DETECTORES DE CROMATOGRAFIA LQUIDA Um detector classificado como seletivo se responde diferentemente estruturas moleculares diferenciadas da amostra, e universal se responde

nde de modo similar a muitos compostos. Absorbncia e Fluorescncia so os detectores seletivos mais usados. ndice de refrao o nico detector universal utilizado. Enquanto que o detector de ndice de refrao -Vis) so destrutivos, isto , as amostras podem ser coletadas para testes qualitativos posteriores de caracterizao. DESCRIO GERAL DE HPLC A amostra dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatogrfica preenchida com a fase estacionria (FE) Um solvente (FM) bombeado com vazo constante e desloca os componentes da mistura atravs da coluna. Esses se distribuem entre as duas fases de acordo com suas afinidades As substncias com maior afinidade com a FE movem-se mais lentamente. J as substncias com pouca afinidade com a FE movem-se mais rapidamente. Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal eltrico o qual registrado, constituindo um cromatograma. A cromatografia pode ser conceituada como um mtodo fsico-qumico de separao, no qual os constituintes da amostra a serem separados so particionados entre duas fases, uma estacionria (FE) geralmente de grande rea e outra que percola atravs da primeira, a fase mvel (FM). Aplicaes Protenas e aminocidos Pesticidas Frmacos Explosivos HPAS Vitaminas Pigmentos Aucares Polmeros ons metlicos

Usos e Limitaes Na Cromatografia Lquida os compostos a serem analisados no necessitam ser volteis ou termicamente estveis, mas necessrio que sejam solveis na fase mvel (FM) que possuam uma possvel interao com a FE e que possam adequadamente ser detectadas. DETECTORES PARA HPLC Tem a funo de monitorar o efluente da coluna e fornecer a medida detectada do soluto; Funciona de acordo com diferentes princpios, mas todos geram sinal eltrico que proporcional a alguma propriedade do analito; A resposta do detector pode ser relacionada com a quantidade de analito, portanto o detector deve ser calibrado com cada espcie de interesse; A escolha do detector de acordo com as caractersticas dos analitos.

Caractersticas ideais de um detector: Alta sensibilidade; Boa estabilidade e reprodutibilidade; Resposta linear; Resposta rpida, independente da vazo; Insensvel a trocas de temperatura e presso; Alta confiabilidade e fcil uso; Seletividade, preciso, exatido; No destruir a amostra.

Sistemas de Deteco: Qualquer propriedade qumica ou fsica que pode ser medida em soluo pode, em princpio, ser utilizada para a deteco. Propriedades da soluo: mede alguma mudana ocorrida na FM. Ex. ndice de refrao e eletroqumicos. Propriedades do soluto: mede uma propriedade especfica do soluto. Ex. Espectrofotomtrico UV-vis e DAD.

2. Detector de Fluorescncia Baseia-se na medida da luz emitida pelas substncias previamente irradiadas com luz UV. 2.1. Aplicao: Na deteco de compostos fluorescentes, (vitaminas (ex. riboflavina), micotoxinas, HPAs, etc) e compostos derivatizados (ex. aminas). 2.2. Vantagens: - Muito sensvel

- No destrutivo - Permite gradiente 2.3. Desvantagens: - Poucas substncias so naturalmente fluorescentes 3. Detector de ndice de Refrao Baseia-se na medida da diferena do ndice de refrao da FM na presena das substncias. Para aplicaes gerais. 3.1. Detecta: Quantidade 3.2. Vantagens: - Praticamente todas as substncias so detectveis - No destrutivo 3.3. Desvantagens: - Sensibilidade menor que UV - Sensvel a diferenas de T, vazo e presso da FM - No permite fazer gradiente DETECTORES POR NDICE DE REFRAO o segundo detector mais usado na CLAE. Este detector acompanha continuamente a diferena de ndice de refrao entre a fase mvel pura e o efluente que sai da coluna contendo os componentes da amostra. Para solutos que no absorvem no UV ou visvel e, conseqentemente, no so detectados por detectores fotomtricos, a melhor escolha o detector por ndice de refrao. A resposta deste detector universal e sua sensibilidade moderada, geralmente da ordem de micrograma (10-6 g). Este nvel de concentrao corresponde a uma diferena no ndice de refrao entre a amostra e a fase mvel de aproximadamente 10 -7 unidades de ndice de refrao. Para observar esta diferena necessrio um controle de temperatura de aproximadamente 0,001 oC, o que normalmente conseguido por circulao de gua, de uma boa fonte termostatizada, atravs do refratmetro ou um bom controle da temperatura ambiente. Alm deste problema com a temperatura, existem ainda outros: a sensibilidade s variaes de vazo e mudanas na composio da fase mvel, que impedem o uso de gradiente por ser difcil encontrar um par de solventes com ndices de refrao idnticos. Qualquer mudana na composio da mistura mudar o ndice de refrao da fase mvel, ento, o lado da referncia ter que mudar, o que quase impossvel. A figura 10 apresenta o esquema de um tipo de detector por ndice de refrao. DETECTORES POR FLUORESCNCIA

