UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERU

FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA

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ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

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Presentado al: ING.JAIME CLAROS CASTELLARES Facilitador del curso `` CONTROL DE CALIDAD
PRESENTADO POR AMARO QUISPE, Henderson CASAS DE LA CRUZ, Nick DIAZ VIVANCO, Giancarlos LLANCO APARCO, Vaneza NOLASCO LEON,Luis

HUANCAYO -.-

PER

2012

ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

RESUMEN

La investigacin tiene como objetivo conocer los fundamentos, variables, instrumentos y aplicaciones de la espectroscopia de fluorescencia, que en nuestro caso se realizara en la Facultad de Ingeniera Qumica de la Universidad Nacional del Centro del Per. Para lo cual se investig en artculos cientficos sobre la espectroscopia de fluorescencia. La espectroscopia de fluorescencia es un mtodo muy utilizado en mediciones analticas y en la investigacin cientfica, especialmente en bioqumica y biomedicina. Las dos razones principales por las que se masific el uso de esta tcnica espectroscpica son: 1) su gran sensibilidad y 2) el alto nivel de evolucin alcanzado tanto por los instrumentos requeridos, como por los fluorforos, fuentes, monocromadores diseados para aplicaciones especficas. Las variables que afectan la fluorescencia son: Rendimiento cuntico, rigidez estructural, Ph, temperatura y disolvente. Siendo las aplicaciones ms utilizadas en anlisis bioqumicos, mdicos, qumicos y de investigacin de compuestos orgnicos. Tambin se ha utilizado para diferenciar los tumores malignos de piel de los benignos. La bsqueda de infromacion nos permitio conocer una de las tecnologas del control de calidad como es la espectroscopia de fluorescencia.

OBJETIVOS: OBJETIVOS GENERALES: Conocer los fundamentos, instrumentos que se utilizan, variables y todas las reas donde es aplicada la espectroscopia de fluorescencia. OBJETIVOS ESPECFICOS: Investigar los fundamentos de la espectroscopia de fluorescencia. Investigar las variables que afectan la fluorescencia. Investigar los instrumentos que se utilizan para el anlisis de fluorescencia. Investigar las aplicaciones de la espectroscopia de fluorescencia.

4. LUGAR DE EJECUCIN DEL PROYECTO. Curso Control de Calidad en la Facultad de Ingeniera Qumica de la Universidad Nacional del Centro del Per ubicado en el distrito de El Tambo, provincia de Huancayo, departamento de Junn.

5. JUSTIFICACIN:

Debido al poco o nulo conocimiento de la espectroscopia de fluorescencia por

parte de los alumnos de la Facultad de Ingeniera Qumica. Conocer la espectroscopia de fluorescencia ampliara nuestros conocimientos

sobre la utilizacin de nuevas tecnologas para el control de calidad.

6. CONOCIMIENTO GENERAL DEL TEMA: 6.1. REVISIN BIBLIOGRFICA (ANTECEDENTES).

E.Folch (Universidad del Centro Educativo Latinoamericano Rosario Argentina 2007) La determinacin de hierro en arroz. Aplicacin de la Espectroscopia de Fluorescencia de Rayos X (FRX) y Espectrometra de Emisin Atmica (ICP-AES) E. Rosero, E. Solarte, A. Fernndez, E. Pea y M. Pea (Universidad de PamplonaColombia 2008) - Deteccin De Nitrgeno En Un Humedal Artificial De Flujo Subsuperficial Utilizando Mtodos Espectroscpicos De Fluorescencia Y Reflectancia. L. Sarmiento, V. Lubes y L. Echevarra (Departamento de Qumica, Universidad Simn Bolvar, Caracas-Venezuela 2009) Caracterizacin ptica Del SistemaVanadio (III)Fenantrolina En Solucin.

