1 Atividade Antioxidante in Vitro e Antifúngica Do Noni (Morinda Citrifolia L.)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUI CENTRO DE CINCIAS DA SADE DEPARTAMENTO DE NUTRIO PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ALIMENTOS E NUTRIO
ADRIANA BARBOSA COSTA
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE in vitro E ANTIFNGICA DO NONI ( Morinda citrifolia L.)
Teresina 2011
Dissertao para obteno do grau de Mestre, pelo curso de Ps-Graduao em Alimentos e Nutrio, setor do Centro de Cincias da Sade da Universidade Federal do Piau. Orientador: Prof Dr. Alessandro de Lima
TERESINA 2011
Comisso julgadora da dissertao para obteno do grau de Mestre:
________________________________________________ Prof. Alessandro de Lima Orientador/Presidente
________________________________________________ Elma Regina Silva de Andrade-Wartha 2 examinador
________________________________________________ Reginaldo Almeida da Trindade 3 examinador
Teresina, 12 de Abril de 2011.
Aos meus pais, Alade e Jos, que mesmo com toda dificuldade, sempre estiveram dispostos a ajudar os filhos nos ensinando a sermos humildes e solidrios mesmo com as adversidades que a vida nos impe.
O que dignifica a vida de um homem no so as derrotas impostas aos seus opositores, mas as vitrias silenciosas, sem manchetes, conseguidas sobre si mesmo, e que ningum pode avaliar quanto de renncias e penosos sacrifcios cada uma delas lhe custou. Joo Jos Torres
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me confortar e abenoar toda a minha famlia. minha me, Alade, pela ajuda infinita, por ser minha mola mestra, pelas preocupaes, por estar sempre disponvel aos filhos, em todos os momentos; Ao meu orientador, Prof. Dr.Alessandro de Lima, pelo voto de confiana, por ter me aceitado como sua orientanda com tanto carinho, pelo exemplo notrio de professor e que em to pouco tempo, me repassou conhecimentos valiosos dentro da cincia dos alimentos e principalmente, pela forma humilde e respeitosa com que trata seus orientandos e por me inspirar no campo da pesquisa. Espero no ter lhe decepcionado! A UFPI, por ter sido o bero da minha formao acadmica e ao Programa de Ps- Graduao em Alimentos e Nutrio da UFPI, na pessoa da professora Ps. Doc. Regilda Saraiva do Reis Moreira Arajo, pela iniciativa de fundar o primeiro mestrado em Nutrio da UFPI dando oportunidade para muitos alunos de fazer um mestrado em uma instituio que tanto nos engrandece; Ao Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Piau (IFPI), por ter me disponibilizado o laboratrio para realizao das minhas anlises; Ao meu grande amor, amigo e companheiro, Thiago Luiz, pelo amor que nos une e por tudo que representa em minha vida, por ser um exemplo de determinao e de esforo e por me apoiar em todos os momentos; minha grande amiga, Nonata, pela espiritualidade que fortalece a todos, pelas oraes e pela amizade verdadeira, suas palavras sempre ficaro no meu corao; Aos amigos sempre dispostos a ajudar: Adenilma, Juliana e Leidiane, pela fora e amizade; minha to exemplar ajudante de laboratrio e estagiria do IFPI, Denise Vilela; A Ana Mara, por ter me ajudado a engrandecer esse trabalho nas anlises de -caroteno-cido linolico; Ao NUEPPA, pela disponibilizao do laboratrio de microbiologia e ao doutorando Chico, pela disponibilidade e ajuda nas anlises antifngicas;
Ao Manoel, tcnico do IFPI, por ter contribudo para o enriquecimento do trabalho; Aos colegas ps-graduandos, com os quais compartilhei muitos momentos de alegria e de preocupaes e com os quais sempre vou ter especial carinho: Juliana, Leidiane, Marina, Ana Lina, Rosana, Adolfo, Thedes, Vanessa e Celsa; E muito obrigada a todos aqueles que torcem por mim e me abraam em todos os momentos! E a todos aqueles no citados aqui, mas que de uma forma ou de outra cooperaram comigo.
RESUMO
Na busca pela identificao de novas fontes de antioxidantes naturais e de esclarecer lacunas, na literatura cientfica, a cerca das reais propriedades benficas atribudas ao Noni (Morinda citrifolia Linn), o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterizao qumica e avaliar a atividade antioxidante e antifngica da polpa, casca e semente do noni. Foi determinada a composio centesimal (umidade, cinzas, protenas, carboidratos e lipdios); os compostos bioativos (fenlicos totais, carotenides totais e vitamina C); a atividade in vitro; nos extratos aquoso, etanlico e acetnico, utlizando os mtodos de captura de radicais DPPH, ABTS e de cooxidao do -caroteno/cido linolico, j a atividade antifngica foi realizada pela inibio dos fitopatgenos Aspergillus terreus, Aspergillus japonicus e Penicillium citrinum. Os resultados demonstraram que, em relao a outros frutos, as distintas partes do noni possuem quantidades significativas de carboidratos, (27,210,82; 9,700,55 e 8,370,43) para semente, casca e polpa, respectivamente e de protenas (2,64 0,03; 2,23 0,4; e 2,24 0,04) semente, casca e polpa, respectivamente. A polpa apresentou maior teor de vitamina C (23,10,1 mg/100g) e de carotenides totais (3,90 0,05 mg/100g). No extrato acetnico da polpa foi quantificado 109,81 2,02 mg/100g de fenlicos totais, seguido pelos extratos acetnicos da casca (76,016,36 mg/100g), da semente (28,751,07 mg/100g) e do extrato etanlico da polpa (20,33 1,37 mg/100g). Todos os extratos avaliados apresentaram atividade antioxidante in vitro, entre estes, o acetnico e etanlico da casca e semente do noni, possuiram maior atividade pelo mtodo -caroteno/ cido linolico, o extrato etanlico da polpa teve uma maior atividade antioxidante pelo ensaio DPPH e ABTS e o extrato acetnico da polpa pelo mtodo ABTS. Quanto atividade antifngica, o extrato aquoso da polpa, casca e semente apresentaram melhor atividade inibitria para o fungo Aspergillus japonicus, demonstrando que o noni fonte de compostos bioativos que possuem atividade antioxidante e antifngica relevantes.
Palavras-chave: noni, compostos bioativos, atividade antioxidante, atividade antifngica.
ABSTRACT
In the quest for identifying new sources of natural antioxidants and to clarify gaps in scientific literature, about the real beneficial properties attributed to Noni (Morinda citrifolia Linn), the purpose of this study was to do the chemical characterization and evaluate antioxidant and antifungal activity of the pulp, skin and seeds of the noni. It was determined the proximate composition (moisture, ash, protein, carbohydrates and lipids), the bioactive compounds (total phenolics, total carotenoids and vitamin C), the in vitro activity, in aqueous, ethanolic and acetone extracts, using capture methods of DPPH radical, ABTS and co-oxidation of -carotene / linoleic acid. The antifungal activity was carried out by the inhibition of plant pathogens Aspergillus terreus, Aspergillus japonicus and Penicillium citrinum. The results showed that compared to others fruits, the different parts of the noni have significant amounts of carbohydrates (27.21 0.82, 9.70 0.55 and 8.37 0.43) for seed, rind and pulp, respectively, and protein (2.64 0.03, 2.23 0.4, and 2.24 0.04) seeds, bark and pulp, respectively. The pulp had a higher content of vitamin C (23.1 0.1 mg/100 g) and carotenoids (3.90 0.05 mg/100g). In the acetone extract of the pulp was measured 109.81 2.02 mg/100g of total phenolics, followed by acetonic extracts of skin (76.01 6.36 mg/100g), seed (28.75 1.07 mg/100g) and the ethanolic extract of the pulp (20.33 1.37 mg/100g). 1.37 mg/100g). All extracts evaluated showed in vitro antioxidant activity. Acetone and ethanolic extracts of peel and seeds of the noni, possessed greater activity by the method -carotene / linoleic acid. The ethanolic pulp extract had a higher antioxidant activity by DPPH and ABTS assay and acetone extract of pulp by the ABTS method. As for the antifungal activity, the aqueous extract of the pulp, peel and seeds showed better inhibitory activity for the fungus Aspergillus japonicus, showing that noni is a source of bioactive compounds that have antioxidant activity and antifungal relevant. Keywords: noni, bioactive compounds, antioxidant activity, antifungal activity.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 Estrutura qumica dos principais tipos de flavonides ........................ Figura 02 Estrutura qumica dos principais cidos fenlicos............................... Figura 03 Estabilizao do radical ABTS
+
28 29
por um antioxidante e sua formao 31 32
pelo perssulfato de potssio................................................................. Figura 04 Estabilizao do radical livre DPPH..................................................... Figura 05 rvore adulta do noni (fonte:
www.sucononi.com).............................................................................. 36 Figura 06 (A) Fruto verde; (B) de vez, ponto de colheita; (C) maduro, ponto ideal para retirada das sementes. (Fonte: EMBRAPA,
2010)..................................................................................................... 36 Figura 07 Fluxograma de preparo e obteno dos extratos da polpa, casca e semente do noni, por extrao seqencial........................................... Figura 08 Curva de calibrao de cido glico (mg/L)......................................... Figura 09 Curva de calibrao-resposta da porcentagem de inibio de trolox em etanol (0 a 20 g/mL) frente ao radical ABTS+ ........................ 46 42 43
Figura 10 Curva cintica do potencial antioxidante do extrato aquoso, etanlico e acetnico da polpa do noni................................................................ 57 Figura 11 Curva cintica do potencial antioxidante do extrato aquoso, etanlico e acetnico da casca do noni............................................................... Figura 12 Curva cintica do potencial antioxidante do extrato aquoso, etanlico e acetnico da semente do noni........................................................... 58 Figura 13 Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato aquoso da polpa do noni ....................................................................................... Figura 14 Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato aquoso da semente do noni................................................................................... Figura 15 Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato aquoso da casca do noni........................................................................................ 61 Figura 16 Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato etanlico da polpa do noni........................................................................................ Figura 17 Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato etanlico da semente do noni................................................................................... 62 62 61 60 57
Figura 18 Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato etanlico da casca do noni....................................................................................... Figura 19 Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato acetnico da polpa do noni........................................................................................ Figura 20 Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato acetnico da semente do noni................................................................................... Figura 21 Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato acetnico da casca do noni........................................................................................ 62 Figura 22 Curva cintica da atividade antioxidante de extratos alcolicos da polpa, casca e semente do noni........................................................... Figura 23 Curva cintica da atividade antioxidante de extratos aquosos da polpa, casca e semente do noni........................................................... Figura 24 Curva cintica da atividade antioxidante de extratos acetnicos da polpa, casca e semente do noni........................................................... 66 65 65 62 61 63
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Tabela 02 Tabela 03
Principais agentes de defesa antioxidante ........................................ Fontes alimentares de antioxidantes dietticos................................. Composio centesimal da polpa, semente e casca do noni (Morinda citrifolia Linn.) ....................................................................
20 23
49
Tabela 04
Teor de vitamina C e carotenides da polpa, casca e semente do noni (Morinda citrifolia Linn.) em mg/ 100g de 50
amostra.............................................................................................. Tabela 05 Teores de fenlicos totais (expresso em equivalente de cido glico) presente no extrato aquoso, etanlico e acetnico da polpa, casca e semente do noni (Morinda citrifolia Linn.)............................. Tabela 06 Atividade antioxidante dos extratos aquoso, etanlico e acetnico da polpa, casca e semente de noni (Morinda citrifolia Linn.), pelo mtodo -caroteno/ cido linolico
52
............................................................................................................ 55 Tabela 07 Capacidade antioxidante (EC50 em ppm) dos extratos da polpa, semente e casca do noni, utilizando o mtodo -caroteno/ cido linolico.............................................................................................. Tabela 08 Coeficiente de correlao linear (r2) obtido dos extratos alcolicos, aquosos e acetnico da polpa, semente e casca do noni ( Morinda citrifolia Linn) na avaliao da atividade antioxidante pelo mtodo do -caroteno/ cido linolico........................................................... Tabela 09 Coeficiente de correlao linear (r ) obtido dos extratos alcolicos, aquosos e acetnico da polpa, semente e casca do noni ( Morinda citrifolia Linn). na avaliao da atividade antioxidante pelo ensaio do radical DPPH............................................................................... Tabela 10 Capacidade antioxidante, expressos em EC50 (g/mL) dos extratos da polpa, semente e casca do noni (Morinda citrifolia Linn) 60 utilizando o radical livre DPPH........................................................... Tabela 11 Capacidade Antioxidante Total (TEAC) dos extratos aquoso, alcolico e acetnico da polpa, casca e semente do noni ( Morinda citrifolia Linn) pelo mtodo ABTS+ expressos em mM de trolox/ g 59
2
55
56
de amostra fresca.............................................................................. Tabela 12 Taxa de inibio do crescimento micelial de Aspergillus terreus sobre ao do extrato aquoso da polpa, casca e semente do noni . em diferentes concentraes............................................................ Tabela 13 Taxa de inibio do crescimento micelial de Penicillium citrinum sobre ao do extrato aquoso da polpa, casca e semente do noni . em diferentes concentraes............................................................ Tabela 14 Taxa de inibio do crescimento micelial de Aspergillus japonicus sobre ao do extrato aquoso da polpa, casca e semente do noni . em diferentes concentraes.............................................................
65
69
69
70
LISTA DE ABREVIATURAS
ABTS: 2,2- azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-cido sulfnico BHA: butilhidroxianisol BHT: butilhidroxidotolueno DCFI: diclorobenzenoindofenol DPPH: radical [2,2 difenil-1-pricril-hidrazil (DPPH)] ERNs: espcies reativas de nitrognio EROs: espcies reativas de oxignio H2O2: perxido de hidrognio HClO: cido hipocloroso HO : hidroxila NO-: nion nitroxila NO+: ction nitrosonium O2 : superxido ONOO- : peroxinitrito PG: propilgalato LDL RO : alcoxila ROO : peroxila TBHQ: terciobutilhidroxinona TEAC: atividade antioxidante total equivalente ao trolox
SUMRIO
