Anlisismicrobiolgico:Documentoaclaratorio NT32Rev.

3Abril2012

Pgina INDICE 1. INTRODUCCIN....................................................................................................................................1 2. 3. 4. OBJETOYCAMPODEAPLICACIN........................................................................................................2 MTODOSDEENSAYO..........................................................................................................................2 CARACTERSTICASDEFUNCIONAMIENTODELOSMTODOS.VALIDACIN...........................................3 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 5. 6. Mtodosnormalizados(TipoI)............................................................................................................ 3 Mtodosalternativos(TipoII).............................................................................................................. 3 Mtodosbasadosenmtodosdereferencia(TipoIII)........................................................................4 ComprobacindelfuncionamientodemtodosTipoI,IIyIII ..............................................................4 Otrosmtodos(TipoIV)....................................................................................................................... 5

ESTIMACINDEINCERTIDUMBRE.........................................................................................................5 ASEGURAMIENTODELACALIDADDELOSRESULTADOSDEENSAYO.....................................................5 6.1. 6.2. Controlinterno.....................................................................................................................................6 Controlexterno(intercomparaciones)................................................................................................. 6

7.

REFERENCIAS.......................................................................................................................................7

ANEXOI:CEPASDEREFERENCIA 1. INTRODUCCIN El desarrollo y realizacin de anlisis de control microbiolgico es una herramienta que tiene una repercusin decisivaenelmbitodelasaludpblica,latecnologaalimentariayelMedioAmbiente. Los laboratorios que realizan estos ensayos trabajan en un entorno de creciente exigencia y responsabilidad, tanto legal como social, que reclama un nivel de calidad y de confianza extraordinarios. Por ello, tanto los mtodos de ensayo como los laboratorios que realizan los anlisis deben asegurar, al mximo nivel permitido por el desarrollo cientfico y tcnico, la fiabilidad de los resultados. Esto implica que, adems de reunir los criterios tcnicos que aseguren su validez, deben ser realizados con una serie de garantas, que permitan obtenerresultadoscomparables,conindependenciadellaboratorioquelosejecute.Enestesentido,elempleo demtodosdereferencia,reconocidosyaceptados,eslaherramientamseficazparaobtenerestasgarantas En la actualidad, existe una amplia disponibilidad de mtodos de ensayo (por ejemplo normas de ensayo que tienen reconocimiento internacional como mtodos de referencia) que establecen el estndar cientfico a considerar, llegando incluso, cada vez con ms frecuencia, a convertirse en mtodos oficiales al ser invocados enlareglamentacin. Por otra parte, los criterios de acreditacin de ENAC deben mantenerse siempre en lnea con las tendencias que las comunidades cientfica y tecnolgica establecen como ms apropiadas, establecidas en este caso por mtodosdereferencia,comonormasydocumentossimilares.Porestarazn,seconsideranecesarioponerde manifiesto las ventajas que aporta a los laboratorios el uso de mtodos de referencia normalizados, como va principal para garantizar la validez de los mtodos y la fiabilidad de los resultados, frente a mtodos de elaboracinpropiaquerequierendeprocesoscomplejosdevalidacin.
1/8

