Prctica de Laboratorio N 1 y 2

1.- Determinacin del tiempo de tratamiento de un medio de cultivo 2.- Cultivo de muestra tratadas trmicamente

Objetivo. Determinar el tiempo de tratamiento trmico ptimo en agua contaminada (Refresco de soya). Realizar cultivo con la muestra tratada.

Introduccin.- El tratamiento trmico permite aumentar la vida til de un producto durante un periodo de conservacin. El tratamiento trmico consiste en destruir la actividad metablica de microorganismos y en inactivar las enzimas. Eso se hace aplicando al producto una combinacin de temperatura y tiempo determinados. Segn el producto, el tiempo de tratamiento trmico se diferencia. Los tiempos ptimos para conseguir la estabilidad microbiolgica de la leche semidesnatada, del zumo de frutas y de la nata tomando como referente el Clostridium botulinum no son los mismos. En efecto, para el zumo el tiempo ptimo es 13,508 minutos y las propiedades del producto que tambin puede ser agua potable, aguas envasadas, etc. No existe un procedimiento de esterilizacin y desinfeccin aplicable a todos los casos. El mtodo de esterilizacin ser seleccionado para cada caso teniendo en cuenta la naturaleza fsica del producto o alimento y la naturaleza biolgica del contaminante. Como rara vez se conoce la poblacin de microorganismos sobre un objeto, producto o alimento que debe ser tratado, debemos presuponer que se encuentran presentes las formas microbianas ms resistentes como las esporas de Clostridium botulinum. Si se conoce la poblacin microbiana contaminante se proceder segn convenga de acuerdo

al tipo de microorganismo identificado como patgeno o perjudicial y segn su termo resistencia. El mtodo de esterilizacin a emplearse debe ser previamente valorado. Actualmente existen valores tabulados de tiempo de exposicin, temperatura y concentracin de principios activos para los mtodos ms usados que nos permiten elegir el ms adecuado para cada caso. En la eleccin debe tenerse en cuenta tambin el uso posterior que le ser dado al objeto, alimento, etc. a esterilizar. Marco terico.- Los mtodos de esterilizacin se clasifican en: 1.- MTODOS FSICOS
1.1.- Calor Hmedo: La utilizacin del calor y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de exposicin y la temperatura. Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos. principalmente a dos razones: accin del calor. El calor provoca desnaturalizacin de protenas, fusin y desorganizacin de las El calor hmedo produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas. Estos efectos se deben

estructuras biolgicas son producidas por reacciones que eliminan agua y 2) El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho ms elevado que el aire. Ventajas del calor hmedo: -Rpido calentamiento y penetracin No deja residuos txicos -Econmico -Destruccin de bacterias y esporas en corto tiempo. -Hay un bajo deterioro del material expuesto Desventajas:

1) El agua es una especie qumica muy reactiva y muchas

-No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua -Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metlicos Procedimientos: a) Ebullicin: Se requiere un recipiente con agua. Es la aplicacin del calor mediante la ebullicin del agua a presin atmosfrica (100 oC). No es confiable en su totalidad este mtodo por cuanto quedan las esporas.

b) Tyndalizacin: Esterilizacin por accin discontinua del vapor de agua a una temperaturade100oCenvarias sesiones. Se basa en el principio de Tyndal

c) Pasteurizacin: Es la aplicacin de una temperatura inferior a 110 C durante 30 minutos. La aplicacin del calor va seguida de un rpido enfriamiento. Se usa para prevenir las infecciones de origen lcteo y retasar la descomposicin de la leche, ya que las bacterias de la leche no forman esporas.

d) Vapor a presin (autoclave): Se realiza la esterilizacin por el vapor de agua a presin. El vapor la coagulacin de las protenas.

a presin proporciona temperaturas altas con penetracin y humedad en abundancia que facilitan