Y. Vitta, A. Fernndez y P. Campns (Universidad Central de Venezuela, Facultad de Ciencias-Venzuela 2009) Determinacin Selectiva De Clorofila a Por Fluorescencia Molecular

ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA: La luz puede ser absorbida y emitida por ciertos compuestos y a este proceso se lo denomina luminiscencia. Existen dos tipos de luminiscencia: la fluorescencia y la fosforescencia. En la fluorescencia el tiempo entre la absorcin y emisin de la luz es del orden de 10-8 segundos, mientras que el proceso de fosforescencia es mucho ms lento y toma alrededor de 10-3 a 1 segundo en ocurrir. As, la fluorescencia dura nicamente mientras dura el estmulo, es un fenmeno virtualmente instantneo, mientras que la fosforescencia puede durar hasta minutos luego de desaparecido el estmulo. La espectroscopa de fluorescencia es un mtodo muy utilizado en mediciones analticas y en la investigacin cientfica, especialmente en bioqumica y biomedicina. Las dos razones principales por las que se masific el uso de esta tcnica espectroscpica son: 1) su gran sensibilidad y 2) el alto nivel de evolucin alcanzado tanto por los instrumentos requeridos, como por los fluorforos diseados para aplicaciones especficas. An cuando una de las aplicaciones ms utilizadas de la fluorescencia es el marcaje de macromolculas (como una alternativa al marcaje con istopos radiactivos), puede ser usada por ejemplo para realizar estudios de dinmica molecular, anlisis estructural de protenas, cuantificacin de iones en compartimentos celulares, microscopa, anlisis de potencial de membrana, interacciones entre macromolculas.

TEORA DE LA FLUORESCENCIA MOLECULAR

FIGURA N 1: Relajacin vibracional y conversin interna y externa

Fuente: http://www.ugr.es/~decacien/Planes/Quimica/Plan%201997/temarios/671111darchivos/fundamentos/SEMINARIO%203.PDF

Normalmente, el tiempo de vida media de una especie excitada es breve porque hay diversas formas en las cuales un tomo o una molcula excitada liberan su exceso de energa y se relajan a su estado fundamental. [1] La relajacin vibracional, sealada por las flechas onduladas cortas entre los niveles de energa vibracionales, tiene lugar durante las colisiones entre molculas excitadas y las molculas del disolvente. Durante estas colisiones el exceso de energa vibracional se transfiere a las molculas del disolvente en una serie de etapas como se indica en la figura. La ganancia de energa vibracional del disolvente se refleja en un ligero incremento de la temperatura del medio. La relajacin vibracional es un proceso tan

eficiente que el tiempo de vida promedio de un estado vibracional excitado es de 10-15 s aproximadamente. Tambin puede ocurrir el relajamiento no radiante entre el nivel vibracional inferior de un estado electrnico excitado y el nivel vibracional superior de otro estado electrnico. Este tipo de relajacin llamado algunas veces conversin interna, se ilustra por las flechas onduladas largas. [2] En la figura se ilustra el otro proceso de relajacin: la fluorescencia. Se puede observar que las bandas de radiacin son producidas cuando las molculas fluorecen debido a que las molculas electrnicamente excitadas se pueden relajar a cualquiera estados vibracionales del estado electrnico fundamental. De igual forma que las bandas de absorcin molecular, las bandas de fluorescencia molecular estn formadas por una multitud de lneas espaciadas tan estrechamente que son muy difciles de resolver. El camino ms probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida media del estado excitado. Por tanto, si la desactivacin por fluorescencia es rpida con respecto a los procesos sin radiacin, se observa tal emisin. Por otro lado, si un camino sin radiacin tiene una constante de velocidad favorable, la fluorescencia no tiene lugar o es menos intensa. La fotoluminiscencia est limitado a un nmero relativamente pequeo de sistemas que incorporan caractersticas estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de desactivacin sin radiacin se reduzca hasta el punto que la reaccin de emisin puede competir cinticamente. Se observa que las bandas de fluorescencia molecular estn formadas principalmente por bandas que tienen longitudes de onda ms largas y, por tanto, energas menores que la banda de radiacin responsable de su excitacin. Este desplazamiento hacia longitudes de onda mayores se llama desplazamiento de Stokes. [4]

