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BIOMATERIAIS E TECIDO SSEO
AMRICO DOS SANTOS AFONSO

PORTO-1998
t. .4II
I1
"I
IH
Amrico dos Santos Afonso
.-
Interaco entre Biomateriais e Tecido sseo
PORTO1998
Dissertao de candidatura ao grau de doutor apresentada Faculdade de Medicina Dentria da Universidade do Porto
Aos meus pais Aos meus sogros memria de meu tio minha famlia
Concha e ao Z Pedro, a quem devo esta tese
Aos meus Mestres
Aos Docentes da Faculdade de Medicina Dentria da Universidade do Porto
Agradecimentos:
A concretizao de um trabalho de investigao resulta sempre do esforo e do trabalho de um grupo de pessoas que directa ou indirectamente contribuem para a sua efectivao. Mesmo correndo o risco de no citar todos aqueles que o mereceriam, constituiria uma injustia no reconhecer a colaborao, apoio e o estmulo de um conjunto de pessoas que tornou possvel a realizao deste trabalho. Ao Prof Doutor Jos Cavalheiro, manifesto o meu reconhecimento pela orientao desta dissertao, onde, paralelamente ao apoio cientfico, me transmitiu o exemplo de perserverana, inconformismo, competncia e sentido humanista. Ao Prof Dr. Rogrio Branco, devo a motivao para a investigao no campo dos biomateriais. Estou-lhe grato pela amizade e estima com que me tem distinguido e honrado ao longo dos anos. Os seus conselhos, orientaes, sugestes e crticas serviram como incentivo para o prosseguimento da minha carreira na investigao cientfica. Prof. Doutora Graa Simes de Carvalho, pelo incentivo e exemplo de grande rigor e competncia na investigao cientfica. Ao Prof Dr. Fernando Peres agradeo o apoio incondicional na criao de condies para a realizao do trabalho na Faculdade de Medicina Dentria. Ao Professor Doutor Carlos Bernardo, pelas facilidades concedidadas na Universidade do Minho, pelo interesse com que acompanhou todo o meu trabalho, pelas crticas e sugestes oportunas, presto o meu reconhecimento. Ao colega e amigo, Dr. Mrio Vasconcelos, pela colaborao inexcedvel, apoio e estmulo nas inmeras actividades que realizmos em conjunto, quero expressar a minha gratido. D. Ana Mota, o meu reconhecimento pela colaborao e competncia na elaborao dos trabalhos histolgicos. Ao Dr. Jos Alo Freitas, uma palavra de especial apreo pelo apoio, competncia e disponibilidade na realizao da cirurgia experimental. D. Eduarda Falco, os meus agradecimentos pela colaborao e competncia na cirurgia experimental.
0 Dr. Ramiro Mascarenhas e a respectiva equipa da Estao Zootcnica Nacional foram inexcedveis na competente colaborao que dispensaram durante a cirurgia experimental e na manuteno dos animais. Ao Prof. Doutor Joo Carlos Pinho, expresso o meu reconhecimento pelo estmulo e ajuda na reviso desta dissertao. Ao Prof Doutor Henrique Barros, pela ajuda preciosa no tratamento estatstico dos dados. equipa da "Medisa", quero agradecer todo o apoio, profissionalismo, sugestes e inexcedvel dedicao na elaborao deste trabalho. Aos Laboratrios Bial agradeo o apoio impresso deste trabalho. Ao Sr. Eduardo Oliveira, pela amizade e apoio na preparao da iconografia. Gisela e ao Fred Grech, pela ajuda nas tradues. Aos alunos e funcionrios da FMDUP. Aos meus colegas e amigos.
NDICE
Agradecimentos 9
Captulo I - Contexto e Objectivos do Trabalho Captulo II - Introduo 1. Tecido sseo 1.1. Clulas do Tecido sseo 1.2. Formao do Tecido sseo 1.3. Remodelao ssea 1.4. Reparao do Tecido sseo 2. Biomateriais 2.1. Definio 2.2. Classificao 2.2.1. Metais e Ligas metlicas 2.2.2. Cermicos 2.2.3. Polmeros 2.2.4. Compsitos 2.3. Comportamento Biolgico 2.3.1. Materiais Bio-inertes 2.3.2. Materiais Biotolerados 2.3.3. Materiais Bioactivos 2.4. Bioactividade e Comportamento sseo 2.4.1. Bioactividade 2.4.2. Osseo-integrao ou Osteointegrao 2.4.3. Adeso ssea 2.4.4. Osteoconduo 2.4.5. Osteo-induo 2.5. Biocompatibilidade 2.6. Fenmenos de Superfcie 2.7. Micromovimentos 3. Estudos de Biocompatibilidade 3.1. Estudos in vitro 3.2. Estudos in vivo
15 21 21 24 26 27 28 31 31 32 32 32 34 35 35 35 36 36 36 36 37 38 38 38 38 39 41 45 46 48
Captulo H I - Materiais e Mtodos

1. Materiais
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55
1.1. Caracterizao Geral dos Materiais 1.1.1. Ao Inox 1.1.2. Titnio

1.1.3. Hidroxiapatite 1.1.4. Vidros Bioactivos 1.2. Caracterizao dos Materiais Utilizados
55 55 57
59 62 66
1.2.l.Osteopatite 1.2.2. Cimento de Vidro Bioactivo 2. Mtodos 2.1. Caracterizao dos Materiais 2.1.1. Composio Qumica 2.1.2. Anlise Superficial 2.2. Preparao dos Materiais 2.2.1. Pinos Metlicos (Ao Inox e Titnio) 2.2.2. Osteopatite 2.2.3. Cimento de Vidro Bioactivo 2.3. Experimentao Animal 2.3.1. Modelo Experimental 2.3.2. Protocolo da Cirurgia Experimental 2.4. Preparao Histolgica
2.4.1. Microscopia ptica
66 66 67 67 67 69 70 70 70 71 71 71 74 78
82
2.4.2. Microscopia de Fluorescncia 2.4.3. Microscopia Electrnica de Varrimento 2.4.4. Histomorfometria 2.4.4.1. Anlise Estatstica Captulo IV - Resultados 1. Caracterizao dos Materiais 1.1. Ao Inox 1.2. Titnio 1.3. Osteopatite 1.4. Cimento de Vidro Bioactivo 2. Cirurgia Experimental 3. Histologia
3.1. Microscopia ptica
83 83 87 88 89 89 89 89 92 93 98 99
99
3.1.1. Ao Inox
100
3.1.2. Titnio 3.1.3. Osteopatite 3.1.4. Cimento de Vidro Bioactivo 3.2. Microscopia de Fluorescncia 3.2.1. Amostras metlicas (Ao Inox e Titnio) 3.2.2. Osteopatite 3.2.3. Cimento de Vidro Bioactivo 3.3. Microscopia Electrnica de Varrimento 3.3.1. Ao Inox 3.3.2. Titnio 3.3.3. Osteopatite 3.3.4. Cimento de Vidro Bioactivo 3.4. Histomorfometria Captulo V - Discusso 1. Ao Inox 2. Titnio 3. Osteopatite 4. Cimento de Vidro Bioactivo Captulo VI - Concluses Sugestes para futuras linhas de investigao Resumo/Summary/Rsum Bibliografia
104 110 117 124 126 128 128 130 130 137 144 149 158 163 167 171 177 181 189 191 193 199
I CONTEXTO E OBJECTIVOS DO TRABALHO