1 INTRODUO ....................................................................................................... 15 2 REVISO DA LITERATURA ................................................................................ 17 2.1 OS RADICAIS LIVRES .................................................................................... 17 2.2 ESTRESSE OXIDATIVO.................................................................................. 18 2.3 COMPOSTOS ANTIOXIDANTES ................................................................... 19 2.3.1 Mecanismos de ao dos antioxidantes ............................................ 21 2.3.2 Antioxidantes dietticos ou naturais ................................................. 22 2.3.2.1 Vitamina C (cido ascrbico) ................................................... 24 2.3.2.2 Vitamina E ................................................................................ 25 2.3.2.3 Carotenides ............................................................................ 26 2.4 COMPOSTOS FENLICOS ............................................................................. 27 2.4.1 Flavonides e cidos fenlicos ........................................................ 29 2.4.2 Mtodos utilizados na avaliao da capacidade antioxidante ....... 30 2.5 ATIVIDADE ANTIFNGICA DE PLANTAS ...................................................... 33 2.6 O NONI ............................................................................................................ 35 2.6.1 Caractersticas da planta .................................................................... 36 2.6.2 Constituio qumica........................................................................... 38 2.6.3 Atividade biolgica .............................................................................. 36 3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 38 3.1OBJETIVOS GERAL ........................................................................................ 38 3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ............................................................................................ 38 4. MATERIAL E MTODOS ....................................................................................................... 39 4.1 OBTENO E PREPARO DAS AMOSTRAS ............................................................. 39 4.2 MTODOS.............................................................................................................................. 39 4.2.1 Anlise da composio centesimal .............................................................. 39 4.2.2 Obteno dos extratos aquoso, alcolico e acetnico, e
quantificao de slidos totais (peso seco) ........................................................ 40 4.2.3 Compostos fenlicos totais, segundo SWAIN, 1959, adaptada por LIMA, 2008 ........................................................................................................................... 41 4.2.4 Contedo de carotenides totais segundo AOAC (1998) ................... 42
4.2.5 Contedo de vitamina C pelo mtodo de TILLMANS modificado por Benassi e Antunes-1988 ............................................................................................... 43 4.2.6 Determinao da atividade antioxidante in vitro dos extratos da polpa, semente e casca do noni ................................................................................ 44 4.2.6.1 Mtodo DPPH ......................................................................................... 44 4.2.6.2 Mtodo ABTS ........................................................................................... 44 4.2.6.3 Mtodo de co-oxidao do -caroteno/cido linolico ................ 45 4.2.7 Determinao da atividade antifngica ....................................................... 47 4.4 TRATAMENTO ESTATSTICO ....................................................................................... 47 5. RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................................ 48 5.1 COMPOSIO CENTESIMAL......................................................................................... 48 5.2 VITAMINA C E CAROTENIDES................................................................................... 49 5.3 FENLICOS TOTAIS.......................................................................................................... 50 5.4 DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO ............................ 51 5.4.1 Mtodo -caroteno/ cido linolico ............................................................... 52 5.4.2 Atividade antioxidante utilizando o radical DPPH .................................. 57 5.4.3 Atividade antioxidante pelo mtodo ABTS+ .............................................. 64 5.4.4 Atividade antifngica ........................................................................................... 67 6. CONCLUSES ........................................................................................................................... 72 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ......................................................................................... 73
INTRODUO
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1. INTRODUO
Durante sculos, as diferentes culturas do mundo tm utilizado produtos naturais e herbceos como parte do acervo da medicina tradicional. Frente a isso, o uso de plantas medicinais e seus extratos vm crescendo na assistncia sade (VARANDA, 2006) em funo de sua fcil aceitabilidade, disponibilidade e baixo custo. Em todo o mundo, a medicina popular utilizada para cuidados primrios em relao sade, sendo que a maior parte dessa terapia tradicional envolve o uso de extratos de plantas ou seus princpios ativos. Dessa forma, cientistas e profissionais da sade tm aumentado o interesse neste campo de pesquisa reconhecendo os reais benefcios que os produtos naturais podem proporcionar sade (VARANDA, 2006; BALUNAS et al., 2006). Os compostos bioativos mais comumente encontrados em vegetais, frutas e hortalias so as substncias fenlicas, que so formadas no metabolismo secundrio dos vegetais, podendo ser encontradas na forma livre ou ligadas a acares e protenas, possuindo vrias funes como: crescimento da planta, propriedades sensoriais, processos germinativos da semente, defesa contra pragas e danos oxidativos. Em animais e humanos, os estudos tm apontado que os compostos fenlicos so capazes de bloquear as estruturas radicalares, devendo-se isto estrutura qumica, formada por pelo menos um anel aromtico com grupamentos hidroxila (BRAVO, 1998; LIU, 2007). O excesso de radicais livres no organismo, leva ao estresse oxidativo (conjunto de condies intra e extracelulares que leva gerao exacerbada de radicais livres, causando desequilbrio na homeostase). Esta condio tem sido associada como um possvel agente causador de uma srie de doenas crnicas no transmissveis, como aterosclerose, infarto do miocrdio, artrite reumatide, catarata, mal de Parkinson, envelhecimento precoce, cncer, dentre outras. (MANACH e DONOVAN, 2004; KIM et al., 2008). Os Estudos em todo o mundo tm caracterizado vrios produtos naturais com o intuito de identificar e quantificar os componentes bioativos destes vegetais a fim de utiliz-lo na alimentao da populao e com isso reduzir o risco de surgimento de doenas. Nesse contexto, as frutas exticas, como o Noni (Morinda citrifolia Linn),
INTRODUO
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tem ganhado cada vez mais espao, tanto pela busca de benefcios que estas possam oferecer, como pela procura por diferentes tipos de fontes alimentares. Pesquisas esto sendo feitos com a planta Morinda citrifolia, popularmente conhecida por noni. O emprego tradicional do noni, usado h mais de 2000 anos pelos polinsios, est atribudo aos efeitos relacionados com atividade
antibacteriana, antioxidante, antiviral, antifngica, antitumoral, anti-helmntica, analgsica, antiinflamatria, hipotensora e imunoestimulante (WANG et al., 2002). Esse vegetal tem suas folhas e especialmente seu fruto consumidos sob diferentes formas por vrias comunidades do mundo (CHANBLANCO et al., 2006). No Brasil o seu consumo como alimento ou como medicamento tem aumentado de forma significativa nos ltimos anos. Com isso, h um grande marketing comercial do noni no Brasil, tal fato se d por essa planta possuir um papel relevante na economia dos pases da qual originada. Atualmente o nosso pas o quinto maior mercado de produtos base de noni e existem cadastrados, mais de 18.000 distribuidores que comercializam o suco de Noni, cpsulas de extrato seco e do p da planta, todos esses produtos esto venda nas farmcias de manipulao (ASSOCIAO BRASILEIRA DE EMPRESAS DE VENDAS DIRETAS, 2006). Diante da relevncia que tem alcanado os estudos sobre as propriedades medicinais da Morinda citrifolia Linn, de fundamental importncia pesquisas que avaliem os reais benefcios que esta planta pode trazer sade. Diante do exposto, este trabalho teve como objetivo caracterizar nutricionalmente o Noni, bem como avaliar sua atividade antioxidante e antinfngica, nas distintas partes que compem o fruto (casca, semente e polpa).
REVISO DE LITERATURA
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2. REVISO DA LITERATURA
2.1 OS RADICAIS LIVRES
O termo radical livre pode ser definido como um conjunto de molculas orgnicas e inorgnicas que contm em sua estrutura um ou mais eltrons no pareados, independentes na sua existncia (HALLIWELL, 1994). Ou seja, so tomos ou molculas altamente reativos, que contm nmero mpar de eltrons em sua camada eletrnica e este no emparelhamento de eltrons da ultima camada confere alta reatividade a esses tomos ou molculas (HALLIWELL, 1992; HALLIWELL, 1990). Tal configurao eletrnica faz dos radicais livres molculas muito instveis, com meia-vida muito reduzida e muito reativas quimicamente. A presena desses radicais no organismo humano torna crtica a manuteno de muitas funes fisiolgicas normais (POMPELLA, 1997). Esses radicais livres, cujo eltron desemparelhado encontra-se centrado nos tomos de oxignio ou nitrognio, so classificados como espcies reativas de oxignio (EROs) ou espcies reativas de nitrognio (ERNs). As principais EROs distribuem-se em dois grupos, os radicalares: hidroxila (HO), superxido (O2
),
peroxila (ROO) e alcoxila (RO); e os no radicalares: oxignio, perxido de hidrognio (H2O2) e cido hipocloroso (HClO). Como ERNs podemos citar o ction nitrosonium (NO+), o nion nitroxila (NO-) e o peroxinitrito (ONOO-) (DROGE, 2002, BARREIROS, et al.,2006). Portanto, como a exemplo do H2O2, apesar de no ser considerado um radical livre, capaz de atravessar a membrana nuclear e induzir danos molcula de DNA por meio de reaes enzimticas. Algumas ERO e ERN podem ser altamente reativas no organismo causando danos aos lipdeos, protenas e DNA, outros so reativas apenas com os lipdeos, alm disso, existem aqueles que so poucos reativos, mas que apesar disso podem gerar espcies danosas (ANDERSON, 1996). A gerao dos radicais livres, nas clulas, ocorre tanto no meio citoplasmtico, como nas mitocndrias e esto envolvidos em funes fisiolgicas bsicas, como na produo de energia, fagocitose, regulao do crescimento celular, sinalizao intercelular e sntese de substncias biolgicas importantes. Porm, sua produo
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em excesso apresenta efeitos prejudiciais como a peroxidao dos lipdeos de membrana e agresso s protenas dos tecidos e das membranas, enzimas, carboidratos e DNA (HUSAIN, 1987; ANDERSON, 1996; YU e ANDERSON, 1997). A produo de radicais livres tambm ocorre nos fagcitos quando infectados por bactrias ou vrus, produzindo oxidantes como o xido ntrico, nion superxido, perxido de hidrognio, entre outros, fazendo com que os radicais livres faam parte da defesa imune do organismo (VALKO et al., 2006) Os radicais livres se formam em um gama de reaes de xido reduo, no entanto, podem ceder o eltron solitrio, oxidando-se, ou podem receber outro eltron, reduzindo-se, como o que ocorre com o radical superxido (O2).que apresenta um baixa capacidade de oxidao. Portanto, os radicais livres podem provocar ou serem resultados dessas reaes de xido reduo. O radical OH apresenta uma alta capacidade de difuso e por isso, o mais reativo na induo de leses nas molculas celulares (FERREIRA e MATSUBARA, 1997). As causas exgenas que levam formao dos radicais livres so diversas, como radiaes gama, poluentes, praguicidas entre outros. O fumo uma importante fonte exgena desses radicais, pois a combusto do cigarro produz xidos de nitrognio levando oxidao das molculas biolgicas (ELSAYED, 2001).
2.2 ESTRESSE OXIDATIVO
A formao de radicais livres ocorre pela ao cataltica de enzimas in vivo, durante os processos de transferncia de eltrons que ocorrem no metabolismo celular e pela exposio a fatores exgenos. A concentrao desses radicais pode se elevar devido maior gerao intracelular ou pela deficincia dos mecanismos antioxidantes, esse desequilbrio desfavorvel que ocorre entre as molculas oxidantes e antioxidantes, caracteriza o estresse oxidativo (CERUTTI, 1991; CERUTTI, 1994; SIES, 1993). Segundo Drge (2002), esse desbalano entre a produo de EROS/ ERNs e remoo pelos sistemas de defesa antioxidante caracteriza o estresse oxidativo, sendo este uma condio celular ou fisiolgica de EROS/ ERNs que causa danos
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moleculares s estruturas celulares tendo como conseqncia alterao funcional e prejuzo das funes vitais em diversos tecidos e rgos. A ocorrncia de um estresse oxidativo moderado frequentemente
acompanhada de um aumento nas defesas antioxidantes enzimtica, porm, a produo de uma quantidade elevada de radicais livres pode causar danos e morte celular (ANDERSON, 1996). Niess et al.,(1999) afirma que o efeito deletrio desse estresse oxidativo variar consideralmente de um ser vivo para outro, dependendo de fatores como a idade, estado fisiolgico e da dieta. Os danos oxidativos induzidos nas clulas e tecidos tm estreita relao com a etiologia de diversas doenas, principalmente, as crnicas no transmissveis como as cardiopatias, aterosclerose e problemas pulmonares, sendo que os danos oxidativos no DNA tambm influenciam de forma significativa nos processo de mutagnese e carcinognese (POULSEN et al.,1998; AMES, et al.,1993; WITSUN, 1994). Diante dos danos causados pelos mecanismos radicalares, as protees conhecidas do organismo contra as ROS e RNS abrangem a proteo enzimtica, sendo constitudo pelas enzimas antioxidantes catalase, superoxido dismutase, glutationa redutase e glutationa peroxidase; por micromolculas que podem ter origem no prprio organismo, como a glutationa, cido rico, bilirrubina, albumina e melationena; ou so adquiridas atravs da dieta, como a vitamina C, vitamina E, carotenides e os compostos fenlicos presentes principalmente nos alimentos de origem vegetal (BARREIROS et al.,2006).
2.3 COMPOSTOS ANTIOXIDANTES
A produo contnua e em excesso de radicais livres durante os processos metablicos levou ao desenvolvimento de defesas pelo organismo, como o mecanismo de defesa antioxidante, com o intuito de limitar os nveis intracelulares e impedir a induo de danos (SIES, 1993). Os compostos antioxidantes so os agentes responsveis pela inibio e reduo das leses causadas pelos radicais livres nas clulas. Halliwell (2000) define antioxidante como sendo uma substncia que presente em baixas concentraes em relao ao substrato oxidvel, regenera ou previne de maneira eficaz a oxidao desse substrato.
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A definio de um bom antioxidante se d pelas suas caractersticas qumicas, como a presena de doadores de eltrons ou de hidrognio; capacidade de deslocamento do radical formado em sua estrutura; potencial de quelar metais de transio envolvidos no processo oxidativo e facilidade de acesso ao local de ao (MANACH e DONOVAN, 2004). Quanto classificao, esses agentes protetores das clulas contra os radicais livres, podem ser classificados em antioxidantes enzimticos e no enzimticos (tabela 1), os quais so produzidos pelo organismo, ou antioxidantes dietticos, isto , que so obtidos pela dieta (SIES, 1993). A exemplo dos antioxidantes que agem enzimaticamente tem-se as enzimas superxido dismutase, catalase, NADPH-quinona oxidoredutase, glutationa
peroxidase e enzimas de reparo. Entre os antioxidantes no enzimticos tem-se as protenas do plasma, a glutationa, clorofilina, L-cistena e os provenientes da dieta como o -tocoferol (vitamina E), -caroteno (pro-vitamina A), cido ascrbico (vitamina C) e os compostos fenlicos em que se destacam os flavonides e os cidos fenlicos (PIETTA, 2000; HALLIWELL, 1995).
Tabela 01: Principais agentes de defesa antioxidante No-enzimtico -tocoferol (vitamina E) -caroteno cido ascrbico (vitamina C) Flavanides Protenas do plasma Selnio Glutationa Clorofilina L-cistena Curcumina Enzimtico Superxido dismutase Catalase NADPH-quinona oxidoredutase Glutationa peroxidase Enzimas de reparo
FONTE: (Adaptado de BIANCH E ANTUNES, 2003)
Outra classificao segundo Bravo (1998), coloca os antioxidantes como primrios ou secundrios, sendo que os antioxidantes primrios agem como doadores de prtons e esto nesta classe os compostos fenlicos, tocoferol, aminocidos, carotenides e os antioxidantes sintticos. Os antioxidantes
secundrios tm sua ao no bloqueio da decomposio dos perxidos e
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hidroperxidos, inativando-os. Nesta classe esto os antioxidantes sintticos, compostos fenlicos e as vitaminas A, C e E (DONNELI e ROBINSON, 1995). Os antioxidantes sintticos, como o butilhidroxitolueno (BHT), o
butilhidroxianisol (BHA), o propilgalato (PG) e o terciobutilhidroxinona (TBHQ), so frequentemente usados na indstria de alimentos com o intuito de aumentar a vida de prateleira dos alimentos que contenham lipdeos em sua composio, entretanto muitos estudos tm sugerido que o uso de altas doses desses constituintes levam ao desenvolvimento de processos carcinognicos, nesse sentido, tem sido substitudos, ainda que parcialmente, por antioxidantes naturais (BARREIROS e DAVID, 2006). Apesar da proteo celular conferida pelos antioxidantes endgenos, os componentes celulares no so totalmente protegidos e constantemente h formao de espcies reativas de oxignio e nitrognio que interagem em diferentes nveis com o ambiente celular antes de serem eliminadas. No entanto, de fato estabelecido que alm dos antioxidantes endgenos, necessria a participao dos antioxidantes dietticos, pois so indispensveis para a defesa apropriada contra a oxidao e, por isso, tm importante papel na manuteno da sade. Os benefcios provenientes de frutas, hortalias e demais vegetais deve-se em grande parte presena de antioxidantes nestes alimentos (LAMPE, 1999).