En aquellos casos en los que la radiacin absorbida sea emitida sin cambio en la longitud de onda (misma energa) se conoce como radiacin deresonancia o resonancia fluorescente. Debido a que las diferencias de energa entre los estados vibracionales es aproximadamente el mismo, tanto para el estado fundamental como para el excitado, la absorcin, o espectro de excitacin, y el espectro de emisin o fluorescencia de un compuesto frecuentemente aparece como una imagen especular de uno a otro con una sobreposicin que ocurre en la lnea de resonancia.
FIGURA N 1: Relajacin vibracional y conversin interna y externa

Fuente: http://www.ugr.es/~decacien/Planes/Quimica/Plan%201997/temarios/671111darchivos/fundamentos/SEMINARIO%203.PDF

VARIABLES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA Rendimiento cuntico

El rendimiento cuntico o la eficacia cuntica de la fluorescencia es simplemente la relacin entre el nmero de molculas que emiten fluorescencia respecto al nmero total de molculas excitadas. Las molculas altamente fluorescentes, por ejemplo, la

fluoresceina, tienen eficiencias cunticas que, en ciertas condiciones, se aproximan a la unidad. Las especies no fluorescentes tienen eficiencias que son prcticamente cero.

TABLA N1 Efecto de la sustitucin en la fluorescencia del benceno

Rigidez estructural

Empricamente se encuentra que la fluorescencia est particularmente favorecida en molculas que poseen estructuras rgidas. Por ejemplo, las eficacias cunticas para el fluoreno y el bifenilo estn prximas a 1'0 y 0'2, respectivamente, bajo condiciones similares de medida. La influencia de la rigidez tambin tiene importancia en el aumento de la fluorescencia de ciertos quelatantes orgnicos cuando estn formando un complejo con un ion metlico. Por ejemplo, la fluorescencia de la 8-hidroxiquinolena es mocho menor que la de su complejo con zinc: Leary 210. [1]

Temperatura y disolvente

La eficacia cuntica de la fluorescencia disminuye en muchas molculas con el aumento de la temperatura, ya que el aumento de la frecuencia de las colisiones a temperatura elevada hace aumentar la probabilidad de desactivacin no radiante ( conversin externa ). Una disminucin en la viscosidad del disolvente tambin aumenta la probabilidad de conversin externa y produce el mismo resultado. Efecto del pH

La fluorescencia de un compuesto aromtico con sustituyentes cidos o bsicos en el anillo depende normalmente del pH. Tanto la longitud de onda como la intensidad de emisin son probablemente diferentes para la forma ionizada y no ionizada del compuesto. Por lo tanto ser muy frecuente en los mtodos fluorimtricos el control estricto del pH. [3] Efecto de la concentracin La potencia de la radiacin fluorescente F es proporcional a la potencia radiante del haz de excitacin que es absorbido por el sistema. F = K' (P0 - P) Donde P0 es la potencia del haz incidente sobre la disolucin y P es su potencia despus de atravesar la longitud b del medio. La constante K' depende de la eficacia cuntica del proceso de fluorescencia. Con objeto de relacionar F con la concentracin c escribimos la ley de Beer as:

INSTRUMENTACIN PARA LA MEDIDA DE LA FLUORESCENCIA Y DE LA FOSFORESCENCIA Un monocromador selecciona una longitud de onda de excitacin, y la fluorescencia se examina con un segundo monocromador el cual se coloca de manera que forme un ngulo de 90 con la luz incidente. Fuentes

En la mayora de las aplicaciones se necesita una fuente ms intensa que las lmparas de volframio o de deuterio utilizadas para la medida de absorcin. Esto se debe, como qued demostrado anteriormente a que la magnitud de la seal de salida, y por tanto la sensibilidad, es directamente proporcional a la potencia de la fuente P0. Normalmente se utiliza una lmpara de arco de xenn o de mercurio. Filtros y Monocromadores

En los fluormetros se utilizan tanto los filtros de interferencia como los de absorcin, mientras que los espectrofluormetros estn equipados con monocromadores de red. Detectores