Anlisismicrobiolgico:Documentoaclaratorio NT32Rev.3Abril2012

En la elaboracin de este documento han participado la Sociedad Espaola de Microbiologa (SEM), la Agencia Espaola de Seguridad Alimentaria y Nutricin (AESAN), el Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino (MARM) y la Asociacin de Entidades de Ensayo, Calibracin y AnlisisFELAB (EUROLAB EspaaAsociacinEspaoladeLaboratoriosdeEnsayo,CalibracinyAnlisis/AELIAsociacinEspaolade Laboratorios Independientes). Asimismo, se ha previsto la posibilidad de incorporar anexos a este documento, relativos a cuestiones tcnicas de inters, elaborados en su caso, en colaboracin con organizacionestcnicascompetentes. 2. OBJETOYCAMPODEAPLICACIN El objetivo de este documento es establecer los criterios a utilizar por ENAC para la acreditacin de los laboratoriosquerealizanensayosmicrobiolgicos. No debe entenderse esta nota como un documento en el que se establece una metodologa para la validacin de mtodos de ensayo sinocomo unas directrices que faciliten tanto la implantacinen los laboratorios de los aspectosaqurecogidos,comosuevaluacinporpartedeENAC. Asimismo, se incluye un anexo sobre manipulacin y conservacin de cepas referencia, elaborado en colaboracinconlaColeccinEspaoladeCultivosTipo(CECT). 3. MTODOSDEENSAYO La norma UNEEN ISO/IEC 17025 en su apartado 5.4.2 establece que El laboratorio debe utilizar mtodos de ensayo que satisfagan las necesidades del cliente y sean apropiados para el uso previsto. Por tanto, debe tenerse en cuenta el mbito de aplicacin, tanto por el laboratorio en cuanto a la seleccin de los procedimientos de ensayo y su validacin, como por el organismo de acreditacin en las evaluaciones que realice. Adems, la norma establece que cuando el cliente no especifique el mtodo a utilizar, el laboratorio debe seleccionar los mtodos apropiados que hayan sido publicados en normas internacionales, regionales o nacionales, por organizaciones tcnicas reconocidas o en libros o revistas cientficas especializados o especificados por el fabricante de equipos. Por tanto, en el caso de elegir un procedimiento de ensayo interno, es recomendable que se parta demtodos de referenciaque sean ampliamente aceptados, conocidos yaplicadosenelsector. As pues, debido al marco en que se ubica la aplicacin y uso de los ensayos microbiolgicos, se podra establecerlasiguienteclasificacindemtodos,atendiendoalniveldeconfianzaqueaportanyque,portanto, marcarnelniveldeinformacinadicionalqueENACrequerirrelativaasuvalidez: Tipo I: Mtodos normalizados. Son mtodos desarrollados por un organismo de normalizacin o por otras organizaciones bien establecidas, cuyos mtodos son generalmente aceptados por el sector tcnicoencuestin(ILACG18)(Ej.:ISO,NF,NMKL,UNE,EN,AOAC,APHAetc.) Nota: Un mtodo normalizado ha sido exhaustivamente estudiado y describe de forma clara y exacta lascondicionesderealizacindelensayo.Suscaractersticasdefuncionamientodebenseracordescon el uso previsto. Estos mtodos normalizados son considerados mtodos de referencia ya que pueden serutilizadosparaevaluarotrosmtodosdesarrolladosparalamismadeterminacin(ISO16140).

