Microbiologia

Monitoramento e controle microbiolgico

Indispensvel para controlar a qualidade dos ambientes de fabricao e manipulao de produtos farmacuticos (e de outros segmentos), o monitoramento microbiolgico de salas limpas est em discusso internacional. No Brasil, os critrios de contagem microbiana e as medidas de controle esto previstos em resoluo tcnica estabelecida pela ANVISA Marcelo Couto

monitoramento e o controle microbiolgico em salas limpas e demais reas crticas do pro-

centrfuga e impinger, entre outros. b) Sedimentao (amostragem passiva): coleta realizada por exposio de placas de Petri contendo uma formulao padro de meio de cultura suplementado com gar (tcnica de sedimentao). c) Tcnica de contato: amostragem realizada diretamente sobre a superfcie do local desejado, principalmente nos pontos crticos, utilizando pequenas placas contendo meios de cultura slidos apropriados, tambm conhecidas como Placas RODAC Replicated Organisms Detection and Counting. d) Coletas com hastes flexveis com pontas de algodo produzidas para esta finalidade (swabs). O material semeado diretamente ou aps submet-lo a suspenso e/ou diluio em placas de Petri ou caldos-padro. A anlise dos resultados obtidos a partir dessas tcnicas serve de parmetro bsico para avaliar se a carga microbiana total se mantm dentro dos

limites estabelecidos pelas orientaes normativas. A deteco da carga microbiana presente no ambiente fundamental para a manuteno de um plano de controle eficiente, elaborao dos documentos e acompanhamento do histrico de contaminao. Estas informaes so essenciais para a obedincia s Boas Prticas de Produo (BPF), como a adoo de medidas preventivas e corretivas relacionadas aos procedimentos operacionais, validao dos processos de limpeza e sanitizao das instalaes e treinamento do pessoal. Os profissionais responsveis pelo monitoramento e controle microbiolgico, no entanto, esbarram em uma srie de desafios cotidianos, a comear pelo manejo dos mtodos e equipamentos existentes para realizar as medies. Uma situao: diferentes equipamentos e mtodos adotados nos testes podem apresentar resultados diversos para amostras realizadas ao mesmo

cesso de produo de medicamentos fazem parte da rotina de garantia da qualidade nas indstrias farmacuticas de todo o mundo. O objetivo medir e avaliar sistematicamente a quantidade de micro-organismos vivos presentes nesses ambientes e orientar medidas preventivas e corretivas para eliminar possveis focos de contaminao. Embora saibamos que a maior parte dos contaminantes seja proveniente de matrias-primas, o controle ambiental uma importante varivel do processo e merece ateno, destaca a farmacutica Da de Aguirra, da Yugue Assessores, especializada em consultoria e treinamento. As tcnicas comumente empregadas para medir a carga microbiana envolvem: a) Coleta por meio de amostradores de ar (amostragem ativa): utiliza equipamentos como os de impactao,

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tempo, em funo das limitaes tcnicas. Algumas vezes no possvel sequer relacionar o resultado dos chamados mtodos rpidos (alternativos) com os obtidos pelo mtodo convencional, no qual os micro-organismos so desenvolvidos em meio de cultura. Pelo mtodo convencional, que utiliza meios de cultura e requer tempo de incubao (em geral de cinco dias), o resultado no reflete o momento atual e sim aquele em que a amostra foi colhida. O monitoramento neste caso ajuda a compor um histrico e avaliar se o ambiente est em tendncia de melhora, de piora ou de estabilizao dos resultados. Na prtica, o que se faz obter a situao do passado e extrapol-la para o presente, mas isso implica em considervel grau de incerteza, aponta a consultora. O desenvolvimento dos mtodos rpidos em microbiologia (tambm conhecidos pela sigla em ingls RMM) uma tentativa de se obter um retrato do ambiente a partir de resultados imediatos e mais precisos, tornando o controle mais efetivo. Em geral, o princpio adotado nestes casos no baseado na capacidade de os micro-organismos crescerem em um meio

de cultura, mas sim na anlise da atividade ou do contedo das clulas, demonstrando dessa maneira resultados em termos de unidades viveis e no unidades formadoras de colnias. Embora os mtodos rpidos estejam conquistando cada vez mais aceitao, ainda h certa resistncia dos microbiologistas, em funo do domnio das prticas tradicionais, de algumas limitaes dos prprios mtodos e da falta de reconhecimento mais amplo deles pelos rgos reguladores, mas a tendncias que a tecnologia ganhe espao, comenta Ana Lucia Gonella, mestre em microbiologia e doutoranda em biotecnologia pela Unicamp Universidade de Campinas.