A tentativa de substituir a perda de tecidos ou rgos remonta a tempos longnquos na histria humana [1]. So conhecidos relatos, atravs dos tempos, da procura de solues para a perda precoce de dentes, utilizando vrios tipos de materiais [2]. Todavia, s a partir da II Grande Guerra se iniciou efectivamente a investigao e o desenvolvimento de novos materiais. Este desenvolvimento foi fruto das necessidades crescentes de materiais com melhores propriedades para aplicaes industriais e tecnolgicas. Os avanos verificados nesta rea tiveram reflexos importantes na evoluo das solues teraputicas e de diagnstico no campo mdico. Durante a guerra do Vietname, os mdicos militares encontraram-se frequentemente perante a necessidade de reconstrues ou reparaes de grandes perdas de tecido sseo, como consequncia de mutilaes severas. A dificuldade de realizar autotransplantes, por falta de osso em quantidade suficiente, motivou o aparecimento de solues alternativas, que incluam o recurso a novos materiais biocompatveis, tanto metlicos como cermicos ou polimricos. Em anos mais recentes, cientistas e clnicos tm vindo a envolver-se cada vez mais no desenvolvimento e investigao de materiais de alta tecnologia para aplicaes biomdicas. O aumento da utilizao de enxertos no tecido sseo induziu avanos enormes no desenvolvimento de materiais alternativos. A ttulo de exemplo, refira-se que, s nos Estados Unidos da Amrica, so realizadas anualmente mais de 200.000 intervenes deste tipo, na especialidade de ortopedia [3]. Quando uma parte do organismo perde a sua funo ou morfologia, devido a dano traumtico, a processo patolgico ou mesmo a envelhecimento do indivduo, o defeito produzido pode ser tratado e/ou corrigido por duas
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vias: uma a chamada transplantao, na qual podem ser utilizados tecidos ou rgos; a segunda denominada implantologia, que utiliza materiais artificiais para restaurar a funo e/ou a morfologia. O desenvolvimento de novos materiais para utilizao em implantologia pode ser efectuado atravs da criao de um novo material, pelo aperfeioamento e investigao de um material j existente ou pela modificao da sua composio qumica, das suas caractersticas fsicas ou da sua estrutura. Em medicina dentria, a perda precoce de dentes ou o aparecimento de defeitos sseos so situaes que desde sempre preocuparam os clnicos. As solues existentes, para doentes que apresentavam perdas extensas de dentes ou que possuam defeitos sseos amplos, apenas permitiam recuperaes estticas e funcionais muito limitadas. Foi exactamente a procura de solues mais satisfatrias que levou introduo dos biomateriais na medicina dentria. Nesta rea os biomateriais so utilizados na reconstruo ou preenchimento de defeitos sseos [4-7], na preveno da reabsoro de osso alveolar aps a extraco dentria [8-10] e na substituio isolada ou mltipla de dentes [11-14]. Encontram-se actualmente disponveis diversos materiais para utilizao em medicina dentria. Os mais utilizados so o osso (autgeno, algeno, xengeno, descalcificado ou desmineralizado), polmeros, metais e materiais cermicos. As propriedades destes materiais variam significativamente, tanto nas caractersticas mecnicas como na composio qumica. Em princpio, muito difcil conciliar elevada biocompatibilidade e boas caractersticas mecnicas num mesmo material. Os enxertos de osso autgeno so utilizados na reconstruo e/ou preenchimento de defeitos sseos [15]. Estes enxertos so o tipo de substituio ssea mais adequado porque possuem propriedades biomecnicas semelhantes s do tecido que vo substituir [7, 16-18]. O principal inconveniente estarem sujeitos a fenmenos de reabsoro, de comportamento imprevisvel. Acresce que a sua colheita implica uma interveno cirrgica suplementar no doente, que pode assumir riscos considerveis em funo da quantidade de tecido recolhido e do local onde a recolha se processa [7, 16, 19]. Embora seja considerado o mtodo mais histocompatvel e com maior probabilidade de sucesso no preenchimento de defeitos sseos, as limitaes na quantidade de osso que se pode obter, sem complicaes para o doente, restringe a sua utilizao [3,20-22]. Apesar disto, os enxertos de osso autgeno continuam a ser o mtodo mais usado na cirurgia ortopdica [21]. Em
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Captulo I - Contexto e Objectivos do Trabalho
implantologia oral, este tipo de material tem sido utilizado simultaneamente com a colocao de implantes metlicos, para aumentar o leito sseo ou preencher defeitos sseos no local de interveno [18, 23]. Os enxertos algenos e xengenos, alm de poderem desencadear reaces imunolgicas de rejeio, apresentam problemas de revascularizao e o risco potencial, no negligencivel, de transmisso de doenas infecciosas e/ou vricas [16, 23, 24]. A utilizao de osso algeno em humanos implica tambm a existncia de bancos de osso, anlises bacteriolgicas/vricas especficas e tcnicas de purificao e tratamento sofisticadas [25]. Existem, finalmente, limitaes na obteno de osso a partir de cadveres, por motivos legais e religiosos, especialmente nalguns pases asiticos [20]. Os polmeros tm sido utilizados na forma de suturas reabsorvveis e, mais recentemente, na forma de membranas reabsorvveis e no reabsorvveis, para aumento ou preenchimento de defeitos sseos, atravs da tcnica de regenerao guiada de tecidos [18, 26-30]. Os metais so, por vezes, a nica alternativa na substituio de dentes perdidos. Possuem a vantagem de serem implantados e fixados mecanicamente ao osso. Os implantes metlicos de ao inoxidvel foram utilizados nos anos cinquenta para a substituio de dentes, mas actualmente a sua utilizao restringe-se fixao provisria de fracturas sseas. As ligas de crmio-cobalto, por serem mais resistentes, constituram o material de eleio dos implantes dentrios at finais dos anos sessenta. No incio dos anos setenta, com os trabalhos de investigao do grupo de Brnemark [31], deu-se incio utilizao de implantes constitudos por titnio comercialmente puro. Os bons resultados da investigao experimental e clnica contriburam para o aumento e generalizao do uso deste material em medicina, conhecendo-se estudos de longo prazo que demonstram o seu sucesso [12, 32]. Os materiais cermicos, principalmente os bioactivos, por serem altamente biocompatveis podem formar ligaes firmes com o osso mas, infelizmente, possuem propriedades biomecnicas fracas. Alguns destes materiais, por possurem uma composio qumica semelhante do tecido sseo e uma boa adeso a este, criaram grandes expectativas na utilizao como substitutos dos tecidos duros [33]. Contudo, as limitaes das suas propriedades mecnicas reduziram o campo da sua aplicao. A substituio de tecidos em zonas no sujeitas a cargas (defeitos sseos) [4, 6, 7, 34] e o revestimento de implantes metlicos, no sentido de potencializar a capacidade de
