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FUNDAMENTOS DE CROMATOGRAFIA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR ITEC- INSTITUTO DE TECNOLOGIA FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

Classificao:

Disciplina: ANLISE DE ALIMENTOS INTRODUO A MTODOS CROMATOGRFICOS

PROFESSOR: JESUS SOUZA

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CROMATOGRAFIA PLANAR

1 - CROMATOGRAFIA EM PAPEL
Compostos hidrossolveis, cidos orgnicos e ions metlicos Princpio: partio (solubilidade) Quantidade de amostra necessria 10-3 a 10-6 g

Cromatografia de Papel 2. Cromatografia em Camada Delgada

1.

Tipos: ascendente, descendente, bidimensional F.M. - Sistema de solventes F.E. - Celulose (papel Whatman) Mtodos de deteco: fsico-qumicos Anlise qualitativa: Rf (fator de reteno) - problema : reprodutibilidade Anlise quantitativa: Densitometria e extrao dos solutos

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1 - CROMATOGRAFIA EM PAPEL

2 - CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

CCD - Cromatografia de Camada Delgada, tambm conhecida por Cromatografia de Capa Fina ou cromatografia de placa PLC Planar Chromatography (Cromatografia Planar) TLC- Thin Layer Chromatography: Usada para descrever uma tcnica clssica, no sofisticada que era/ predominantemente feita manualmente e avaliada por meio visual

2 - CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

2 - CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

A adsoro depende: natureza qumica do adsorvente

Mtodo rpido (20-40 min.) Uso de diversos agentes cromognicos Maior sensibilidade que C.P. (10-9 g) Grande gama de compostos pode ser analisada Mtodo simples e barato F.M. - sistema de solventes F.E - Adsorventes (slica, alumina, celite, amido) Mtodos de deteco: Densitometria e fsico-qumicos Princpio: Adsoro (polaridade)
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rea de superfcie/ tamanho da partcula porosidade da partcula -atividade --> stios ativos Critrios para escolha da fase mvel: analitos devem ser solveis diferentemente no deve haver reao entre analitos/FM e FM/FE

Requerimento da amostra:: detectvel no cromatograma solvel na FM estvel luz, oxignio, solvente, no ser voltil
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ANALISES EM CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

HPTLC HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY Instrumental TLC usada para descrever uma tcnica moderna, instrumental e de alta performance, onde a avaliao feita atravs de equipamentos e software

VISUALIZAO NORMAL

9 SOB LUZ UV VISUALIZAO

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Aplicao da amostra em placas CCD

Posio da cuba:
A cuba deve ser colocada de modo a no receber luz solar direta, em local com temperatura estvel e bancada a mais nivelada possvel. Quando o trabalho estiver sendo feito com substncias fotosensveis, o cromatograma deve ser corrido no escuro..

Comparao
CCD

CP Vantagens: tcnica simples no requer instrumentao sofisticada baixo custo

Vantagens: maior sensibilidade mais rpido > repetabilidade < difuso > faixa de aplicao reveladores reativos permite aquecimento

Derivatizao ps-cromatogrfica:
Se as substncias na placa no forem ativas em UV, a absorbncia ou fluorescncia pode ser gerada pela imerso ou spray de reagentes adequados, chamados reveladores. Imerso para derivatizao indicada para: Aumentar a reprodutibilidade em determinaes quantitativas Aumentar a proteo ambiental/higiene industrial
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Desvantagens: uso limitado alargamento de banda-difuso Desvantagens pouca alternativa de reveladores degradao de compostos lbeis devido
grande superfcie de exposio dificuldades na quantificao
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Evitar contaminao do ambiente de trabalho

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CROMATOGRAFIA EM COLUNA

Cromatografia em coluna
Aberta (colunas de vidro, inox, poliestireno, etc)

Cromatografia de Gasosa Cromatografia em Lquida 3. Cromatografia em Fluido Supercrtico

1. 2.

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Cromatografia em coluna
Fechada CLAE CG FSC

Coluna Aberta Extrao em fase solida (SPE)

OBJETIVOS:

Reduzir o nvel de interferentes. Minimizar o volume final de amostra a fim de maximizar a sensibilidade na analise instrumental. Fornecer a frao de analito em solvente compatvel com as peculiaridades da tcnica instrumental a ser empregada. Servir como filtro, removendo particulados da matriz.
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Vantagens da SPE em relao a LLE

Utilizao (modos de operao) da SPE

Concentrao do analito (enriquecimento): Passar atravs do cartucho um grande volume de amostra a fim de aprisionar somente o analito, deixando passar solvente e interferentes. Em seguida eluise o analito com pequeno volume de solvente. Isolamento do analito (Clean-up): Isolar o analito de interesse dos interferentes da matriz. Isolamento da matriz: Reter na fase slida os interferentes da matriz, em vez de o analito de interesse (o qual passa direto com o solvente da amostra). Estocagem da amostra: Evitar o transporte de grandes volumes de amostra (anlise de amostras que se encontram em local distante do laboratrio analtico).