2.3.1 Mecanismos de ao dos antioxidantes
Os antioxidantes podem atuar sobre diferentes nveis na proteo dos organismos. Podem agir como captadores de radicais e supressores de estados excitados, como sistemas catalticos que neutralizam ou eliminam ROS/ RNS ou fazendo a ligao de ons metlicos protenas, tornando-os indisponveis para a produo de espcies oxidantes (HALLIWELl e GUTTERIDGE, 1999). O primeiro mecanismo de proteo contra os radicais livres impedir sua formao, inibindo principalmente reaes em cadeia com o ferro e o cobre. Outro mecanismo importante de defesa o fato dos antioxidantes serem capazes de interceptar os radicais gerados pelo metabolismo das clulas ou por fontes exgenas, evitando o prejuzo aos lipdeos, aos aminocidos, s duplas ligaes dos cidos graxos poliinsaturados e s bases de DNA, impedindo a leso e perda de
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integridade celular. Vale ressaltar que, os antioxidantes da dieta, tais como a vitamina E, C, A, os flavonides e carotenides exercem papel essencial nessa intercepo de radicais livres. (BIANCHI e ANTUNES, 1999). Os antioxidantes tambm atuam no reparo das leses causadas pelos radicais, processo este relacionado com a remoo dos danos da molcula de DNA e com a reconstituio das membranas celulares danificadas. Em alguns casos, pode ocorrer uma adaptao do organismo em resposta a gerao desses radicais resultando em um aumento da sntese de enzimas antioxidantes (BIANCHI e ANTUNES, 1999). As pesquisas em relao aos antioxidantes tm focado principalmente, o uso de nutrientes isolados no tratamento e preveno de doenas, alm do que, nos alimentos so encontrados uma variedade de substncias que podem atuar em sinergismo na proteo das celulas e tecidos (JACOB, 1995; NIKI et al., HERCBERG et al., 1998). Quanto ao desempenho dos antioxidantes in vivo, este depende de fatores como: tipo de radical formado, local e como so gerados, anlise e mtodos para a identificao dos danos e as doses ideais para obter proteo. Nesse sentido, possvel que um determinado antioxidante atue como protetor em determinado sistema mas falhe na proteo ou ento, aumente as leses induzida em outros sistemas ou tecidos (HALLIWELL et al., 1995).
2.3.2 Antioxidantes dietticos ou naturais
O sistema de defesa humano contra os radicais livres no seria completo sem os antioxidantes provenientes da dieta, o que confirma a importncia da ingesto diria desses compostos, proporcionando vrios benefcios como melhoria na qualidade de vida da populao (RATMAN et al., 2006). Os componentes da dieta podem, no entanto, alterar o balano antioxidante do organismo, seja pelo aumento no consumo de alimentos ricos em substncias antioxidantes. No entanto, h vrias lacunas no que se refere aos antioxidantes em geral, como por exemplo, a inexistncia de uma recomendao especfica para cada antioxidante, a falta de padronizao dos valores antioxidantes dos alimentos e os
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efeitos txicos que venham a existir pela administrao de dose excessivas de antioxidantes (LIMA, 2008). Os compostos antioxidantes da dieta, dependendo do tipo, podem ou no produzir efeitos sinrgicos de difcil avaliao. A complexidade da dieta deve ser avaliada e considerada, pois as interaes entre seus constituintes podem ocasionar efeitos que no representam diretamente as propriedades dos seus constituintes individuais (RICE-EVANS, 1999). Portanto, a ingesto de antioxidantes dietticos a principal forma de obteno pelo organismo de antioxidantes e os principais nutrientes so as vitaminas (C e E), carotenides (-caroteno e licopeno) e entre os no nutrientes incluem-se os compostos fenlicos (flavanides e cidos fenlicos). As vitaminas C, E e o -caroteno so consideradas excelentes antioxidantes pois so capazes de seqestrar os radicais livres com grande eficincia, porm, o uso de medicamentos, lcool, a poluio atmosfrica e muitos outros fatores interferem negativamente nos nveis de antioxidantes celulares, porm, o organismo pode ter suas defesas restabelecidas tendo como fonte de antioxidantes, dietas apropriadas e suplementos a base de vitaminas com expressiva atividade antioxidante. (ROE, 1992; CARAGAY, 1992; ANDERSON, 1996). Os compostos antioxidantes exgenos ou dietticos so encontrados em diversos alimentos, na Tabela 02, so elencados alguns alimentos e seus respectivos compostos antioxidantes.
Tabela 02: Fontes alimentares de antioxidantes dietticos. ALIMENTO Mamo Brcolis Laranja Ch Vinho Cenoura Tomate ANTIOXIDANTE -caroteno Flavonides Vitamina C Catequinas Quercetina -caroteno Carotenides ALIMENTO Uva Salsa Morango Curry Noz Espinafre Repolho ANTIOXIDANTE cido elgico Flavonides Vitamina C Curcumina Polifenis Clorofilina Taninos
FONTE: BIANCHI e ANTUNES, 1999.
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2.3.2.1 Vitamina C (cido ascrbico)
Composto natural com expressiva atividade antioxidante e baixa toxicidade, a vitamina C, por ser um nutriente hidrossolvel, e est envolvido em mltiplas funes biolgicas, atuando como cofator de diversas enzimas envolvidas na hidroxilao ps-traduo do colgeno, na biossntese de cartinina, na converso de neurotransmissores, na amidao peptdica e no metabolismo da tirosina. (WEBER et al., 1996). Contudo, a vitamina C tambm tem importante papel na absoro do ferro diettico pois apresenta a capacidade de reduzir a forma frrica (Fe3+) a ferrosa (Fe2+), facilitando assim, a absoro do ferro no-heme no trato gastrointestinal (LOUREIRO , 2002; HALLIWELL, 2001). Geralmente, o cido ascrbico consumido em grandes quantidades pelos seres humanos, adicionadas a produtos alimentares, com o objetivo de inibir a formao de metablitos nitrosos carcinognicos. Sendo assim, essa vitamina rapidamente absorvida e de forma eficiente, por um processo dependente de energia, entretanto o consumo em doses excessivas pode ocasionar ao aumento da sua concentrao nos tecidos e no plasma sanguneo (BIANCHI e ANTUNES, 2003). Alm das suas vrias funes, a vitamina C um potente agente redutor capaz de reduzir grande parte das ROS/ RNS de importncia fisiolgica, sendo que em meio fisiolgico, encontra-se predominantemente na forma de mononion ascorbato (Food and Nutrition Board, 2000). Outra funo importante do cido ascrbico referente sua capacidade de regenerar o -tocoferol e, por conseguinte, atuar no mecanismo protetor contra a lipoperoxidao sendo que uma vez depletada, outros compostos antioxidantes podem, de forma menos eficiente, reduzir o radical -tocoferila (AMES, 2001).
2.3.2.2 Vitamina E
A vitamina E um componente dos leos vegetais encontrada na natureza em quatro formas diferentes , , e -tocoferol, sendo o -tocoferol a forma antioxidante amplamente distribuda nos tecidos e no plasma. A vitamina E
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encontra-se em grande quantidade nos lipdeos, e evidncias recentes sugerem que essa vitamina impede ou minimiza os danos provocados pelos radicais livres associados com doenas especficas, incluindo o cncer, artrite, catarata e o envelhecimento (Morrissey et al., 1994; Heinonen et al., 1998). Estudo in vitro comprova a capacidade do -tocoferol em prevenir a peroxidao lipdica de lipoprotenas de baixa densidade (LDL), as quais atuam no transporte de cidos graxos e colesterol do fgado para os tecidos perifricos (THOMAS, 2000). Sua funo antioxidante se deve sua capacidade em inibir a peroxidao lipdica, combatendo os radicais peroxila e convertendo-se em um radical tocoferol regenerando o (SERRACARBASSA, 2006). No entanto, tendo em vista os benefcios antioxidantes do -tocoferol in vitro e que sua quantidade presente em LDL rapidamente alterada em resposta ao consumo diettico, estudos em seres humanos so realizados com o intuito de verificar a eficcia da suplementao oral deste nutriente tanto no retardo como na preveno de doenas que envolvam a lipoperoxidao (JESSUP et al., 2004). -tocoferol ao reagir com a vitamina C
2.3.2.3 Carotenides
Assim como as vitaminas, os carotenides so as substncias mais investigadas como agentes quimiopreventivos devido a sua funcionalidade como antioxidantes em sistemas biolgicos (POOL-ZOBEL, 1997). So corantes naturais cuja estrutura qumica composta por ligaes duplas conjugadas responsveis pela cor e funo antioxidante desses compostos (RAO e RAO, 2007). Os carotenides so isoprenides, constitudos na sua maioria por 8 unidades de isoprenos, formando uma longa cadeia de polieno que pode conter de 2 a 15 duplas ligaes conjugadas, sendo que isto permite vrias configuraes cis e trans. Segundo Olson (1999), os carotenides desempenham diversas funes no organismo humano, pois atuam seqestrando o oxignio singlete, removendo os radicais perxidos, modulando o metabolismo carcinognico, como tambm inibindo a proliferao celular, estimulam a comunicao entre clulas (junes gap), e elevam a resposta imune. A quantidade de ligaes duplas conjugadas, presentes nas molculas dos carotenides, interfere na ao seqestrante de radicais.
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A proteo dos sistemas biolgicos pelos carotenides do ataque dos radicais depende de um mecanismo pelo qual h transferncia de energia do oxignio excitado para a molcula do carotenide, em que a energia dissipada por meio de rotaes e vibraes do carotenide no meio solvente (STAHL e SIES, 1999). Os carotenides reagem com os radicais livres, principalmente com os radicais perxidos e com o oxignio molecular, sendo a base de sua ao antioxidante. Certos carotenides como a lutena, -caroteno, zeaxantina e licopeno, exercem suas funes antioxidantes em fases lipdicas, impedindo que os radicais livres danifiquem as membranas lipoproticas (SIES e STAHL, 1995). Dessa forma, por serem potentes antioxidantes certos carotenides atuam como precursores da vitamina A na dieta, sendo o -caroteno o mais importante precursor dessa vitamina, sendo encontrado amplamente distribudo nos alimentos. Alm disso, h tambm certos carotenides que no atuam como precursores da vitamina A como o caso do licopeno e lutena (HANDELMAN, 2001). O licopeno est entre os 600 pigmentos carotenides encontrados na natureza e entre os 25 que esto presentes no plasma e tecidos. A sua distribuio no organismo humano ampla, sendo o fgado o rgo onde h maior acumulo desse carotenide (SHAMI e MOREIRA, 2004). lipossolvel, composto por onze ligaes conjugadas e duas ligaes duplas no conjugadas (RAO e SHEN, 2002). Tambm tido como o carotenide que possui a maior capacidade seqestrante do oxignio singlete, caracterstica essa atribuda possivelmente presena na sua estrutura das duas ligaes duplas no conjugadas, o que lhe oferece maior reatividade (KRINSKY, 2001; DI MASCIO, KAISER e SIES, 1989). As fontes de carotenides so vrias, como por exemplo, as cenouras e abboras ( e -caroteno), tomates e seus produtos derivados, como extrato de tomate, polpa e molhos, ricos em licopeno e como fonte de lutena o espinafre (SILVA e NAVES 2001; BIANCHI e ANTUNES, 1999).
2.4 COMPOSTOS FENLICOS
Os compostos fenlicos so encontrados na parede celular dos vegetais livres ou ligados a aucares (glicosdeos) e protenas e englobam uma grande variedade compostos, desde molculas simples at molculas com alto grau de polimerizao
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possuindo em comum um anel aromtico, ao qual est unida uma ou mais hidroxilas (CROF, 1998; BRAVO, 1998; KARAKAYA, 2004). Atuam na adaptao da planta a condies de estresse ambiental, como na defesa contra radiaes ultravioleta ou agresso por patgenos. Alm disso, contribuem para caractersticas da planta ou fruto, como adstringncia, cor, flavor e estabilidade oxidativa (NACZK e SHAHIDI, 2004; FARAH e DONANGELO, 2006). Os compostos fenlicos esto classificados, segundo Ribreau-Gayon (1968) como compostos: pouco distribudos na natureza, polmeros e os largamente distribudos na natureza. Na famlia dos compostos pouco distribudos na natureza esto os fenis simples, o pirocatecol, a hidroquinona e o resorcinol. Tambm pertencem a essa famlia os aldedos derivados dos cidos benzicos, que so os constituintes dos leos essenciais como a vanilina (SOARES, 2002). Os compostos fenlicos presentes na forma de polmeros so aqueles que no se apresentam na forma livre nos tecidos vegetais. Dentre eles, esto os taninos e as ligninas. Os taninos so polmeros de alto peso molecular, responsveis por conferir sabor adstringente ao alimento e esto classificados em dois grupos: os taninos hidrolisveis e os condensados. J as ligninas, so polmeros complexos, de grande rigidez e resistncia mecnica. Ao sofrerem hidrlise alcalina, liberam grandes variedades de derivados dos cidos benzico e cinmico (KING e YOUNG, 1999). Na famlia dos compostos largamente distribudos na natureza esto os fenlicos, podendo ser encontrados em todo reino vegetal ou em apenas uma planta. Os fenlicos podem ser divididos em dois grandes grupos: os flavanides e derivados e os cidos fenlicos (cidos benzico, cinmico e seus derivados) e as cumarinas (SOARES, 2002). Os compostos fenlicos atuam como seqestradores de radicais e como quelantes de metais de transio, agindo tanto na etapa de iniciao, como na de propagao do processo oxidativo. Isto leva a produo de produtos intermedirios, relativamente estveis devido ressonncia do anel aromtico apresentada por estas substncias (NAWAR, 1985; SHAHIDI et al., 1992). O grau de hidroxilao e a posio dos grupos hidroxila na molcula dos compostos fenlicos so os mais importantes fatores que determinam a atividade antioxidante nesses compostos. O tipo de estrutura pode afetar na solubilidade e nos efeitos estricos de cada
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molcula, como ocorre nos derivados glicosilados, que podem aumentar ou diminuir a atividade antioxidante (RICE-EVANS et al., 1996). Os compostos fenlicos podem estar presentes entre as distintas partes das plantas, porm a maior concentrao desses compostos est nas frutas, hortalias e seus derivados como azeite virgem de oliva, vinho tinto etc. Tambm pode haver considerveis quantidades desses compostos em cereais e leguminosas (SOARES, 2002; LIU, 2005).
2.4.1 Flavonides e cidos fenlicos
Dentre os compostos fenlicos de origem natural destacam-se os flavonides e os cidos fenlicos, cuja classificao ocorre de acordo com as suas estruturas qumicas. A estrutura qumica dos flavonides formada por dois anis aromticos unidos por um heterociclo oxigenado, dependendo do grau de hidrogenao e da substituio do heterociclo, se classifica, em diferentes grupos: flavonas, flavanis, flavonis, flavononas, antocianinas e isoflavanides. Estes compostos esto geralmente ligados a aucares, formando glicosdeos. (KARAKAYA, 2004). A estrutura dos principais grupos flavonides pode ser observada na Figura 01:
Figura 01: Estrutura qumica dos principais tipos de flavonides.
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Quanto aos cidos fenlicos, tambm chamados de compostos benzicos e cinmicos, estes possuem estrutura mais simples dentre os compostos fenlicos, na qual compreende um anel aromtico com grupos ligados sua estrutura, dentre os quais o mais comum a hidroxila. Outros grupos funcionais com os quais eles podem se ligar so os aldedos, alcois ou cidos, podendo formar steres com os cidos orgnicos ou unir-se a aucares. Alm desses compostos, outros tambm de natureza fenlica so os estilbenos, lignanos e, de forma polimeralizada, os taninos e as ligninas (MANACH e DONOVAN, 2004). Na figura 02, consta a estrutura qumica dos principais cidos fenlicos.
Figura 02: Estrutura qumica dos principais cidos fenlicos.
2.4 .2 Mtodos utilizados na avaliao da capacidade antioxidante
Um grande nmero de mtodos tem sido desenvolvidos com o intuito de determinar a capacidade antioxidante dos alimentos. Estes mtodos podem ser baseados na captura do radical peroxila (ORAC, TRAP), poder de reduo do metal
