Quim. Nova, Vol. 34, No.

4, 665-676, 2011 APLICAES DE CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA PARA O ESTUDO DE POLUENTES ORGNICOS EMERGENTES Carla Grazieli Azevedo da Silva e Carol H. Collins* Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13083-970 Campinas - SP, Brasil Recebido em 12/7/10; aceito em 13/10/10; publicado na web em 18/2/11

APPLICATIONS OF HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY FOR THE STUDY OF EMERGING ORGANIC POLLUTANTS. Emerging organic pollutants (EOP) include many environmental contaminants based on commercial products such as pharmaceuticals, personal care products, detergents, gasoline, polymers, etc. EOP may be candidates for future regulation as they offer potential risk to environmental and human health due to their continual entrance into the environment and to the fact that even the most modern wastewater treatment plants are not able to totally transform / remove these compounds. High performance liquid chromatography is recommended to separate emerging organic pollutants with characteristics of high polarity and low volatility, especially pharmaceuticals, from environmental matrices. Keywords: emerging organic pollutants; high performance liquid chromatography; environmental contaminants.

INTRODUO Produtos qumicos so amplamente utilizados na sociedade moderna, sendo produzidos mundialmente em larga escala para as mais variadas aplicaes. No entanto, uma das desvantagens da produo e utilizao destes est nos resduos que so gerados, sejam eles derivados diretamente das atividades industriais ou produzidos aps seu consumo pela sociedade, que podem impactar de forma negativa o meio ambiente.1 Ao longo dos ltimos anos, agncias ambientais regulatrias dos pases desenvolvidos vm tentando estabelecer procedimentos de caracterizao e controle de substncias prejudiciais ao meio ambiente e mais especificamente sade humana.2 Os chamados poluentes orgnicos, como o agrotxico DDT (diclorodifeniltricloroetano), so um tpico de grande destaque dentro da cincia e tecnologia ambiental, sendo determinados desde os anos 70 em baixas concentraes nas matrizes ambientais.3,4 Atualmente a Agncia de Proteo Ambiental dos E.U.A. (USEPA, United States Environmental Protection Agency) apresenta uma lista com mais de 120 poluentes prioritrios2,5 e a Comisso Europeia sobre Meio Ambiente (European Commission for Environment) designa 132 compostos perigosos ao meio ambiente2,6 sendo 12 deles classificados como as mais txicas substncias conhecidas, os chamados poluentes orgnicos persistentes (POP). POLUENTES ORGNICOS EMERGENTES Poluentes orgnicos emergentes (POE) ou simplesmente contaminantes emergentes referem-se a qualquer composto qumico presente numa variedade de produtos comerciais como medicamentos, produtos de uso veterinrio, embalagens de alimentos, produtos de higiene, agrotxicos, etc., ou ainda qualquer micro-organismo, que podem ser encontrados em matrizes ambientais e biolgicas, que no so usualmente monitorados ou que ainda no possuem legislao regulatria correspondente, mas que apresentam risco potencial sade
*e-mail: chc@iqm.unicamp.br

humana e ao meio ambiente7,8 Como risco potencial sade humana e ao meio ambiente pode-se citar a disfuno no sistema endcrino e reprodutivo de seres humanos e dos animais, abortos espontneos, distrbios metablicos e incidncia de neoplasias malignas, alm da induo de bactrias mais resistentes.9-13 Ao contrrio dos POP, no necessitam ser persistentes para causar efeitos negativos devido entrada contnua desses compostos no meio ambiente, como resultado de processos industriais, descarte de produtos comerciais ou ainda por sua excreo na forma no metabolizada ou metabolizada, sendo lanados diretamente nos corpos dgua ou na rede de esgotos. Tambm podem ser descartados no solo e sedimentos, o que leva contaminao de mananciais superficiais por escoamento e aquferos por infiltrao.14-16 A Tabela 1 traz a listagem das principais classes de poluentes orgnicos emergentes. O grande progresso na instrumentao analtica nos ltimos anos e o desenvolvimento de tcnicas de extrao mais robustas possibilitaram a deteco e identificao de novos compostos em faixas de concentrao mais baixas, contribuindo, assim, para o melhor entendimento do problema de contaminao do meio ambiente.8,17 Dessa forma POE tm sido determinados nas mais variadas matrizes ambientais como guas, efluentes industriais, solos, sedimentos, emisses gasosas, amostras biolgicas (urina, sangue, leite, saliva, tecidos, etc), alimentos e at ovos de pssaros,18 sendo que as matrizes aquosas so as mais analisadas.19-21 Os analitos que mais tm chamado a ateno da comunidade cientfica e, por isso, so os mais estudados, so os princpios ativos de frmacos, substncias classificadas como interferentes endcrinos e substncias contidas em produtos de higiene pessoal, devido ao fato de que at as mais modernas estaes de tratamento de gua e efluentes no apresentam processos de tratamento capazes de degrad-los ou elimin-los completamente, principalmente os POE que apresentam alta solubilidade em gua ou so pouco degradveis, como frmacos polares.11,12,16 CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA APLICADA AO ESTUDO DOS POE As separaes em qumica ambiental geralmente envolvem as duas tcnicas cromatogrficas mais conhecidas: a cromatografia

Reviso

666 Tabela 1. Principais classes de poluentes orgnicos emergentes11,12,14 Classe Produtos farmacuticos Antibiticos (uso humano ou veterinrio) Analgsicos e anti-inflamatrios Exemplos

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clorotetraciclina, eritromicina, sulfametoxazol, lincomicina, trimetoprim cido acetilsaliclico, diclofenaco, paracetamol, cetoprofeno, acetoaminofeno, ibuprofeno diazepam, fluoxetina, carbamazepina, paroxetina benzafibrato, cido clofbrico, cido fenofbrico atenolol, propanolol, metoprolol, betaxolol iopamidol, diatrizoato, Iopromida, Iomeprol etinilestradiol, desogestrel, mestranol almscares nitrados, policclicos e macrocclicos benzofenonas, parabenos N, N-dietiltoluamida triclosano, clorofeno difenil teres polibromados (PBDE) cido etilendiaminotetra-actico (EDTA), cido nitriloactico (NTA) alquilfenis lineares, carboxilados (SPC) e etoxilados (APEO), compostos perfluorados metil-t-butil ter (MTBE) benzotriazois, benzotiazois 17-estradiol, progesterona, testosterona, estrona atrazina, clordano, dieldrin, hexaclorobenzeno benzo[a]pireno, fluoranteno, antraceno, naftaleno 3,3,4,4- tetraclorobifenil (PCB 77), 3,4,4,5-tetraclorobifenil (PCB 81) dietilftalato, dibutilftalato 2,3,7,8-tetracloro-p-dioxina (2,3,7,8-TCDD) anfetaminas, cocana, tetra-hidrocanabinol, 3,4- metilenodioximetanfetamina (MDMA)

Drogas de uso psiquitrico Reguladores lipdicos e seus metablitos -Bloqueadores Meio de contrastes de raio-X Contraceptivos Produtos de higiene pessoal Fragrncias Protetores solares Repelentes de insetos Antisspticos Interferentes endcrinos Retardantes de chama Aditivos industriais Surfactantes (no inicos) Aditivos de gasolina Inibidores de corroso Hormnios naturais Agrotxicos Hidrocarbonetos poliaromticos (PAH) Bifenilas policloradas (PCB) Ftalatos Dioxinas e Furanos Drogas de abuso

detector) ou ainda detectores de maior detectabilidade e seletividade, como o detector por captura de eltrons (ECD, electron capture detector) ou detector de nitrognio e fsforo (NPD, nitrogenphosphorus detector).22 A deteco utilizando espectrmetro de massas (MSD, mass selective detector) e ionizao por impacto de eltrons tornou-se a mais utilizada, devido aos excelentes limites de deteco e s possibilidades de utilizao de softwares de tratamento de dados com bibliotecas contendo milhares de espectros de massas para confirmao das estruturas dos compostos analisados. Este vem sendo o detector mais utilizado para determinao de poluentes orgnicos volteis ou semivolteis por GC.23

Figura 1. Faixa de aplicao da HPLC e GC para determinao de poluentes orgnicos emergentes baseados em suas propriedades fsico-qumicas de polaridade e volatilidade. Adaptado da ref. 22

Mtodos baseados na HPLC so adequados para uma variedade de compostos orgnicos que apresentam polaridade mais alta e volatilidade mais baixa ou ainda elevada instabilidade trmica, caractersticas de alguns POE,22,24 o que pode ser visto atravs da Figura 2.

lquida de alta eficincia (HPLC, high performance liquid chromatography) e a cromatografia gasosa (GC, gas chromatography). Diagramas de polaridade-volatilidade podem esquematizar de forma didtica qual a tcnica de separao a ser utilizada, dividindo os poluentes orgnicos de acordo com suas propriedades fsico qumicas de volatilidade e polaridade.22 A Figura 1 pode ser interpretada da seguinte forma: poluentes volteis e semivolteis, no polares/lipoflicos so frequentemente separados por cromatografia gasosa. As separaes por cromatografia gasosa podem utilizar detectores universais como detector de ionizao por chama (FID, flame ionization