Mais rpida. Reduo do consumo de solvente. Eliminao de emulso. Enriquecimento de traos. Alto potencial para automao.

ESQUEMA DE UM SISTEMA PARA SPE

FASES SLIDAS MAIS COMUNS - SPE

Amostra leos vegetais e manteiga Frutas e vegetais Leite humano Sangue
Plasma

Cartucho C 18 Sep-Pak ENV+ poliestireno divinilbenzeno, RP-C 18 Florisil C 18 Empore politetrafluoroetileno,Sep-Pak Vac C18, OASIS
HLB

Slica
ENV+, Bondesil ENV, Bondesil LMS, Bondesil PPL, Bondesil C18, Abselut Nexus, OASIS, OASIS HLB, Chromabond EASY e Strata X. OASIS HLB C 18

Figura 1: Esquema de um cartucho de SPE operando no modo de pr-concentrao seguida de clean-up de amostra. A) ativao e condicionamento do cartucho; B) aplicao da amostra, com reteno do(s) analito(s) e dos interferentes; C) troca de solvente e eluio dos interferentes; D) troca de solvente e eluio do(s) analito(s).

Vinho Mel

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CROMATOGRAFIA GASOSA
Modalidades e Classificao
FM = Lquido Cromatografia Lquida (CL) Cromatografia Gasosa (CG)

CROMATOGRAFIA GASOSA
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por CG ?
Para uma substncia qualquer poder ser arrastada por um fluxo de um gs, ela dever ser no mnimo parcialmente solvel nesse gs

FM = Gs

Slida
Em CG a fase estacionria pode ser:

Cromatografia Gs-Slido (CGS) Cromatografia Gs-Lquido (CGL)

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seus constituintes devem ser

VOLTEIS
DE FORMA GERAL: CG aplicvel para separao e anlise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIO de at 300oC e que sejam termicamente estveis.

Lquida

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APLICAES GASOSA:

PRTICAS DA

CROMATOGRAFIA
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CG : equipamento
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Qumica: - Determinao de antioxidantes, nutrientes ou contaminantes em alimentos. Indstria: - Monitorizao de processos industriais. Sade: - Anlises dos constituintes do sangue. - Anlise forense. Ambiente: - Determinao de resduos de pesticidas em produtos alimentares, guas ou esgotos. - Determinao de gases e solventes orgnicos na atmosfera, solos ou rios.
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1 - Reservatrio de Gs e Controles de Vazo / Presso. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatogrfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Tratamento (Amplificao) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador). Observao: em vermelho: temperatura controlada
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CG : equipamento

INSTRUMENTAO
Gs de Arraste
Fase Mvel em CG: NO interage com a amostra - apenas a carrega atravs da coluna. Assim usualmente referida como GS DE ARRASTE

Requisitos:
INERTE: No deve reagir com a amostra, fase estacionria ou superfcies do instrumento. PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionria.
Impurezas tpicas em gases e seus efeitos: H2O, O2
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hidrocarbonetos

oxida / hidrolisa algumas FE incompatveis com DCE rudo no sinal de DIC

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INSTRUMENTAO
Gs de Arraste

INSTRUMENTAO
Parmetros de Injeo
TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser suficientemente elevada para a vaporizao imediata, ms sem decomposio, da amostra

Requisitos:
CUSTO: Gases de altssima pureza podem ser muito caros
CUSTO

B A
PUREZA

A = 99,995 %
C

Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulio do componente menos voltil VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado fsico da amostra COLUNA
empacotada = 3,2 mm (1/4) capilar = 0,25 mm Amostras Lquidas
0,2 L ... 20 L 0,01 L ... 3 L

B = 99,999 % C = 99,9999 %

COMPATVEL COM DETECTOR: Cada detector necessita de um gs de arraste especfico para melhor funcionamento
Seleo de Gases de Arraste em Funo do Detector:
DCT DIC DCE

Amostras Gasosas
0,1 ml ... 50 mL 0,001 ml ... 0,1 mL

He , H2 N2 , H2 e He N2, Ar + 5% CH4

Slidos: convencionalmente, dissolve-se em um solvente adequado e injeta-se a soluo

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INSTRUMENTAO
Microsseringas para Injeo
LQUIDOS Capacidades tpicas: 1 L, 5 L e 10 L

INSTRUMENTAO
Colunas: Definies Bsicas

Microsseringa de 10 L:
mbolo agulha (inox 316)

corpo (pirex)

Microsseringa de 1 L (seo ampliada):

corpo agulha EMPACOTADA = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m

guia mbolo (fio de ao soldado ao guia)

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Recheada com slido pulverizado (FE slida ou FE lquida depositada sobre as partculas do recheio)

Paredes internas recobertas com um filme fino (frao de m) de FE lquida ou slida

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Introduo
Definies.