1.2.- Calor Seco: El calor seco produce desecacin de la clula, es esto txico por niveles elevados de electrolitos, fusin de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que estn en contacto con stos. La accin destructiva del calor sobre protenas y lpidos requiere mayor temperatura cuando el material est seco o la actividad de agua del medio es baja. Ventajas del calor seco: -No es corrosivo para metales e instrumentos. Desventajas: del calor. -Permite la esterilizacin de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no voltiles. -Requiere mayor tiempo de esterilizacin, respecto al calor hmedo, debido a la baja penetracin

Entre los mtodos que utilizan el calor seco como medio de esterilizacin se destacan: a). Flameado: Consiste en la exposicin directa del instrumento a una flama en forma directa por poco tiempo con el mechero de Bunsen.

b). Incineracin: Consiste en someter el material contaminado a altas temperaturas en hornos riesgo en la basura.

especiales para reducirlo prcticamente a cenizas. Su fin es evitar el vertido de material de alto

c). Estufa : Se mantiene una temperatura estable mediante termostatos de metal, que al dilatarse por el calor, cortan el circuito elctrico.

1.3.- Radiaciones: La accin de las radiaciones del tipo de radiacin y el tiempo de exposicin.

a). Radiaciones ionizantes: Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los cidos

nucleicos, estructuras proteicas y lipdicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos, dando lugar a mutaciones en los microorganismos que los incapacitan radiaciones tienen gran penetrabilidad. Se utilizan a escala industrial por sus costos. metablicamente para producir una enzima esencial y sobreviniendo la muerte bacteriana. Las

b). Rayos Gamma: Su empleo est basado en los conocimientos sobre la energa atmica. Este tipo de esterilizacin se aplica a productos o materiales termolbiles y de gran importancia en el campo industrial. Puede esterilizar antibiticos, vacunas, alimentos, etc.

c). Rayos X: Penetran bien, pero requieren mucha energa, son pocos operativos para su empleo masivo, su uso es muy costoso, por lo tanto son muy poco usados con fines de esterilizacin d). Rayos Ultravioletas: Afectan a las molculas de DNA de los microorganismos. 1.4.- Mecnicos: a). Filtracin: En la filtracin se usan membranas filtrantes con poros de un tamao determinado. El tamao del poro depender del uso al que se va a someter la muestra.

sustancias. Tambin el aire puede ser sometido a una limpieza exhaustiva provocando su paso a travs de materiales capaces de retener los microorganismos y partculas en suspensin

Este mtodo es til para identificar microorganismos en muestras de agua potable y otras

b). Sedimentacin: Es un mtodo por el cual los microorganismos son eliminados de depsitos en consecuencia, se depositan en el fondo del recipiente que las contiene quedando el lquido laboratorio la sedimentacin se acelera por centrifugacin. Es utilizado este mtodo para identificar microorganismos en muestras de agua potable y otras sustancias.

hdricos. Se fundamenta en el hecho de que la densidad de muchas bacterias es algo mayor de 1.0; sobrenadante no estril del todo, pero su poblacin microbiana disminuye notablemente. En el

2.- MTODOS QUMICOS

Estos mtodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos. a) Desinfectantes: Son agentes antimicrobianos capaces de matar los microorganismos patgenos emplear solo sobre materiales inertes.

(infecciosos) de un material. Pueden presentar efectos txicos sobre tejidos vivos, por lo que suelen

b) Conservantes: Son agentes antimicrobianos capaces de matar los microorganismos patgenos o perjudiciales de un material o alimento. Pueden presentar efectos txicos si no aplican a normas establecidas. Son de consumo humano. Posee como ventajas: No deja ningn residuo txico.

Se convierte en agua y oxgeno al final del proceso. El material no precisa aireacin. El ciclo de esterilizacin dura entre 54 y 75 minutos. Desventajas: No se pueden esterilizar objetos que contengan celulosa, algodn, lquidos, humedad, madera o instrumental con lmenes largos y estrechos.

Es el mtodo de esterilizacin ms caro de entre los descritos.