Figura 2. Posio de alguns dos poluentes orgnicos emergentes no diagrama de polaridade v olatilidade. Adaptado da ref. 22

Propriedades fsico-qumicas dos analitos O conhecimento das propriedades fsico-qumicas dos analitos de extrema importncia para evitar problemas na quantificao, que podem estar relacionados com reaes secundrias, com impurezas ou degradaes na sua estrutura durante a aplicao do mtodo analtico. Por exemplo, os antibiticos tetraciclinas podem interagir de forma irreversvel com os ons metlicos residuais presentes nos

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sorventes dos cartuchos de extrao em fase slida base de slica modificada com grupos alquila (C18, C8, etc) e certos metais podem catalisar a abertura do anel de -lactamas. Esse problema pode ser resolvido adicionando-se um agente quelante matriz a ser extrada (Na2EDTA, por exemplo), ou substituindo o sorvente dos cartuchos por material polimrico.25 A solubilidade dos analitos na amostra ambiental e no solvente de eluio, assim como na fase mvel a ser utilizada, tambm merece ateno. Por exemplo, alguns antibiticos formam complexos lipoflicos insolveis em gua quando na presena de ctions de metais alcalinos. Alm disso, os padres das penicilinas sofrem metanlise, quando solubilizados em metanol, devendo ser preparados em acetonitrila ou em outro solvente compatvel.25 Durante a etapa de deteco, quando se utiliza um espectrmetro de massas (MS), pode ocorrer algum tipo de fragmentao caracterstica do analito, dependendo da faixa de pH que se encontra. Por exemplo, a eritromicina em soluo cida apresenta uma perda de massa de 18 Da, correspondente perda de uma molcula de gua.25 Um dos parmetros crticos a serem observados durante a determinao dos POE, principalmente frmacos, o que se refere ao pH da amostra pois, em muitos casos, o pH do meio determina a forma qumica do analito em soluo e, consequentemente, interfere na eficincia da extrao. Por exemplo, o baixo percentual de recuperao do processo de extrao de quinolonas foi melhorado aps acidificao da soluo em pH 2,5. No entanto, importante escolher uma faixa de pH onde tambm no ocorra degradao dos analitos.25 POE com caractersticas cidas, como analgsicos e anti-inflamatrios no esteroidais (diclofenaco, naproxeno, cido acetilsaliclico, etc.) ou bsicas, como frmacos de uso psiquitrico (fluoxetina, carbamazepina, etc.) ou analgsicos (morfina, codena, etc.), necessitam do ajuste do pH da fase mvel, onde seu valor depende do pKa dos compostos a serem analisados.16 A concentrao de tampo recomendada fica na faixa entre 2-20 mmol L-1 para evitar problemas de solubilidade na fase mvel, bem como facilitar o modo de ionizao quando se utiliza o detector MS.16 Mtodos de extrao, limpeza e concentrao dos analitos A etapa de extrao, limpeza (clean-up) e concentrao uma das mais importantes quando se realiza a determinao de POE, uma vez que as concentraes desses analitos nas matrizes ambientais ou biolgicas complexas so baixas, podendo chegar at ng L-1 .16 A extrao em fase slida (SPE, solid phase extraction) atualmente a tcnica mais empregada para amostras lquidas, como matrizes de guas superficiais e efluentes.16,25 Os materiais sorventes dependem das caractersticas de acidez dos compostos analisados. Para antibiticos, medicamentos antifungos e antiparasitrios de uso humano e veterinrio, os materiais sorventes mais utilizados so os cartuchos com sorvente de copolmero divinilbenzeno e Nvinilpirrolidona que, por apresentarem caractersticas de interao mista hidroflica-lipoflica, podem extrair analitos de mdia a alta polaridade, apresentando os melhores percentuais de recuperao.26 Para extrao de analitos com caractersticas mais bsicas, como frmacos de uso psiquitrico (por exemplo, fluoxetina, sertralina, etc.) e -bloqueadores (por exemplo, propanolol, metoprolol, etc.) podem ser utilizados sorventes de copolmero divinilbenzeno e N-vinilpirrolidona modificados com grupos sulfonato, para troca catinica. Para analitos com caractersticas cidas, como frmacos da classe dos anti-inflamatrios no esteroidais (por exemplo, diclofenaco, naproxeno, etc.) podem ser utilizados sorventes com grupos dimetilbutilamina, capazes de realizar troca aninica, ou base de slica modificada com C18.16 Uma alternativa a utilizaco de cartuchos em srie, como utilizados na extrao de 15 frmacos

com caractersticas distintas de acidez (bsicos, neutros e cidos)27 ou na determinao de antibiticos da famlia das -lactamas em amostras de alimentos de origem animal.28 Para eluio dos analitos, so utilizados solventes com caractersticas polares, como acetona, metanol, acetonitrila e acetato de etila.16, 25,26 A extrao em fase slida em linha (on-line solid-phase extraction) aparece como um procedimento promissor devido s vantagens desse tipo de extrao, principalmente devido pequena manipulao de amostra em funo da automao do processo extrativo, o que reduz os riscos de contaminao e o tempo de anlise.22,29 A microextrao em fase slida (SPME, solid phase micro-extraction) inicialmente foi utilizada para separaes por GC. No entanto, essa tcnica de extrao pode ser aplicada tambm HPLC, devido s vantagens que apresenta, como alto poder de concentrao dos analitos sem a necessidade do uso de solventes, sendo utilizada para determinao de antibiticos em amostras de leite e anti-inflamatrios esteroidais em urina.30 A microextrao em fase lquida com a utilizao de membranas de polipropileno (LPME, liquid-phase microextraction) aplicada a amostras aquosas, oferecendo como vantagem a possibilidade de se utilizar uma pequena quantidade de amostra e de solvente extrator. Na LPME, analitos com elevado coeficiente de partio podem atingir elevados fatores de concentrao, uma vez que so transferidos por difuso de um volume de amostra, da ordem de 1-5 mL, para um diminuto volume de extrato (5-50 L).31 Nesse sentido, pode-se variar a relao de volume de amostra e solvente extrator de forma a se obter fatores de concentrao desejveis, de modo que fatores de concentrao de 25000 vezes j foram obtidos a partir da LPME, utilizando membranas de polipropileno de 28 cm de comprimento, na determinao de frmacos antidepressivos em amostras de guas.32 Para matrizes slidas e semisslidas, como material biolgico (tecidos) e alimentos, a extrao por disperso de matriz em fase slida (MSPD, matrix solid phase dispersion) tem sido utilizada. Analitos presentes em tecido animal ou vegetal podem ser extrados utilizando slica com fases ligadas modificadas com grupos alquila (C8, C18) ou base de silicato de magnsio, principalmente para a extrao de analitos de baixa polaridade, como bifenilas policloradas (PCB), bifenilas polibromadas (PBB) e hidrocarbonetos poliaromticos (PAH).33 Para material sedimentar (lodo de estao de tratamento de efluentes, solos, sedimentos de rio, lagos, etc.), a extrao lquido/ slido pode utilizar o extrator Soxhlet ou a extrao por lquido pressurizado (PLE, pressurized liquid extraction), sendo que a extrao por lquido pressurizado, combinada ao pr-tratamento das amostras por liofilizao, apresentou maior eficincia na extrao de frmacos polares em amostras de lodo de uma estao de tratamento de efluentes na Alemanha.34 A extrao sortiva em barra de agitao (SBSE, stir-bar sorptive extraction), utilizando uma barra de agitao magntica revestida com polidimetilsiloxano (PDMS), o qual a fase extratora, apresenta detectabilidade analtica de 50 at 250 vezes maior que SPME, uma vez que so utilizados volumes de revestimentos nas barras de 24 at 126 L, valores bem maiores que os 0,5 L do SPME. O resultado limite de quantificao de ng mL-1.35 Alm disso, essa tcnica no gera resduos e, na teoria, no h perdas do analito durante o processo de extrao. Nesse sentido, essa tcnica tem sido aplicada para determinao de frmacos em amostras biolgicas (sangue, soro, plasma, urina, etc.) e hormnios sexuais em guas com recuperaes de at 100,2% para o interferente endcrino mestranol.36 Fases mveis e fases estacionrias para HPLC As fases estacionrias mais utilizadas na HPLC para separao de compostos orgnicos so do tipo fase reversa (RP, reversed phase),