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(FRAP; CUPRAC), captura do radical hidroxila (mtodo de desoxirribose), captura do radical orgnico (ABTS, DPPH), quantificao de produtos formados durante a peroxidao de lipdios (TBARS, oxidao do LDL, co-oxidao do -caroteno) (FRANKEL e MEYER, 2000; SNCHEZ-MORENO, 2002; ARUOMA, 2003), etc. Dentre estes mtodos, ABTS, FRAP, DPPH e ORAC so alguns dos mais usados atualmente (PREZ-JIMNEZ e SAURA CALIXTO, 2006). A importncia da determinao da atividade antioxidante nos alimentos se d principalmente pelo fato de que o conhecimento do potencial antioxidante de cada alimento, antes de ser ingerido, ir permitir a mensurao da quantidade de cada alimento necessria para se ter uma resposta antioxidante eficiente. Para isso, importante que a determinao da capacidade antioxidante seja avaliada utilizandose mais de um mtodo. Esses mtodos so necessrios, pois existe uma grande dificuldade em medir cada composto que tenha ao antioxidante, separadamente, alm das interaes existentes entre os diferentes antioxidantes do sistema. Todos os mtodos utilizados na mensurao da capacidade antioxidante tm em comum a presena de um agente antioxidante e um substrato especfico. Esses mtodos possuem duas classificaes: os que agem na captura de radicais livres e os que atuam na determinao de uma molcula alvo (LIMA, 2008). Dentre as vrias metodologias utilizadas para a avaliao da atividade antioxidante de alimentos vegetais, o mtodo -caroteno/ cido linolico tem sido bastante utilizado. Este mtodo colorimtrico se baseia na tcnica de co-oxidao de substratos em meio emulsionado, isto , determina a atividade de uma amostra ou composto de proteger um substrato lipdico da oxidao. Foi desenvolvido por Marco (1968) e Miller (1971), no qual utiliza o cido linolico, monopalmitato de polioxietileno sorbitan (Tween 40) e o -caroteno. um mtodo colorimtrico que utiliza comprimento de onda de 470nm sendo que a leitura das absorbncias se refere descolorao da soluo (-caroteno e cido linolico) em meio aquoso. O cido linolico, ao ser submetido oxidao, forma estruturas radicalares, que atacam as duplas ligaes do -caroteno, que ao perder seu cromforo provoca a descolorao da soluo. A presena de antioxidantes no sistema protege o cido linolico, prolongando o perodo de formao dos radicais na reao. Para a comparao dos resultados obtidos por esse mtodo, utiliza-se o antioxidante sinttico butilhidroxidotolueno (BHT) como padro positivo para comparao dos
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resultados. A eficincia desse mtodo tem sido analisada em vrias matrizes alimentares, principalmente frutos e sementes ricas em lipdeos (Lima, 2008). Outra metodologia que tem sido bastante aplicada pelos pesquisadores o mtodo utilizando o radical ABTS, que apresenta com principais vantagens em
relao aos demais, ser utilizado tanto para extratos hidroflicos como lipoflicos e a forma de expresso dos resultados como valor TEAC (atividade antioxidante total equivalente ao trolox), facilitando assim comparaes entre diversos alimentos. O radical ABTS, (2,2- azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-cido sulfnico) pode ser
gerado por meio de uma reao qumica, eletroqumica ou enzimtica, normalmente se utiliza o persulfato de potssio (Figura 03). O radical formado um cromforo estvel quimicamente e com elevada solubilidade em gua e um mximo de absorbncia de 414 nm com medidas secundrias de absorbncias de 645, 734 e 815 nm (MILLER et al., 1993, Re et al., 1999).
Figura 03: Estabilizao do radical ABTS perssulfato de potssio.
por um antioxidante e sua formao pelo
O mtodo DPPH tem sido muito utilizado pela facilidade de execuo e baixo custo, alm de obteno de resultados confiveis. Foi proposto por Brand-Williams et al. (1995) e se baseia na captura do radical DPPH (2,2-difenil-1- picril-hidrazil) por antioxidantes, produzindo um decrscimo da absorbncia a 515 nm,. Esse mtodo foi modificado por SNCHEZ-MORENO et al., (1998) para medir os parmetros cinticos. O DPPH um radical livre que pode ser obtido diretamente por dissoluo do reagente em meio orgnico (Figura 05). A vantagem desse mtodo se d pela disponibilidade em se obter comercialmente o radical DPPH, o que evita sua gerao por formas distintas, facilitando seu uso, porm, por ser um mtodo que utiliza metanol para gerar a reao, seu uso se torna inapropriado para amostras
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biolgicas, devido ocorrncia de precipitao das protenas em meio alcolico (BRAND-WILLIAMS et al., 1995).
Figura 04: Estabilizao do radical livre DPPH.
2.5 ATIVIDADE ANTIFNGICA DE PLANTAS
Fungos filamentosos, tambm conhecidos como bolores ou mofos, so microrganismos eucariotos, heterotrficos e multicelulares. So organismos
fundamentais para o equilbrio da natureza, alm da importncia ambiental, eles tambm possuem valor econmico e aplicaes na produo de alimentos e medicamentos (AZEVEDO, 2004). Estes microrganismos esto presentes em todos os ambientes e so economicamente importantes no campo da medicina, da fitopatologia e da indstria, alm de serem ecologicamente importantes como decompositores. No entanto, tambm podem contaminar os alimentos, causando sua deteriorao, reduzindo seu valor nutricional, alterando suas qualidades organolpticas e tornando-se, em alguns casos, um problema de sade pblica (RAVEN et al., 1992). Alguns fungos dos gneros Aspergillus, Fusarium e Penicillium podem causar problemas no consumo de gros, devido produo de micotoxinas, compostos capazes de causar doenas em animais e em seres humanos (COELHO NETO e DHINGRA, 1998). As micotoxinas produzidas por esses fungos so metablitos txicos naturais e freqentemente encontradas em alimentos . Aproximadamente duzentas espcies de fungos so consideradas
toxinognicas, sendo que o tipo de substrato e as condies do ambiente so fatores determinantes para a produo de micotoxinas (BOURGEOIS, 1994). Entre
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os txicos contaminantes de alimentos podemos destacar as aflatoxinas produzidas por espcies do gnero Aspergillus, as quais so altamente txicas e carcinogenticas para homens e animais, tornando-se assim, um fator preocupante para a indstria alimentcia (AMADO, 2004; GRANADA. 2003). As fumonisinas so toxinas produzidas principalmente pelo fungo Fusarium moniliforme (SANTURIO, 2000), detectadas naturalmente em diversos alimentos, principalmente no milho e seus derivados, causam edema pulmonar e hidrotrax em sunos, leucoencefalo-malcia em eqinos, e provvel cncer de esfago em humanos. Alm desta toxina, o Fusarium tambm pode produzir as micotoxinas zearalenona e tricotecenos (POZZI, 2002; PUTZKE, 2004). A micotoxina patulina pode ser produzida por vrias espcies do gnero Penicillium e Aspergillus, sendo freqentemente encontrada em frutas, verduras e cereais. Em animais, esta toxina causa vrias complicaes como distrbios gastrointestinais, efeitos neurotxicos e imunolgicos. A verruculogeno tambm uma importante toxina produzida por Penicillium e Aspergillus causando fortes tremores em animais afetados (KAWASHIMA et al., 2002). A busca por novos agentes antimicrobianos, a partir de plantas, intensa devido ao aumento da resistncia dos microorganismos patognicos frente aos produtos sintticos. Alm disso, o uso destes pesticidas a longo prazo causa impactos negativos o meio ambiente e para a sociedade, devido poluio causada pelos resduos qumicos. Frente a este problema, a agricultura vem criando estratgias para resolver essas questes, buscando mtodos alternativos para o controle de doenas e pestes, que visem causar menos danos ao ambiente e a sade humana. Contudo, muitos trabalhos so desenvolvidos com extratos brutos ou leos essenciais, obtidos a partir de plantas medicinais o que tm indicado o potencial das mesmas no controle de fitopatgenos (BAUTISTA-BAOS et al., 2003; CUNICO et al., 2003; MYTLE et al., 2004; MOREIRA et al., 2004). No campo, a produtividade das frutas est relacionada aplicao de fungicidas, o que pode acarretar no aumento dos nveis de contaminantes qumicos indesejveis no produto final, somando-se o efeito deletrio j proporcionado pelas toxinas fngicas naturais. Com isso, os mtodos de controle biolgico constituem alternativas viveis em relao ao qumico tradicional, principalmente por no deixarem resduos txicos nas frutas tratadas (WILSON e WISNIEWSKI, 1997).
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Sendo assim, os fungos atuam como os principais agentes causadores de doenas em plantas. Existem mais de 5.000 espcies de fungos que atacam culturas de alto valor econmico, bem como plantas ornamentais e outras no cultivadas (RAVEN et al., 1992). Entre as doenas de importncia econmica causadas por fungos podem ser citadas as murchas do feijoeiro, do tomateiro e da bananeira, alm de atacarem outras culturas como o mamo, melo, melancia, ervilha, entre outras. Contudo, no intuito de reduzir os efeitos negativos do uso de agrotxicos acarretando assim no aumento da produo de alimentos de melhor qualidade, tmse buscado novas medidas de proteo das plantas contra as doenas. Neste sentido, vrios estudos esto sendo realizados na busca pela descoberta de pesticidas naturais, sendo que os extratos vegetais aparecem como fontes potenciais para o desenvolvimento desses novos produtos. A utilizao de produtos naturais no controle de doenas de plantas representa um meio eficiente para a reduo do uso de defensivos agrcolas (KIMATI et al., 1997).
2.6 O NONI
A planta Morinda citrifolia Linn, conhecida popularmente como noni, originria do Sudeste da sia e Austrlia e, subsequentemente, foi distribuda em toda a regio do Pacfico, principalmente nas ilhas da Polinsia Francesa, onde se situa o Taiti. Era uma das plantas que os colonizadores polinsios do Hava mais valorizavam e a utilizavam como medicamento e como corante (NELSON, 2006). Assim, uma planta tipicamente encontrada nas ilhas do Hava e Taiti (WANG et al., 1999; WANG e SU, 2001). conhecida, entre outros nomes vulgares, como: Ba Ji Tian, Nonu, Indian Mulberry, Canary wood e Cheese fruit. Os cultivos comerciais de noni podem ser encontrados no Taiti, Hava e outros pases da Polinsia, onde se fabricam a maioria dos sucos comercializados no mundo. Como no h cultivares selecionados, a explorao comercial de noni d-se a partir de plantas originadas de sementes. Os produtos derivados dessa fruta so comercializados nos Estados Unidos da Amrica (EUA) desde os anos 90 e so distribudos cada vez mais pelo mundo inteiro (VEIGA, 2005; SCOT, 2006).
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O noni um fruto rico em vitaminas, protenas, minerais e no alcalide proxeronina. Estudos comprovam as mais de 53 propriedades da M. citrifolia dentre os quais estas propriedades, podem-se destacar: regenerador celular, antissptico natural, analgsico, antiinflamatrio, antiparasitrio, regulador matablico,
regenerador de clulas danificadas e como antioxidante (WANG et al., 2002). As partes da planta do noni so praticamente todas aproveitadas e a cada uma delas so atribudas propriedades medicinais diferentes. A casca, cuja propriedade adstringncia, utilizada no tratamento da malria; as folhas so usadas como analgsico e para inflamaes externas; as flores so empregadas no tratamento de inflamaes oculares; o extrato das razes no tratamento da hiperteno e as sementes so utilizadas como laxante (RODRIGUEZ e PINEDO, 2004). A parte da planta de mais ampla utilizao o fruto, com vrias aplicaes: antibactericida, antiinflamatria, analgsica, adstringente, anticongestiva, emoliente, antioxidante, laxativa, expectorante, analgsica,
emenagoga,
hipotensora, purificadora do sangue, imunoestimulante e tnica (ELKINS, 1997). Tambm atribuda ao fruto, ao anticancergena (RODRIGUEZ e PINEDO, 2004).
2.6.1 Caractersticas da planta
A Morinda citrifolia perene, de clima tropical e temperado,freqentemente cresce em reas florestais e em regies costeiras, com cerca de 400 metros acima do nvel do mar (LUBECK e HANNES, 2001; McCLATHEY, 2002; WANG et al., 2002).
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Figura 05: rvore adulta do noni (FONTE:www.sucononi.com)
Figura 06: (A) Fruto verde; (B) de vez, ponto de colheita; (C) maduro, ponto ideal para retirada das sementes. (Fonte: EMBRAPA, 2010)
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2.6.2 Constituio qumica
Segundo pesquisas realizadas por Chan-Blanco et al., (2006), o fruto do noni contm cerca de 90% de gua sendo que os principais componentes da matria seca so slidos solveis, fibras alimentares e protenas. Em quantidade considerveis esto os hidratos de carbono, incluindo quantidades variveis de sacarose, frutose e glicose (JENSEN et al., 2005). A partir do suco do noni, o teor de protena encontrado foi em torno de 11,3% da matria seca e os principais aminocidos encontrados foram o cido asprtico, cido glutmico e isoleucina (CHUNHIENG, 2003). O teor de minerais est em torno de 8,4% da matria seca, sendo os principais: potssio, enxofre, clcio e fosfro. O cido ascrbico e a provitamina A so as principais vitaminas encontradas na polpa. Com relao aos compostos fitoqumicos presentes na polpa do noni, j foram identificados 160 compostos sendo a maioria dos nutrientes, compostos fenlicos, cidos orgnicos e alcalides. Os compostos fenlicos foram descritos como o maior grupo dentro dos micronutrientes funcionais, sendo as antraquinonas, rutinam asperulosido e escopoletina as mais relatadas. Porm, existem diferenas na composio qumica para cada parte analisada, alm do que, a composio fitoqumica completa do fruto, incluindo outras partes alm da polpa, como a casca e a semente, ainda no foi descrita pela literatura atual (CHAN-BLANCO et al., 2006). No fruto maduro foram identificados em torno de 51 compostos volteis incluindo cidos orgnicos, alcois, steres, cetonas e lactonas (CHAN-BLANCO et al., 2006).
2.6.3 Atividade biolgica
Vrios estudos relacionados aos benefcios que o noni pode oferecer ao organismo esto direcionados para a comprovao do que a medicina popular advinda dos Polinsios defende: a preveno e cura de diversas enfermidades atravs da ingesto do fruto, principalmente da polpa do noni. Um dos efeitos mais estudados no noni relativo sua atividade antioxidante, porm com o uso de metodologias pouco aplicveis no Brasil. Zin, Abdul-Hamid e Osman (2002) analisaram a atividade antioxidante de extratos polares e no polares
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das razes, folhas e frutos da M. citrifolia. De acordo com a pesquisa, os extratos no polares das trs partes da planta demonstraram possuir alta atividade antioxidante quando comparados com os antioxidantes clssicos como o -tocoferol e di-tercbutilmetil-fenol (BHT). Estudos relataram que o noni exibe uma atividade relevante na inibio do crescimento de certas bactrias in vitro, como Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Proteus morgaii, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Salmonella e Shigella. Este efeito antibacteriano pode estar relacionado presena de compostos fenlicos presentes na planta, como alizarina, escopoletina e outras antraquinonas (ATKINSON, 1956). J Furuzawa et al., (2003) estudando o potencial profiltico e teraputico contra Sarcoma 180, utilizaram uma substncia rica em polissacarideos chamada Noni-ppt extrada da Morinda citrifolia. Os resultados mostraram que a atividade antitumoral de Noni-ppt produziu a cura em 25% a 45% dos camundongos alognicos A atividade antiinflamatria do noni foi estudada por Li et al. (2003), em que foram investigadas in vitro, a ao antiinflamatria de 24 espcies de plantas australianas e chinesas e observaram que a M. citrifolia em p possui atividade inibitria da enzima cicloxigenase (COX-1). Uma pesquisa feita por Younos et al., (1990), utilizando o extrato aquoso liofilizado das razes da M.citrifolia, investigou a atividade analgsica do noni em camundongos. O extrato da raiz do noni (1,6 mg/kg) mostrou uma significante atividade analgsica semelhante ao efeito da morfina em camundongos. Entretanto alguns estudos encontraram resultados controversos quanto s reais propriedades benficas do consumo de noni. Alguns estudos sugerem que o uso indiscriminado e em altas doses do noni poder ter efeitos deletrios sade. Nesse sentido importante cautela no uso desses produtos e mais estudos com vistas a esclarecer as lacunas ainda existentes quanto as propriedade medicinais e antioxidantes do noni.
OBJETIVOS 3. OBJETIVOS
39
3.1 OBJETIVOS GERAL
Avaliar a atividade antioxidante in vitro e a atividade antifngica da casca, semente e polpa do Noni (Morinda citrifolia Linn.).
3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
Realizar a composio centesimal das distintas partes (cascas, sementes e polpa) do noni;
Quantificar os teores de compostos bioativos (vitamina C, carotenides e fenlicos totais) presentes na casca, semente e polpa do Noni;
Avaliar a atividade antioxidante in vitro de extratos de noni, pelos mtodo de varredura dos radicais DPPH, ABTS e de co-oxidao do -caroteno/ cido linolico.
Analisar a atividade antifngica no extrato aquoso do noni
MATERIAL E MTODOS
40
4. MATERIAL E MTODOS
4.1 OBTENO E PREPARO DAS AMOSTRAS
As amostras de Noni (Morinda citrifolia Linn.) foram adquiridas no municpio de Altos, estado do Piau-Brasil a 31 C 12 21 de latitude e a 400m de altitude, provenientes de hortas domiciliares. O solo local Podzlico Vermelho Amarelo Distrfico com baixa fertilidade natural (P 5 mg/dm, K14 mg/dm, Al 6 mmol/dm, e Ca+Mg 8 mmol/dm) e alta acidez (pH-5,3). A precipitao mdia anual do municpio em torno de 1.297 mm, sendo que cerca de 90% das chuvas se concentram no perodo de novembro a maio. A temperatura mdia anual est em torno de 25C e umidade relativa de 67% situado a 42 km ao nordeste de Teresina.Os frutos foram coletados no perodo de Agosto a Novembro de 2010. Os frutos foram coletados maduros e lavados cuidadosamente com gua destilada antes da separao das partes. O fruto foi subdivido em trs partes: casca, semente e polpa. Aps a separao das partes, as amostras foram trituradas em moinho analtico, acondicionadas em sacos plsticos envolvidos por papel alumnio e armazenados sob congelamento a -18C, por um perodo mximo de 30 dias.