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adeso rpida ao tecido sseo [11, 13-15, 33, 35-38] so as principais indicaes destes materiais. So de assinalar os implantes de alumina e zircnia, utilizados em aplicaes clnicas devido sua elevada resistncia biomecnica e boa biocompatibilidade [16, 39]. A utilizao de biomateriais na elaborao de implantes dentrios tem mais de 40 anos, envolvendo diferentes materiais e apresentando tamanhos, forma e desenhos muito distintos. Este facto proporcionou um avano muito rpido da implantologia oral quando se compara a sua evoluo com a de outras especialidades da rea da medicina dentria [40]. Infelizmente, e at anos recentes, a generalizao da sua utilizao clnica no foi acompanhada pelos benefcios da experimentao e investigao cientfica no que respeita influncia das propriedades fsico-qumicas dos materiais [41]. Na actualidade, a intensa investigao laboratorial bsica e os ensaios in vivo tm permitido um avano significativo nos conhecimentos sobre o comportamento dos biomateriais implantados e a resposta que geram no hospedeiro. Paralelamente a este tipo de investigao fundamental, o controlo da utilizao e do comportamento clnico dos implantes, segundo protocolos definidos e aceites por instituies de prestgio internacional, tem contribudo para uma melhor aquisio de conhecimentos e avanos tcnico-cientficos na rea da implantologia [11, 12]. Os implantes dentrios, fundamentalmente do tipo endsseo, continuam a ser o tipo mais utilizado em medicina dentria e com um ndice de utilizao clnica que aumenta todos os anos [42], Considera-se, actualmente, que um material ideal para utilizar em implantologia oral deve possuir capacidade de adeso firme ao tecido sseo e apresentar caractersticas mecnicas adequadas ao desempenho das funes dos tecidos ou rgos dentrios que visa substituir. Um material ideal para enxertos sseos dever ser substitudo pelo tecido sseo do hospedeiro, de forma contnua e gradual, necessitando para tal de ser biodegradvel e osteocondutor [43]. No caso dos implantes dentrios, devero ter propriedades biomecnicas adequadas para suportar as foras mastigatrias e uma boa integrao nos tecidos onde so colocados. Devem ainda suportar as foras a que so submetidos durante a sua funo na cavidade oral e transmitir essas foras ao tecido sseo envolvente de forma equilibrada, contribuindo para a sua diferenciao e aumento de resistncia. No desenvolvimento de biomateriais para esta funo fundamental estudar e compreender as interaces que
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Captulo I - Contexto e Objectivos do Trabalho
ocorrem aps a sua implantao no tecido sseo. Outro aspecto essencial a identificao dos parmetros que directa ou indirectamente condicionam a formao da interface entre o osso e o implante. Para muitos dos materiais utilizados em implantologia oral desconhecem-se ainda vrios dos factores que permitem compreender os fenmenos interactivos que induzem nos tecidos receptores. No caso dos materiais em fase de desenvolvimento, o estudo e a anlise do seu comportamento nos tecidos vivos representa uma etapa fundamental da sua evoluo. Os resultados obtidos nos ensaios so fundamentais para indicar a sua utilizao clnica. No , por isso, estranho que os objectivos que devem guiar a investigao na rea da implantologia nos anos noventa sejam [44]: - a obteno de um melhor conhecimento sobre os factores que controlam a integrao tecidular dos biomateriais, bem como dos fenmenos e mecanismos que ocorrem a este nvel; - a avaliao dos efeitos biolgicos da aplicao de foras nos biomateriais; - a transferncia das tenses transmitidas pelo implante aos tecidos envolventes atravs da interface. Assim, o objectivo genrico deste trabalho o estudo das interaces de alguns dos biomateriais mais utilizados em medicina, como o ao inox 316L, o titnio, uma hidroxiapatite modificada quimicamente e um cimento de vidro bioactivo. O tipo de implantao de cada material foi condicionado pela forma habitual de utilizao clnica: nos materiais metlicos, utilizou-se a forma de pinos cilndricos, enquanto que na hidroxiapatite usou-se a forma de grnulos e no cimento de vidro bioactivo a forma de pasta. Mais especificamente, pretende-se responder s seguintes questes fundamentais: Qual a importncia da composio qumica dos biomateriais e das suas caractersticas superficiais na modulao da resposta do tecido sseo? Qual o tipo de interface que se forma entre os diferentes materiais e o tecido sseo? Quais os mecanismos e/ou fenmenos que ocorrem no desenvolvimento do processo de adeso entre os materiais e o osso?
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II INTRODUO
1. TECIDO SSEO O osso um tecido especializado, caracterstico da classe dos animais vertebrados. Do ponto de vista zoolgico, o tecido sseo tende a apresentar caractersticas especficas que advm da sua diferenciao nos vrios animais, de acordo com parmetros que incluem o meio ambiente onde vivem e o tipo de foras a que o osso submetido [1j. Sendo um tecido especializado no suporte de foras e tenses que lhe so transmitidas pelos msculos esquelticos, o osso um dos tecidos mais resistentes e duros do organismo humano. Para alm das funes de suporte, proteco e locomoo, o osso tambm um reservatrio importante de minerais, com um papel activo na regulao do equilbrio orgnico [45]. O osso um tipo de tecido conjuntivo, constitudo por clulas sseas (osteoblastos, ostecitos e osteoclastos) e matriz extracelular, diferenciando-se dos outros tecidos conjuntivos pelo facto dessa matriz ser mineralizada. Na sua composio incluem-se 33% de matriz orgnica e 67% de compostos inorgnicos [46]. Os ies mais abundantes so o clcio e o fsforo, que formam o constituinte mineral mais importante, a hidroxiapatite, que tem como frmula Ca10(PO4)6 (0H)2 [46]. Os cristais de hidroxiapatite so relativamente pequenos, podendo atingir o tamanho de 10 a 100 nm [47]. Distribuem-se ao longo das fibrilas de colagnio e so envolvidos pela substncia fundamental amorfa. A sua associao com as fibras de colagnio responsvel pela dureza e resistncia caractersticas do tecido sseo [48]. Podem tambm ser encontrados, em menores quantidades, ies de potssio, sdio e magnsio. A matriz orgnica extracelular do osso formada, essencialmente, por fibras de colagnio de tipo I, em percentagens de 85 a 95% [46, 49, 50].