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com base de slica com grupos C18. Fases estacionrias com grupos C8 podem ser utilizadas para -bloqueadores e antibiticos (tetraciclinas, penicilinas, sulfonamidas e macroldeos).16, 25 As fases mveis utilizadas na RP-HPLC so misturas de metanol:gua (MeOH:H2O) ou acetonitrila:gua (ACN:H2O) com ajuste da fora cromatogrfica e seletividade da fase mvel at se obter resoluo, Rs, suficiente para que ocorra a separao de todos os picos cromatogrficos no mnimo tempo de anlise. A adio de modificadores, como cido frmico, acetato de amnio, amnia, etc., realizada com o objetivo de favorecer o processo de ionizao dos analitos atravs do ajuste de pH do meio, melhorando suas interaes com a fase mvel e a fase estacionria. O controle do pH do meio tambm pode ser realizado atravs do uso de fases mveis tamponadas. Quando se utiliza o detector espectrmetro de massas (MS) e o processo de ionizao por eletronebulizao (ESI, electrosprayionization) tambm se podem utilizar modificadores, com o objetivo de favorecer o processo de ionizao dos analitos.16,25 Detectores para HPLC Os detectores de absoro espectrofotomtrica na faixa do ultravioleta (UV) e por fluorescncia foram inicialmente utilizados nos equipamentos de HPLC para anlise de compostos que absorvem na regio do ultravioleta ou so fluorescentes, incluindo alguns POE como surfactantes ou PAH.22 Algumas publicaes recentes tm empregado a deteco por UV para determinao de antibiticos da classe das fluorquinolonas em matrizes biolgicas (urina e msculo de frango)37 e ambientais (efluente hospitalar)37 ou anti-inflamatrios em efluentes,38 ou o detector de fluorescncia para determinao de produtos veterinrios em amostras de leite bovino,39 por se tratarem de equipamentos de mais baixo custo quando comparados com os HPLC-MS. Porm, os valores dos limites de deteco alcanados para detectores de UV so bem mais altos, na faixa de g L-1 a ng L-1, comparados ao detector MS que consegue atingir limites de deteco da ordem de ng L-1 a pg L-1 , quando utilizado em srie (MS/MS), oferecendo, tambm, a possibilidade de confirmao dos compostos analisados. Para anlises ambientais com o propsito de triagem (screening), com limites de deteco na faixa de concentrao de g L-1, o detector de UV pode ser perfeitamente utilizado ou ainda, quando a concentrao dos analitos na matriz elevada, como o caso das publicaes citadas acima.37, 38 O vasto emprego da HPLC-MS/MS em qumica ambiental16 devido ao fato de que a maioria dos mtodos oficiais da USEPA utiliza esse modo de separao e deteco,24 inclusive para alguns POE que j apresentam mtodo oficial de referncia estabelecido,20,40 devido aos bons limites de deteco, alm da possibilidade de confirmao estrutural dos compostos analisados, combinada robustez do mtodo.41 O modo de ionizao por eletronebulizao o mais utilizado na deteco com espectrmetro de massas (MS) por se tratar de uma forma de ionizao mais verstil para analitos com polaridade mediana a muito polares e pouco volteis, como o caso da maioria dos frmacos, ou analitos termicamente instveis, como alguns antibiticos, quando comparado com o modo de ionizao qumica presso atmosfrica (APCI, atmospheric pressure chemical ionization), que utiliza aquecimento na sonda na faixa de 300-400 oC para a dessoro trmica dos analitos.25 O modo de ionizao dos analitos depende dos tipos de stios, cidos ou bsicos, que as molculas apresentam. Frmacos antiinflamatrios no esteroidais, derivados do cido fenil actico, foram ionizados no modo negativo [M-H]-, com perda tpica de CO2 (m/z 44), produzindo o on benzlico o qual estabilizado pelo efeito de conjugao do anel aromtico. A detectabilidade para frmacos cidos foi testada em ESI e APCI, onde foi aproximadamente 10 vezes

maior utilizando o modo de ionizao ESI quando comparada ao modo de ionizao por APCI.16 O mesmo resultado foi obtido com frmacos utilizados como reguladores lipdicos.16 Frmacos com stios bsicos, como o frmaco de uso psiquitrico carbamazepina e seus metablitos, foram determinados em amostras aquosas utilizando o modo positivo [M+H]+, sendo que a perda caracterstica dos principais metablitos a do grupo HNCO (m/z 43), com detectabilidade maior por ESI do que quando ionizados pelo modo de APCI.16 Os analisadores de massas mais utilizados para deteco dos analitos so o triplo quadrupolo (QqQ) para o modo sequencial (massas em srie), por tempo de vo (TOF, time of flight) e o on trap. O analisador tipo TOF foi empregado na determinao de frmacos (analgsicos, antibiticos, -bloqueadores e antiepilticos) em amostras de guas superficiais, guas subterrneas e efluentes por apresentar maior detectabilidade, faixa dinmica linear e exatido de massa do que os analisadores do tipo triplo quadrupolo (QqQ), porm os melhores limites de deteco foram encontrados para o analisador do tipo QqQ.16 Recentemente, o analisador hbrido tipo quadrupolo-tempo de vo (Q-TOF, quadrupole time-of-flight hybrid analyzer) tem sido utilizado por oferecer melhor resoluo e detectabilidade do que os do tipo quadrupolo convencional, sendo aplicado para identificao e quantificao de metablitos desconhecidos de frmacos.16,22,25 Efeito de matriz Matrizes complexas como guas superficiais ou esgotos domsticos podem exercer efeito de matriz elevado, ocorrendo efeitos que podem diminuir ou aumentar o sinal do analito, principalmente quando se trabalha com detectores de alta detectabilidade como o MS em srie (MS/MS). Isso pode ser resolvido atravs da utilizao de padres internos (PI) com estrutura semelhante dos compostos a serem analisados ou compostos isotopicamente marcados, cuja rea ser comparada nas injees das solues padro e nas injees da matriz para verificar se houve alguma variao nas reas dos compostos devido ao efeito de matriz16,25 (Figura 1S, material suplementar). ALGUNS EXEMPLOS DE DETERMINAO DE POE Produtos farmacuticos Os produtos farmacuticos so a classe de poluentes orgnicos emergentes que mais tm chamado a ateno dos pesquisadores, devido aos nmeros crescentes de utilizao de medicamentos. Esses nmeros so considerados alarmantes em pases desenvolvidos, como o caso da Alemanha, onde o consumo de medicamentos superou (desde 2001) a quantidade de 100 toneladas por ano (Figura 2S, material suplementar).42 A quantidade real de medicamentos consumidos ainda maior, pois nesses dados no esto inclusos medicamentos consumidos sem receiturio mdico ou adquiridos ilegalmente. No caso do Brasil, os nmeros de consumo de medicamentos podem ainda ser maiores, porm ainda no h dados disponveis. A anlise de produtos farmacuticos em amostras ambientais aquosas foi inicialmente realizada utilizando a cromatografia gasosa acoplada ao detector por espectrometria de massas (GCMS). Quando a anlise envolvia frmacos ou metablitos polares, como diclofenaco, ibuprofeno, cido clofibrico, etc., a etapa de derivatizao era necessria.43 No entanto, essa etapa apresenta algumas desvantagens tais como o fato de ser trabalhosa, de contribuir para baixos percentuais de recuperao dos analitos e ao alto custo dos reagentes derivatizantes. Vrios trabalhos recentes43-46 utilizam mtodos analticos baseados na separao por HPLC com deteco por espectrometria de massas em srie com ionizao por ESI (HPLCESIMS/MS) para

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a determinao de frmacos em matrizes aquosas. Tal fato pode ser explicado pela versatilidade desse modo de ionizao, podendo ser utilizado para analitos com polaridades que variam entre mdias e altas, com detectabilidade melhor por ESI do que com APCI.46 Os mtodos desenvolvidos43-46empregando HPLCESIMS/MS conseguem atingir limites de deteco e quantificao na ordem de ng L-1, utilizando extrao em fase slida (SPE) com material sorvente de copolmero divinilbenzeno e N-vinilpirrolidona, com percentuais de recuperao dos analitos que variaram de 41 at 101%, como pode ser visualizado na Tabela 2. Mtodos convencionais de tratamento de efluentes no so capazes de eliminar totalmente os frmacos que chegam s estaes de tratamento de esgotos urbanos. A anlise de efluente tratado de uma planta de tratamento de efluentes na Espanha quantificou a presena de metoprolol, propanolol, carbamazepina, cido saliclico, benzafibrato, ibuprofeno, acetoaminofeno, diclofenaco, naproxen e cido clofbrico na faixa de concentrao entre 0,01-0,69 g L-1, evidenciando que o processo de tratamento de efluentes realizado no foi efetivo para eliminar esses frmacos.44 (Figura 3S, material suplementar). No mesmo trabalho, foi analisada a gua do Rio Ebro, um dos maiores da Pennsula Ibrica, onde os frmacos acetoaminofeno, cafena, carbamazepina, benzafibrato, diclofenaco e ibuprofeno foram quantificados na faixa de concentrao de 9-240 ng L-1.44 Um tpico de interesse dentro do estudo dos POE a separao de frmacos e metablitos com estereoismeros em matrizes ambientais. Frmacos como -bloqueadores adrenergticos e os inibidores de recaptao de serotonina so administrados como misturas racmicas. Porm, esses compostos, quando presentes em amostras de guas superficiais, podem interagir com os organismos vivos devido presena de enzimas quirais desses ambientes. Por exemplo, para humanos, o enantimero (-) de um -bloqueador geralmente 25-100 vezes mais eficiente do que seu enantimero (+) e sua pureza ptica perfeitamente determinada como frmaco. Porm, quando anlises ambientais so realizadas, nem sempre se leva em conta a atividade