4.2 MTODOS
4.2.1 Anlise da composio centesimal
A composio centesimal foi realizada pela metodologia do Instituto Adolfo Lutz (2005). A determinao da umidade foi feita por gravimetria, com secagem em estufa a 105C at peso constante. O resduo mineral fixo (cinzas) foi determinado a partir da incinerao em mufla a 550C at peso constante. As protenas foram determinadas pelo mtodo de Kjeldahl (micro) (IAL, 2005) utilizando fator de converso nitrognio protena de 6,25. Os lipdeos totais foram obtidos a partir da frao etrea por fluxo intermitente de Soxhlet, utilizando-se hexano P.A como
MATERIAL E MTODOS
41
solvente. Os carboidratos foram obtidos por diferena, subtraindo de 100% do valor das protenas, lipdeos, cinzas e umidade.
4.2.2 Obteno dos extratos aquoso, alcolico e acetnico, e quantificao de slidos totais (peso seco)
Os extratos alcolicos, acetnicos e aquosos foram obtidos de forma seqencial, a partir de 20 g de cada amostra (polpa, semente e casca do noni) previamente trituradas, segundo metodologia de Jardini e Mancini-Filho (2007). Para a obteno dos extratos alcolicos, foram pesados 20 gramas de amostra na qual foi adicionada 100 mL de lcool etlico e submetidos agitao por uma hora para posterior filtrao vcuo. O resduo foi recuperado para obteno do extrato acetnico e aquoso, seguindo o mesmo procedimento utilizado para obteno do extrato alcolico, utilizando-se acetona e gua, respectivamente, como diluente. O preparo e obteno dos extratos seguiram o fluxograma abaixo (Figura 07). Para determinao do peso seco, colocou-se 1mL em triplicata, de cada extrato obtido, em cpsulas de porcelana, previamente taradas, e em seguida o material foi levado estufa a 105 C por 1 hora. Aps secagem as amostras foram resfriadas em dessecador por 30 min, pesadas e anotado o resultado.
MATERIAL E MTODOS
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20g da amostra + 100mL de lcool etlico 1 hora de agitao Filtrao vcuo (usando filtro Whatman n 4)
Sobrenadante (extrato alcolico)
resduo + 100mL de acetona 1 hora de agitao Filtrao vcuo (usando filtro Whatman n 4)
Sobrenadante (extrato acetnico)
resduo + 100mL de gua 1 hora de agitao + Centrifugao (4.000 rpm)
Sobrenadante (extrato aquoso)
resduo
Figura 07: Fluxograma de preparo e obteno dos extratos da polpa, casca e semente do noni, por extrao seqencial.
4.2.3 Compostos fenlicos totais, segundo SWAIN, 1959, adaptada por LIMA, 2008
Foi adicionado em um balo volumtrico de 10 mL, 0,5 mL de amostra, em triplicata, do extrato alcolico, aquoso e acetnico, a 8 mL de gua destilada e 0,5mL do reagente de Follin Denis. Em seguida, a soluo foi homogeneizada e deixou-se em repouso por 3 min. Decorrido esse tempo, acrescentou-se 1mL de soluo saturada de carbonato de sdio anidro. A soluo ficou em repouso por 1 hora e logo aps foram realizadas as leituras de absorbncias em espectrofotmetro a 720 nm. A leitura do branco foi realizada contendo os mesmos reagentes menos a amostra.
MATERIAL E MTODOS
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Utilizou-se como padro a soluo de cido glico, em concentraes variando de 0 a 100 mg/mL. A partir da reta obtida, realizou-se o clculo do teor de fenlicos totais, expresso em mg de cido glico/g de amostra. CURVA PADRO DE CIDO GLICO
0,7 0,6 absorbncia 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 concentrao (mg/L)
Figura 08. Curva de calibrao de cido glico (mg/L)
y = 0,0078x - 0,0185 R = 0,9964
4.2.4 Contedo de carotenides totais segundo AOAC (1998)
A determinao dos carotenides foi realizada segundo AOAC (1998). Preparou-se um extrato com 10 gramas de cada amostra (casca, semente e polpa), 30 ml de lcool isoproplico e 10 ml de hexano. A mistura foi homogeneizada, em seguida, adicionou-se 85 ml de gua e transferida para o funil de separao. Aps 30 minutos de repouso, adicionou-se 10 ml de gua destilada. Em seguida, filtrou-se a mistura. O filtrado foi recolhido em recipiente contendo 5 mL de acetona, o qual foi completado com hexano at completar 50 mL. Procedeu-se a leitura, em triplicata, destes extratos em espectrofotmetro (Coleman 33 D) a 450 nm. Carotenides (mg/100g) = Absorbncia lida x 100 250 x L x W L- largura da cubeta W- quociente original entre a amostra inicial e o volume final da diluio
MATERIAL E MTODOS
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4.2.5 Contedo de vitamina C pelo mtodo de TILLMANS modificado por Benassi e Antunes-1988
Utilizou-se cido oxlico em substituio ao cido metafosfsforico. Pesou-se 10 gramas da amostra e diluiu-se em 100 mL de gua destilada. Aps filtrao, trasnferiu-se 10 mL do filtrado para erlenmeyer de 250 mL. Adicionou-se 10 mL de cido oxlico e titulou-se com DCFI at a colorao rsea persistente . Calculou-se o valor de cido ascrbico pela expresso: mg/100g = (V1 x F x100) ____________________ V2
v1= volume de DCFI usado para titular a amostra v2= volume da amostra F= fator do DCFI
4.2.6 Determinao da atividade antioxidante in vitro dos extratos da polpa, semente e casca do noni
4.2.6.1 Mtodo DPPH O ensaio de captura de radicais DPPH, desenvolvido por Blois (1958) e adaptado por Brand-Willians (1995), tem por base a reduo do radical [2,2 difenil-1pricril-hidrazil (DPPH)], que ao fixar um H (removido do antioxidante em estudo), propicia uma diminuio e absorbncia, permitindo calcular, aps o estabelecimento do equilbrio da reao, a quantidade de antioxidante gasta para reduzir 50 % do radical DPPH. Para a avaliao da atividade antioxidante da polpa, semente e casca do noni, foi adicionado a 1,5 mL de soluo metanlica de DPPH (6X10 -5M) uma alquota de 0,5 mL de cada extrato contendo diferentes concentraes de cada
MATERIAL E MTODOS
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extrato. A leitura de absorbncia foi realizada em espectrofotmetro (coleman 33D) a 517 nm nos tempos de 2, 5, 10, 20 e 30 minutos aps o incio da reao. Todas as leituras foram feitas em triplicata e acompanhadas de um controle (sem o antioxidante). A porcentagem de descolorao do radical DPPH foi calculada de acordo com a frmula:
% de proteo = (Abs controle - Absamostra) / Abscontrole Foi tambm calculado o valor EC50, isto , a concentrao da amostra necessria para inibir 50% do radical.
4.2.6.2 Mtodo ABTS
Consiste em verificar como os antioxidantes so capazes de degradar os radicais livres presentes no meio. Por esse mtodo, inicialmente, gera-se o radical colorido; em seguida, adiciona-se o antioxidante para posteriormente, medir o decrscimo de absorbncia produzido. Sendo que, quanto maior a atividade antioxidante do composto testado, maior ser o decrscimo na absorbncia. Utilizou-se a metodologia descrita por Re et al., (1999) para a formao do radical ABTS+ a partir da reao de 7mM de ABTS com 2,45 mM de persulfato de potssio para concentrao final, incubada temperatura ambiente e na ausncia de luz, por um perodo de 12 horas. Aps esse tempo, a soluo foi diluda em etanol at obter-se 20-80% de inibio do radical comparando-se com a absoro do branco. Foram adicionados 40 L de cada amostra diluda a 1960 L da soluo contendo o radical. A absorbncia foi determinada em espectrofotmetro, a 734 nm, aps 2, 5, 10, 20, 30 minutos de reao. A soluo padro utilizada foi o antioxidante sinttico trolox nas concentraes de 20 a 50 M em etanol (Figura 10). Todas as leituras foram realizadas em triplicata e os resultados expressos em M de trolox por grama de amostra.
MATERIAL E MTODOS
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0,6 Variao de Absorbncia 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0
y = 0,038x - 0,0052 R = 0,999
10 Concentrao (ug/mL)
15
20
Figura 09. Curva de calibrao-resposta da porcentagem de inibio de trolox em etanol (0 a 20 g/mL) frente ao radical ABTS
+
4.2.6.3 Mtodo de co-oxidao do -caroteno/cido linolico
Os procedimentos de anlise foram realizados de acordo com o mtodo descrito por MILLER (1971), que se baseia na oxidao (descolorao) do caroteno em uma determinada emulso. A descolorao observada diretamente em colormetro. Para formar a emulso, foram adicionados 20 L de soluo de caroteno dissolvido em clorofrmio (20 mg/mL), 40 L de cido linolico, 530 mg de emulsificante Tween 40 e 1 mL de clorofrmio (para completar emulsificao). A emulso foi evaporada com nitrognio gasoso. Foram acrescidos posteriormente, 100 mL de gua destilada previamente oxigenada (por trinta minutos). A soluo emulsionada foi diluda at atingir a faixa de densidade tica, entre 0,6 0,7 nm. Em tubos calibrados para leitura no espectrofotmetro, foram tomados 5 mL da soluo emulsionada e adicionados a diferentes volumes de extratos, alm do BHT isolado, nas concentraes de 25, 50, 100, 200 e 400 ppm. Todas as determinaes foram realizadas em triplicata e acompanhadas de um controle, sem antioxidante. Imediatamente aps a adio da soluo emulsionada s substncias antioxidantes naturais e ao BHT, ou seja, no tempo zero (A 0), foram realizadas as leituras de cada tubo em espectrofotmetro, a 470 nm. A seguir, os tubos foram
MATERIAL E MTODOS
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colocados em banho-maria a 50 C e, aps um perodo de duas horas (Af), foram realizadas as leituras das absorbncias. Os resultados foram expressos em porcentagem de inibio de oxidao, conforme o clculo expresso na frmula a seguir: % de Oxidao = X da Abs. amostra1 x 100 X da Abs. controle2 % de Proteo = 100 - % de Oxidao
1
X da diferena das absorbncias de cada amostra (Abs. am i Abs.
amf)
2
X da diferena das absorbncias de cada controle (Abs. ci Abs. cf)
O decaimento da densidade tica do controle (Ac0 Acf) foi considerado como 100% de oxidao. A partir dessa relao, o decrscimo na leitura da absorbncia das amostras foi correlacionado com o controle, desse modo estabelecendo o percentual de inibio da oxidao das amostras antioxidantes. Foi calculado o valor do EC50, isto , a concentrao da amostra necessria para inibir 50% do radical.
4.2.7 Determinao da atividade antifngica
A atividade antifngica dos extratos aquosos da casca, semente e polpa de noni foi avaliada a partir do desenvolvimento de trs importantes fitopatgenos: Aspergillus terreus, Aspergillus japonicus e Penicillium citrinum Todas as linhagens foram cedidas pelo Laboratrio de microbiologia do Ncleo de Estudos, Pesquisa e Processamento de Alimentos (NUEPPA), do Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do Piau. O meio de cultura utilizado no experimento foi o gar Batata Dextrose (BDA), da marca comercial Himedia, sendo preparado conforme instrues do fabricante. A atividade antifngica foi avaliada por meio da inibio do crescimento micelial dos fitopatgenos de acordo com a metodologia proposta por Franzener et
MATERIAL E MTODOS
48
al., (2007). Os extratos aquosos foram incorporados ao meio de cultura BDA ainda fundente (com temperatura aproximada de 100C) de modo a obter-se quatro diferentes concentraes: 1, 2, 4 e 8 mg de extrato por mL de meio de cultura . Aps a solidificao do meio, um disco de miclio de 6 mm de dimetro foi transferido de uma cultura pura de sete dias para o centro da placa. A avaliao foi realizada por meio de duas medies diametralmente opostas das colnias quando o controle (BDA sem adio do extrato) atingiu o mximo de crescimento. O experimento foi conduzido em triplicata de forma inteiramente casualizada.
4.4 TRATAMENTO ESTATSTICO
Neste trabalho os resultados foram expressos como mdia desvio-padro. Para comparao das mdias aritmticas, empregaram-se a anlise de varincia (ANOVA) e o teste Tukey, usando o software Prisma 4.0 (GraphPad). Adotou-se o nvel de significncia de 5% de probabilidade (p<0,05).
RESULTADOS E DISCUSSO
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5. RESULTADOS E DISCUSSO
5.1 COMPOSIO CENTESIMAL
Os resultados da composio centesimal da polpa, semente e casca do noni encontram-se dispostos na tabela 03, na qual se pode observar segundo os valores para umidade, que a gua componente majoritrio no noni, em todas as partes estudadas. O valor da umidade no presente estudo foi de 88,36% 0,22; 68,65% 1,03 e 86,49% 0,36 para polpa, semente e casca respectivamente. Resultados semelhantes, para a polpa do noni, foram encontrados por Chan-Blanco et. al., (2006) e Corria (2010) que quantificaram 90% e 89,44%, respectivamente. O contedo de cinzas variou 0,93% para a polpa e semente a 1,05% para a casca. Tabela 03: Composio centesimal da polpa, semente e casca do noni ( Morinda citrifolia Linn.) Constituintes Umidade Cinzas Protena Lipdeos Carboidratos VET Polpa (%) 88,36 0,22a 0,93 0,03b 2,24 0,04a 0,37 0,01a 8,370,43c 45,77 Semente (%) 68,65 1,03c 0,93 0,26b 2,64 0,03a 0,57 0,01a 27,210,82a 124,53 Casca (%) 86,49 0,36b 1,05 0,13a 2,23 0,4a 0,52 0,07a 9,700,55b 52,40
Valores expressos em mdia desvio padro, n=3 a,b,c Mdias seguidas da mesma letra nas colunas no diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Tukey ao nivel de 5%. VET:Valor energtico total
Os resultados tambm demonstram que no houve diferenas significativas nos valores de protenas e lipdeos referentes s trs partes do fruto analisadas. O teor mdio de protena encontrado para a polpa do noni foi de 2,24% 0,04, valor superior aos encontrados por Shovic e Whistler (2001) e Corria (2010), 0,4% e
50
0,68%, respectivamente. Porm, semelhante ao encontrado por Chunhieng (2003), 2,5%. O teor de protenas das distintas partes do noni est prximo aos de outras frutas tripicais como tangerina (2,49%) e banana (2,69%), e superiores aos de abacaxi (1,45%) e maracuj (0,67%) (GONDIM et al., 2005). Marques et. al., (2008), estudando a composio centesimal da polpa e casca da manga, encontraram para tal fruta valores inferiores de protenas e lipdeos aos encontrados para o noni, sendo que para polpa, os valores de protenas foi de 0,44% e para casca de 1,24%, j o contedo de lipdeos para polpa e casca foi de 0,18% para polpa e 0,44% para casca. Quanto ao teor de protenas e lipdeos presentes na semente do noni, os resultados encontrados foram inferiores aos da semente do maracuj, 12,57% de protenas e 28,12% de lipdeos, de acordo com Jorge et al.,(2009). Ainda na tabela 01, observa-se que o valor energtico total, equivalente a 100 g de amostra, para a polpa e casca forneceram cerca de 45,77 e 52,40 kcal, respectivamente, valores inferiores aos encontrados para semente (124,53 kcal), portanto a polpa do noni considerado de baixo valor calrico.
5.2 VITAMINA C E CAROTENIDES
A tabela 04 apresenta os valores obtidos para vitamina C e carotenides totais das partes do noni (polpa, semente e casca). De acordo com essa tabela, os teores de vitamina C da polpa (23,1mg/100g) foram significativamente (p<0,05) maiores que o encontrado para as outras partes do noni, a semente apresentou o menor contedo de vitamina C, com 1,36mg/100g.
Tabela 04: Teor de vitamina C e carotenides da polpa, casca e semente do noni (Morinda citrifolia Linn.) em mg/ 100g de amostra.
CONSTITUINTES VITAMINA C CAROTENIDES POLPA 23,10,1a 3,90 0,05a CASCA 10,550,34b 3,600,10b SEMENTE 1,360,14c 1,060,10c
Valores expressos em mdia desvio padro, n=3 a,b,c Mdias seguidas da mesma letra nas colunas no diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Tukey ao nivel de 5%.
51
Diferentemente do valor de vitamina C determinado neste trabalho, Barros et al., (2008) e Canuto et al., (2010), verificaram teores para a polpa do noni 105,3 e 51,2 mg/100g, valores. Tais discrepncias nos teores de vitamina C encontrados nos frutos podem estar relacionadas com o grau de maturao dos frutos analisados, alm da metodologia utilizada para quantificao. (Silva et al., 2009) O teor de vitamina C da polpa e casca do noni superior aos de frutas como: aa (10,1mg/100g), bacuri (0,2mg/100g), caj (0,3mg/100g), cupuau (3,3mg/100g), murici (0,3) e tamarindo (0,1mg/100g) (CANUTO et al., 2010). Quanto ao contedo de carotenides, no houve diferena estatstica entre os valores obtidos para a polpa (3,9 mg/100g) e casca (3,60mg/100g) do noni, porm, ambos foram superiores ao teor de carotenides obtidos na semente, que foi de 1,06mg/100g, valor este condizente com os obtidos de amndoas e sementes tpicas do serrado brasileiro (CREPALDI et al., 2001). Melo e Andrade (2010) avaliando os carotenides totais do umbu maduro e semi maduro, encontraram valores de 3,02 e 1,70 mg/100g respectivamente. Lima (2008), encontrou para a polpa do pequi 7,25mg/100g enquanto para a semente um valor de 0,295mg/100g.
5.3 FENLICOS TOTAIS
Os compostos fenlicos tm participao no sabor, na coloraco, na vida de prateleira e na ao do produto como alimento funcional, notadamente
correlacionado com a capacidade antioxidante (CHITARRA; CHITARRA, 2005). Na Tabela 05 esto ilustrados o contedo de fenlicos totais para os extratos do noni, na qual pode-se averiguar que os extratos acetnicos da polpa, casca e semente foram os que obtiveram melhores resultados na extrao de fenlicos. Dentre os resultados dispostos na tabela 04, constata-se que o extrato acetnico da polpa foi o que teve um maior teor de fenlicos, 109,81mg/ 100g, diferente estatisticamente (p<0,05) dos demais extratos. Chan-Blanco et al.,(2007) encontrou no extrato aquoso da polpa de noni 51,1 mg/100g, nesse mesmo estudo foram ainda identificados os compostos fenlicos rutina e a escopoletina como componentes majoritrios. J Barros et al. (2008), encontraram valores superiores