Cromatografia Liquida de Alta Eficincia CLAE HPLC

Surgiu a partir da cromatografia gasosa; Fatores que afetam o equilbrio:

composio da fase mvel, composio da fase estacionria Temperatura taxa de fluxo

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Introduo
Definies
UtilizaUtiliza -se de instrumentos sofisticados que podem ser totalmente automatizados; Colunas recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase mvel que eluda sob altas presses; Capacidade de realizar separaes e anlises quantitativas e qualitativas;

Introduo
FASE MVEL(FM)
Ser de alto grau de pureza; Dissolver a amostra sem decompor seus componentes; No decompor ou dissolver a fase estacionria; Ter baixa viscosidade; Ser compatvel com o tipo de detector utilizado; Ter polaridade adequada para permitir uma separao conveniente.

FASE ESTACIONRIA(FE)
Ter capacidade mxima de amostra; Dar melhor resoluo na separao da mistura; Ser de fcil introduo na coluna; Produzir pequena queda de presso; Possuir baixo custo;

Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)

Instrumentao Geral
LEGENDAS

Vantagens: Vantagens: rapidez de anlise, alta eficincia, reprodutibilidade sensibilidade

e possibilidade de automao. Limitaes: Limitaes : custo do equipamento, necessidade de operador experiente, ausncia de detector universal, emprega solventes de alta pureza e materiais de alto custo. Aplicaes: Aplicaes : Anlise qualitativa e quantitativa de cidos nuclicos, pesticidas, hidrocarbonetos poliaromticos (HPAs HPAs), ), polmeros, lipdeos, drogas farmacuticas, herbicidas, aditivos, antioxidantes, anlises clinicas, aminocidos, carboidratos, etc.
Bomba

Reservatrio da Fase Mvel Filtro da Linha Injetor Pr-Coluna

Tratamento de Dados

Cromatograma

Analtica de uma coluna cromatogrfica, A tcnica baseada na Coluna habilidade recheada com fase estacionria, separar os componentes da amostra, os quais so dissolvidos na fase mvel que percola pela coluna. Os componentes separados so eluidos at um detector que os quantifica baseado em suas propriedades fsico-qumicas. A resposta do detector Detector um da grfico (area X tempo) com vrios picos, chamado cromatograma. Controlador Bomba A instrumentao Geral em CLAE mostrada acima. A escolha dos componentes do sistema depende das aplicaes individuais:

Sistema de bombas (isocrtico ou gradiente ) A composio do eluente Colunas (analticas, preparativas...) A composio do eluente novaria durante a corrida varia durante a corrida Detectores (seletivos, sensveis...) cromatogrfica cromatogrfica

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Instrumentao

Sistemas de Deteco Tipos de detectores: Absoro:fotomtrico( fixo), espectrofotomtrico ( varivel) espectrofotomtrico por arranjos de diodos (DAD ou PDA) ndice de refrao; Fluorescncia; Espalhamento de Luz; Espectrometria de Massas; Dicrosmo Circular; HPLC com detectores UVEletroqumico Vis so os mais utilizados!!! Etc...

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Fludo supercrtico: Composto confinado, onde a fase liquida e o seu vapor coexistem em equilbrio. Existem vrios compostos que so utilizados como fluidos supercrticos, o mais utilizado o CO2
CROMATOGRAFIA COM FLUIDO SUPERCRTICO

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Princpio do processo

Diagrama de fases do fluido supercrtico

O processo de SFE consiste em dois passos essenciais: extrao e separao. O material a ser extrado colocado num extrator juntamente com o fluido supercrtico em condies de presso e temperatura especficas.

Materiais
Bomba de alta presso Extrator de ao inoxidvel Vlvula micromtrica para amostragem Banho termosttico Manmetro Rotmetro

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Extrao com CO2 supercrtico

Vantagens: Baixa temperatura e presso crtica Menos viscosidade e maior difusibilidade Reutilizao do gs Inerte, no reativo e no inflamvel Baixo custo do gs

Aplicao
Descafeinizao

do caf e ch

Extrao de corantes e antioxidantes Reduo do teor de nicotina do tabaco Extrao de leo de sementes vegetais e frutas oleaginosas Desodorizao e reduo da acidez de leos comestveis Extrao de aromas e fragrncias

Desvantagens: Baixa capacidade de processamento Alto custo do equipamento

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