quiral dos compostos e anlises enantioespecficas podem indicar possveis interaes desses frmacos e seus metablitos com a biota.47 Separaes quirais podem ser realizadas por vrios mtodos, utilizando a separao por GC, a HPLC e a eletroforese capilar (CE, capillary electrophoresis). Entretanto, analitos polares como os -bloqueadores, por exemplo, necessitam da etapa de derivatizao para serem analisados pela GC, enquanto a CE requer detectores de MS para analitos com concentraes da ordem de g L-1, sendo menos comuns do que equipamentos de HPLC com esse tipo de detector. Dessa forma, um mtodo para anlise de frmacos quirais pode ser obtido empregando-se colunas quirais em HPLC-MS/MS.47 A Figura 3 apresenta a separao enantiomrica de seis -bloqueadores (atenolol, metoprolol, nadolol, solatol, pindolol, propanolol), dois inibidores de recaptao de serotonina (citalopram e fluoxetina), alm de um frmaco utilizado como broncodilatador (salbutamol), utilizando um procedimento para a determinao de frmacos em amostras de esgotos domsticos no tratados e aps o tratamento de efluentes coletados na regio metropolitana da cidade de Edmonton (Canad). A extrao dos compostos foi realizada por SPE com cartuchos de sorvente de copolmero divinilbenzeno e N-vinilpirrolidona, e a resoluo em seus pares de enantimeros foi feita com a fase estacionria (FE) quiral Chirobiotic V ( base de vancomicida de alta pureza, uma glicoprotena macrocclica), em HPLC-ESI-MS/MS. O composto quiral (+)-levobunolol e sua mistura racmica foram utilizados como padro interno.47 As amostras de esgotos domsticos no tratados apresentaram concentraes de -bloqueadores entre 10 e 971 ng L-1 e aps o tratamento de efluentes entre 14 e 664 ng L-1. A anlise enantiomrica indicou que houve transformao enantiosseletiva, onde os frmacos administrados na forma (R)-(+)-atenolol e (R)-()-fluoxetina sofreram racemizao aps serem metabolizados, sendo determinados como mistura racmica nas amostras de efluentes. J o frmaco propanolol, administrado como mistura racmica, sofreu transformao enantiosseletiva, com excesso do enantimero (S)-()-propanolol.

Tabela 2. Resultados para mtodos utilizando HPLC-ESI-MS/MS na determinao de produtos farmacuticos em amostras aquosas Ref. 43 Frmacos paracetamol, trimetoprim, sulfametoxazol, propanonol, eritromicina, dextropropoxifeno tamoxifeno, lofepramina, diclofenaco, cido mefenamico, ibuprofeno, cido clofibrico Ref. 44 acetoaminofeno, cafena, metropolol, cido saliclico, propanolol, carbamazepina, benzafibrato, naproxeno, diclofenaco, ibuprofeno Ref. 45 Ref. 46

cloropromazepina, claritromicina, eritromicina, cloroquinona, closantel, lincomicina, ciprofloxacina, fluoxetina, flufenazida, amoxilina, sulfametoxazol, miconazol, midazolam,cido oleandromicina, tilmicosin, niflumico, proclorperazina, oxitetraciclina, ciclofosfamida, trifluoroperazina, metotrexato, ibuprofeno, salbutamol, trifluoroperidol atenolol, enalapril, diazepam, carbamazepina,furosemida, omeprazol, ranitinida, benzafibrato, cido clofibrico, 17--etinilestradiol, estrona gua tratada Strata X Luna C18 (250 x 2,0 mm com partculas de 5 m) acetato de amnio 20 mmolL-1 com 1% de cido frmico e metanol gradiente 1-20 no foi citado > 60 4 - 13 (n=6) gua de rio e efluente domstico Oasis MCX e LiChrolut EN Luna C8 (50 x 2 mm com partculas de 3 m) cido frmico 0,1%(pH 2) e acetonitrila gradiente 0-1 no foi citado > 70 8 (n=3)

Tipo de matriz Cartucho (SPE) Fase estacionria Fase mvel

gua de rio, torneira e mar Strata X Luna C18 (250 x 10,0 mm com partculas de 10 m) metanol 10 mmol L-1 em acetato de amnio com HCl (pH 6) e cido actico 0,87 mol L-1 gradiente 0,03-0,96 0,08-3,19 60-96 < 10 (n=3)

gua de rio e efluente domstico Oasis HLB Kromasil 100 C18 (250 x 4,6 mm com partculas de 5 m) cido actico 0,5% (pH 2,8) e acetonitrila gradiente 3-15 no foi citado 41-101 2 - 38 (n=3)

Modo de separao LD (ng L-1) LQ (ng L )

-1

Rec. (%) CV(%)

LD: Limite de deteco do mtodo; LQ: Limite de quantificao do mtodo; Rec.(%): Recuperao (%); CV(%): Coeficiente de variao (%).

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triclosano em guas superficiais de lagos e rios com o desequilbrio da cadeia alimentar, devido sua ao txica a certos tipos de algas e organismos aquticos.49 A concentrao mxima permitida de triclosano em produtos de higiene e cuidado pessoal de 0,30% (m/m), de acordo com a Diretiva 76/768/CEE da Unio Europeia, e os rtulos dos produtos devem expressar a quantidade presente nas formulaes.49 Com o objetivo de verificar se a dosagem mxima de triclosano est sendo respeitada e de entender como se d a sua entrada no meio ambiente atravs dos esgotos domsticos, foi utilizado um mtodo para determinao em amostras de cremes dentais, saliva e esgoto domstico49 utilizando HPLC com detector por arranjo de diodos (DAD, diode array detection), uma vez que a molcula do triclosano absorve na regio do UV. O processo extrativo empregado foi extrao por soro em barra de agitao (SBSE) recoberta com polmero polidimetilsiloxano (PDMS). A concentrao de triclosano encontrada em saliva avaliada imediatamente aps a escovao foi de 1,6 mg L-1, e foi 26,5 g L-1 aps o perodo de 12 h, comprovando a presena de triclosano durante esse perodo.49 A Figura 4 mostra o cromatograma dos diferentes tipos de amostras utilizando a calibrao por adio de padro para avaliar o efeito de matriz. O valor de triclosano em creme dental foi de 1284 g L-1, o que corresponde a 0,27% (m/m) do produto, valor abaixo do limite mximo permitido pela Diretiva 76/768/CEE da Unio Europeia.49

Figura 3. Cromatograma (HPLC-MS/MS) da soluo padro 50 ng mL-1 da mistura racmica resolvida para cada um dos frmacos analisados. Coluna: Chirobiotic V (250 x 4,6 mm, com partculas de 5 m), com coluna de guarda nitrlica (10 x 3 mm). Condies cromatogrficas: modo de eluio isocrtico; fase mvel: metanol e soluo aquosa de acetato de amnio 20 mmol L-1 acidificada pH 4 com cido frmico 0,1%, 90:10 (v/v); vazo: 0,5 mL min-1; volume de injeo: 25 L; deteco: MS em srie. Adaptado da ref. 47

Tal fato comprovou a suposio dos autores de que h transformao enantiosseletiva durante o tratamento de efluentes causada pela degradao enzimtica de bactrias, sendo, segundo eles, o primeiro mtodo desenvolvido para determinao de frmacos quirais de classes diferentes em amostras de esgotos domsticos no tratados e aps o seu tratamento.47 Produtos de higiene pessoal Produtos de higiene pessoal como POE so um tpico que tem despertado crescente interesse, devido seu intenso uso mundial como forma de proteger ou melhorar a sade humana e dos animais, pois se sabe que esses produtos chegam at as estaes de tratamento de efluentes em concentraes potencialmente txicas ao meio ambiente onde no so totalmente eliminados.48 O triclosano (2,4,4-tricloro-2-hidroxifenil ter) est presente na maioria dos cremes dentais, antisspticos bucais, sabonetes para profilaxia, desodorantes e desinfetantes domsticos, onde tem ao bactericida de amplo espectro. Tambm pode ser incorporado em polmeros e fibras, sendo encontrado em efluentes tratados na concentrao entre 5-90 ng L-1. Estudos relacionam a presena do
Figura 4. Cromatogramas (HPLC-DAD) obtidos para a anlise de (A) creme dental comercial; (B) saliva imediatamente aps a escovao; (C) saliva 12 h aps a escovao (C); (D1) amostras de esgoto domstico e (D2) efluente tratado. Amostras coletadas na cidade de Lisboa, Portugal. Coluna: Teknokroma ODS-A com grupos C18 (150 x 4,0 mm, com partculas de 5 m). Condies cromatogrficas: modo de eluio isocrtico; fase mvel acetonitrila e soluo aquosa de cido fosfrico 0,1%, 80:20 (v/v); vazo: 1,0 mL min-1; volume de injeo: 20 L; temperatura de anlise: 25 oC; deteco por DAD a 230 nm. Adaptado da ref. 49

Interferentes endcrinos Interferentes endcrinos so substncias qumicas que podem literalmente interferir no funcionamento natural do sistema endcrino de espcies animais, inclusive os seres humanos, causando cncer