2/8

Anlisismicrobiolgico:Documentoaclaratorio NT32Rev.3Abril2012

Tipo II: Mtodos alternativos. Mtodos que han sido validados por comparacin con el mtodo de referencia que corresponda, de acuerdo a un estndar aceptado (ej. ISO 16140, ISO/TR 13843, ISO 17994 etc.) y son generalmente reconocidos por la comunidad cientfica y tecnolgica como equivalentesalmtododereferencia. Tipo III: Mtodos basados en mtodos de referencia. Mtodos descritos en procedimientos internos del laboratorio, que estn basados claramente en mtodos de referencia y que no suponen una modificacin tcnica respecto del mtodo de referencia que ponga en cuestin su validez tcnica. Debenmantenerseactualizadosenrelacinconelmtododereferenciaenquesefundamentan. Nota: En cualquier caso, se consideran modificaciones tcnicas respecto del mtodo de referencia, aquellas que pongan en cuestin su validez tcnica, como por ejemplo, cambios relevantes en un mediodecultivo,cambiosenlascondicionesdeincubacin(tiempo/temperatura),etc. TipoIV:Otrosmtodos.Sonaquellosmtodosdesarrolladosporelpropiolaboratoriooporcualquier otra parte (un fabricante o proveedor de equipos, de medios de cultivo etc.), y que no disponen del reconocimientodelosmtodosdereferenciaodelosmtodosalternativos. Nota: En los Anexos Tcnicos nicamente los mtodos del Tipo I reflejarn la norma o documento de referencia. Los mtodos englobados en los Tipos II, III y IV figurarn en el Anexo Tcnico como Procedimiento Interno. Comopartedelosprocedimientosdeensayo,sedebenincluirtambinlosprocedimientosparalapreparacin de las muestras en relacin con el alcance solicitado, pues se trata de un aspecto crtico en determinados alcances (ej.: alimentos). Existen normas reconocidas que regulan la manipulacin previa de los objetos de ensayo (ej. serie de normas ISO 6887, UNEEN ISO 8261) y que deben ser consideradas como una referencia adecuada. 4. CARACTERSTICASDEFUNCIONAMIENTODELOSMTODOS.VALIDACIN. Los mtodos de ensayo presentados para su acreditacin deben estar validados. Segn la norma UNEEN ISO/IEC17025lavalidacineslaconfirmacin,atravsdelexamenyelaportedeevidenciasobjetivas,deque se cumplen los requisitos particulares para un uso especfico previsto. Para ello, es necesario conocer las caractersticasdefuncionamientodelmtodo. Por otra parte, la extensin de las actividades de validacin a realizar por el laboratorio depender del tipo de mtodoseleccionado: 4.1. Mtodosnormalizados(TipoI) Los mtodos normalizados entendidos como de referencia no requieren una validacin completa. El laboratorio debe, tal y como establece la norma UNEEN ISO/IEC 17025:2005 confirmar que puede aplicarcorrectamentelosmtodosnormalizadosantesdeutilizarlosparalosensayos. 4.2. Mtodosalternativos(TipoII) A efectos de validacin, los mtodos alternativos se tratarn como los mtodos de referencia. No obstante,paraqueENACentiendaqueunmtodosepuedeconsiderarcomomtodoalternativodeber disponer de evidencias de su validacin. En caso de que dichas evidencias no estn disponibles ser responsabilidaddellaboratoriosolicitanteelaportarlas.
3/8

Anlisismicrobiolgico:Documentoaclaratorio NT32Rev.3Abril2012

4.3. Mtodosbasadosenmtodosdereferencia(TipoIII) Los mtodos basados en mtodos de referencia no precisan de una validacin completa. No obstante el laboratoriodeberrealizarlanecesariacomprobacindesufuncionamiento. 4.4. ComprobacindelfuncionamientodemtodosTipoI,IIyIII El laboratorio debe justificar la seleccin del nmero y tipo de matrices en funcin del alcance de acreditacin y sta debera basarse en la informacin tomada de referencias bibliogrficas o estndares internacionales(ej.:AnexoBdeUNEENISO16140,ISO/TS19036). A continuacin se indican las caractersticas de funcionamiento que al menos se deben confirmar en el caso de mtodos de referencia, alternativos y basados en mtodos de referencia teniendo en cuenta la naturalezadelmtodo: Mtodoscuantitativos: Recuperacin En cuanto a la estimacin de la recuperacin debera evaluarse a partir de valores de referencia. Estos valores podran obtenerse por comparacin con mtodos de referencia, a partir de muestras inoculadas con materiales de referencia o cepas de referencia o a partir de resultados deinterlaboratorios. Reproducibilidad Se considera una referencia adecuada las pautas establecidas en el documento tcnico ISO/TS 19036:2006. Hay que tener en cuenta que, se debe realizar el clculo de la precisin (reproducibilidad) en muestrascondiferentesnivelesdecontaminacin(ISO19036:2006ysumodificacin). En el caso de muestras con alto nivel de contaminacin se deben realizar las correspondientes dilucionesdecimalesparapermitirelrecuentodelasplacas,dentrodelintervaloqueseestablece endocumentosdereferencia(ej.normasISO8199eISO7218). Mtodoscualitativos: Lmitededeteccin Laestimacindellmitededeteccinrequieredelempleodesuspensionesdeinculoconniveles deconcentracinbajos.Elpropiointervalodeconfianzaaestosbajosniveleshaceque,desdeun punto de vista estadstico, no se pueda conocer de forma exacta si un determinado inculo contiene o no el microorganismo a detectar. Por tanto, es aceptable comprobar el mtodo con bajos niveles de inculos de microorganismos diana de forma que se evalen diferencias entre las distintas matrices, analistas, equipos etc., verificndose la capacidad del laboratorio para obtenerresultadosreproduciblesyeficacesaestosniveles.
4/8