El Escaldado
Es uno de los tratamientos por calor ms suaves. Se aplica a frutas y verduras para adems fijar su de otros procesos de conservacin como la congelacin.

color, inactivar sus enzimas alterantes y destruir algunos microorganismos a modo d paso previo

EBULLICIN

CALOR HMEDO PASTEURIZACIN

TYNDALIZACION

VAPOR A PRESIN FLAMEADO ESTUFA

FSICOS

CALOR SECO

INCINERACIN

RADIACIONES RADIACIONES MTODOS DE ESTERILIZACIN MECNICOS FILTRACIN IONIZANTES RAYOS X RAYOS GAMMA RAYOS ULTRAVIOLETA

SEDIMENTACIN

QUMICOS DESINFECTANTES CONSERVANTES

Procedimiento.- La prctica se organizara por grupos de acuerdo a la disponibilidad del material de laboratorio. Se debe aplicar los fundamentos tericos analizados en clase, por la que se debe considerar en primera instancia, las ecuaciones necesarias para el clculo del tiempo de tratamiento trmico, asumiendo que el microorganismo objetivo de destruccin es el clostridium botulinum, con un tiempo estndar de destruccin trmica de 2,8 minutos para una temperatura de 250 F o su equivalente en grados centgrados. Adems de un valor para z de 10C.

Se deben registrar los cambios de temperatura del producto segn transcurre el proceso de calentamiento. Con los datos de tiempo- Temperatura se debe construir la curva de calefaccin para la muestra correspondiente, posteriormente la curva de calefaccin escalonada. Cada grupo tomara una muestra de 150ml de refresco de soya. Cada grupo tendr un tiempo diferente para la fase de mantenimiento. Un primer grupo tomara 9 minutos para la fase indicada, el segundo grupo 14 minutos los siguientes grupos tomaran mltiplos de cinco. Los clculos de los tiempos de tratamiento trmico sern realizados por cada grupo con los datos obtenidos para posteriormente analizar y seleccionar el tratamiento conveniente de acuerdo a lo establecido en la parte terica. Las muestras tratadas de cada grupo, debern cultivarse a 30C en estufa para observar si se presenta o no proceso fermentativo. Si la disponibilidad de materiales y reactivos lo permiten los grupos realizaran cultivos en agar-agar. Materiales y equipamiento. Erlenmeyer de 250ml con tapn perforado para introduccin de termmetro de vstago largo con escala 0 a 125C. Malla de amianto Pinza tipo tijera Varilla de vidrio Calentador elctrico Frasco lavador

Clculos.-

Temperatura (C) 20 34 39 45 53 60 68 76 83 90 98 98 98 98 98 99 99 99 90 84 79 72 69 56 40 34

Tiempo (min) 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 41 44 47 50 51 53 56 59 61 64 67 70

Temperatura (C)

Curva de calefaccin de Refresco de soya

120 100 80 60 40 20 0 0 6 12 18 24 30 36 41 47 51 56 61 67 Tiempo (min)

Conclusiones y recomendaciones.En nuestro caso (grupo N3) tuvimos un tiempo de 19 minutos en la zona de mantenimiento de la curva de calefaccin. De acuerdo a los clculos realizados y con lo que pudimos observar en el laboratorio unos das despus de dejar la muestra en estufa a 30C podemos concluir que el tratamiento no fue optimo ya que el tiempo necesario para matar un microorganismo a 121C (F) es segn nuestra gua de laboratorio 2,8 min y nuestro tiempo obtenido fue bajo. Por lo que para obtener un tratamiento trmico adecuado para este refresco de soya debe ser mayor a 19 min en la zona de mantenimiento. Recomendaciones: en la realizacin de esta prctica se debe tener cuidado al llegar a la temperatura de ebullicin o zona de mantenimiento ya que los vapores se van acumulando en el erlenmeyer que est tapado lo que provoca que la presin se eleve por lo que es conveniente destapar de vez en cuando.