1.- Como se determina el contenido de protenas en alimentos. Explicar detalladamente.

9 ANLISIS DE PROTENAS 9.1 DETERMINACIN DE PROTENAS

9.1.1 Protena cruda. Mtodo de Kjeldahl (AOAC Official Method 2001.11)

Nota: Mtodo digestin en parrilla (boque de calentamiento) usando cobre como catalizador y unidad de destilacin con vapor. Equipo Bchi
DIGESTION:

Pesar de 0.1-0.2g de muestra e introducir en un tubo de Kjeldahl, y agregar 0.15g de sulfato de cobre pentahidratado, 2.5g de sulfato de potasio o sulfato de sodio y 10 mL de cido sulfrico concentrado. NOTA. No colocar el papel. Encender el aparato y precalentar a la temperatura de 360C. Colocar los tubos en el portatubos del equipo Kjeldahl y colocarlo en el bloque de calentamiento. (Ver Fig. 10) Fig.10 Unidad de digestin Kjeldahl. Bchi. Ajustar la unidad de evacuacin de gases con las juntas colocadas sobre los tubos de digestin. (Ver Fig. 11) Fig. 11 Unidad de extraccin y neutralizacin de vapores cidos de la reaccin Kjeldahl
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Accionar la trampa de succin de gases antes de que se produzcan stos. Calentar hasta total destruccin de la materia orgnica, es decir hasta que el lquido quede transparente, con una coloracin azul verdosa. Una vez finalizada la digestin, sin retirar la unidad de evacuacin de gases, colgar el portatubos para enfriar. NOTA. Tener la precaucin de colocarlo adecuadamente, de lo contrario se podra caer. Despus del enfriamiento, terminar la digestin con la tecla stop y desconectar la trampa.
DESTILACIN

En un matraz Erlenmeyer de 250 mL adicionar (segn se indique) 50 mL de HCl 0.1N y unas gotas de indicador rojo de metilo .1% o bien 50 mL de cido brico 4% con indicadores Conectar el equipo de destilacin y esperar unos instantes para que se genere vapor. Colocar el tubo de digestin con la muestra diluida y las sales disueltas en un volumen no mayor de 10 mL de agua destilada, en el aparato de destilacin cuidando de introducir la alargadera hasta el fondo de la solucin. (Ver Fig. 12)

Fig. 12. Unidad de destilacin Bchi. Presionar el botn blanco para adicionar sosa al 36% (hasta 40 mL aproximadamente). Colocar la palanca de vapor en posicin ON hasta alcanzar un volumen de destilado en el matraz Erlenmeyer de 100-150mL, lavar la alargadera con agua destilada, recoger el agua de lavado sobre el destilado. Una vez finalizada la destilacin, regresar la palanca de vapor a la posicin original.
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Titular el exceso de cido (en el caso de recibir el destilado en HCl 0.1N) con una solucin de NaOH 0.1 N. En el caso de recibir con cido brico, con una solucin de HCl 0.1N. Calcular el % de protena considerando las reacciones que se llevan a cabo.
9.1.2 Absorcin a 280 nm (Warburg y Christian, 1941)

Colocar la solucin problema debidamente diluida en una celda de cuarzo del espectrofotmetro, de 1 cm de paso, y determinar la absorbancia a 280 nm, usando como blanco la solucin en que se encuentra preparada la muestra. La concentracin de protena se obtiene por referencia a una curva de calibracin preparada con albmina bovina srica en concentraciones de 50 a 500 g/mL
9.1.3 Mtodo de Biuret (Gornall et al, 1949)

Colocar 1 mL de la solucin de protena adecuadamente diluida en tubos de ensaye perfectamente etiquetados, y adicionar 4 mL del reactivo de Biuret. Mezclar y dejar en reposo 30 min. a temperatura ambiente. Determinar la absorbancia del color violeta producido a 540 nm contra un blanco preparado de la misma manera con 1 mL de la solucin en que se encuentra diluida la muestra. La concentracin de protena se obtiene por referencia a una curva de calibracin preparada con albmina bovina srica con concentraciones de 1 a 10 mg/mL.
9.1.4 Mtodo de Lowry (Lowry et al, 1951))

Colocar 1 mL de la solucin adecuadamente diluida en tubos de ensaye perfectamente etiquetados, y adicionar tomando el tiempo 3 mL del reactivo C preparado recientemente (50 mL de A y 2 de B) Despus de exactamente 10 min adicionar a la mezcla 0.3 mL del reactivo D (1 parte de reactivo de Folin con 1 parte de agua), agitando inmediatamente. Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 min. Determinar la absorbancia del color azul producido a 750 nm contra un blanco preparado de la misma manera con 1 mL de agua en vez de la solucin problema.