Anlisismicrobiolgico:Documentoaclaratorio NT32Rev.3Abril2012

Asimismo,puedeobtenerseinformacinsobrelascaractersticasdefuncionamientodelosmtodosde: - Actividadesdecontroldecalidadinterno:Losresultadosobtenidosenlasactividadesdecontrolde calidad interno aplicando el mtodo de ensayo a confirmar, pueden ser utilizados en la comprobacindelmtodo(ej.verificacindenuevasmatrices). - Participacin en Intercomparaciones (Control de calidad externo): Los resultados obtenidos en la participacin en intercomparaciones, tambin pueden ser utilizados para la comprobacin de un mtodo. Para ello, el laboratorio deber evaluar la idoneidad y calidad del programa de intercomparacin, valorando si es adecuado utilizar la informacin proporcionada por el ejercicio enlacomprobacin. PuedetomarsecomoreferencialodispuestoalrespectoenGENAC09oISO/TS19036. 4.5. Otrosmtodos(TipoIV) La norma UNEEN ISO/IEC 17025 en su apartado 5.4.2 establece que el laboratorio debe validar los mtodos no normalizados y los mtodos que disea o desarrolla para confirmar que los mtodos son aptos para el fin previsto. La validacin debe ser tan amplia como sea necesario para satisfacer las necesidadesdeltipodeaplicacinodelcampodeaplicacindados.Portanto,paraestetipodemtodos, el laboratorio deber evaluar su idoneidad para su mbito de aplicacin as como las actividades necesariasarealizarparagarantizarsuvalideztcnica. En este sentido las actividades recogidas en el apartado 4.4 que se han considerado como vlidas para asegurar la adecuacin al uso, no permiten garantizar de forma completa la validez de los mtodos definidos como Tipo IV ni su caracterizacin ya que stas deben estar fundamentadas en referencias vlidas(ej.:ISO16140,ISO/TR13843,UNEENISO17994) ENAC deber disponer de evidencias completas de que dichos mtodos han sido adecuadamente validados. El laboratorio deber disponer de toda la informacin sobre el trabajo experimental realizado paralavalidacindelmtodo. ESTIMACINDEINCERTIDUMBRE

5. LaestimacindeIncertidumbrenoesdeaplicacinamtodoscualitativosniNMP. En el caso de ensayos microbiolgicos de recuento en productos agroalimentarios se ha publicado la ISO/TS 19036:2006 que puede utilizarse como referencia. En el caso de anlisis microbiolgico de aguas existe el documentoISO29201,elcualestendesarrollo. 6. ASEGURAMIENTODELACALIDADDELOSRESULTADOSDEENSAYO EnlanormaUNEENISO/IEC17025seestablecequeellaboratoriodebedisponerdeuncontroldecalidadpara realizarelseguimientodelavalidezdelosensayos.

