Aseguramiento de calidad

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

Norma ISO 17025

Bqca. QM Alicia I. Cuesta, Consultora Internacional de la FAO

Objetivos de la clase:
1. Preparacin de medios de cultivo y reactivos. 2. Control de esterilidad de los medios de cultivo y diluyentes. 3. Evaluacin de la calidad de los medios de cultivo: Norma ISO/TS 11133-2:2000

REQUISITO: El laboratorio debe asegurarse que la calidad de los medios de cultivo y reactivos sea apropiada para los ensayos realizados. Este es un punto crtico!

Cmo se asegura su calidad?

Qu necesita un microorganismo para crecer?

1. Medios de cultivo: Son necesarios para el aislamiento, mantenimiento, la reproduccin y la identificacin de los microorganismos. Contienen sustancias nutritivas pH adecuado Deben estar estriles. 2. Incubacin: Depende del metabolismo del microorganismo a cultivar. La atmsfera empleada.(aerobio, microaeroflico, anaerobio) Tiempo. Temperatura.

Medios de cultivos
Clasificacin de medios de cultivo: 1.Segn su estado fsico: lquidos, semislidos y slidos. 2.Segn su finalidad en microbiologa: No selectivos: contienen suficientes nutrientes como para soportar
el crecimiento de gran variedad de microorganismos.

Selectivos: permiten el crecimiento de slo un tipo de

microorganismo.

Enriquecido: son medios no selectivos que se le agrega sustancias

como ser sangre, suero, albmina, etc... Para microorganismos exigentes.

Diferenciales: son medios de cultivo que permiten establecer

diferencias entre diferentes tipos microorganismos.

Medios de cultivo

Los requerimientos de los medios de cultivo son especficos de : la muestra que se analiza.
de los microorganismos a ser detectados.

Los medios de cultivo se preparan:

1. En el laboratorio a partir de sus diferentes componentes. 2. A partir de productos en polvo deshidratados comerciales o 3. Pueden adquirirse medios listos para su uso. Se puede tomar como base el documento ISO 7218:1996(E) Microbiology of food and animal feeding stuff-General rules for microbiological examinations para: -La preparacin y esterilizacin de medios. -Tiempos de almacenamiento recomendados.

Requisitos de los medio de cultivo provistos por el fabricante : Los lotes de medios deben estar debidamente identificados. Cada lote recibido debe ir acompaado de evidencias del cumplimiento de las especificaciones de calidad.

REQUISITO: El fabricante en el momento de la entrega de medio de cultivo debe proveer informacin acerca de las especificaciones de calidad, como mnimo debe incluir lo siguiente:
Nombre del medio y lista de componentes, incluido cualquier suplemento. Fecha de vencimiento del medio. Condiciones de almacenamiento. Control de esterilidad. Control del crecimiento de los microorganismos de inters (target) y de los microorganismos no deseados (no target) y criterios de aceptabilidad. Controles fsicos y criterios de aceptabilidad aplicados. Fecha de emisin de las especificaciones

Manejo de los medios de cultivo:

1. El laboratorio debe registrar la fecha : de recepcin de apertura del envase. de caducidad

2. El almacenamiento debe realizarse en las condiciones apropiadas. Envases: deben estar hermticamente cerrados. (especialmente medios deshidratados) No deben utilizarse medios deshidratados que presenten apelmazamiento o un cambio de color.

Control de calidad del agua destilada

Para la preparacin de medios, soluciones y tampones, debe utilizarse agua destilada que haya sido sometida a controles peridicos que aseguren su calidad. Controles peridicos: Requisitos del agua destilada: -Conductividad. - pH - Contaminacin microbiana - Libre de sustancias bactericidas, inhibidoras o interferentes. -Se debe llevar un registro actualizado de los mismos.

Procedimiento para preparacin de medios de cultivo, diluyentes y reactivos

Los medios de cultivo, soluciones y reactivos deben prepararse, almacenarse y utilizarse de acuerdo con un procedimiento documentado. En dicho procedimiento debe haber una descripcin del equipamiento necesario. El laboratorio debe colocar una etiqueta indicando la identificacin y otros datos en los medios de cultivo y reactivos. Debe haber un registro de preparacin de medios de cultivo y reactivos.

Almacenamiento de los medios de cultivo y diluyentes preparados:

Debe determinarse y verificarse el perodo de validez de los medios preparados en las condiciones de conservacin especificadas. En general los medios preparados se guardan: En heladera no ms de tres meses A temperatura ambiente no ms de un mes en condiciones que impidan que su composicin sea modificada.
Observar cambio del color, evaporacin, la deshidratacin o el crecimiento microbiano.