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e prejudicando os sistemas reprodutivos. Podem ser de origem antropognica, denominados de xenoestrognios ou biognica, por exemplo, os estrognios presentes no metabolismo animal (estrona, progesterona, testosterona, etc.) e no metabolismo das plantas, os fitoestrognios.9 Os xenoestrognios podem ser representados pelos hormnios sintticos de medicamentos contraceptivos ou utilizados na pecuria animal ou, ainda, substncias produzidas para uso na indstria ou na agricultura, como os agrotxicos (atrazina, lindano, clordano, dieldrin, hexaclorobenzeno, etc.), bifenilas policloradas (PCB), hidrocarbonetos policclicos aromticos (PAH), surfactantes no inicos (alquilfenis), ftalatos, dioxinas e furanos, entre outros,12 que, por apresentarem caractersticas lipoflicas, podem ser determinados em tecidos adiposos, leite materno, esperma e sangue. Os ftalatos representam um dos grupos de interferentes endcrinos mais estudados, devido a sua grande utilizao como aditivos na indstria de polmeros. O bis(2-etil-hexil)ftalato (DEHP) amplamente utilizado para aumentar a flexibilidade do PVC (policloreto de vinila), sendo utilizado na proporo de at 40% m/m.50 Estudos revelam que o DEHP est relacionado a efeitos carcinognicos, mutagnicos e teratognicos, alm de afetar o sistema reprodutivo de humanos e animais com reduo da quantidade de esperma e diminuio da mobilidade dos espermatozoides.50 DEHP e seu metablito mono(2-etil-hexil)ftalato (MEHP) foram determinados em amostras de plasma seminal, a fim de relacionar sua presena com a incidncia de infertilidade em pacientes italianos atravs da extrao lquido-lquido, utilizando uma mistura de solventes (metanol, n-hexano e ter etlico acidificado com cido fosfrico) e posterior separao e deteco por HPLC-DAD.50 Aplicando o mtodo validado, os resultados da anlise de amostras de plasma seminal de 10 pacientes infrteis revelou concentraes na faixa de 0,200-0,570 g mL-1 para DEHP e 0,550-0,950 g mL-1 para MEHP, relacionando a exposio ambiental aos ftalatos estudados com a incidncia de infertilidade masculina (Figura 5).50

frango, pato, coelho, peixe e carneiro) na China, utilizando PLE com posterior limpeza com SPE utilizando cartuchos de amino-propil. A separao foi realizada por HPLC com detector MS em srie e ionizao por ESI. A validao do mtodo foi realizada na faixa de 1,0 at 500 g L-1 pelo procedimento de calibrao externa com padro interno 4-n-nonilfenol, apresentando coeficiente de correlao (r) superior a 0,99.51 A eficincia de extrao foi avaliada pela determinao do percentual de recuperao dos analitos em amostras de carne fortificadas com solues padro (Figura 4S, material suplementar). Foram encontradas concentraes entre 0,27 e 7,08 g kg-1 de bisfenol A, e entre 0,49 e 55,98 g kg-1de nonilfenol em todos os tipos de carnes analisadas. Octilfenol apareceu em concentraes mais baixas (abaixo do LQ), sendo detectado somente em amostras de peixe.51 POE no Brasil No Brasil, a principal fonte de contaminao ambiental das guas se d atravs de esgotos domsticos no tratados, uma vez que a grande maioria dos efluentes urbanos no passa pelo processo de tratamento tercirio para remoo de nutrientes e desinfeco. De acordo com a Pesquisa Nacional de Saneamento Bsico (realizada pelo IBGE, em 2002) 82% desses efluentes so descartados em rios que so utilizados para o abastecimento de gua potvel.52 Um estudo53 com amostras de gua superficial dos rios Atibaia, Ribeiro Anhumas, Capivari e Jundia (Bacia do rio Atibaia), localizados na regio metropolitana da cidade de Campinas, no Estado de So Paulo, em 2006, utilizando a tcnica de SPE para extrao dos analitos e a HPLC com detectores DAD e fluorescncia, revelou a presena de paracetamol, cafena, cido acetilsaliclico, di-n-butilftalato, bisfenol A, 17-estradiol e 17-etinilestradiol nas faixas de concentrao entre 0,005 at 41,7 g L-1 refletindo, assim, o baixo percentual de tratamento da Regio Metropolitana de Campinas, especialmente nas regies onde a densidade populacional mais elevada.53 Um estudo posterior17 com amostras de gua superficial da mesma regio (Bacia do rio Atibaia) e amostras de efluente no tratado da cidade de Campinas, realizado utilizando HPLC com deteco por MS em srie com ionizao por ESI no modo negativo, encontrou valores de estrognios e xenoestrognios, estrona, 17-estradiol, estriol, 17-etinilestradiol, bisfenol A, 4-n-octilfenol e 4-n-nonilfenol, nas faixas de 2,2 at 39ngL-1, sendo que os maiores valores foram encontrados para bisfenol A, que apresentou concentraes que variaram entre 25 at 84 ng L-1, valores que evidenciam a maior detectabilidade e especificidade do detector de massas acoplado ao sistema de separaco por HPLC, que atingiu limites de quantificao da ordem de ngL-1, quando comparada com o detector DAD do estudo anterior.17,53 POE foram estudados em amostras de gua de rio da cidade do Rio de Janeiro,1 onde foram determinados 19 interferentes endcrinos como estrogeno, progesterona, estrona, estradiol, etc., atravs da HPLC acoplada ao detector de MS em srie, ionizao por ESI e extrao por SPE. Os resultados revelaram nveis mais elevados para os fitoestrognios (daidzena, coumestrol e genistena), com valores de at 366 ng L-1, seguidos por progesterona com 47 ng L-1 e de estrognios e seus conjugados com at 7 ng L-1. Os resultados mostraram que os compostos analisados esto ocasionalmente presentes em nveis relativamente altos, indicando que os rios estudados receberam carga de efluentes no tratados de diferentes fontes e/ou o tratamento de efluentes no foi eficiente para sua completa remoo.1 Xenoestrognios foram determinados em amostras de guas superficiais utilizadas para abastecimento na regio metropolitana de Belo Horizonte, em Minas Gerais, usando a HPLC acoplada ao detector de MS em srie, com analisador TOF.54 O perodo de amostragem foi de 1 ano, sendo que foi encontrada a presena de 17 -estradiol,

Figura 5. Cromatogramas (HPLC-DAD) obtidos para amostra de plasma seminal de um paciente infrtil, fortificada com 0,920 g mL-1 de MEHP e 280 g mL-1 de DEHP. Coluna Spherisorb S5 ODS2 com grupos C18 (250 x 4,6 mm, com partculas de 5 m). Condies cromatogrficas: modo de eluio isocrtico; fase mvel acetonitrila e soluo aquosa de cido fosfrico 0,1% (pH 3,0), 90:10 (v/v); vazo: 1,0 mL min-1; volume de injeo: 20 L; temperatura de anlise: 20 oC.; deteco por DAD a 220 nm. Adaptado da ref. 50

Uma forma de contaminao com interferentes endcrinos conhecida atravs da alimentao. Alquilfenis e bisfenol A (BPA) apresentaram elevada toxicidade crnica em testes realizados in vitro e in vivo, alm de serem persistentes no meio ambiente. Octilfenol (OP) e nonilfenol (NP) so amplamente utilizados como surfactantes no inicos em produtos de limpeza, sendo descartados nos esgotos domsticos. O bisfenol A o monmero utilizado na produo de resinas epxi, policarbonatos e como antioxidante de polmeros, que so utilizados em vrias embalagens de alimentos.51 Um dos estudos pioneiros51 na determinao simultnea de octilfenol, nonilfenol e bisfenol A foi realizado em carnes (suna, gado,