5/8

Anlisismicrobiolgico:Documentoaclaratorio NT32Rev.3Abril2012

En el mbito de los ensayos microbiolgicos, la implantacin de actividades de control de calidad adecuadas resulta especialmente importante, dado que no siempre es posible caracterizar de forma completa el funcionamientodeestosprocedimientosdeensayo.Noobstante,esfactibleestablecersistemasquepermitan garantizareladecuadocontroldelosprocedimientosdeensayomicrobiolgicos. Elaseguramientodelacalidaddebesertantointernocomoexternoypuedeaplicarsedediferentesformas: 6.1. Controlinterno - Control de las condiciones de trabajo: proporciona informacin sobre la esterilidad de los medios y materiales auxiliares utilizados y en general, sobre la buena prctica en la realizacin de los ensayos. Debenexistircriteriosparaladesviacinpermitida. Ensayoscuantitativos: - Controldelaprecisin:muestrasnaturalessininoculary/omuestrasnaturalesinoculadas - Controlderecuperacin:muestrassegnloestablecidoenelapdo.4.4(Recuperacin) Ensayoscualitativos: - Elcontroldecalidadinternodebeincluiractividadesquegaranticenunadecuadocontroldelmtodoa nivelesbajosdecontaminacin(verapdo.4.4Lmitededeteccin) Estasactividadesdecontroldecalidaddebenrealizarseenlamedidadeloposibleconmuestrasnaturales tantopositivas(inoculadasocontaminadasnaturalmente)comonegativas. 6.2. Controlexterno(intercomparaciones) La participacin en intercomparaciones permite una evaluacin del sesgo de forma que el laboratorio pueda demostrar que se mantiene dentro de los criterios de aceptacin definidos por normas, reglamentos,porelclienteoporellaboratorio. Todaslasactividadesdeaseguramientodelacalidaddebernplanificarsedeformaque,eneltiempoyen funcindelalcancedelmtodoseincluyaunaadecuadarepresentacindelavariedaddematricesconlas quetrabajaellaboratorio,complementndoseaslosresultadosobtenidosenlavalidacininicial. Por ltimo, la periodicidad de las actividades de control de calidad tanto interno como externo deber establecerseconsiderandodiversosfactorescomopuedenser: - La robustez del mtodo utilizado (en funcin de los controles especficos incluidos en el mismo, mtodo de referencia o de rutina, pruebas de confirmacin, datos de validacin, vigencia del mtodo etc.) - La frecuencia con la que el laboratorio ejecuta dichos anlisis (dado que se debe asegurar que el laboratorio mantiene la destreza en la ejecucin del mismo en cuanto a los materiales, equipos y cualificacindelpersonal) - Losresultadoshistricosdeaseguramientodecalidad,ascomolacorrectaevaluacindelosmismos.
6/8

Anlisismicrobiolgico:Documentoaclaratorio NT32Rev.3Abril2012

- Los resultados obtenidos en el conjunto de acciones de evaluacin de la calidad (ej. siembra por duplicado de placas, verificacin del factor de dilucin, interlaboratorios, muestras blancas, control de mediosdecultivo,controlesambientales,cualificacindelpersonaletc.) 7.

REFERENCIAS Reglamento (CE) n 2073/2005, de la Comisin, de 15 de noviembre de 2005, relativo a los criterios microbiolgicosaplicablesalosproductosalimenticios. GENAC04Rev.1Guaparalaacreditacindelaboratoriosdeanlisismicrobiolgicos. GENAC09Rev.1Guaparalaexpresindelaincertidumbreenlosensayoscuantitativos. ILACG18:04/2010.GuidelinefortheFormulationofScopesofAccreditationforLaboratories UNEEN ISO 16140:2003 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal. Protocolo para lavalidacindemtodosalternativos. ISO/TR13843:2000WaterqualityGuidanceonvalidationofmicrobiologicalmethods. ISO17994:2004WaterqualityCriteriaforestablishingequivalencebetweenmicrobiologicalmethods. ISO19458:2006WaterqualitySamplingformicrobiologicalanalysis. ISO8199:2005WaterqualityGeneralguidanceontheenumerationofmicroorganismsbyculture. ISO/TS 19036:2006 Microbiology of food and animal feeding stuffs Guidelines for the estimation of measurementuncertaintyforquantitativedeterminations. UNEEN ISO 68871:2004 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y alimentacin animal. Preparacin de las muestras de anlisis, suspensin inicial y diluciones decimales para examen microbiolgico.Parte1:Reglasgeneralesparalapreparacindelasmuestrasdeanlisis,suspensininicial ydilucionesdecimales. UNEEN ISO 68872:2004 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y alimentacin animal. Preparacin de las muestras de anlisis, suspensin inicial y diluciones decimales para examen microbiolgico.Parte2:Reglasespecficasparalapreparacindecarneyproductoscrnicos. UNEEN ISO 68873:2004Microbiologadelos alimentos para consumohumano y animal. Preparacin de las muestras de ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para examen microbiolgico. Parte 3: Reglasespecficasparalapreparacindepescadosyproductosdelapesca. UNEEN ISO 68874:2004 y UNEEN ISO 68874/AC:2005 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal. Preparacin de las muestras de ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para examen microbiolgico. Parte 4: Reglas especficas para la preparacin de productos distintos a leche y productoslcteos,carneyproductoscrnicosy,pescadosyproductosdelapesca. UNEEN ISO 8261:2002 Leche y productos lcteos. Directrices generales para la preparacin de muestras paraanlisis,suspensionesinicialesydilucionesdecimalesparaelanlisismicrobiolgico.
7/8