REQUISITOS Medios preparados por el laboratorio: Se debe verificar (siempre que sea necesario) que los medios de cultivo y diluyentes preparados por el laboratorio tengan las caractersticas adecuadas con respecto a: Recuperacin o supervivencia de los microorganismos de inters.(Productividad) Inhibicin o supresin de los microorganismos no deseados.(Selectividad) Propiedades bioqumicas (diferenciales y diagnsticas) Propiedades fsicas (por ejemplo, pH, volumen). Sea estril.

Medio de cultivo: Parmetros a tener en cuenta para obtener un buen resultado. Agua: recipientes dnde se almacena el agua debe ser inerte. pH: la medida a 25 oC. pH +0.2. ajuste el pH con 1 M NaOH o 1M CLH fundir en el agua hirviente volmenes <500ml. 15 ml de espesor agar en placas petri 90 mm. Secado de placas estufa 25-55 oC (20 min.) o en flujo laminar. Incubacin: las pilas de platos < 6.

Medios listos para su uso:

Todos los medios y diluyentes que se suministren en una forma directamente utilizable o parcialmente completa deben ser validados antes de su utilizacin. Se evala utilizando criterios objetivos del medio respecto a: la recuperacin o supervivencia de los microorganismos de inters la inhibicin o supresin de los microorganismos no deseados tiene que ser cuantitativa. los atributos (por ejemplo: Propiedades fsicas y bioqumicas). Parte de esa validacin es provista por las especificaciones de calidad del proveedor.

Reactivos
EVALUACIN DE LA CALIDAD DE LOS REACTIVOS: El laboratorio debe asegurarse que la calidad de los reactivos utilizados sea apropiada para los ensayos realizados. Ejemplo: Reactivos usados para revelar pruebas bioqumicas Realizo controles positivo y negativo utilizando microorganismos que sean trazables a colecciones de cultivos nacionales o internacionales reconocidas.

Control de las prdidas de volumen durante la esterilizacin: Debe verificarse que no haya prdidas significativas de volumen de los diluyentes durante el proceso de esterilizacin en autoclave. Este punto es especialmente importante en mtodos cuantitativos. El laboratorio debe tener : Un procedimiento documentado. Registro de datos obtenidos realizados en forma peridica. El laboratorio determina el intervalo en el que se efectan estos controles.

Control de las prdidas de volumen durante la esterilizacin

Para la evaluacin de la prdida de volumen de los diluyentes: 1. Colocar un volumen fijo de diluyente en tubos de ensayo o frascos de dilucin. 2. Medir el peso o volumen antes y despus del proceso de esterilizacin en autoclave.

3. Con los datos obtenidos, se efecta el clculo y la inferencia estadstica.

LAVADO DE MATERIAL: Otro aspecto a tener en cuenta es el correcto lavado del material reciclable. El laboratorio de debe contar con un instructivo para esta tarea. Pasos: Descontaminacin material de vidrio. Enjuague y se lavado con agua caliente y extran neutro (diluido al 2%) Enjuague n de veces con agua corriente y luego un n de veces con agua destilada. Eliminar el detergente El material se seca en estufa y se acondiciona para ser esterilizado.

Eliminacin de los reactivos:

Si bien la eliminacin adecuada de los reactivos no es un problema que afecte directamente a la calidad, DEBE REALIZARSE DE ACUERDO CON LA NORMATIVA VIGENTE EN MATERIA DE MEDIO AMBIENTE, SALUD Y SEGURIDAD. Las precauciones a tomar con suplementos conteniendo sustancias txicas se especificarn claramente en cada caso de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Control de esterilidad de los medios de cultivo y diluyentes: Fue efectivo el proceso de esterilizacin de los medios de cultivo y diluyentes? PRUEBA: se incuban en estufa de cultivo. La temperatura y tiempo de incubacin para esta prueba se corresponden con las condiciones usadas durante el ensayo. Se realiza este ensayo sobre el 1% de las placas o tubo del comienzo y 1% de las placas o tubos del final de verter o distribuir los medios o diluyentes. Este procedimiento se realiza por cada vez que se esteriliza un lote de medio de cultivo o diluyente en autoclave o se esteriliza por filtracin.

REGISTRO CONTROL DE ESTERILIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO Y

REACTIVOS

Datos a registrar: Fecha de realizacin del control Medio de cultivo o diluyente Indicacin del proceso de esterilizacin (Ejemplo N correlativo de proceso en autoclave o filtracin) Tiempo de incubacin (en horas) Temperatura de incubacin ( C) Resultado Conforme (SI o NO) Firma del personal responsable de la realizacin del control.