La seal de fluorescencia tpica es de baja intensidad, por tanto, se necesitan factores de amplificacin altos para estas medidas. Los tubos fotomultiplicadores son los ms utilizados como detectores en instrumentos de fluorescencia sensibles. Cubetas

Para medidas de fluorescencia se utilizan tanto cubetas cilndricas como rectangulares fabricadas con vidrio o ms normalmente con slice. [5]

6.2. CARACTERIZACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. 6.2.1. CARACTERIZACION: Nulo conocimiento sobre la espectroscopia de fluorescencia como medio para el

control de calidad, en nuestra facultad. El inmenso campo de aplicaciones de la espectroscopia de fluorescencia.

6.2.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA: 6.2.2.1. PREGUNTA GENERAL. Cules son los fundamentos de la espectroscopia de fluorescencia y sus

aplicaciones como un medio para el control de calidad? 6.2.2.2. PREGUNTAS ESPECFICAS: En que se basa la espectroscopia de fluorescencia? Cules son las aplicaciones de la espectroscopia de fluorescencia?

Cmo nos ayuda la espectroscopia de fluorescencia en el control de calidad?

7. HIPOTESIS:

Los conocimientos que se adquirirn sobre espectroscopia de fluorescencia constituirn para los estudiantes una fuente importante de informacin por ser una herramienta indispensable en los estudios de anlisis qumico.

8. PROGRAMA DE ACCIONES:

CRONOGRAMA DE ACCIONES Descripcin de las Acciones a Realizar Periodo de Tiempo Acciones Ao 2012 O X X N X X

Elaboracin del Proyecto Recopilacin Bibliogrfica

9. RECURSOS: Recursos propios econmicamente. 10. PRESUPUESTO Y CALENDARIO DE GASTOS:

ACTIVIDADES

Identificacin del proyecto de investigacin (diagrama de Ishikawa). Identificacin general de objeto de estudio. Identificacin general de objeto especifico de estudio Formulacin del problema general.

SEMANAS(OCTUBRENOVIEMBRE 2012) SEM SEM #2 SEM #3 SEM #1 #4 S. 3.00

S. 2.00 S. 1.50

S. 1.00

Formulacin del problema especfico. Formulacin del objetivo general. Formulacin del objetivo especfico. Formulacin de la hiptesis general. Formulacin de la hiptesis especifico. Servicios de TICs Servicios de Adquisiciones Servicios de Materiales de Escritorio TOTAL POR SEMANA PRESUPUESTO GENERAL

S.0.50 S.1.00 S.1.50 S.1.00 S.0.50 S.3.00 S.2.50 S.3.50 S.3.00 S.7.50 S.1.50 S.9.00

S.21.00

11. FUENTES DE REFERENCIA:

[1]. [2]. [3].

bioweb.uv.es/bioqumica/Documentos/MetBioqcaI/Tema%203A.pdf http://www.uned.es/cristamine/mineral/minbas_mrc.htm http://www.ugr.es/~decacien/Planes/Quimica/Plan%201997/temarios/671111d-

archivos/fundamentos/SEMINARIO%203.PDF [4]. ESPECTROSCOPA DE FLUORESCENCIA INDUCIDA POR LSER EN

CLULASA. Silva-prez1 et al Preparatoria Salvador Allende, Instituto de Educacin Media Superior del Gobierno del Distrito Federal, 07469 Mxico D. F [5]. www.uam.es/personal_pdi/ciencias/mvelez/.../TecAvanFluoI.pdf

[6]. Tesis Espectroscopia De Fluorescencia Laser En Leucocitos De Humano Austin Silva Prez Maestro En Ingeniera Biomdica [7]. ESPECTROMETRA DE FLOURESCENCIA DE RAYOS X Carmen Oralia Pizarro y Alejandro Albert O Camacho Dvila, Facultad de Ciencias

Melndez

Qumicas ,Universidad Autnoma de Chihuahua [8]. http://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/8250/4/T6rayosX.pdf