BIOLOGIA MOLECOLARE

NLM 5978 VER 30 11 2010

TOTALE PAGEINE 6

BA064 INNER MIX BA071 BIOMIX

20 TEST 20 TEST

MIX ACCESSORIE PER GEN-C

NUCLEAR LASER MEDICINE S.r.l. UFFICI OPERATIVI: Viale delle Industrie, 3 20090 SETTALA MI (Italy) Tel (+39) 02/95. 24. 51 - Fax (+39) 02/95. 24. 52. 37 SITO INTERNET: www.nlm.it E-MAIL: info@nlm.it

MQI013-3

REAGENTI ACCESSORI AC004

(forniti solo su richiesta) per lutilizzo di amplificati non biotinilati (es. Taqman Roche)

1. BIOMIX (BA071)
La Biomix prevede laggiunta di biotina ad amplificati provenienti da metodiche non-biotinilate. Prima della fase di denaturazione dispensare 4l di Biomix ai 30l di ogni amplificato; miscelare con cura, aggiungere 30l di denaturante, incubare 5 minuti e procedere come da metodica. Attenzione la Biomix viene fornita con una modularit di 4 sedute da 5 campioni ciascuna. Lesecuzione di un minor numero di test per seduta comporta linsufficienza dei reagenti per i test previsti.

2. INNER-MIX (BA064)
La Inner-mix permette la ri-amplificazione con primers biotinilati della regione 5-UTR del virus dellEpatite C, a partire da cDNA o da amplificati ottenuti attraverso altre metodiche di amplificazione virale (metodo nested). La mix da utilizzare in abbinamento allenzima di amplificazione dal tappo color verde.

STRUMENTI NECESSARI MA NON FORNITI

AREA 1 Cappa a flusso laminare verticale Set dedicato di pipette a volume variabile Puntali con filtro e provette sterili monouso e provette per PCR da 0,2 ml Taq DNA polimerasi dal tappo color verde AREA 2 Termociclatori (GeneAmp PCR System 2700, PerkinELmer; PTC100, MJ Research; MasterCycler, Eppendorf; MyCycler, BioRad) Set dedicato di micropipette a volume variabile e puntali con filtro

PROCEDURA
Gli amplificati ad alto titolo (fino a 10 ) vanno diluiti 1:1000 con acqua distillata mentre per quelli a titolo 4 3 2 inferiore (10 ) sufficiente una diluizione 1:100; i campioni a titolo molto basso (10 o 10 ) vanno diluiti 1:50 o 1:10. Data la variabilit di efficienza della precedente amplificazione, tali indicazioni sono prettamente generiche e devono essere adattate a cura dellutilizzatore. Attenzione: per evitare contaminazioni, eseguire le diluizioni degli amplificati e aggiungerli alla mix solo nella zona post-PCR.
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AMPLIFICAZIONE Reagenti Mix Dna polimerasi - tappo verde Volume per campione 39,5 l 0,5 l

Preparare la Master Mix per il numero di campioni +1 volume (per avere una quantit di mix sufficiente per tutti i campioni da processare). Miscelare e dispensare 40 l di Master Mix in provette da 0,2 ml precedentemente contrassegnate. Aggiungere in ciascuna provetta 10 l del rispettivo amplificato opportunamente diluito e miscelare pipettando su e gi. Preriscaldare il coperchio del termociclatore prima di inserire le provette; posizionare le provette nel termociclatore ed impostare il seguente profilo termico:

Ciclo 94C 55C 72C 4C

Tempo 30 sec 30 sec 45 sec X 45

RIVELAZIONE SU GEL (i reagenti per la preparazione del gel non sono inclusi) Questa fase non richiesta, ma prima di effettuare il test HCV Genotyping possibile rivelare la presenza di amplificati di HCV caricando il prodotto di PCR su gel dagarosio al 2%. I campioni positivi di HCV amplificati con la Inner-mix danno una banda di 238 bp.

RIVELAZIONE SU STRISCIA Come da protocollo AC004 con 15l di amplificato e 15 l di DNAT.

Per ulteriori informazioni fare riferimento alla metodica del kit GEN-C cod. AC004

MOLECULAR BIOLOGY
NLM 5978 VER 30 11 2010
TOTAL PAGES 6

BA064 INNER MIX BA071 BIOMIX

20 TEST 20 TEST

ACCESSORY REAGENTS FOR GEN-C

NUCLEAR LASER MEDICINE S.r.l. HEAD OFFICE: Viale delle Industrie, 3 20090 SETTALA MI (Italy) Tel (+39) 02/95. 24. 51 - Fax (+39) 02/95. 24. 52. 37 WEB: www.nlm.it E-MAIL: info@nlm.it

MQI013-3

ACCESSORY REAGENTS AC004

(provided only upon request) for the use of non-biotinilated products (e.g. Taqman Roche)

1. BIOMIX (BA071)
The Biomix allows biotinilation of amplificated products coming from non-biotinilated tests. Before starting the denaturation step, add 4l of Biomix in 30l of each amplificated sample; mix well, add 30l of denaturing solution and proceed as previously described. Reagents are provided for four distinct runs of 5 samples each. If modularity isnt respected reagents could not be enough for the number of tests declared

2. INNER-MIX (BA064)
The Inner-mix allows re-amplification with biotinilated primers of 5-UTR region of Hepatitis C virus from cDNA or amplification products derived from other viral amplification methods (nested PCR). The amplicons obtained can then be used to determine HCV genotype through reverse hybridization. Amplification enzyme assigned: green cap

MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED

AREA 1 Vertical downflow airbox Dedicated adjustable volume pipettes set. Aerosol-resistant pipet tips and disposable sterile 0,2 ml PCR tubes. DNA polymerase (green cap). AREA 2 Thermal Cycler (GeneAmp PCR System 2700, Perkin Elmer; PTC100, MJ Research; MasterCycler, Eppendorf; MyCycler, BioRad) Dedicated adjustable volume pipettes set and aerosol-resistant pipet tips

PROCEDURE
High titer amplicons (up to 10 ) have to be diluted 1:1000 with distilled water, whereas those with a lower titer 4 3 2 (10 ) have to be diluted 1:100; samples with a very low titer (10 or 10 ) have to be diluted 1:50 or 1:10. Due to the variability in efficiency of the previous amplification, these indications are to be considered as general and have to be adapted by the single user. Warning: to avoid cross-contamination dilute amplicons and add them to the Inner master mix only in the post-PCR area. AMPLIFICATION Reagents Primer mix DNA polymerasegreen cap Volume per sample 39,5 l 0,5 l
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Prepare the Master mix for the number of samples to be analyzed +1. Dispense 40 l of this mix in each PCR tube previously marked. Add 10 l of the sample (properly diluted) to each tube. Pre-warm the thermal cycler lid and put the tubes in the thermal cycler after setting the following program:

Temperature 94C 55C 72C 4C

Time 30 sec 30 sec 45 sec X 45

GEL DETECTION (Reagents for gel preparation are not included) This step is not required, but before proceeding with HCV Genotyping it is possible to detect the presence of HCV amplicon by loading PCR product on 2% agarose gel stained with Ethidium Bromide. HCV positive samples amplified with the Inner mix give a 238 bp band.

STRIP ASSAY Detection as described in AC004 with 15l of amplificated product and 15 l of DNAT.

For any further information please refer to the instructions of the kit GEN-C cod. AC004

Lot number

Catalogue number

In vitro diagnostic device Temperature limitation Use by

Site of manufacturing

Consult instructions for use

European Conformity

Irritant