Sntesis parcial
En microbiologa se le da especial nfasis a la calidad de los medios de cultivo y reactivos, tal que aquella sea apropiada para los ensayos realizados. La preparacin y esterilizacin constituyen pasos crticos en el logro de este objetivo. El fabricante en el momento de la entrega de medio de cultivo debe proveer informacin acerca de las especificaciones de calidad.

El laboratorio debe contar con Procedimientos o Instructivos documentados e implementado para : La preparacin y esterilizacin de medios de cultivo y diluyentes La preparacin de reactivos Control de calidad del agua destilada. Lavado de material Control de las prdidas de volumen de los diluyentes durante la esterilizacin en especial para mtodos cuantitativos.

EVALUACIN DE LA CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

El objetivo es definir la: metodologa para evaluar la PRODUCTIVIDAD y SELECTIVIDAD de medios de cultivo utilizados en el laboratorio de microbiologa.

PRODUCTIVIDAD:
Definicin: rendimiento, recuperacin, crecimiento de un microorganismo que se espera que desarrolle en el medio de cultivo. Segn el medio de cultivo, se usa una cepa apropiada de referencia target para evaluar la productividad (ver anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)
EJEMPLO: En un medio de cultivo no selectivo como por ejemplo el PCA se evala el adecuado desarrollo de las cepas target o blanco. En este caso se usan E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 6538 y B. subtilis ATCC 6633

Selectividad:
Definicin: la supresin del crecimiento de un microorganismo que se espera sea inhibido en el medio de cultivo. Segn el medio se usa una cepa apropiada de referencia no-target para evaluar la selectividad (ver anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)
En un medio de cultivo selectivo como por ejemplo Caldo Lauril sulfato (LST) se evala el desarrollo de las cepas target y no target. En este caso las cepas target que se usan son E.coli ATCC 25922, C.freundii ATCC 43864 y las cepas no target Enterococcus faecalis ATCC 29212. Evala reacciones caractersticas: gas y turbidez.

En medios selectivos y/o diferenciales hay que evaluar:

El crecimiento de las cepas target

Hay que prestar atencin tambin a la apariencia, tamao y morfologa de las colonias (especificidad)
El crecimiento de las cepas no-target debe estar en parte o completamente inhibido.

PARA EVALUAR CADA LOTE DE MEDIO DE CULTIVO segn Norma ISO/TS 11133-2:2000 SE PUEDE EMPLEAR LOS SIGUIENTES MTODOS:
a)Pruebas cuantitativas

b) Pruebas semi-cuantitativas

c) Pruebas cualitativas

EVALUACIN DE LA CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

La eleccin del empleo de una u otra metodologa ser considerada en cada caso en particular segn el medio a evaluar, las capacidades y necesidades del laboratorio ver ANEXO B norma ISO/TS 11133-2:2000.

MEDIO DE REFERENCIA
El uso de un medio de referencia especfico es obligatorio en los mtodos de cuantitativos (ver anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)

Para las pruebas semi-cuantitativas o cualitativas, el uso de un medio especfico de referencia o un medio de cultivo que da una la reaccin positiva" ayuda al nterpretar los resultados. El medio de referencia debe ser de conocida buena calidad (por ejemplo ser un medio listo para el uso de calidad asegurada por el proveedor)

Cultivo de trabajo: (segn Instructivo de cultivos de referencia)

Se prepara un cultivo en fase estacionaria de la cepa a partir de la cepa de reserva almacenadas en el laboratorio en un caldo no selectivo. (por ejemplo caldo cerebro corazn)

Productividad:
Para evaluar la productividad de los medios de cultivo slido, semislido o lquidos ya preparados esterilizados, los mismos deben ser inoculados con un microorganismo target apropiado o cultivo de trabajo.

Productividad: Pruebas cuantitativas

Para las pruebas cuantitativas la proporcin de Productividad PR es definido como sigue: PR = Ns /No

donde Ns: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo a probar (obtenido de uno o ms placas) No: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo de referencia definido obtenido de uno o ms placas que debe ser 100 ufc.

Productividad: Pruebas cuantitativas CRITERIO DE CONFORMIDAD: Anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000. All figuran: Los microorganismos Tiempo y temperatura de incubacin Criterios Medio de referencia que debe usarse segn el medio a evaluar. PR debe ser mayor o igual a un valor lmite para que el medio de cultivo sea conforme. En general para que los medios no selectivos como el PCA sea conforme, el PR debe ser a 0,7.