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As fibras colagnicas do osso esto envolvidas por uma substncia de suporte, o cimento. Este cimento orgnico, ao longo do qual as fibras se mineralizam, preenche os espaos entre as fibrilas dando consistncia ao tecido sseo. Os compostos no colagenosos incluem um vasto conjunto de protenas, entre as quais se encontram as glicoprotenas, sialoprotenas e fosfoprotenas [46]. As glicoprotenas esto implicadas na transformao do tecido osteide em osso. O tecido sseo apresenta caractersticas distintas, em funo do seu estado de maturao, podendo ser divido em dois tipos distintos [51]: - O tecido sseo primrio ou imaturo encontra-se, predominantemente, no feto. Surge, tambm, nos ossos em crescimento ou durante o processo de reparao de fracturas e em algumas situaes patolgicas, no adulto, nomeadamente tumores. Este tipo de tecido apresenta, como caracterstica especfica, uma orientao pouco organizada das fibras de colagnio, segundo uma disposio plexiforme e com trajecto irregular. Possui numerosos ostecitos, de grande volume, com uma forma de distribuio inconstante na matriz, relativamente aos espaos vasculares e conjuntivos. - 0 tecido sseo secundrio existe em locais onde so exercidas foras de tenso. Substitui o osso primrio durante o processo de crescimento ou de regenerao ssea. , por sua vez, dividido em dois tipos de tecido: o osso lamelar, predominante, e o osso fibroso ou fascicular. O osso lamelar constitudo por lminas finas, as lamelas, de tamanhos compreendidos entre os 4 e 7 p n . No interior de cada lamela, as fibras de colagnio orientam-se de forma paralela entre si, mas a sua orientao geral diferente da das lamelas adjacentes. Este tipo de tecido observado nos ossos longos e na cortical do osso alveolar [51 j. O osso fibroso ou fascicular, no lamelar, constitudo por fibrilas de colagnio espessas, com organizao paralela entre elas. observado, geralmente, nos locais de insero dos ligamentos, permitindo uma unio forte entre o tecido sseo e as fibras ligamentares [51]. Os ossos so classificados macroscopicamente em ossos longos e achatados. Incluem-se no grupo dos ossos longos, a tbia, o fmur, o rdio, o cbito e o mero. Os ossos do crnio e o externo so exemplos de ossos achatados. Uma caracterstica comum a todos os tipos de osso possurem uma camada externa, densa, de osso compacto e uma cavidade medular central.
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Captulo II - Introduo
A cavidade medular est ocupada, nos ossos vivos, por medula ssea e tecido gordo. Os ossos adultos, tanto os compactos como os esponjosos, possuem caractersticas histolgicas semelhantes. So constitudos por camadas microscpicas de tecido, as lamelas sseas, que no osso compacto se apresentam mais comprimidas. Podem identificar-se trs tipos diferentes de lamelas: circunferenciais, concntricas e intersticiais [51]. -As lamelas circunferenciais envolvem a parede externa do osso adulto, formando uma camada superficial. - As lamelas concntricas preenchem grande parte do osso compacto formando uma unidade metablica bsica denominada de osteon. Os osteons so cilindros de tecido sseo, com orientao paralela ao eixo principal do osso. No centro de cada osteon existe o canal de Havers que est recoberto por uma camada nica de osteoblastos e aloja um capilar. Os canais de Havers esto interligados atravs dos canais de Volkman, que tambm possuem capilares no seu interior. Esta rede vascular permite o aporte de fluidos orgnicos s partes mais profundas do tecido. -As lamelas intersticiais preenchem os espaos existentes entre as lamelas concntricas e no so mais do que fragmentos das lamelas concntricas que adoptam uma grande diversidade de formas. Na parede externa do osso compacto existe uma membrana de tecido conjuntivo osteognico, denominada de peristeo. Este tecido possui uma alta percentagem de clulas sseas jovens e indiferenciadas, contribuindo significativamente para o processo regenerativo do osso. A parede interna dos ossos compacto e esponjoso est revestida por uma camada nica de clulas sseas, denominada de endsseo, que tambm contribui para o processo regenerativo e remodelativo do osso. A caracterizao experimental do osso pode ser feita atravs da determinao da relao entre o clcio e o fsforo, bem como da presena dos ies sdio e magnsio, entre outros. Uma relao Ca/P de 1,38 0,04 caracterstica de um osso jovem, enquanto que uma relao Ca/P de 1,25 0,12 caracterstica do precursor mineral de um osso recm formado [52],
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1.1. Clulas do Tecido sseo A matriz celular do tecido sseo formada por trs tipos de clulas: osteoblastos, ostecitos e osteoclastos. Osteoblastos. Tm como principal funo a produo da matriz ssea, durante o desenvolvimento ou a reparao do tecido sseo. Durante o processo de remodelao funcional da estrutura ssea, para se adaptar a foras ou tenses mecnicas, estas clulas desempenham um papel fundamental. So clulas mononucleadas que sintetizam protenas colagnicas ou no colagnicas e so responsveis pelo processo de mineralizao do tecido osteide [45]. Os osteoblastos dispem-se em camadas de clulas cubides, que possuem caractersticas histolgicas comuns s das clulas secretoras de protenas. Apresentam alguma polaridade e so basfilas. Ultra-estruturalmente contm grandes quantidades de retculo endoplasmtico rugoso e complexo de Golgi [53]. Sintetizam e secretam a matriz orgnica extracelular do osso, incluindo o colagnio de tipo I, osteocalcina, osteopontina, osteonectina, fosfatase alcalina, proteoglicanos, bem como os factores de regulao do crescimento que so armazenados dentro da matriz ssea. Os osteoblastos inactivos apresentam caractersticas morfolgicas diferentes das clulas em estado activo. Os ncleos so mais densos e as clulas apresentam uma forma mais achatada, sendo denominadas clulas de revestimento. Ostecitos. So clulas achatadas e fusiformes que suportam o osso e esto localizadas no interior das lamelas do osso esponjoso e compacto. Esto completamente envolvidas por matriz extracelular, formando um espao denominado de lacuna. As lacunas esto interligadas atravs de uma srie de canais finos, os canaliculus, que so ocupados por finas extenses do citoplasma dos ostecitos, permitindo o contacto entre as clulas adjacentes. Por vezes estes prolongamentos no esto em contacto directo e o espao entre elas preenchido por fludo extracelular. Estes canaliculus so extremamente importantes na manuteno da vitalidade destas clulas, pois atravs deles que se processam as trocas metablicas entre as clulas e os fluidos orgnicos. No caso dos canalculos serem obstrudos as clulas morrem, ficando as lacunas vazias.
