, las Gram- son ms resistentes que las Gram+, y las formas esporuladas ms resistentes

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que las vegetativas. Se postula que su accin se debe a la inactivacin de enzimas celulares, coagulacin de protenas y oxidacin de grupos sulfhidrilo y amino y de lpidos. El ozono se utiliza en forma comercial para el tratamiento de aguas, del aire y las superficies de cmaras de refrigeracin, donde ejerce un efecto bactericida. Tambin contribuye a la eliminacin de colores, olores y sabores. El ozono se prepara haciendo pasar una corriente de aire seco entre dos electrodos de placa conectados a una corriente alterna de varios miles de volts, y tambin por lmparas U.V. de longitud de onda de 175 nm a 210 nm , y se considera responsable en gran parte de la accin germicida de las radiaciones U.V. en el aire y las superficies. El lmite superior tolerable por el hombre es de 0,04 ppm. Concentraciones de 0,1 ppm dan lugar a irritaciones de nariz, garganta y ojos, a pesar de su olor agradable. 7- Radiacin ultravioleta: La longitud de onda ms efectiva para la destruccin de microorganismos y la produccin de mutaciones es cercana a los 260 nm. La energa asociada a esta longitud de onda es absorbida por las bases de los cidos nucleicos (ARN: cido desoxirribonucleico), producindose reacciones anormales con posibles efectos letales sobre los microorganismos. Tambin contribuye a su accin la produccin de ozono, como se mencion anteriormente. La fuente habitualmente usada es la lmpara de vapor de Hg de baja presin. La penetracin de la radiacin U.V. es pequea en los lquidos e insignificante en los slidos, y por lo tanto se utiliza principalmente para la destruccin de microorganismos suspendidos en el aire o que se encuentren sobre superficies de laboratorio o ambientes que requieran cierto grado de asepsia. En la industria panificadora, por ejemplo, se utiliza durante el envasamiento de los panes de tipo lactal. En general, los mohos son ms resistentes a las radiaciones U.V. que las bacterias y levaduras. Las esporas bacterianas y de hongos y los virus, resultan an ms resistentes. Cabe sealar que la radiacin U.V. resulta nociva especialmente para los ojos y piel del personal expuesto, por lo cual se recomienda limitar los tiempos de exposicin y efectuar exmenes clnicos peridicos. 8- Radiaciones ionizantes: Son radiaciones de mayor energa y gran poder de penetracin y comprenden a las radiaciones , , y rayos X. En las ltimas dcadas se han aplicado para destruir microorganismos en productos comerciales, principalmente en los farmacuticos. Actualmente se est introduciendo su aplicacin a alimentos en varios pases del mundo, pero su uso no resulta en general atractivo para el consumidor. En nuestro pas, se aplica a condimentos destinados a la elaboracin de embutidos.

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FACTORES QUE INFLUYEN SOBRE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA TIEMPO DE CONTACTO CONCENTRACION TEMPERATURA REACCION DEL MEDIO- pH INFLUENCIA DE OTRAS SUSTANCIAS PRESENTES: *INCOMPATIBILIDADES E INACTIVACION * SOLUBILIDAD- COEFICIENTE DE PARTICION ESPECTRO ANTIMICROBIANO RESISTENCIA MICROBIANA EJEMPLOS DE DESINFECTANTES Y SUSTANCIAS QUE LOS INACTIVAN DESINFECTANTE Aldehdos: formaldehdo, glutaraldehdo fenoles, cresoles, xilenoles H2O2 compuestos de amonio cuaternario cloro Iodo INACTIVANTE amonaco, bisulfito, protenas, aminocidos dilucin, Tweens, deterg.catinicos catalasa detergentes aninicos, Tweens tiosulfato, tioglicolato tiosulfato, Tweens, sulfito

ACCIN DE LOS ANTIMICROBIANOS Sobre la pared y la membrana celular: Aldehdos, tensioactivos aninicos y catinicos, agentes quelantes, fenoles y derivados, bigunidos, parabenos. Sobre el material nuclear: Agentes alquilantes, colorantes, acridinas (dibenzopiridinas), xido de etileno. Grupos enzimticos y protenas en gral: Agentes oxidantes, halgenos, agentes alquilantes, alcoholes, cidos y lcalis, metales pesados.

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PARTE PRACTICA 1) Esterilizacin en autoclave de 100 ml de un medio de cultivo, contenidos en un Erlenmeyer de 250 ml. Se utilizar cinta indicadora de tempertura tiempo de calentamiento. Comparacin con un medio de cultivo no autoclavado, luego de 24 h de incubacin de ambos a 37C. 2) Esterilizacin por filtracin a travs de membranas de 0,2 m de dimetro de poro de 100 ml de una bebida gaseosa. Incubacin (72 h a 28C) de las membranas en un medio slido y en un caldo. 3) Antimicrobianos: Se sembrarn 0,5 ml de un cultivo de Saccharomyces cervisiae en tubos conteniendo 9 ml de caldo Sabouraud + 1 ml de un antimicrobiano qumico (el listado de los antimicrobianos usados se dar en el TP). Al cabo de 72 h de incubacin a 28C, se compararn los resultados obtenidos con un blanco (caldo Sabouraud sin sembrar) y un testigo (caldo Sabouraud sembrado con la levadura sin agregado de antimicrobianos) 4) Se expondrn a la radiacin U.V. durante 35-40 minutos cajas de Petri abiertas conteniendo granos de maz, man y trigo, soportados en un medio de cultivo agarizado. Posteriormente se incubarn a 28 C durante 5 das, junto con los controles no irradiados, y con otra caja de Petri conteniendo granos de maz rociados con un funguicida. Al cabo del perodo de incubacin se observar la existencia de desarrollo microbiano en cada una de las cajas. 5) Se abrirn 4 cajas de Petri conteniendo medio de cultivo agarizado, en 4 lugares estratgicos dentro de la cmara de incubacin. Al cabo de 0,5 h, se cerrarn las cajas, y se incubarn durante 72 h a 28C. Se pone en marcha entonces el ozonizador, y al cabo de 2 horas de funcionamiento se abrirn cuatro cajas de Petri con medio de cultivo agarizado, en los mismos lugares seleccionados en la primera vez. Al cabo de 0,5 h, se cerrarn y se incubarn. Se compararn los resultados obtenidos. 6) Se abrirn 4 cajas de Petri conteniendo medio de cultivo agarizado, en 4 lugares estratgicos dentro del flujo laminar en funcionamiento. Al cabo de 1 h, se cerrarn las cajas, y se incubarn durante 72 h a 28C. "EL CALOR Y LA HUMEDAD ME ESTN MATANDO..."
(una bacteria dentro del autoclave)