(160,84mg/100g) ao deste estudo, para o extrato aquoso da polpa do noni.
52
Tabela 05: Teores de fenlicos totais (expresso em equivalente de cido glico) presente no extrato aquoso, etanlico e acetnico da polpa, casca e semente do noni (Morinda citrifolia Linn.) Extratos *Teores de fenlicos totais (mg/100g de amostra) polpa Aquoso Etanlico Acetnico 12,75 0,26
c
casca 8,230,13
c
semente 2,910,47c 11,221,63b 28,751,07a
20,33 1,37b 109,812,02a
18,821,26b 76,016,36a
* valores correspondem mdia desvio padro, n=3 a,b,c Mdias seguidas da mesma letra nas colunas no diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Tukey ao nivel de 5%.
ROESLER et al. (2007), analisando frutos do cerrado quanto ao contedo de fenlicos presente em extrato etanlico e aquoso de cada fruta, obteve para os extratos aquosos da polpa da banha de galinha (1,59mg/100g) valor inferior do extrato aquoso do noni (Tabela 05) e para o araticum, 16,91mg/100g. Para o extrato aquoso da semente da banha galinha, o teor de fenlicos foi um pouco superior ao do extrato aquoso da semente do noni (2,91mg/ 100g). Ainda de acordo com ROESLER et al. (2007), para o extrato etanlico da banha galinha, foi encontrado para a polpa (4,68mg/ 100g), araticum
(20,31mg/100g) e para cagaita, valor de 18,31mg/100g, tanto para o extrato etanlico da polpa como da casca. Pode-se inferir de acordo com esses resultados que o extrato etanlico do noni possui teor considervel de fenlicos totais quando comparados a frutos do cerrado.
5.4 DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO
Neste estudo, foi determinada a atividade antioxidante in vitro utilizando-se trs mtodos distintos. Os extratos utilizados foram os aquosos, etanlicos e acetnicos para as trs partes do fruto do noni: polpa, semente e casca.
53
5.4.1 Mtodo -caroteno/ cido linolico
Para a avaliao da atividade antioxidante dos extratos da polpa, semente e casca do noni pelo mtodo -caroteno/ cido linolico, foram utilizados cinco tipos de concentraes diferentes (25, 50, 100, 200, 400 ppm), de tal forma que a reao dos antioxidantes das amostras e do BHT (padro) reagissem com o sistema emulsionado com conseqente descrscimo na densidade ptica em intervalos de tempo, durante 120 minutos. A capacidade antioxidante dos extratos aquosos, etanlicos e acetnicos esto demonstrados na Tabela 06. Pode-se aferir que os trs extratos, principalmente nas concentraes de 100, 200 e 400ppm, apresentaram boa atividade em combater os perxidos formados, comparados com o padro BHT. Observando a tabela 06, pode-se constatar que, relacionando as partes (polpa, semente e casca) do noni, com seus respectivos percentuais de proteo, a menor atividade foi conferida pela polpa, sendo a semente e casca as partes que apresentaram melhores percentuais de proteo da oxidao. Ainda na tabela 06, na concentrao de 400ppm, o extrato aquoso da polpa obteve 7,16% de proteo, 31,69% para o extrato alcolico e 26,17% para o acetnico, valores esses inferiores aos encontrados para a casca, que na mesma concentrao, obteve 17,80%, 54,36% e 58,36% para o extrato aquoso, etanlico e acetnico, respectivamente. Esses valores no diferiram estatisticamente aos obtidos para a semente, sendo 54,59% para o extrato alcolico, 32,19% para o aquoso e 50% para o acetnico. Contudo, pode-se concluir que nas concentraes de 200 e 400 ppm, a porcentagem de proteo foi estatisticamente maior para os extratos acetnicos e etanlicos para todas as partes do noni, ficando a menor atividade antioxidante para o extrato aquoso. Essas diferenas podem estar relacionadas com o fato de que os teores de fenlicos nos extratos etanlicos e acetnicos foram estatisticamente superiores aos encontrados para o extrato aquoso. Lima (2008), avaliando a capacidade de proteo da polpa do pequi, encontrou para o extrato alcolico, na concentrao de 200ppm, 18,3% de proteo, valor este semelhante ao encontrado para o extrato alcolico da polpa do noni (17,74%).
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Em uma pesquisa sobre o potencial antioxidante em vinhos de jabuticaba e uva, pelo sistema -caroteno/ cido linolico, Barros et al.(2010), encontraram expressiva atividade antioxidante em todas as concentraes utilizadas, sendo seu valor mximo de proteo na concentrao de 200ppm. O vinho tinto de jabuticaba obteve 57,7% de proteo e o vinho branco apresentou 65,9%, valores prximos ao do padro BHT(87,14%). Jardini (2007), avaliando a atividade antioxidante em diferentes extratos da polpa e sementes da rom, pelo teste de co-oxidao com -caroteno/ cido linolico, verificou para concentrao de 200ppm, proteo de 6,18% para extrato alcolico da polpa e 14,46% para o da semente, valores significativamente menores aos encontrados para o noni neste estudo (Tabela 06) para o extrato alcolico da polpa e semente. Pelo mesmo mtodo, Giada (2006) observou que, na concentrao de 200 ppm, os extratos aquoso e alcolico da semente de girassol apresentaram uma proteo de 35,1 e 4,2%, respectivamente, aps duas horas de ensaio. A porcentagem de proteo conferida pelos extratos foi menor que o padro BHT (p< 0,05), porm os extratos etanlicos e acetnicos da casca e semente superaram valores de proteo acima de 50%, o que confere a esses extratos relativa atividade em inibir a oxidao.
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Tabela 06: Atividade antioxidante dos extratos aquoso, etanlico e acetnico da polpa, casca e semente de noni (Morinda citrifolia Linn.), pelo mtodo -caroteno/ cido linolico.
% inibio da oxidao Extratos 25 Polpa Aquoso Casca Semente Polpa Etanlico Casca Semente Polpa Acetnico Casca Semente BHT
a,b,A,B,C
Concentrao (ppm) 50
aB
100
aC
200
aB
400
bB
5,450,98
6,130,99
6,651,62
6,701,19
7,160,40bB
8,710,30aB 11,231,10aB 13,361,39aA 17,5617,56bA 17,800,68bA 15,100,71aA 29,460,39aA 30,520,69aA 3,371,32aB 5,941,10aB 1,460,29bB 3,160,33bB 5,351,51bA 43,13c 4,041,32bC 6,591,21abB 30,481,28bA 32,191,38bA 17,740,55aB 31,691,08aB
8,270,81bB 19,630,70abA 31,571,15aA 54,361,24aA 2,030,55bC 7,750,79bB 8,380,78bA 60,51c 4,050,77bB 16,590,91bA 10,881,45bA 75,53c 13,121,14aB 26,171,53aB 35,511,05aA 58,360,69aA 28,071,45aA 50,001,85aA 81,86c 87,56c
12,171,72aA 16,581,22bA 23,171,96abA 35,961,03aA 54,590,54aA
Mdias seguidas de mesma letra, nas colunas, no apresentam diferena estatstica entre si pelo teste de Tukey a 5%; letras minsculas, entre extratos; letras maisculas, entre partes.
De acordo com a Tabela 07, os extratos do noni apresentaram valores variados de EC50, isto , quantidade de antioxidante capaz de reduzir pela metade os radicais livres presentes na soluo, sendo que quanto menor o EC50 maior ser a atividade antioxidante do extrato. Pode-se observar na Tabela 07 que o extrato acetnico da casca (EC50 = 329,35 ppm), seguido pelo extrato etanlico da semente e casca apresentaram melhor atividade antioxidante corroborando com o percentual de inibio observado anteriormente (Tabela 06).
Tabela 07: Capacidade antioxidante (EC50 em ppm) dos extratos da polpa, semente e casca do noni, utilizando o mtodo -caroteno/ cido linolico. EC50 em ppm Extratos Aquoso Etanlico Acetnico Polpa 11.148 633,58 751,97 Semente 677,44 329,35 399,71 Casca 1.814 329,35 329,35
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O coeficiente de correlao linear (r2) obtido para cada extrato, no intervalo de concentrao de 25-400 ppm, encontram-se dispostos na Tabela 08, observa-se que houve correlao linear positiva para todos os extratos, apenas os extratos aquosos obtiveram valores de r2 menores que 0,90. Tabela 08: Coeficiente de correlao linear (r2) obtido dos extratos alcolicos, aquosos e acetnico da polpa, semente e casca do noni (Morinda citrifolia Linn) na avaliao da atividade antioxidante pelo mtodo do -caroteno/ cido linolico. Extrato Concentrao (ppm) 25-400 Alcolico polpa Alcolico semente Alcolico casca Aquoso polpa Aquoso semente Aquoso casca Acetnico polpa Acetnico semente Acetnico casca 0,987 0,990 0,988 0,858 0,862 0,726 0,992 0,990 0,985 r2 obtido
A partir dos resultados obtidos, nas distintas concentraes testadas, pelo ensaio -caroteno/ cido linolico, pde-se traar a curva cintica de degradao do -caroteno e avaliar, a partir disso, a eficcia do antioxidante utilizado para a anlise em intervalos de tempo variveis. As curvas cinticas dos extratos aquosos, etanlicos e acetnicos da polpa, casca e semente do noni esto dispostas nas Figuras 10 a 12, demonstrando a crescente taxa de proteo acompanhada pelo aumento das concentraes.
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100,00 90,00 80,00 70,00 % de proteo 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 25 50 100 200 400 Ext. acetnico Ext. Etanlico Ext. Aquoso BHT
Concentrao (g/mL)
Figura 10: Curva cintica do potencial antioxidante do extrato aquoso, etanlico e acetnico da polpa do noni.
100,00 90,00 % de proteo 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 25 50 100 200 400 Concentrao (g/mL) Ext. acetnico Ext. Etanlico Ext. Aquoso BHT
Figura 11: Curva cintica do potencial antioxidante do extrato aquoso, etanlico e acetnico da casca do noni.
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100 90 80 % de proteo 70 60 50 40 30 20 10 0 25 50 100 200 400 acetonico etanolico aquoso BHT
Figura 12: Curva cintica do potencial antioxidante do extrato aquoso, etanlico e acetnico da semente do noni.
5.4.2 Atividade antioxidante utilizando o radical DPPH
Na avaliao da atividade antioxidante por este mtodo, as substncias antioxidantes presentes nos extratos reagem com o DPPH, que um radical estvel, convertendo-o na sua forma reduzida 2,2-difenil-1-picril hidrazina. O grau de descolorao vai indicar o potencial antioxidante de cada extrato, a habilidade do antioxidante em seqestrar radicais livres ser inversamente proporcional ao valor do EC50, que a quantidade de antioxidante capaz de seqestrar metade dos radicais livres DPPH presentes em soluo. Quanto menor o valor de EC 50 , maior a atividade do antioxidante, menor quantidade de extrato ser necessria para reduzir em 50% do radical livre DPPH. Neste estudo, a capacidade em seqestrar os radicais DPPH foi avaliada utilizando concentraes distintas para cada extrato, variando de acordo com a resposta antioxidante de cada um. Uma curva linear foi obtida entre a concentrao do antioxidante e o seqestro do radical, calculando-se a partir disso, o EC50 de cada extrato. Na Tabela 09 encontra-se, para cada intervalo de concentrao, o coeficiente de correlao linear (r2) obtido para cada extrato, demonstrando uma boa linearidade
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na maioria dos extratos, com valores superiores a 0,90, com exceo dos extratos acetnicos da semente e da casca, que apresentaram r2 um pouco inferior a 0,90. Tabela 09: Coeficiente de correlao linear (r2) obtido dos extratos alcolicos, aquosos e acetnico da polpa, semente e casca do noni (Morinda citrifolia Linn). na avaliao da atividade antioxidante pelo ensaio do radical DPPH . Extrato Alcolico polpa Alcolico semente Alcolico casca Aquoso polpa Aquoso semente Aquoso casca Acetnico polpa Acetnico semente Acetnico casca Concentrao (g/mL) 6,25-75 100-800 25-400 600-1400 50-600 100-1200 200-1200 50-600 50-400 r2 obtido 0,967 0,986 0,827 0,988 0,902 0,900 0,961 0,766 0,788
Conforme disposto na Tabela 10, todos os extratos exibiram capacidade de de seqestro do radical DPPH, o extrato etanlico da polpa de noni foi o que apresentou melhor atividade antioxidante, por varrer o radical com menor quantidade de extrato, seguido pelo o extrato etanlico da casca, acetnico da casca acetnico da semente. Lima (2008), avaliando a capacidade antioxidante do extrato etanlico da polpa e amndoa do pequi, pelo mtodo DPPH, determinou valor de EC50 para a polpa (820,37) menor que o encontrado para a o noni neste trabalho, 0,967. Roesler et al.,(2007), avaliando a capacidade antioxidante de frutas do cerrado brasileiro, encontrou valores de EC50
,
para os extratos aquosos e etanlicos da polpa,
respectivamente, de 879,93ppm e 387,47ppm para cagaita, 1.321,93ppm e 148,82ppm para o araticum e 1328,98ppm e 182,16ppm para lobeira. Jorge et al.,(2009), analisando o extrato etanlico da semente do maracuj, obtiveram EC50 de 113,41ppm.
60
Tabela 10: Capacidade antioxidante, expresso em EC50 (g/mL) dos extratos da polpa, semente e casca do noni (Morinda citrifolia Linn) utilizando o radical livre DPPH. EC50 em g/mL Polpa Extratos Aquoso Etanlico Acetnico 1.401 40,98 507,50 739,67 498,77 108,19 598,9 103,02 105,79 Semente Casca
Nas Figuras 13 a 21 pode-se visualizar a atividade antioxidante dos extratos da polpa, casca e semente do noni, em distintas concentraes, nos tempos de 2, 5, 10, 20 e 30 minutos. Percebe-se que os extratos possuem comportamento diferenciado de acordo com a concentrao usada nos testes, mas de uma forma geral, o decaimento na absorbncia mais evidente nos primeiros cinco minutos de reao, demonstrando que os extratos de noni possuem compostos antioxidantes de ao rpida, caracterstica importante para um bom extrato antioxidante.
0,6 0,5 Absorbncia 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 5 10 15 20 25 30 35
Controle 600 g/mL 800 g/mL 1000 g/mL 1200g/mL 1400 g/mL
Tempo (minutos) Figura 13: Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato aquoso da polpa do noni.
61
0,6
0,5
Controle 50 g/Ml 100 g/mL
Absorbncia
0,4
0,3
200 g/mL 400g/mL 600 g/mL
0,2
0,1
0 0 5 10 15 20 25 30 35
tempo (minutos)
Figura 14: Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato aquoso da semente do noni.
0,6
0,5
Controle 100 g/mL
absorbncia
0,4
200 g/mL
0,3
400 g/mL 800g/mL 1200g/m
0,2
0,1
0 0 5 10 15 20 25 30 35
tempo (minutos)
Figura 15: Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato aquoso da casca do noni.
62
0,6 0,5 Controle Absorbncia 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Tempo (minutos) 6,25 g/mL 12,5 g/mL 25 g/mL 50g/mL 75 g/mL
Figura 16: Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato etanlico da polpa do noni.
0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Controle 50 g/mL 100 g/mL 200 g/mL 400g/mL 600 g/mL
Absorbncia
10
15
20
25
30
35
tempo (minutos)
Figura 17: Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato etanlico da semente do noni.
63
0,6 0,5 Absorbncia 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 5 10 15 20 25 30 Controle 25 g/Ml 50 g/mL 75 g/mL 100g/mL 200 g/mL
Tempo (minutos) Figura 18: Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato etanlico da casca do noni.
0,6
0,5
Controle 200 g/Ml
Absorbncia
0,4
400 g/mL
0,3
800 g/mL
0,2
1000g/mL
0,1
1200 g/mL
0 0 5 10 15 20 25 30 35
tempo (minutos)
Figura 19: Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato acetnico da polpa do noni.
64
0,6
0,5
Controle 50 100
0,4
Absorbncia
0,3
200
0,2
400 600
0,1
0 0 5 10 15 20 25 30 35
tempo (minutos)
Figura 20: Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato acetnico da semente do noni.
0,6 0,5 Controle Absorbncia 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 5 10 15 20 25 30 50 75 100 200 400
tempo (minutos) Figura 21: Atividade antioxidante, pelo mtodo DPPH, do extrato acetnico da casca do noni.
65
5.4.3 Atividade antioxidante pelo mtodo ABTS+
O resultado da avaliao da atividade antioxidante pelo mtodo ABTS geralmente expressa como valor TEAC (Atividade Antioxidante Total Equivalente ao Trolox), o qual definido como a concentrao de Trolox que apresenta o mesmo percentual de inibio que uma concentrao de 1mM do composto de referncia. Muitos trabalhos divergem quanto aos tempos usados para medir a reao. Tempos mais longos so mais utilizados do que os tempos mais curtos, isso porque os antioxidantes alimentares no reagem to rapidamente com o radical, a medida em um tempo muito curto poderia subestimar o valor de TEAC. Van Den Berg et al.,(1999) explicam que o uso de tempos mais longos se justifica pelo fato de que certos antioxidantes seguem uma reao bifsica frente ao radical ABTS, com uma fase inicial rpida e outra fase considerada lenta.
Tabela 11: Capacidade Antioxidante Total (TEAC) dos extratos aquoso, alcolico e acetnico da polpa, casca e semente do noni (Morinda citrifolia Linn) pelo mtodo ABTS+ expressos em mM de trolox/ g de amostra fresca,
Valor de TEAC (mM trolox/g amostra fresca) Extratos Polpa 2 b 1,020,04 5 b 1,070,04 10 b 1,120,04 0,520,04
e
15 20 1,130,57b 1,150,57b 0,550,05e 0,570,04e 1,030,02c 1,050,02c
30 1,170,00b 0,600,05e 1,090,01c
Alcolico Semente 0,420,03de 0,460,06c Casca Polpa Aquoso Semente Casca Polpa Acetnico Semente Casca
abc
0,930,03 0,100,20
0,960,04 0,170,01 0,230,01
1,000,04c 0,220,00g 0,280,01f 0,230,03fg 1,510,02 0,620,05d 0,630,04d
0,250,01f 0,270,01fg 0,290,01fg 0,310,01f 0,250,02f 1,550,03 0,340,01f 0,240,01g 1,600,02 0,370,01f 0,270,01g 1,670,02
0,170,00
0,130,02fg 0,180,02 1,330,03 0,470,03 0,510,04