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A quantidade de ostecitos existente por unidade de volume sseo est directamente dependente da rapidez do processo formativo deste tecido. Quanto maior for a rapidez de formao ssea maior ser a quantidade de osteoblastos aprisionados que se transformaro, posteriormente, em ostecitos. Normalmente, o osso embrionrio e o osso em fase de reparao contm um nmero mais elevado de ostecitos do que o osso lamelar. Osteoclastos. Estas clulas desempenham um papel fundamental no processo de remoo e reabsoro do osso que destrudo, libertando clcio ou, em conjugao com o processo de deposio ssea, levando remodelao deste tecido em consequncia de exigncias funcionais [53]. Os osteoclastos so as principais clulas envolvidas na reabsoro do tecido sseo mineralizado. Diferenciam-se, em contacto com o osso, a partir de clulas precursoras hematopoiticas mononucleadas, estando referenciada uma srie de factores locais e sistmicos que influenciam este processo [45, 51,53,54]. Estas clulas distinguem-se das outras por apresentarem um volume aumentado e mltiplos ncleos. O nmero de ncleos presentes pode atingir as dezenas [51]. 0 citoplasma contm mltiplos vacolos e vesculas, bem como numerosas mitocndrias e ribossomas livres. As mitocndrias desempenham um papel relevante na produo do citrato necessrio para a reabsoro do osso, armazenando, de forma transitria, os ies de clcio e de fsforo, e satisfazendo as necessidades metablicas atravs da produo de ATP. Os componentes do retculo endoplasmtico rugoso so pouco pronunciados enquanto que o complexo de Golgi ntido e acompanha o nmero de ncleos presentes. A membrana celular, nas zonas de contacto com o tecido sseo, possui interdigitaes citoplasmticas com 50 a 150 |im de comprimento, assumindo a forma de mltiplas pregas estriadas denominadas de bordo rugoso [51]. Esta zona da membrana corresponde parte activa da clula permitindo-lhe as trocas necessrias para assegurar o processo de reabsoro. Durante este processo, a membrana tem a dupla funo de excretar os componentes desmineralizantes do tecido e de absorver os produtos libertados pelo processo de reabsoro ssea. Junto da membrana citoplasmtica observa-se uma zona clara que delimita a rea de reabsoro. Esta zona corresponde a uma parte citoplasmtica sem organelos celulares, possuindo filamentos actnicos e microtbulos organizados. Estas clulas apresentam uma grande especificidade morfolgica e funcional. Alm de serem multinucleadas, possuem pares de centrolos em nmero
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idntico ao dos ncleos. Desenvolvem um bordo recortado tpico, quando em contacto com a matriz ssea mineralizada e caracterizam-se pela capacidade de acidificao do meio extracelular, com consequente dissoluo dos cristais de clcio e fsforo. Apresentam, ainda, actividade de ATPase e de fosfatase cida resistentes ao tartarato e receptores para a calcitonina [45, 55]. A interveno dos osteoclastos no processo de reabsoro ssea ainda no est totalmente clarificada [54]. Pensa-se que a interveno enzimtica que induz a quebra da integridade da matriz e/ou a quelao da componente mineral [51]. Quando o osso est em fase de reabsoro, estas clulas localizam-se na sua superfcie, levando perda de tecido e criando depresses denominadas reentrncias de reabsoro ou lacunas de Howships. Para alm das funes osteolticas, os osteoclastos desempenham um papel importante no desenvolvimento e crescimento sseo, atravs da libertao de factores de crescimento de tipo polipeptdico, a partir da matriz extracelular mineralizada [45]. 1.2. Formao do Tecido sseo O tecido sseo forma-se e desenvolve-se de forma distinta, apresentando trs formas habituais de ossificao: endocondral, intramembranosa e suturai [46]. - A ossificao endocondral segue um modelo de matriz cartilaginosa que precede a formao do tecido sseo. Localiza-se nos extremos dos ossos longos e caracteriza-se pela condensao de clulas mesenquimatosas que adoptam a forma genrica do osso a que vo dar origem. As clulas cartilaginosas diferenciam-se a partir destas clulas mesenquimatosas e sofrem um processo de crescimento rpido levando formao de uma matriz cartilaginosa que sofre um processo posterior de mineralizao. - A ossificao intramembranosa ocorre de forma directa no tecido conjuntivo. Neste tipo de formao, o osso desenvolve-se directamente dentro de uma membrana de tecido conjuntivo mole em vez de tecido cartilaginoso. Uma vez iniciado, este processo de ossificao prossegue muito rapidamente, englobando tecido conjuntivo que fica misturado com o osso imaturo neoformado e originando uma matriz ssea altamente desorganizada. Esta matriz desorganizada sofre um processo de mineralizao limitado pela rapidez da sua formao, incluindo no seu interior muitos osteoblastos que, ficando envolvidos, se transformam em ostecitos. Este tecido um osso muito rico em clulas osteoblsticas.
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- A ossificao suturai um tipo especial de ossificao intramembranosa na qual o osso se forma nos bordos das suturas sseas. E caracterstica das suturas entre os ossos do crnio e permite um crescimento gradual que vai acompanhando o aumento de volume dos rgos que esto alojados no seu interior. 1.3. Remodelao ssea A remodelao ssea um processo contnuo de eventos que permitem a substituio de osso antigo por novo tecido sseo, assegurando, tambm, a substituio de osso primrio ou imaturo por osso secundrio [54]. Este processo depende das foras a que o osso est sujeito durante as suas funes normais. De facto, o aparecimento e a orientao das trabculas sseas encontram-se condicionados pela intensidade, durao e orientao das foras a que o tecido submetido durante as suas funes de suporte [46]. A remodelao do tecido sseo compacto adjacente a um implante resulta na formao de osteons secundrios, que so estruturas lamelares concntricas com uma margem perifrica pedunculada denominada cimento ou linha limite de reabsoro [56]. A arquitectura trabecular do tecido sseo relaciona-se directamente com as foras que lhe so transmitidas atravs das inseres musculares ou, no caso da implantologia, das foras de carga que lhe so transmitidas atravs do implante. Durante a remodelao ssea que ocorre aps a colocao de implantes dentrios metlicos, verifica-se, usualmente, um processo de reabsoro do osso adjacente da crista alveolar. Consideram-se aceitveis valores de reabsoro que no ultrapassem 1 mm no primeiro ano e 0,1 mm nos anos subsequentes [57]. As causas possveis desta perda de tecido no osso alveolar incluem a infeco localizada dos tecidos, peri-implantite, ou a existncia de foras mecnicas anormais no implante que ou provocam uma atrofia por falta de estmulos ou promovem a sua reabsoro, devido a foras exageradas [57]. Comparativamente, a durao da fase de formao do tecido sseo distinta entre diferentes espcies animais. Enquanto pode demorar uma a duas semanas no Homem, no Co dura uma semana e no Coelho alguns dias. O preenchimento de uma cavidade ssea no Coelho demora 4,5 semanas, no Co 10 semanas e no Homem cerca de 13 semanas. A durao do ciclo de remodelao ssea aumenta na proporo directa do tamanho do animal[56[.