Limites de aceitao
Um dos maiores desafios, no entanto, a dificuldade de se estabelecer limites de aceitao microbiana para os diferentes tipos de ambientes de produo. Tambm devemos considerar que a identificao dos micro-organismos to importante quanto os limites de aceitao deles. Por exemplo, na rea de produtos injetveis, submetidos

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a esterilizao terminal, no segura a presena de micro-organismos gram-negativos ou termorresistentes, enquanto na manufatura de produtos com filtrao esterilizante devemos nos preocupar com a presena de bactrias com tamanho 0,2m, destaca a microbiologista Ana Lucia. Os debates so ainda mais intensos em relao aos limites para reas controladas de produtos no-estreis. O IEST Instituto de Cincias Ambientais e Tecnologia, sediado nos Estados Unidos, desenvolveu uma recomendao sobre Micro-organismos em Salas Limpas, a IEST-RP-CC023, que uma das importantes referncias sobre o assunto. O documento, que aborda reas estreis e no-estreis, fornece diretrizes para o controle e a medio da contaminao no ar e nas superfcies, descrevendo procedimentos e tcnicas para alcanar o nvel de controle microbiano desejado. Ele apresenta ainda uma introduo aos mtodos aceitos para controle e monitoramento e os recursos disponveis para a realizao dessa atividade, alm de orientaes sobre desinfetantes, seu espectro de letalidade e tcnicas de aplicao. No Brasil, a SBCC tambm deu uma valiosa contribuio para o tema ao publicar a recomendao normativa RN-007-05, adaptada realidade nacional, lembra Jean-Pierre Herlin, diretor da Anlise Engenharia e Consultoria, um dos membros do comit tcnico responsvel pelo desenvolvimento da RN. Publicado em 2005, como resultado das atividades de um grupo de especialistas, o documento, intitulado Metodologia e Limites Microbiolgicos em reas Limpas continua em vigor e uma importante referncia para os interessados nessa questo.
A B C D Grau da sala

No ano passado, a ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria publicou a sua resoluo RDC 17/2010, em substituio RDC 210, que dispe sobre as Boas Prticas de Fabricao de Medicamentos e na qual esto previstos, entre diversos critrios, os parmetros de monitoramento e controle microbiolgico. Os critrios de contagem microbiana e os limites de contaminao microbiolgica apresentados foram baseados nas referncias da Organizao Mundial da Sade e na regulamentao dos medicamentos adotada na diretiva europeia, a GMP EU, comenta Andra Muggiati de Abreu, gerente de Garantia da Qualidade do Instituto de Tecnologia do Paran - TECPAR. Ela refora que essas orientaes, ao serem incorporadas na resoluo brasileira, tornaram-se compulsrias no Pas. A RDC 17, assim como j previa a RDC 210, determina que as reas de produo onde estiverem sendo processados produtos suscetveis a contaminao por micro-organismos sejam monitoradas periodicamente, considerando as diferentes classes das reas limpas. Entre outros aspectos, o documento estabelece que, quando forem realizadas operaes asspti-