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17-etinilestradiol e 4-n-nonilfenol, com concentraes mais altas para o composto 4-n-nonilfenol, que chegou a atingir 1918 ng L-1 , e para o composto estradiol, at 54 ng L-1. Um ponto interessante do trabalho a coleta de amostras de efluentes em diferentes pontos da estao de tratamento, contribuindo assim para o desenvolvimento e melhora nesse processo, visto que foi evidenciado que as etapas de filtrao com areia, floculao, sedimentao e clorao no foram eficientes para remoo completa dos interferentes endcrinos estudados.54 Como forma de monitorar processos de tratamento de efluentes mais eficientes na remoo de POE (nonilfenol, benzafibrato, dibutilftalato e bisfenol A), amostras de esgoto sanitrio e de efluentes de um sistema combinado de tratamento com reator de leito de lodo anaerbio de fluxo ascendente, seguido de ps-tratamento aerbio com filtros biolgicos percoladores, coletadas no Centro de Pesquisa e Treinamento em Saneamento do Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental-UFMG foram analisadas por HPLC acoplada ao detector de MS em srie, com ionizao por ESI, utilizando analisador TOF e extrao por SPE.55 Foi observado que a combinao do tratamento de efluentes por vias anaerbias-aerbias foi suficiente para degradar os POE benzafibrato e bisfenol A. No entanto, os ftalatos apresentaram perfil de mais difcil remoo, mesmo aps o tratamento aerbio.55 O trabalho tambm merece destaque pelo fato de utilizar fenolftalena como padro interno, um reagente de baixo custo e de fcil acesso a qualquer laboratrio de qumica analtica. Estudos de degradao de POE so de extrema importncia para avaliar a cintica de transformao desses compostos, bem como estudar quais so os novos compostos formados e sua potencial toxicidade. Nesse sentido, pode-se citar a utilizao da HPLC combinada ao detector de UV e MS que avaliou a cintica de degradaco do interferente endcrino etinilestradiol utilizando a oxidao por ozonlise.56 TENDNCIAS EM CROMATOGRAFIA LQUIDA APLICADA AO ESTUDO DOS POE As tendncias em cromatografia lquida de alta eficincia aplicada ao estudo dos POE incluem o uso da cromatografia lquida de ultra eficincia (UHPLC, ultra-performance liquid chromatography), a cromatografia lquida bidimensional (LC-LC) e a cromatografia por interao hidroflica (HILIC, hydrophilic interaction chromatography). A UHPLC representa um dos ltimos avanos da cromatografia lquida, empregando fases estacionrias com partculas de dimetros menores (em torno de 2 m) comparadas s empregadas em HPLC.57 O uso destas partculas, juntamente com altas velocidades lineares da fase mvel (FM), permite reduzir o tempo de anlise, enquanto mantm a resoluo e eficincia de separao, proporcionando picos menos alargados (5-10 s), alm de diminuir drasticamente o tempo de anlise, para aproximadamente 10 min ou menos.20 Um exemplo de UHPLC aplicada ao estudo de POE a determinao de 23 produtos farmacuticos, de diferentes classes incluindo analgsicos, anti-inflamatrios, reguladores lipdicos, frmacos de uso psiquitrico, agentes antilcera, antibiticos e -bloqueadores (Tabela 3), em um tempo mdio de anlise de menos de 10 min (Figura6), utilizando como detector espectrmetro de massas com analisador Q-TOF, sendo um dos primeiros trabalhos empregando a UHPLC na determinao de poluentes orgnicos emergentes.58 Os filtros UV do grupo dos parabenos (steres alqulicos e arlicos do cido p-hidroxibenzoico) so encontrados na maioria dos bloqueadores solares e cosmticos do mercado com fator de proteo solar (FPS), podendo tambm ser encontrados como preservantes em alimentos e medicamentos, devido a sua ao bactericida. A presena de parabenos em tumores mamrios na faixa de concentrao mdia de 12 ng g-1 intensificou seu estudo como POE.13

Figura 6. Cromatograma (UHPLC-ESI-Q-TOF) da separao da soluo padro de 23 produtos farmacuticos. A ordem de eluio dos compostos encontra-se na Tabela 3. A concentrao do padro foi de 100 ng mL-1. Coluna AcquityTM C18 (5 cm x 2.1 mm, com partculas de 1,7 m). Condies cromatogrficas: modo de eluio por gradiente, utilizando como solvente A: tampo acetato de amnio:cido actico 5 mmol L-1 (pH 4,8), e solvente B: acetonitrila:metanol 2:1 (v/v); iniciando com 5% da fase mvel B, por 1 min, com aumento linear at 60% de B em 7 min, aps aumento de B at 90% em 2 min; vazo: 400 L min-1; volume de injeo: 10 L; deteco por MS em srie. Adaptado da ref. 58

Um estudo empregando a UHPLC-ESI-MS/MS determinou quatro parabenos (metilparabeno, etilparabeno, benzilparabeno e propilparabeno), dois agentes microbianos (triclosano e triclocarbano) e trs filtros UV do grupo das benzofenonas (2,4-di-hidrxibenzofenona, 2,2-di-hidrxi-4 metoxibenzofenona e 3-benzofenona), alm de octocrileno e cido octildimetil-p-aminobenzoico, outros dois filtros UV, em guas superficiais da regio da Catalunha (Espanha).59 Atravs da UHPLC acoplada ao detector MS em srie, foi possvel identificar e quantificar todos os analitos com um tempo mdio de anlise de 9 min com excelente resoluo dos picos, diminuindo o efeito de matriz, sendo encontradas concentraes de 3-benzofenona (7ngL-1) na gua de rio e concentraes de metilparabeno (5613 ng L-1) e propilparabeno (1945 ng L-1) em amostras de esgoto a serem tratadas na estao de tratamento de efluentes (Figura 5S, material suplementar).59 Um mtodo utilizando UHPLC-ESI-MS/MS60 foi empregado para o estudo de 24 hormnios (estriol, trembolona, boldenona, nandrolona, bisfenol A, zeranol, 17 -estradiol, testosterona, 17 etinilestradiol, di-hidrodietilestilbestrol, metiltestosterona, etisterona, dietilestilbestrol, dienestrol, estrona, levonorgestrel, didrogesterona, ciproterona, megestrol, progesterona, noretistesrona, clormadinona, 4-n-nonilfenol e 4-n-octilfenol) em tecidos biolgicos de animais aquticos num tempo de anlise de 12 min. A extrao dos analitos foi realizada por SPE utilizando como sorvente copolmero divinilbenzeno e Nvinilpirrolidona. Foram encontradas concentraes de bisfenol A na faixa de 0,5 at 6,2 g kg-1 em amostras de camaro.60 O uso de drogas de abuso (DOA, drugs of abuse) um indiscutvel problema da sociedade atual. Um importante aumento no consumo de cocana e cannabis, separadamente ou associada com derivados do pio e estimulantes da famlia das anfetaminas tem sido verificado, segundo estudos do Centro Europeu de Monitoramento de Drogas (European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction), sendo que o abuso destas substncias sempre est associado a consequncias negativas sociedade, como aumento da utilizao do sistema de sade por parte dos usurios e maior incidncia de crimes.61 Nove drogas de abuso ou seus metablitos, incluindo anfetaminas, metanfetaminas, cocana, herona e metadona, foram analisadas por HILIC62 utilizando na etapa de extrao a SPE (com material sorvente

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Tabela 3. Produtos farmacuticos do cromatograma (UHPLC-ESI-Q-TOF) da separao da soluo padro de 23 produtos farmacuticos mostrado na Figura 6
Frmaco Pico Estrutura
H N

Utilizao Antiinflamatrio
OH

Frmaco

Pico

Estrutura

Utilizao Frmaco de uso psiquitrico

Acetoaminofeno

1
HO

Carbamazepina

13
O

N NH2

Sotalol

HN O S H3C O

HN

-Bloqueador Propifenazona
H N N

14

N N

Analgsico

H2N

N NH2 S

Famotidina

NH2 S O2 NH2

Antilcera

O OH OH

Atenolol

NH O OH CH3 O

NH2

OH HO O O

-Bloqueador

Eritromicina

15

HO O O

Antibitico

O OH

NO2 O S N H N H2C N NH2 N H CH3

Ranitidina

H3C

Antilcera
Cl

O HN

Benzafibrato

16

O OH O

Regulador lipdico

Trimetoprim

6
H3CO OCH3 O HO O

NH2 OCH3

Antibitico Cetoprofeno 17

CH3 OH O H N H

Antiinflamatrio

F N H3C O H O O S N H N O CH3 N N CH3

Ofloxacina

Antibitico

O H

Paroxetina

18

Frmaco de uso psiquitrico

Sulfametoxazol

8
H2N

Antibitico Lansoprazol 19
N N H H N O H3C O S

CF3

Antilcera
N

OH

Metoprolol

9
H3CO H3C HO HO H3C

H N

CH3 CH3

-Bloqueador Fluoxetina 20

N CH3 H3C O

CH3 OH H3C CH3 CH3 N HO O O CH3 O CH3 O OCH3 CH3 OH CH3

CF3

Frmaco de uso psiquitrico

Azitromicina

10

H3C O

Antibitico

cido mefenmico

21
H3C Cl

NH O CH3

OH

Analgsico

Propanolol

11

O OH

N H

-Bloqueador

Loratadina

22
N O O

Antihistamnico

HO O

COOH OH

Pravastatina

12

Regulador lipdico

Mevastatin

23
O

Regulador lipdico

HO

HO

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base de copolmero divinilbenzeno e N-vinilpirrolidona ou copolmero divinilbenzeno e N-vinilpirrolidona modificada com grupos sulfonato (para os analitos de caractersticas bsicas) e deteco MS em srie, em amostras de esgotos coletados em estaes de tratamento da Blgica. Padres deuterados dos analitos foram utilizados para padronizao interna. A separao por HILIC (Figura 7) mostrou excelente desempenho para todos os compostos, especialmente os de caractersticas hidroflicas, os quais eluram primeiramente (como anfetaminas e derivados), ou altamente polares (como a ecgonina metilster, um dos principais metablitos da cocana) que no apresentavam reteno em RP-HPLC, mostrando assim a importncia e aplicabilidade desta nova modalidade de separao, onde foram detectadas drogas de abuso na faixa de 1 at 819 ng L-1, com exceo da 6-monoacetilmorfina.63 Esse ltimo artigo traz uma das tendncias de diagnstico no invasivo sobre o consumo de drogas ilcitas em pases desenvolvidos, que envolve a amostragem da excreo urinria de usurios em guas e esgotos a fim de se tomar medidas de preveno e tratamento de dependncia de drogas de abuso, chamada epidemologia de esgoto (sewage epidemology), que j foi aplicada a estudos em diversos pases como Blgica, Espanha, Itlia, Irlanda, Estados Unidos e Reino Unido.61 Esse procedimento uma alternativa s tcnicas usuais de amostragem diretamente nos fluidos biolgicos (sangue, urina, soro, etc.), que necessitam de voluntrios para sua quantificao, conferindo s autoridades de sade e policial, tendncias, padres de uso, reas de maior incidncia, etc., que poderiam servir para melhorar e intensificar campanhas de preveno, alm de contribuir para o estudo de contaminao ambiental pelas drogas ilcitas, bem como da eficincia da sua remoo pelos sistemas de tratamento de efluentes em uso.61,63 A cromatografia lquida bidimensional uma alternativa interessante quando se realizam anlises em amostras complexas, como amostras biolgicas, por exemplo, pois com o aumento de uma dimenso tem-se tambm o aumento da capacidade de pico e, consequentemente, o processo de separao melhorado.64-66