A espectroscopia de fluorescncia um mtodo de deteco dos mais sensveis da atualidade, especfico para compostos que fluorescem. Em boas condies possvel detectar quantidades da ordem de picogramas (10-12 g), o que comparvel aos detectores por captura de eltrons em CG. Uma alta intensidade de fluorescncia esperada de compostos que sejam conjugados simetricamente ou que no podem produzir estruturas fortemente inicas. A fase mvel empregada nos detectores de fluorescncia deve ser cuidadosamente selecionada, pois a intensidade de emisso depende do meio em que se encontra a amostra. Isto dificulta algumas de suas aplicaes, tais como anlise quantitativa e eluio por gradiente, nas quais deve-se selecionar os componentes da fase mvel para no atrapalhar a fluorescncia.

Os detectores para fluorescncia tambm podem proporcionar espectros de emisso das amostras retidas momentaneamente na sua cela. Desde que uma fonte de UV necessria em ambos os detectores, por absorbncia no UV e por fluorescncia, eles podem ser combinados em um s detector.

Detector de ndice de Refrao O detector de IR mede mudanas no ndice de reflexo. Uma clula de vidro dividida em duas cmaras (clulas). O fluxo que sai da coluna de HPLC passa atravs da clula de amostra enquanto a outra clula, chamada clula de referncia, cheia apenas com a fase mvel. Quando o efluente que passa pela clula de amostra no contm analito, o contedo das duas clulas o mesmo (Figura 1A). Nesse caso, quando um feixe de luz incide sobre as clulas, o feixe observado no sofre desvio. Mas se o efluente contiver quaisquer componentes diferentes dos da fase mvel, ocorrer um desvio do feixe devido diferena nos ndices de reflexo nos dois lquidos (Figura 1B). Medindo-se essa diferena, a presena dos componentes pode ser observada.

Figura 1

O detector de IR menos sensvel do que o UV, sendo esta a principal razo pela qual ele menos usado do que este. Mas ele possui algumas vantagens sobre o detector de UV. Ele adequado deteco de todos os componentes. Por exemplo, amostras que no absorvem luz UV, como

acares, alcois ou ons inorgnicos no podem, obviamente, ser analisadas com um detector UV. Em contraste, mudana no ndice de reflexo ocorre para qualquer analito e, portanto, o detector de IR serve para todos. Ele aplicvel para os casos em que o solvente absorve no UV, quando um detector UV no pode ser usado. Algumas vezes, o solvente orgnico usado para anlise por GPC absorve no UV e, portanto, esse detector no pode ser usado. Ele fornece uma relao direta entre intensidade e concentrao do analito. A quantidade de luz UV absorvida depende de cada analito; portanto, a intensidade do pico obtido com um detector UV no d informaes sobre a concentrao. J a intensidade observada comum detector de IR proporcional concentrao do analito. Por essas vantagens, o IR usado com frequncia para deteco de acares e para anlise de GPC.

Detector de Fluorescncia A vantagem do mtodo de fluorescncia sua alta sensibilidade para grupos seletivos de compostos no nvel de fg. Usando-se um comprimento de onda especfico, os tomos do analito so excitados e, ento, emitem um sinal luminoso (fluorescncia). A intensidade dessa luz emitida monitorada para quantificar a concentrao do analito. A maioria dos frmacos, produtos naturais, amostras clnicas e derivados de petrleo apresentam absoro fluorescente. Alguns compostos que no a apresentam ou que tm baixa absorbncia, podem ser tratados com derivados fluorescentes como o cloreto de dansila. O sistema fcil de operar e relativamente estvel. DETECTORES NDICE DE REFRAO No momento da passagem do analito pelo detector, pode ocorrer uma alterao do ndice de refrao. Essa alterao em relao ao valor da fase mvel livre de analito detectada. A deteco s possvel quando o ndice de refrao do analito diferente do IR da fase mvel. Esse detector normalmente utilizado quando os analitos no absorvem na regio de comprimento de onda do UV-VIS. Apresenta as seguintes desvantagens: baixa sensibilidade no permite a utilizao em anlises por gradiente (pois o IR varia com a composio da fase mvel) temperatura deve ser constante (pois o IR varia com a temperatura)

APLICAO Anlises de carbohidratos e acares em geral.