d
1,440,03
0,540,06 0,570,05
0,700,02d 0,740,02d 0,790,02d 0,670,06d 0,700,05d 0,740,05d
Mdias seguidas de mesma letra, nas colunas, no apresentam diferena estatstica entre si pelo teste de Tukey a 5%.
Na Tabela 11 esto expressos os valores TEAC dos extratos de noni. O extrato acetnico da polpa apresentou maior atividade antioxidante (p<0,05) em
66
todos os tempos, com TEAC variando de 1,33mM 0,03 no tempo 2 minutos a 1,67nM 0,03 no tempo de 60 minutos. Ao contrrio de Jurequi et al., (2007) que quantificaram um TEAC de 3,48mol/g de amostra. Na Tabela 11, tambm pode ser visto que o extrato alcolico da polpa e da casca no tempo de 30 minutos apresentaram atividade antioxidante. Valores prximos aos de frutos como pequi TEAC = 0,95mM/ g, (Lima, 2008) e superiores aos de frutos como bacuri e cupuau, TEAC =0,6 (Canuto et al. 2010). Villao et al., (2006) encontraram valores de TEAC de 1,98 mM/g para o cido glico; 1,01 mM/g para o cido cafico; 0,99 mM/g para a epicatequina; e 1,83 mM/g para a procianidina B2. Demonstrando que os extratos alcolicos da polpa e casca apresentam atividade antioxidante comparvel a padres de cidos fenlicos puros. O extrato aquoso da casca polpa e semente apresentaram os menores valores de TEAC e inferiores (p<0,05) em relao aos extratos alcolicos e acetnicos. Provavelmente os compostos antioxidantes presentes nesses extratos possuam baixa reatividade com o radical ABTS. Por isso a importncia da realizao da atividade antioxidante de matrizes alimentares por distintas metodologias. Villao et al., (2006), descrevem que mesmo padres de cidos fenlicos puros como os cidos sirngico, vanlico, p-cumrico e a procianidina B3 no possuem atividade antioxidante com o radical ABTS. Nas Figuras 23, 24 e 25 so visualizadas as curvas cinticas da atividade antioxidante dos extratos de noni de acordo com o tempo de reao. Percebe-se que o padro trolox reage rapidamente com os radicais livres e aos dois minutos j estabiliza, enquanto os extratos mesmo reagindo com os radicais nos primeiros dois minutos continuam a degradar aps esse tempo at os 30 minutos de reao.
67
0,8 0,7 0,6 0,5 CONT Al. POL AL.CAS 0,4 AL.SEM 0,3 0,2 0,1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 TROLOX
Absorbncia
Tempo (min)
Figura 22: Curva cintica da atividade antioxidante de extratos alcolicos da polpa, casca e semente do noni.
0,8 0,7 CONT 0,6 AQ.POL AQ.CAS AQ.SEM TROLOX
Absorbncia
0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 5 10 Tempo 15 (min) 20 25 30 35
Figura 23: Curva cintica da atividade antioxidante de extratos aquosos da polpa, casca e semente do noni.
68
0,8 0,7 0,6 CONT AC.POL 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 AC.CAS AC.SEM TROLOX
Absorbncia
Tempo (min)
Figura 24: Curva cintica da atividade antioxidante de extratos acetnicos da polpa, casca e semente do noni.
5.4.4 Atividade antifngica
Para realizao da atividade antifngica, apenas o extrato aquoso foi utilizado devido ao provvel efeito inibidor que o extrato acetnico e etanlico poderiam exercer sobre as cepas utilizadas. Os resultados dos testes de suceptibilidade dos fitopatgenos Aspergillus terreus, Aspergillus japonicus e Penicillium citrinum ao extrato aquoso da polpa, casca e semente do noni esto esquematizados nas Tabela 10, 11 e 12. Nelas pode-se observar a porcentagem de inibio de cada patgeno para o extrato aquoso de cada parte do noni.
69
Tabela 12: Taxa de inibio do crescimento micelial de Aspergillus terreus sobre ao do extrato aquoso da polpa, casca e semente do noni . em diferentes concentraes.
Concentrao (mg de extrato/ mL de meio) 0,0 1,0 2,0 4,0 0,0 1,0 2,0 4,0 0,0 1,0 2,0 4,0 Mdia de crescimento micelial (cm) 3,7 4,0 3,7 3,0 3,7 3,65 3,45 2,6 3,7 3,7 3,6 3,2 Taxa de inibio (%) Sem atividade Sem atividade 18,91 1,35 6,75 29,72 Sem atividade 2,70 13,5
Aspergillus terreus
POLPA
CASCA
SEMENTE
De acordo com a Tabela 12, na concentrao de 4 mg de extrato/ mL de meio, o extrato aquoso da casca foi o que obteve maior taxa de inibio para Aspergillus terreus, praticamente 30,00%, seguido pela polpa e semente. Em concentraes menores, no houve inibio significativa do fitopatgeno.
Tabela 13: Taxa de inibio do crescimento micelial de Penicillium citrinum sobre ao do extrato aquoso da polpa, casca e semente do noni . em diferentes concentraes.
Concentrao (mg de extrato/ mL de meio) 0,0 2,0 4,0 8,0 0,0 2,0 4,0 8,0 0,0 2,0 4,0 8,0 Mdia de crescimento micelial (cm) 2,3 2,0 2,0 1,8 2,3 2,1 2,0 1,9 2,3 2,1 2,2 2,0 Taxa de inibio (%) Sem crescimento 13,04 21,73 8,6 13,04 17,39 4,34 8,6 13,04
Penicillium citrinum
POLPA
CASCA
SEMENTE
Na Tabela 13, pode-se constatar que na concentrao de 8mg/mL, os extratos aquosos da polpa foram os que demonstraram maior taxa de inibio para Penicillium citrinum, valor aproximado ao obtido pelo extrato aquoso da casca
70
(17,39%). A semente apresentou a menor taxa de inibio dentre os extratos testados.
Tabela 14: Taxa de inibio do crescimento micelial de Aspergillus japonicus sobre ao do extrato aquoso da polpa, casca e semente do noni . em diferentes concentraes.
Aspergillus japonicus Concentrao (mg de extrato/ mL de meio) 0,0 2,0 4,0 8,0 0,0 2,0 4,0 8,0 0,0 2,0 4,0 8,0 Mdia de crescimento micelial (cm) 8,5 6,2 6,1 5,5 8,5 6,7 6,5 6,4 8,5 7,0 6,8 5,7 Taxa de inibio (%) 27,05 28,23 35,29 22,35 23,47 24,70 17,64 19,62 32,94
POLPA
CASCA
SEMENTE
A espcie Aspergillus japonicus foi a que apresentou maior sensibilidade aos extratos aquosos do noni. A maior taxa de inibio foi para os extratos aquosos da polpa e semente na concentrao de 8mg/mL. As taxas de inibio nas demais concentraes para Aspergillus terreus (1 e 2mg/L), Aspergillus japonicus (2 e 4mg/mL) e Penicillium citrinum (2 e 4mg/mL) foram semelhantes para cada parte estudada, porm, relativamente inferiores taxa de inibio encontrada para as concentraes maiores, de 4mg/mL para Aspergillus terreus e 8mg/mL para Penicillium citrinum e Aspergillus japonicus. Martins et al. (2010), avaliando a capacidade antifngica do extrato oleoso de alho roxo (Allium sativum L.), observaram 100% de inibio dos fungos Aspergillus nger e Penicillium spp. em concentraes de 0,07812% e 0,03906%,
respectivamente. Chalfoun et al.(2004), mostram o efeito in vitro de leos essenciais dos condimentos alho, canela, cravo e tomilho testados em concentraes de 500, 1000, 1500 e 2000mg/mL e do leo de cravo nas concentraes de 200, 400, 600 e 800mg/ml, sobre o desenvolvimento micelial dos fungos Penicillium spp., Aspergillus nger, Eurotium repens, constataram uma inibio total do leo de canela sobre os
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fungos testados, os leos de tomilho e alho tiveram o mesmo efeito nas concentraes mais altas, o cravo inibiu o desenvolvimento dos fungos a partir da concentrao de 600mg/mL, exceto o fungo Penicillium spp. que foi verificado na concentrao de 800mg/mL. O extrato aquoso da casca semente e polpa do noni mostraram relativa atividade antifngica para os fitopatgenos: Aspergillus terreus, Aspergillus japonicus e Penicillium citrinum, entretanto acredita-se que com uso de maiores concentraes dos extratos sero obtidos maiores taxas de inibio desses fitopatgenos.
CONCLUSES
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6. CONCLUSES A polpa, casca e semente do noni possuem um alto teor de umidade, quantidade significativas de carboidratos e protenas e apenas quantidades traos de lipdeos; As distintas partes do noni apresentaram teores variveis dos compostos bioativos (vitamina C e carotenides totais), a polpa se destacou como maior fonte de vitamina C. J com relao ao teor de carotenides totais, tanto a polpa como a casca se constituem em boas fontes desse nutriente; Os teores de fenlicos totais presentes no noni, no extrato acetnico, foram superiores aos encontrados nos outros extratos aquoso e etanlico, porm, ambos obtiveram teores de fenlicos totais superiores aos encontrados para muitas frutas tpicas do serrado brasileiro; Na avaliao da atividade antioxidante in vitro, todos os extratos apresentaram expressiva atividade antioxidante, variando-se de acordo com a parte do noni e ou extrato testado. No houve uma relao direta entre a atividade antioxidante pelos trs mtodos utilizados. No mtodo do -caroteno/ cido linolico a melhor atividade antioxidante foram obtidos pelos extratos etanlicos e acetnicos da casca e semente do noni, O extrato alcolico da polpa teve uma maior atividade antioxidante pelos ensaios DPPH e ABTS, neste ultimo mtodo se destacou tambm o extrato acetnico da polpa; Demonstrando que a polpa do Noni possui elevada capacidade em combater os radicais livres de DPPH e ABTS. A casca, polpa e semente do noni possuem capacidade antifngica frente aos fitopatgenos estudados (Aspergillus terreus, Aspergillus japonicus e Penicillium citrinum), com melhor atividade inibitria para o fungo Aspergillus japonicus, demonstrando que o extrato aquoso do noni pode ser uma alternativa para o combate de pragas em plantas atravs da inibio dos referidos fitopatgenos e uma substituio ao uso de pesticidas qumicos.
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1 Atividade Antioxidante in Vitro e Antifúngica Do Noni (Morinda Citrifolia L.)