Leite de vaca, uma matriz complexa pelo seu alto teor de gordura e protenas, foi analisado por cromatografia lquida bidimensional, acoplada a um detector amperomtrico, para a determinao de sulfametoxazol e trimetoprim, medicamentos utilizados para prevenir ou tratar infeces do trato respiratrio e gastrointestinal, com limite de deteco (LD) entre 15 at 25 g L-1 .67 PERSPECTIVAS Como perspectivas para a rea de cromatografia lquida aplicada ao estudo de poluentes orgnicos emergentes destacam-se a identificao de metablitos e produtos de transformao, bem como o alcance de limites de deteco e quantificao ainda menores. A HPLC tambm estar intimamente ligada legislao ambiental aplicada, pois, atualmente, para a grande maioria dos POE ainda no h concentraes mximas permitidas estabelecidas pela legislao. Os grandes desafios esto voltados para o estudo de possveis novos POE, como nanomateriais e siloxanos, amplamente utilizados na sociedade, estando presentes na formulao de vrios produtos (cosmticos, protetores solares, roupas, automveis e eletrnicos) e os possveis riscos sade e ao meio ambiente que eles podem causar. Estudos de biorremediao e processos avanados de tratamento de efluentes, como a oxidao qumica e fotoqumica por meio dos processos oxidativos avanados (POA), ozonlise, nanofiltrao, osmose reversa, biorreatores de membrana, etc., provavelmente utilizaro a cromatografia lquida de alta eficincia como ferramenta chave no monitoramento dos processos de degradao dos POE em ambientes artificiais ou naturais. CONCLUSO A cromatografia lquida de alta eficincia uma das tcnicas de separao de grande destaque dentro da qumica analtica e da

Figura 7. Cromatograma (HILIC-ESI-MS/MS) da separao de drogas de abuso e seus metablitos de uma amostra de efluente coletada em uma planta de tratamento de esgoto na Blgica. Coluna Luna HILIC (15 cm x 3 mm, com partculas de 5 m). Condies cromatogrficas: modo de eluio por gradiente, utilizando como solvente A: tampo acetato de amnio 5 mmol L-1 e solvente B: acetonitrila; iniciando com 95% da fase mvel B, por 0,5 min, seguido do decrscimo linear de B at 50% em 7,5 min; vazo: 0,4 mL min-1; volume de injeo: 5 L; deteco por MS em srie. Adaptado da ref. 63

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cincia ambiental, sendo utilizada como uma excelente ferramenta para os mais variados estudos envolvendo os poluentes orgnicos emergentes. A maioria dos trabalhos publicados na rea est voltada para o estudo de frmacos no meio ambiente, principalmente em amostras aquosas, mas podem ser encontrados na literatura vrios estudos com outros poluentes orgnicos emergentes em varias matrizes ambientais. Os detectores que utilizam espectrmetro de massas so os mais empregados, devido s baixas concentraes que esses analitos apresentam, sendo este o nico detector que permite a confirmao estrutural dos analitos, principalmente quando usado em srie. MATERIAL SUPLEMENTAR Est disponvel gratuitamente em http://quimicanova.sbq.org. br, na forma de arquivo PDF, com acesso livre. Nesse material encontram-se as Figuras 1S a 5S. AGRADECIMENTOS Ao CNPq e FAPESP pelo apoio financeiro e bolsas. Este trabalho uma contribuio do Instituto Nacional de Cincias e Tecnologias Analticas Avanadas (INCTAA). REFERNCIAS
1. Kuster, M.; Azevedo, D. A.; De Alda, M.J.L.; Aquino Neto, F.R.; Barcel, D.; Environ. Int. 2009, 35, 997. 2. Hutzinger, O. Em The Handbook of Environmental Chemistry; Barcel, D., ed.; Springer-Verlag: Berlin, 2006, vol. 1, p. XIII. 3. DAmato, C.; Torres, J. P. M.; Malm, O.; Quim. Nova 2002, 25, 995. 4. Saldanha, G.C.; Bastos, W. R.; Torres, J. P. M.; Malm, O.; J. Braz. Chem. Soc. 2010, 21, 306. 5. http://www.epa.gov/waterscience/methods/pollutants.htm, acessada em Janeiro 2011. 6. Official Journal of the European Communities; Council Directive on pollution caused by certain dangerous substances discharged into the aquatic environment of the Community (76/464/EEC), No L129/23. 7. La Farr, M.; Prez, S.; Kantiani, L.; Barcel, D.; Trends Anal. Chem. 2008, 27, 991. 8. Kuster, M.; De Alda, M. J. L.; Hernando, M. D.; Petrovic, M.; MartnAlonso, J.; Barcel D.; J. Hydrol. 2008, 358, 112. 9. Kuster, M.; De Alda, M. J. L.; Barcel D. Em The Handbook of Environmental Chemistry; Barcel, D.; Petrovic, M.; Aguera, A., eds.; Springer-Verlag: Berlin, 2005, vol. 5, p. 1-24. 10. Hoenicke, R.; Oros, D. R.; Oram, J. J.; Tabersk, K. M.; Environ. Res. 2007, 105, 132. 11. Bila, D. M.; Dezotti, M.; Quim. Nova 2003, 26, 523. 12. Ghiselli, G.; Jardim, W. F.; Quim. Nova 2007, 30, 695. 13. Darbre P. D.; Aljarrah, A.; Miller, W. R.; Coldham, N. G.; Sauer, M. J.; Pope, G. S.; J. Appl. Toxicol. 2004, 24, 5. 14. Barcel, D.; Trends Anal. Chem. 2003, 10, 14. 15. Lopes, L.; Marchi, M. R. R.; Souza, J. B. G.; Moura, J. A.; Lorenzon, C. S.; Cruz, C.; Amaral, J. A.; Quim. Nova 2010, 33, 639. 16. Petrovic, M.; Cruz, H. M. S.; Barcel, D.; J. Chromatogr., A 2005, 1067, 1. 17. Sodr, F. F.; Pescara, I. C.; Montagner, C. C.; Jardim, W. F.; Microchem. J. 2010, 96, 92. 18. Koester, C. J.; Anal. Chem. 2005, 77, 3737. 19. Richardson, S. D.; Anal. Chem. 2005, 77, 3807. 20. Richardson, S. D.; Ternes, T.; Anal. Chem. 2007, 79, 4295. 21. Richardson, S. D.; Anal. Chem. 2009, 81, 4645. 22. Giger, W.; Anal. Bioanal. Chem. 2009, 393, 37.