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O estabelecimento de uma relao entre a durao do ciclo de remodelao ssea nas vrias espcies animais permite calcular os tempos que so necessrios no Homem para obter um comportamento idntico ao do tecido sseo dos coelhos, aps a implantao de um biomaterial semelhante. 1.4. Reparao do Tecido sseo A resposta normal de cicatrizao do osso um fenmeno dinmico no qual as clulas e os seus metabolitos interactuam para reparar o tecido danificado. Muitos tipos de clulas esto envolvidos neste processo fisiolgico de reparao, incluindo os macrfagos, os leuccitos polimorfonucleares e outras clulas do sistema imunitrio. Sendo um tecido vivo, responde s agresses com o mesmo tipo de resposta tecidular e celular que os outros tecidos orgnicos: inflamao, cicatrizao ou reaco de corpo estranho. No caso da colocao de um implante intra-sseo, realiza-se um conjunto de actos que provocam agresso e dano aos tecidos intervencionados. Aps a insero ou a implantao cirrgica de um biomaterial, o tecido inicia a resposta agresso, sendo despoletado um conjunto de fenmenos que levam reparao dos danos e cicatrizao tecidular [58]. A resposta regenerativa orgnica, no local do trauma cirrgico, envolve a diferenciao e regulao dos tecidos esqueltico e conjuntivo, de forma semelhante ao processo que ocorre durante a reparao de uma fractura ssea. Este processo regenerativo ou reparador tambm apresenta muitos dos mecanismos que se observam durante o crescimento sseo e a morfognese [50]. A gravidade da perturbao dos mecanismos homeostticos, a extenso das respostas patofisiolgicas e a sua resoluo so medidas de resposta do hospedeiro implantao de um biomaterial [58]. Dois factores importantes que influenciam todo o processo de diferenciao tecidular ssea so a vascularizao dos tecidos, que permite uma oxigenao e aporte de nutrientes ao local, e a estabilidade dos tecidos, por ausncia de foras biomecnicas. Imediatamente aps a interveno cirrgica, ocorre a primeira resposta do hospedeiro, que se manifesta pela formao de um cogulo ou trombo sanguneo, atravs da activao dos sistemas extrnseco e intrnseco da coagulao. Surgem mudanas imediatas da permeabilidade e do volume dos vasos que provocam alteraes no fluxo sanguneo. O aumento deste fluxo permite o incremento rpido, no local intervencionado, de clu28
Ias sanguneas, protenas, lquidos e factores qumicos, que medeiam a resposta tecidular inicial. 0 processo de diferenciao do tecido sseo est altamente dependente da vascularizao dos tecidos. Enquanto que os tecidos cartilaginosos e fibrocartilaginosos no necessitam de uma abundante vascularizao devido s exigncias metablicas mnimas, o osso e o tecido fibroso, por outro lado, necessitam de um incremento significativo da irrigao para se diferenciarem. Este processo continua com a presena de clulas especficas de defesa, que contribuem para a resposta inflamatria local. 0 tamanho, forma e propriedades fsico-qumicas do biomaterial so responsveis pela durao do processo inflamatrio [58]. Vriasclulas com funes e tempos de actuao distintos intervm no processo. Os neutrfilos possuem um tempo de vida curto, entre algumas horas at alguns dias, desaparecendo do exsudado plasmtico mais rapidamente do que os macrfagos, que podem perdurar durante algumas semanas ou meses. Os moncitos so as clulas de defesa responsveis, principalmente, pela cicatrizao em situaes de reaces de corpo estranho. Possuem a capacidade de se diferenciarem rapidamente em macrfagos. Se forem mantidos os estmulos nocivos, os macrfagos podem tornar-se o tipo celular predominante no local lesionado, originando a passagem a um estado inflamatrio crnico. No caso dos implantes, estes estmulos nocivos podem ser motivados pela persistncia de micromovimentos do material, por m adaptao deste ao osso, ou devido a foras de carga exageradas ou precoces [58]. O processo final de cicatrizao, em resposta implantao de um biomaterial, pode incluir dois tipos distintos de reparao tecidular. Um a regenerao tecidular, que consiste na substituio do tecido danificado por clulas parenquimatosas especficas desse tecido, osteoblastos no caso do osso. O outro a substituio do tecido original por tecido conjuntivo que ir constituir uma cpsula fibrosa, no caso do tecido sseo, ou uma cicatriz, no caso dos tecidos moles [58]. O tipo de tecido sseo que se forma aps a colocao de um implante endsseo depende da idade, da funo e de mltiplos factores sistmicos. composto por quatro tipos diferentes de osso, caracterizados microscopicamente como osso imaturo ou embriolgico, lamelar, compacto e esponjoso [56]. O osso imaturo, primrio ou osteide, um tecido ricamente preenchido por clulas, que se forma rapidamente (mais de 30 a 50 u.m por dia) em
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resposta ao crescimento ou adaptao biomecnica. Comparativamente com o osso secundrio, possui um grau de mineralizao relativamente menor, uma orientao das fibras mais irregular e uma resistncia mnima. Em condies normais substitudo rapidamente por tecido sseo lamelar. O osso lamelar o principal tecido do esqueleto adulto. Tem uma formao relativamente lenta (0,6 um por dia) e um mecanismo primrio e secundrio de mineralizao. A maturao completa deste tipo de osso requer um perodo de tempo de pelo menos 6 a 12 meses. O osso compacto possui estriaes que so extenses das fibras de Sharpey e semelhante ao osso lamelar na resistncia biomecnica. E caracterstico das unies estveis entre o tecido fibroso e o sseo. O osso esponjoso forma-se nas superfcies corticais durante o processo de cicatrizao ou reparao, crescimento e adaptao biomecnica do osso. importante salientar que existe uma relao directa entre a idade do osso e a seu contedo mineral. Os osteoblastos depositam cerca de 65% dos componentes minerais existentes no osso lamelar vital, durante a mineralizao primria. A mineralizao secundria, correspondendo aos 35% remanescentes, consiste num fenmeno de crescimento dos cristais no celulares que se prolonga durante o perodo de alguns meses [56]. As diferenas da capacidade osteognica do tecido sseo, apresentadas em vrios locais anatmicos, outro aspecto importante. O calo sseo que ocorre aps fractura predominantemente formado no peristeo e endsseo, sendo mais reduzido na cavidade medular [59]. O tipo de regenerao ssea na zona da interface formada entre um implante e o osso neoformado no idntico ao que ocorre durante a reparao de uma fractura ssea. Tal facto devido a que no possvel observar a formao de uma cartilagem endocondral como precursora do crescimento do osso esponjoso no homem [60]. Os efeitos das foras de carga na cicatrizao da fractura ssea tm sido objecto de vrios trabalhos de investigao [61 ]. Os resultados obtidos apontam para a concluso de que aps um perodo de proteco da zona de fractura, com fixao externa e a sua estabilizao, se verifica um aumento dos valores de cicatrizao com a aplicao de foras cclicas controladas. Variveis tais como o tamanho do espao inicial entre os bordos da fractura, a estabilidade da fixao do osso e os parmetros que condicionam a aplicao dos movimentos (magnitude, frequncia e durao da fora) parecem ser determinantes neste processo [61].