Anlisismicrobiolgico:Documentoaclaratorio NT32Rev.3Abril2012

UNEEN ISO/IEC 17025:2005 Evaluacin de la conformidad. Requisitos generales para la competencia de loslaboratoriosdeensayoycalibracin. UNEENVISO111331:2001.Microbiologadelosalimentosparaconsumohumanoyanimal.Guaparala preparacin y produccin de medios de cultivo. Parte 1: Directrices generales para el aseguramiento de la calidadparalapreparacindemediosdecultivoenellaboratorio. UNEENVISO111332:2006.Microbiologadelosalimentosparaconsumohumanoyanimal.Guaparala preparacin y produccin de medios de cultivo. Parte 2: Gua prctica para las pruebas de rendimiento de mediosdecultivo. ISO 7218: 2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs. General rules for microbiological examinations CEN ISO CD 11133: 2009. Microbiology of food, animal feeding stuffs, food production environment and waterPreparation,production,storageandperformancetestingofculturemedia. ISO 29201. Water Quality The variability of test results and the uncertainty of measurement of microbiologicalenumerationmethods.

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Puede consultar su revisin en la pgina webdeENACointernamenteenred.

8/8

Anlisismicrobiolgico:Documentoaclaratorio NT32Rev.3Abril2012 AnexoI

CEPASDEREFERENCIA

1. Nmero de pases que se pueden realizar a una cepa procedente de CC/BRC (Coleccin de
CultivosMicrobianosreconocidaoCentrodeRecursosBiolgicosMicrobianos): Lareconstitucindelacepaysuprimerasiembraenmediodecultivoesslounaactivacin ynodebeconsiderarseunpase. La activacin es una etapa necesaria y crtica y debe hacerse en los medios de cultivo indicadosporlaColeccin.Ellaboratoriodebeconservarregistrosdedichaetapa. Los pases que se hayan realizado en la Coleccin de procedencia no deben ser tenidos en cuenta por el laboratorio ni afectan al nmero de pases que puede realizar (los pases realizados en la Coleccin forman parte de los Antecedentes de la cepa y quedan registradosenlafichadecadacepaquelaColeccindebemanteneractualizada). El laboratorio debe demostrar que el nmero de pases que realiza a las cepas no afecta a sus caractersticas (en funcin de su uso previsto). Debe tenerse en cuenta que a mayor nmerodepasesmayorriesgodecontaminacinydequeseproduzcanmutaciones.

2. VerificacindelascepasprocedentesdeCC/BRCenellaboratorio:
No es necesario que el laboratorio confirme la identidad de la cepa de referencia ya que sta vieneaportadaconelcertificado. Las verificaciones a realizar por el laboratorio dependern, en cada caso, del uso previsto de la cepa. Por tanto, el laboratorio deber confirmar en el laboratorio nicamente las caractersticas (bioqumicas,morfolgicas,etc.)queleafectensegnelusodedichacepaensulaboratorio.Por otrolado,encadapasedebeevaluarselaviabilidadylapureza.

1/1