Productividad: Pruebas cuantitativas Ejemplo

Se desea evaluar la productividad del PCA. El medio de referencia usado es agar tripticasa soya (TSA) 1) Ns ( dil -6):140 ufc No ( dil -6): :170 ufc PR = Ns /No PR= 0,8 esto quiere decir que el medio testeado es conforme 2) Ns ( dil -6):100 ufc No ( dil -6): 230 ufc PR = Ns /No PR= 0,4 esto quiere decir que el medio testeado no es conforme en cuanto a su productividad.

Productividad: Pruebas semi-cuantitativas en medios de cultivos slidos Se inocula en forma de estras diluciones del cultivo con ansa calibrada de acuerdo a la figura o modelo. Las placas inoculadas se incuban a temperatura y tiempo que depende del medio de cultivo evaluado y se observa el crecimiento. Se evala la productividad del medio teniendo en cuenta el valor de cada estra con crecimiento.

Productividad : Pruebas cualitativas

Se llevarn a cabo visualmente asignando un score de crecimiento. Score para medios slidos: 0 no hubo crecimiento 1 hubo crecimiento dbil 2 hubo buen crecimiento. Score para medios lquidos: 0 no hubo turbidez 1 hubo turbidez muy tenue 2 hubo buena turbidez

Selectividad:
Para llevar a cabo la prueba de la selectividad, el medio de cultivo selectivo a evaluar y un medio de la referencia se inoculan con un microorganismo y nivel apropiado. Se emplea una suspensin del microorganismo de no-target que contiene 104cfu a 106cfu por ml se inocula en la placa o en el tubo de medio.

Certificado de control de calidad de un no selectivo medio de cultivo

Certificado de control de calidad de un selectivo medio de cultivo

Certificado de control de calidad de un selectivo medio de cultivo

REGISTRO EVALUACION DE MEDIOS DE CULTIVO

La informacin a registrar es: Medio de cultivo evaluado. N ID o N lote de medio evaluado. Fecha de realizacin del anlisis. Cepa usada (Gnero y especie del microorganismo y tipo y N de coleccin). Medio de referencia usado para evaluar la productividad. Medio de referencia usado para evaluar la Selectividad. Resultado de productividad (unidades). Resultado de selectividad (unidades). Medio de cultivo conforme (SI/NO) Personal responsable.

Aseguramiento de calidad de los medios de cultivo Posibles problemas

Anormalidad Falla en la solidificacin del medio slido pH incorrecto Posible causa
Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin Peso incorrecto del agar Agar mal disuelto o incompleta mezcla de los ingredientes

Pobre calidad del agua. Pobre calidad del medio deshidratado. pH medido incorrectamente. Contaminacin externa con qumicos. Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin

Color anormal

Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin pH incorrecto Contaminacin externa. Pobre calidad del agua o del medio deshidratado.

Aseguramiento de calidad de los medios de cultivo Posibles problemas Anormalidad Formacin de precipitado Medio inhibitorio/ Productividad baja Selectividad pobre Posible causa
Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin pH medido incorrectamente Pobre calidad del agua. Pobre calidad del medio deshidratado. Pobre calidad del agua. Formulacin inadecuada Ej.ingredientes y suplementos mal pesados. Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin Pobre calidad del medio deshidratado Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin pH incorrecto. Formulacin inadecuada. Pobre calidad del medio deshidratado. Suplementos agregados incorrectamente Ej: con el medio demasiado caliente o en alta proporcin.

Sntesis parcial
Los medios de cultivos slidos, semislidos y lquidos empleados para la realizar el ensayo deben ser evaluados en cuanto a su productividad, selectividad y reacciones caractersticas. Para ello se han desarrollado pruebas cuantitativas, semi-cuantitativas y cualitativas. Las recomendaciones internacionales de organismos de acreditacin se basan en la Norma ISO/TS 111332:2000. Es importante el uso de cultivos de referencia con adecuada trazabilidad.

Sntesis final
Un punto crtico a tener en cuenta a la hora de implementar y la ISO 17025 y acreditar el laboratorio es la preparacin, esterilizacin y evaluacin de la calidad de los medios de cultivo empleados para realizar el ensayo. Las recomendaciones internacionales de organismos de acreditacin se basan en la Norma ISO/TS 11133-1:2000 y ISO/TS 11133-2:2000. Esto implica una revisin de las prcticas cotidianas realizadas por el laboratorio y a su vez la seguridad que los medios usados son adecuados a la finalidad prevista.