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No estudo do tecido sseo regenerado aps a implantao de um biomaterial, muito importante identificar qual os tipos de clulas que se formam na zona da interface. A identificao das clulas multinucleadas associadas aos processos de reabsorso ssea a mais complexa [55]. fundamental estabelecer a diferenciao entre as clulas osteoclsticas e as clulas gigantes multinucleadas, tambm denominadas de clulas de Langhans ou de clulas gigantes de corpo estranho [62]. Estas clulas tm a sua origem na fuso dos moncitos maduros ou dos macrfagos, e surgem, normalmente, em situaes inflamatrias crnicas, na forma de tecido de reaco identificado como granuloma. Diferenciam-se dos osteoclastos atravs da anlise do comportamento de marcadores citoqumicos especficos para os osteoclastos, que no so evidenciados neste tipo de clulas [55]. 2. BIOMATERIAIS 2.1. Definio O objectivo principal de um biomaterial substituir rgos ou tecidos. Para isso, antes de ser aceite como possvel candidato em aplicaes clnicas, necessrio proceder a uma investigao intensa e exaustiva sobre a sua biocompatibilidade e segurana biolgica. As caractersticas mais importantes para seleccionar um material para utilizao mdica so biocompatibilidade, ausncia de efeitos nocivos ou txicos para o organismo e propriedades biomecnicas capazes de responderem s solicitaes dinmicas e estticas a que estar sujeito durante a sua vida til. Um biomaterial foi inicialmente definido como sendo "um material no vivo, usado como dispositivo mdico, projectado para interactuar com sistemas biolgicos" [63]. Como esta definio apresentava alguma controvrsia, pois a sua amplitude restringia-se apenas a materiais no vivos, na segunda Conferncia sobre Consenso nas Definies em Biomateriais, realizado em Chester no ano de 1991, o termo biomaterial foi redefinido como sendo: "um material destinado a contactar com sistemas biolgicos para avaliar, tratar, aumentar ou substituir qualquer tecido, rgo ou funo do organismo" [64]. Pode considerar-se tambm, de forma geral, que um biomaterial um material que interactua com os tecidos nos quais implantado, mantendo a sua estrutura e propriedades, sem provocar alteraes no meio fisiolgico envolvente.
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Os biomateriais podem ser classificados sob o ponto de vista do comportamento biolgico e da sua composio qumica. A classificao biolgica baseada na resposta orgnica aps a implantao do biomaterial, enquanto que a qumica depende das suas propriedades intrnsecas. O comportamento biolgico mais utilizado pelos investigadores clnicos enquanto que a classificao qumica preferencialmente utilizada em estudos laboratoriais e em cincias bsicas.
2.2. Classificao
2.2A. Metais e Ligas Metlicas Os metais so utilizados em mltiplas aplicaes clnicas, em medicina dentria e noutras reas mdicas, devido s suas propriedades mecnicas e sua suposta inerticidade. A rigidez e potencial toxicidade, atravs da libertao de ies que podem provocar metaloses, reaces inflamatrias e encapsulao fibrosa, so os principais inconvenientes deste tipo de materiais [65-68J. O ao inox, o titnio, a liga de titnio-alumnio-vandio (T6A14V) e as ligas de crmio-cobalto so alguns exemplos de metais ou ligas metlicas utilizadas em medicina. Os implantes metlicos de titnio comercialmente puro constituem o tipo de implante mais usado em implantologia oral e em outras aplicaes mdicas [69]. 2.2.2. Materiais Cermicos Os materiais cermicos, muito estveis e no reactivos, so produzidos a temperaturas superiores a 1000 C. Quando puros, estes materiais possuem uma estrutura cristalina geralmente robusta, porque os tomos esto num estado de mxima densidade de compactao, ao contrrio dos materiais cermicos no cristalinos onde as distncias inter-atmicas so grandes. Em termos fsico-qumicos, pode dizer-se que os materiais cermicos so: - frgeis, duros e resistentes ao desgaste; - altamente resistentes a ataques cidos; - estveis a altas temperaturas; - isolantes trmicos e elctricos.
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Os materiais cermicos podem dividir-se em trs grupos, em funo das suas propriedades fsico-qumicas [70]: - Um primeiro grupo constitudo pelos materiais cermicos oxidados que, quando implantados nos tecidos orgnicos, se mantm estveis e inertes, sendo limitada a sua utilizao clnica. Os xidos de alumina, de zircnia e de magnsio so exemplos deste grupo de materiais [16], - Num segundo grupo encontram-se os materiais cermicos de tipo fosfato de clcio, com comportamento biolgico distinto. Os representantes mais importantes destes materiais so os fosfatos triclcicos e as apatites. A utilizao destes materiais na substituio de tecido sseo relativamente corrente devido semelhana da sua composio com a fase mineral do tecido sseo e por apresentarem grande biocompatibilidade [71]. Estes biomateriais tm indicao clnica no preenchimento de defeitos sseos [4,9, 72], mas no em situaes em que sejam submetidos a foras de carga, excepto no revestimento de implantes metlicos [11, 13-15, 36, 38, 73, 74]. - No terceiro grupo podem incluir-se os vidros de slica e os vidros cermicos. O primeiro e mais conhecido material, baseado no vidro de slica contendo ies de clcio e fsforo, foi desenvolvido por Larry Hench e col. [75, 76], nos anos setenta, na Universidade da Florida, sendo denominado de Bioglass. Apresenta boas propriedades de adeso ssea e biocompatibilidade, embora tenha limitaes de resistncia mecnica. No sentido de melhorar as propriedades biomecnicas deste grupo de materiais, foram introduzidas modificaes no processo de sntese dos vidros bioactivos levando ao aparecimento dos vidros cermicos. Os vidros bioactivos e os vidros cermicos tm sido utilizados no preenchimento de defeitos sseos [6, 7, 77], na preveno da reabsoro alveolar ps-extraco dentria [78], no revestimento de implantes metlicos, melhorando as suas propriedades mecnicas e a regenerao ssea [35, 37], na substituio de vrtebras e de osso ilaco [48, 79] e na libertao de frmacos [80]. Os mecanismos de adeso ssea dos materiais cermicos so diferentes conforme se consideram os cermicos com superfcies bioactivas e os reabsorvveis. Enquanto que os primeiros apresentam um tipo de adeso qumica ao tecido sseo atravs de uma camada superficial bioactiva de apatite, os segundos unem-se, preferencialmente, atravs de ligaes mecnicas. A hidroxiapatite apresenta um tipo intermdio de unio ao tecido sseo [81].