cas, o monitoramento seja frequente e se utilize mtodos apropriados, entre os quais esto includos aqueles que envolvem placas de sedimentao, amostragens volumtrica de ar e de superfcies, destaca a representante do TECPAR. As reas, obviamente, no devem ser contaminadas pelos mtodos de amostragem e os resultados de monitoramento devem ser revisados para fins de liberao do produto terminado. Alm disso, a resoluo diz que as superfcies e o pessoal deve ser monitorados aps operaes crticas. Ainda de acordo com a resoluo da ANVISA, as indstrias devem estabelecer limites de alerta e de ao para a deteco de contaminao microbiolgica, e para o monitoramento de tendncia da qualidade do ar nas suas instalaes. Os limites neste caso, expressos em unidades formadoras de colnia (UFC), so os que constam na tabela abaixo, adotados em consonncia com o citado padro europeu. Os limites adotados levam em considerao o grau de limpeza da sala. Para aquelas classificadas como A, onde esto localizadas zonas de alto risco operacional e so realizados envases e conexes asspticas, o limite de UFC por metro cbico nas amostras

Classificao RDC 17 e GMP UE

Limites recomendados de contaminao microbiolgica (valores mdios) Placa de sedimentao 90mm UFC/4h <1 5 50 100 Placa de contato 55mm UFC/placa <1 5 25 50 Amostra de luva (5 dedos) UFC/luva <1 5

Amostra de ar UFC/m3 <1 10 100 200

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de ar deve ser menor que 1; em ambientes com grau B, que circundam s de grau A, para preparaes e envases asspticos, esse nmero pode chegar a 10; e nas reas limpas onde so realizadas etapas menos crticas da fabricao de produtos estreis os limites podem atingir 100 UFC/m3 (grau C) e 200 UFC/m3 (grau D). Padres tambm so estabelecidos para amostragens de superfcies por meio das anlises de placas de sedimentao para um perodo de quatro horas, de placa de contato, alm de amostras de luva dos trabalhadores envolvidos. O FDA, rgo norte-americano responsvel pela regulao de alimentos e medicamentos, tambm adota limites de contaminao microbiolgica para as diferentes classes de reas limpas, conforme demonstra a tabela ao lado.
Critical area Clean Area Classification (0.5 m particles/ft3) 100 1000 10,000 100,000

Classificao cGMP - FDA

ISO Designation
b

0.5 m particles/m3

Microbiological Active Air Action Levelsc (cfu/m3) 1e 7 10 100

Microbiological Settling Plates Action Levelsc,d (diam. 90mm; cfu/4hours) 1e 3 5 50

5 6 7 8

3,520 35,200 352,000 3,520,000

Produto e embalagem estreis expostos rea imediatamente adjacente linha de processo assptico

ISO Classe 5 para partculas 0,5 m ISO Classe 7 em operao ou Classe 6 ou Classe 5 ISO Classe 8

Supporting clean area

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Os nmeros integram as orientaes de Boas Prticas de Fabricao do rgo, o cGMP (current Good Manufacturing Practices), e so igualmente levados em conta pelas indstrias farmacuticas de todo o mundo, seja em observncia aos padres e procedimentos corporativos adotados pelas suas matrizes ou para que estejam credenciadas a exportar e comercializar seus produtos nos Estados Unidos. considera Silvia Eguchi, diretora de Microbiologia da Dosage Pesquisas Laboratoriais e coordenadora do GT 2 da SBCC, grupo de trabalho criado no Na sua mais recente edio, a USP United States Pharmacopeia acrescentou novos elementos para a discusso da contagem microbiana e do controle de contaminaes microbiolgicas. Autoridade oficial no-governamental que define padres para medicamentos e outros produtos para a sade, a USP tem as suas orientaes acompanhadas de perto. Na verso 2011 (USP 34) do documento so recomendados novos critrios, que levam em conta a taxa de incidncia de contaminaes. O limite tolervel de 0,1%. Isso significa que a cada 1.000 contagens realizadas seria permitida apenas a ocorrncia de uma placa com at 15 unidades formadoras de colnia (UFC). O problema que essa contagem leva um tempo considervel para ser obtida. Se uma indstria estabelecer, por exemplo, que vai colher um amostra por dia em determinada rea ou zona controlada, levar quase trs anos para completar 1.000 placas. Evidentemente, esse tempo diminui medida que mais amostras sejam colhidas em um mesmo dia, mas ainda assim demanda longo perodo de avaliao, mbito do ABNT CB-46 para tratar de questes ligadas biocontaminao em reas limpas. Um dos caminhos para se chegar a padres mundiais deve ser a reviso da norma ISO 14698 Partes 1 e 2, publicada em 2003 com a finalidade de oferecer princpios e metodologia bsica para avaliar e controlar a biocontaminao. O documento original, porm, no foi muito adotado, pela falta de parmetros objetivos para a realizao de contagens e o estabelecimento de limites microbiolgicos para as diferentes classes de reas. Muitos profissionais consideram essa norma um guia, por apresentar orientaes gerais, mas sem fixar critrios de nveis de biocontaminao, obtidos por dados do histrico do controle microbiolgico, comenta Silvia Eguchi, que a delegada brasileira no grupo de trabalho da ISO encarregado de discutir a norma. Do jeito que est, ela no exatamente uma norma e, por isso, especialistas de diversos pases foram convocados para a sua reformulao, acrescenta. O processo de reviso, iniciado h quatro anos, deve consumir pelo menos mais trs, mas a