23. Azevedo, D. A.; Lacorte, S.; Vinhas, T.; Viana, P.; Barcel, D.; J. Chromatogr., A 2000, 879, 13. 24. Barcel, D. Em Applications of LC-MS in Environmental Chemistry, Journal of Chromatography Library; Barcel, D., ed.; Elsevier: Amsterdam, 1996, vol. 59, p. VI. 25. Hernandez, F.; Sancho, J. V.; Guerrero, M. I. C.; Trends Anal. Chem. 2007, 26, 466. 26. Daz-Cruz, M. S.; Barcel, D.; Anal. Bioanal. Chem. 2006, 386, 973. 27. Lavn, M.; Alsberga, T., Yub, Y.; Adolfsson-Ericia, M.; Sun, H.; J. Chromatogr., A 2009, 1216, 49. 28. Prez, M. I. B.; Garca, A. M. C.; Irruela, C.; Gracia, L. G.; Blanco, C.; J. Chromatogr., A 2009, 1216, 8355. 29. Pozo, O. J.; Guerrero, C.; Sancho, J. V.; Ibanez, M.: Pitarch, E.; Hogendoorn, E.; Hernandez, F.; J. Chromatogr., A 2006, 1103, 83. 30. Lord, H.; Pawliszyn, J.; J. Chromatogr., A 2000, 902, 17. 31. Oliveira, A. R. M.; Magalhes, I. R. S.; Santana, F. J. M.; Bonato, P. S.; Quim. Nova 2008, 31, 637. 32. Ho, T. S.; Vasskog, T.; Anderssen, T.; Jensen, E.; Rasmussen, K. E.; Pedersen-Bjergaard, S.; Anal. Chim. Acta 2007, 592, 1. 33. Fidalgo-Used, N. U.; Blanco-Gonzlez, E. B.; Sanz-Medel, A. S.; Anal. Chim. Acta 2007, 590, 1. 34. Sena, R. F.; Tambosi, J. L.; Moreira, R. F. P.; Jos, H. J.; Gebhardt, W.; Schrder, H. F.; Quim. Nova 2010, 33, 1194. 35. Rodrigues, A. C.; Queiroz, M. E. C.; Quim. Nova 2008, 31, 1814. 36. Almeida, C.; Nogueira, J. M. F.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2006, 41, 1303. 37. Kumar, A.; Malik, A. K.; Tewary, D. K.; Singh, B.; J. Sep. Sci. 2008, 31, 294. 38. Aguilar-Arteaga, K.; Rodriguez, J. A.; Miranda, J. M.; Medina, J.; Barrado, E.; Talanta 2010, 80, 1152. 39. Kolberg, D. I. S.; Presta, M. A.; Wickert, C.; Adaime, M. B.; Zanella, R.; J. Braz. Chem. Soc. 2009, 20, 220. 40. http://www.epa.gov/safewater/methods/analyticalmethods_ogwdw.htm, acessada em Janeiro 2011. 41. Jacomini, A. E.; De Camargo, P. B.; Avelar, W. E. P.; Bonato, P.; J. Braz. Chem. Soc. 2009, 20, 107. 42. Ternes, T. A.; Meisenheimer, M.; McDowell, D.; Sacher, F.; Brauch, H-J.; Haist, B. H.; Preuss, G. G.; Wilme, U.; Seibert, N.; Environ. Sci. Technol. 2002, 36, 3855. 43. Nebot, C.; Gibb, S. W.; Boyd, K. G.; Anal. Chim. Acta 2007, 598, 87. 44. Pedrouzo, M.; Revert, S.; Borrull, F.; Pocurull, E.; Marc, R. M.; J. Sep. Sci. 2007, 30, 297. 45. Roberts, P. H.; Bersuder P.; J. Chromatogr., A 2006, 1134, 143. 46. Castiglioni, C.; Bagnati, R.; Calamari, D.; Fanelli, R.; Zuccato, E. A.; J. Chromatogr., A 2005, 1092, 206. 47. MacLeod, S. L.; Sudhir, P.; Wong, C. S.; J. Chromatogr., A 2007, 1170, 23. 48. Tixier, C.; Singer, H. P.; Canonica, S.; Muller, S. R.; Environ. Sci. Technol. 2002, 36, 3482. 49. Silva, A. R. M.; Nogueira, J. M. F.; Talanta 2008, 74, 1498. 50. Mazzeo, P.; Di Pasquale,D.; Ruggieri, F.; Fanelli, M.; DArchivio, A. A.; Carlucci, G.; Biomed. Chromatogr. 2007, 21, 1166. 51. Shao, B.; Han, H.; Li, D.; Mab, Y.; Tu, X.; Wua, Y.; Food Chem. 2007, 105, 1236. 52. Sodr, F. F.; Locatelli, M. A. F.; Jardim, W. F.; Water, Air, Soil Pollut. 2010, 206, 57. 53. Sodr, F. F.; Montagner, M. A. F.; Jardim, W. F.; J. Braz. Soc. Ecotoxicol. 2007, 2, 187. 54. Moreira, D. S.; Aquino, S. F.; Afonso, R. J. C. F.; Santos, E. P. P. C.; Pdua, V. L.; Environ. Technol. 2009, 30, 1041. 55. Leite, G. S.; Franco, R. J. C.; Aquino, S. F.; Quim. Nova 2010, 33, 734. 56. Vieira, K. M.; Nascentes, C. C.; Augusti, R.; J. Braz. Chem. Soc. 2010, 21, 787.

676

da Silva e Collins

Quim. Nova

57. Maldaner, L.; Jardim, I. C. S. F.; Quim. Nova 2009, 32, 214. 58. Petrovic, M.; Gros, M.; Barcel, D.; J. Chromatogr., A 2006, 1124, 68. 59. Pedrouzo, M.; Borrull, F.; Marc, R. M.; Pocurull, E.; J. Chromatogr., A 2009, 1216, 6994. 60. Xu, Y. J.; Tian, X. H,; Zhang, X. Z.; Gong, X. H.; Zhang, S. J.; Liu, H. H.; Zhang, L. M.; Am. Lab. 2010, 7, 11. 61. van Nuijs, A. L. N.; Tarcomnicu, I.; Bervoets, L.; Blust, R.; Jorens, H. N.; Covaci, A.; Anal. Bioanal. Chem. 2009, 395, 819. 62. Maldaner, L.; Collins, C. H.; Jardim, I. C. S. F.; Quim. Nova 2010, 33, 1559.

63. Bijlsma, L.; Sancho, J. V.; Pitarch, E.; Ibnez, M.; Hernndez, F.; J. Chromatogr., A 2009, 1216, 3078. 64. Svec, F.; Chem. Educ.1997, 2, 1. 65. Malerod, H.; Lundanes, E.; Greibrokk, T.; Anal. Methods 2010, 2, 110. 66. Dugo, P.; Cacciola, F.; Kumm, T.; Dugo, G.; Mondello, L.; J. Chromatogr., A 2008, 1184, 353. 67. Andrade, L. S.; Moraes, M. C.; Rocha-Filho, R. C.; Fatibello-Filho, O.; Cass, Q. B.; Anal. Chim. Acta 2009, 654, 127.

Quim. Nova, Vol. 34, No. 4, S1-S3, 2011

Carla Grazieli Azevedo da Silva e Carol. H. Collins* Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13083-970 Campinas - SP, Brasil

Figura 1S. Efeito de matriz de uma amostra de gua superficial analisada por SPE-HPLC-MS/MS na anlise de antibiticos. (A): cromatogramas de soluo padro 10 ng L-1 de antibiticos da classe das quinolonas; (B): cromatogramas de uma amostra real de gua superficial fortificada com a soluo padro, evidenciando o alargamento de pico devido ao efeito de matriz. Coluna: Kromasil C18 (100 x 2,1 mm, com partculas de 5 m). Condies cromatogrficas: modo de eluio por gradiente, utilizando como solvente A: 0,01% de cido actico e solvente B: metanol com 0,1% de cido frmico; iniciando com 5% da fase mvel B, at 90% de B em 20 min; vazo: 0,2 mL min-1; volume de injeo: 9,8 mL; deteco por MS em srie. Adaptado da ref. 29

Figura 2S. Consumo de medicamentos em funo da paridade do poder de compra (PPP$) per capita para a Alemanha. Grfico obtido do site oficial da Organizao Mundial da Sade (OMS) https://apps.who.int/infobase/report.aspx, acessada em Janeiro 2011 *e-mail: chc@iqm.unicamp.br

Material Suplementar

APLICAES DE CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA PARA O ESTUDO DE POLUENTES ORGNICOS EMERGENTES

S2

da Silva e Collins

Quim. Nova

Figura 3S. Cromatogramas (HPLC-ESI-MS/MS) obtidos para (A) amostras de gua do Rio Ebro e (B) amostra coletada aps o tratamento de efluentes. Coluna: Kromasil 100 C18 (250 x 4,6 mm, com partculas de 5 m). Condies cromatogrficas: modo de eluio por gradiente, utilizando como solvente A, cido actico 0,5% (pH 2,8) e solvente B, acetonitrila, iniciando com 55% do solvente B, aps aumento linear at 60% de B em 6 min, aumento de B at 80% em 3 min, aumento de B at 100% em 3 min e decrscimo de B at 55% em 3 min; vazo: 1 mL min-1; volume de injeo: 50 L; temperatura de anlise: 30 C; deteco por MS em srie. Adaptado da ref. 44

Figura 4S. Cromatograma de uma amostra fortificada com 5,0 g L-1 de cada um dos analitos. Coluna: Symmetry C-18 (150 x 2,1 mm, com partculas de 3,5m). Condies cromatogrficas: modo de eluio por gradiente, utilizando como solvente A, soluo aquosa com 0,1% de amnia e como solvente B, metanol, iniciando com 10% de B at 55% em 10 min, aumentando para 85% em 10 min, permanecendo por 7,5 min, aps diminuindo % de B at 10% em 15min; vazo: 0,2 mL min-1; volume de injeo de 2 L; temperatura de anlise: 40 oC; deteco por MS em srie. TIC: cromatograma de ons totais; PI: padro interno; OP: octilfenol; NP: nonilfenol; BPA: bisfenol A, todos por SIM (monitoramento de ons selecionados). Adaptado da ref. 51

Vol. 34, No. 4

Aplicaes de cromatografia lquida de alta eficincia

S3

Figura 5S. Cromatograma (UHPLC-ESI-Q) obtido na separao de 11 produtos de higiene pessoal. Coluna: Zorbax Eclipse XBD C18 (50 x 4,6 mm, com partculas de 1,8 m). Condies cromatogrficas: modo de eluio por gradiente, utilizando como solvente A: cido actico (pH 2,8) e solvente B: metanol, iniciando com 60% da fase mvel B, com aumento linear at 100% de B em 4 min, aps decrscimo de B at 60% em 3 min; vazo: 0,6 mL min-1; volume de injeo: 50 L; temperatura de anlise: 50 oC; deteco por MS. EPB: etilparabeno; MPB: metilparabeno; DHB: 2,4-di-hidrxibenzofenona; PPB: propilparabeno; BP-3: 3-benzofenona; TCC: triclocarbano; TCS: triclosano; OD-PABA: cido octildimetil-p-aminobenzoico. Adaptado da ref. 59