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ADRIANA BARBOSA COSTA

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE in vitro E ANTIFNGICA DO NONI ( Morinda citrifolia L.)

ADRIANA BARBOSA COSTA

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE in vitro E ANTIFNGICA DO NONI ( Morinda citrifolia L.)

ADRIANA BARBOSA COSTA

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE in vitro E ANTIFNGICA DO NONI ( Morinda citrifolia L.)

Comisso julgadora da dissertao para obteno do grau de Mestre:

________________________________________________ Prof. Alessandro de Lima Orientador/Presidente

________________________________________________ Elma Regina Silva de Andrade-Wartha 2 examinador

________________________________________________ Reginaldo Almeida da Trindade 3 examinador

Teresina, 12 de Abril de 2011.

Palavras-chave: noni, compostos bioativos, atividade antioxidante, atividade antifngica.

por um antioxidante e sua formao 31 32

Tabela 01 Tabela 02 Tabela 03

2.1 OS RADICAIS LIVRES

2.2 ESTRESSE OXIDATIVO

2.3 COMPOSTOS ANTIOXIDANTES

FONTE: (Adaptado de BIANCH E ANTUNES, 2003)

secundrios tm sua ao no bloqueio da decomposio dos perxidos e

2.3.1 Mecanismos de ao dos antioxidantes

2.3.2 Antioxidantes dietticos ou naturais

FONTE: BIANCHI e ANTUNES, 1999.

2.3.2.1 Vitamina C (cido ascrbico)

2.4 COMPOSTOS FENLICOS

2.4.1 Flavonides e cidos fenlicos

Figura 01: Estrutura qumica dos principais tipos de flavonides.

Figura 02: Estrutura qumica dos principais cidos fenlicos.

2.4 .2 Mtodos utilizados na avaliao da capacidade antioxidante

Figura 03: Estabilizao do radical ABTS perssulfato de potssio.

por um antioxidante e sua formao pelo

Figura 04: Estabilizao do radical livre DPPH.

2.5 ATIVIDADE ANTIFNGICA DE PLANTAS

2.6.1 Caractersticas da planta

Figura 05: rvore adulta do noni (FONTE:www.sucononi.com)

2.6.2 Constituio qumica

2.6.3 Atividade biolgica

3.1 OBJETIVOS GERAL

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Analisar a atividade antifngica no extrato aquoso do noni

4.1 OBTENO E PREPARO DAS AMOSTRAS

4.2.1 Anlise da composio centesimal

Sobrenadante (extrato alcolico)

Sobrenadante (extrato acetnico)

resduo + 100mL de gua 1 hora de agitao + Centrifugao (4.000 rpm)

Sobrenadante (extrato aquoso)

y = 0,0078x - 0,0185 R = 0,9964

4.2.4 Contedo de carotenides totais segundo AOAC (1998)

4.2.6.2 Mtodo ABTS

0,6 Variao de Absorbncia 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

y = 0,038x - 0,0052 R = 0,999

4.2.6.3 Mtodo de co-oxidao do -caroteno/cido linolico

X da diferena das absorbncias de cada amostra (Abs. am i Abs.

X da diferena das absorbncias de cada controle (Abs. ci Abs. cf)

4.2.7 Determinao da atividade antifngica

4.4 TRATAMENTO ESTATSTICO

5.1 COMPOSIO CENTESIMAL

5.2 VITAMINA C E CAROTENIDES

5.3 FENLICOS TOTAIS

(160,84mg/100g) ao deste estudo, para o extrato aquoso da polpa do noni.

semente 2,910,47c 11,221,63b 28,751,07a

20,33 1,37b 109,812,02a