La concentracin de protena se calcula a partir de una curva patrn preparada con albmina bovina srica en concentraciones de 10 a 100 g/mL, tratadas de la misma manera con los reactivos.
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9.1.5 Mtodo turbidimtrico (Layne, 1957)

Mezclar 1 mL de la solucin problema con 4 mL de alguna de las siguientes soluciones: cido sulfosaliclico al 2.5% cido tricloroactico al 5%% ferrocianuro de potasio 0.75% y adicionar una gota de cido actico Dejar reposar durante 10 min a temperatura ambiente. Medir espectrofotomtricamente la turbidez a 600 nm, utilizando un blanco con 1 mL de agua tratada de la misma manera. La concentracin de protenas se calcula a partir de una curva patrn preparada con albmina bovina srica en concentraciones de 0.1 a 1.0 mg/mL, tratadas de la misma manera con los reactivos.
9.1.6 Unin a colorantes Mtodo de Bradford (Nielsen, 2003)

Colocar en un tubo de ensaye perfectamente etiquetado, 0.1 mL de la muestra adecuadamente diluida. Adicionar 5.0 mL del reactivo de colorante Azul Brillante de Coomasie G-250. Mezclar perfectamente, en vrtex o por inversin del tubo. Dejar reposar durante 5 min a temperatura ambiente. Lea la absorbancia a 595 nm, frente a un blanco de reactivos. La concentracin de protena se calcula a partir de una curva patrn preparada con una solucin de albmina bovina srica de 1 a 10 mg/mL, tratada de la misma manera que el problema. 9.2 EXTRACCION DE PROTENAS (Osborne y Mendel, 1914) La extraccin de protenas mediante el proceso secuencial desarrollado por Osborne y Mendel en 1914 con base en las diferencias de solubilidad entre las protenas. Las fracciones protenicas que se obtienen son: albminas (solubles en agua), globulinas (solubles en soluciones salinas), prolaminas (solubles en soluciones alcohlicas) y glutelinas (solubles en lcali diluido) 9.2.1 A. Albminas Pesar 100 g de harina desengrasada en un vaso de precipitados de 500 mL, agitar con 250 mL de agua desionizada por 1 h en refrigeracin. Centrifugar a 10,000 rpm por 20

min. Recolectar el sobrenadante y lavar con 200 mL de agua el residuo siguiendo el mismo procedimiento. Unir los sobrenadantes y dializar contra agua por 24 hrs.
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cambiando por lo menos tres veces el agua, finalmente las protenas se liofilizan. El residuo se utiliza para la extraccin de globulinas. 9.2.2 B. Globulinas Agregar al residuo 250 mL de solucin salina (NaCl 0.5M) y agitar por 1 h en refrigeracin. Centrifugar a 10,000 rpm por 20 min, separar el sobrenadante y lavar el residuo siguiendo el mismo procedimiento. Unir los sobrenadantes y dializar contra agua, finalmente las protenas son liofilizadas. El residuo se utiliza para la extraccin de prolaminas. 9.2.3 C. Prolaminas Agregar 100 mL de la solucin alcohlica (etanol al 70%-acetato de sodio 0.5%) al residuo anterior y agitar por 1 h. en refrigeracin. Centrifugar a 10,000 rpm por 20 min. Colectar el sobrenadante y, lavar 2 veces ms el residuo siguiendo el mismo procedimiento. Unir los sobrenadantes y dializar contra agua por 24 hrs. cambiando por lo menos tres veces el agua, finalmente las protenas se liofilizan. El residuo de utiliza para la extraccin de glutelinas. 9.2.4 D. Glutelinas Agregar 100 mL de solucin de etanol al 70%-acetato de sodio 0.5%mercaptoetanol 0.1M al residuo anterior y agitar por 30 min. Separar el sobrenadante y lavar el residuo 2 veces ms con la solucin de etanol-acetato de sodio-mercaptoetanol. Se juntan los sobrenadantes y dializar contra agua.

2. citar algunos mtodos gravimtricos para la determinacin de protenas

Turbidimetra Medicin de la turbidez resultante de la precipitacin de protenas Absorcin en el ultravioleta Se mide la absorbancia a 270nm originada fundamentalmente por los anillos aromticos de triptfano y tirosina. Mtodos de unin a colorantes

DETERMINACIN DE PROTEINAS Mtodo Kjeldahl.- En el trabajo de rutina se determina mucho ms frecuentemente la protena total que

las protenas o aminocidos individuales. En general, el procedimiento de referencia Kjeldahl determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto las no protenas como las protenas verdaderas.

3.- como se puede determinar protenas por mtodos cromatograficos. Detallar

4.- como se determina el contenido de aminocidos esenciales en elimentos. Detallar.

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