Expectativa de que a norma ISO 14698, que est sendo revisada, passe a oferecer limites de aceitao baseados em consenso internacional

expectativa que, ao final, os especialistas cheguem a nmeros e critrios globalmente aceitos. O estabelecimento de padres internacionais por meio da norma ISO esbarra no apenas na dificuldade tcnica de se estabelecer nmeros exatos nem sempre facilmente aplicveis na rea de microbiologia , mas tambm na resistncia regional: adotar critrios mais rgidos que os atuais implica em rever procedimentos e realizar investimentos para se adaptar. Representantes de alguns pases participantes das discusses temem que a introduo de nmeros na norma se sobreponha a regulamentaes, legislao e guias locais seguidos atualmente. Apesar disso, a expectativa de que as discusses continuem avanando e, nos prximos anos, os critrios estabelecidos sejam mais claros e harmonizados em todo o mundo. Para isso, o que se busca estabelecer padres mnimos, aplicveis de forma prtica e objetiva em todos os pases afiliados ISO, o que representa uma evoluo do ponto de vista tcnico e tambm operacional e mercadolgico para uma indstria cuja produo se d em escala mundial e com atuao em mercados globalizados. A busca pelo aperfeioamento das tcnicas de contagem microbiana e a definio de nmeros consensuais, que balizem os limites aceitveis nos diferentes ambientes classificados, so os principais desafios vivenciados pelos profissionais que atuam na indstria farmacutica e tambm em outros segmentos como os de alimentos e de cosmticos com o objetivo de desenvolver prticas cada vez melhores de produo, com adequado controle microbiolgico e segurana dos seus produtos.

Novos conceitos e discusses

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Questo dos nmeros

A especialista em microbiologia Silvia Eguchi, coordenadora do GT 2 da SBCC mantido pelo comit ABNT CB-46 para tratar de questes ligadas biocontaminao em reas limpas defende o estabelecimento de critrios internacionais e o aperfeioamento dos mtodos de mensurao e controle microbiano nos ambientes crticos classificados. Ela comenta a questo dos nmeros: Mas importante ter nmeros? Como os limites aceitveis so definidos? So convenes estabelecidas pelos pesquisadores do assunto e profissionais que militam na rea, Sim, em termos. Eles so mais importantes em reas limpas, onde a contaminao microbiana muito baixa. Buscamos um indicador numrico, baseado em
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a partir de estudos e das experincias prticas. Como se trata de critrios estabelecidos pelo homem, questionamentos decorrentes do avano cientfico e do prprio desenvolvimento de anlises estatsticas aplicadas microbiologia. Por isso, natural que sejam continuamente discutidos, de acordo com o avano tcnico-cientfico. estatsticas e critrios cientficos, a ser tomado como referncia. Seja ele qual for, importante que seja acordado por especialistas dos diversos pases e tenhamos parmetros claramente estabelecidos. Caminhamos nesta direo e estou confiante de que a reviso da norma ISO 14698 ser um avano para harmonizar padres.
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Foto: Glaucia Motta

os limites fixados esto sujeitos a