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2.2.3. Polmeros Os polmeros so cadeias extensas de unidades monomricas repetidas, unidas por ligaes covalentes, com peso molecular elevado. A unidade monomrica essencialmente constituda por ligaes do tipo C-C, contendo por vezes tomos de C, N, O, S e Si. As propriedades fsico-qumicas destes materiais so marcadamente influenciadas por vrios factores, dos quais se destacam: a composio qumica, a estrutura, a extenso da cadeia macromolecular (peso molecular) e a distribuio de tamanhos nas cadeias [20]. Os polietilenos, o polipropileno, o poliuretano, o cido polilactdico (PLA) e o poli (metacrilato de metilo) - PMMA - so exemplos de polmeros utilizados em implantologia. Alguns implantes polimricos podem causar respostas patolgicas atravs da libertao de monmeros txicos ou da sensibilizao alrgica [82]. O poli (metacrilato de metilo), vulgarmente designado por PMMA, muito usado como cimento sseo para fixar as prteses ortopdicas [83-85]. O monmero necessrio para a reaco de polimerizao txico e pode provocar hipotenso, insuficincia respiratria e/ou cardiovascular e reaces alrgicas [82, 84, 85]. Localmente, a hipertermia, a precipitao proteica e a necrose tecidular so efeitos secundrios a considerar [83-85]. Os materiais polimricos tambm esto sujeitos a fenmenos de biodegradao que dependem da composio qumica do polmero, dos monmeros residuais e dos aditivos aceleradores da polimerizao, includos no processo de fabrico [82, 86]. So exemplos as reaces oxidativas e hidrolticas que podem ocorrer em zonas localizadas das cadeias, dando origem dissoluo, deformao e fractura de componentes [70]. A utilizao de materiais polimricos mais benfica do que a dos metlicos por duas razes: em primeiro lugar, porque a diferena no mdulo de elasticidade entre o implante e o osso mais reduzida, o que diminui a tenso de contacto e a reabsoro ssea; em segundo lugar, porque, como j se referiu, muitos polmeros so susceptveis de degradao. Atravs dos processos de degradao, os implantes polimricos podem ser gradualmente substitudos pelo tecido hospedeiro, reduzindo a necessidade de uma segunda interveno para remover o implante. Contudo, os conhecimentos sobre as reaces adversas provveis aos produtos de degradao so ainda restritos. As limitaes destes materiais so significativas em situaes de solicitaes mecnicas mais intensas, devido a algumas insuficincias na sua resistncia [82].
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A utilizao de membranas de e-PTFE (politetrafluoroetileno expandido) na regenerao ssea guiada tem tido um incremento notvel em implantologia oral. Quer de forma isolada, para aumentar a quantidade de osso e para a reparao de defeitos sseos periodontals, ou associadas a outros biomateriais [18, 26, 27, 30, 87], estas membranas tm aumentado significativamente o seu campo de aplicao em implantologia [28]. Estudos comparativos, em humanos, sobre a utilizao das membranas de e-PTFE no reabsorvveis versus membranas reabsorvveis de PLA (cido polilctico) e PGA (cido poligliclico), demonstraram que as membranas de e-PTFE so mais eficazes na sua funo de barreira, induzindo a formao de osso em maior quantidade e qualidade [29], 2.2.4. Compsitos No sentido de aumentar as propriedades mecnicas e fsico-qumicas, podem combinar-se tipos diferentes de materiais, originando os denominados biomateriais compsitos. Os compsitos so sintetizados tendo como objectivo principal a criao de um biomaterial que possua propriedades que os componentes isolados no possuem individualmente, e que sejam superiores s que adviriam da simples adio das propriedades de cada um dos componentes. Estes materiais permitem prever uma nova dimenso no desenvolvimento de novos produtos para utilizao biomdica. O tecido sseo, constitudo por fibras de colagnio e minerais, um bom exemplo de um compsito criado pela natureza, com propriedades biomecnicas excelentes. A literatura internacional refere alguns exemplos de associaes de materiais para a obteno de biomateriais compsitos [20,47, 88-93]. A maioria destas associaes pretende colmatar as limitaes apresentadas pelos componentes isolados e, de forma sinrgica, potencializar as suas propriedades individuais, melhorando as propriedades e o comportamento biolgico do biomaterial compsito em aplicaes clnicas. 2.3. Comportamento Biolgico 2.3. . Materiais Bio-inertes Os materiais bio-inertes caracterizam-se por serem essencialmente inertes e no provocarem qualquer reaco de corpo estranho no organismo
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onde so implantados. Os tecidos envolventes, a nvel da interface, encontram-se em contacto directo com o material, com ausncia de interposio de cpsula ou tecido fibroso. O titnio um exemplo clssico de um material inerte, embora exista alguma controvrsia sobre a sua incluso neste grupo de materiais. 0 zircnia e a alumina esto tambm includos nesta classe de materiais [16, 94]. 2.3.2. Materiais Biotolerados Os materiais biotolerados so moderadamente aceites pelos tecidos envolventes. Observa-se, por vezes, a formao de uma cpsula de tecido fibroso rodeando o implante, que pode ser causada pela libertao de ies ou partculas txicas a partir da superfcie do material. O ao inoxidvel, a liga de crmio-cobalto e o PMMA podem induzir respostas deste tipo [ 16, 94]. 2.3.3. Materiais Bioactivos Nos materiais bioactivos observa-se a formao de uma unio directa e firme entre a superfcie do material e os tecidos onde este implantado. Os materiais bioactivos utilizados na substituio de tecido sseo possuem normalmente na sua composio qumica ies livres de clcio e fsforo superficiais, que promovem uma ligao fsico-qumica com o tecido sseo envolvente. Os fosfatos de clcio, a hidroxiapatite e os vidros bioactivos so exemplos destes materiais [16, 94]. 2.4. Bioactividade e Comportamento sseo Alm das classificaes anteriormente referidas, encontram-se includas nas respostas biolgicas as denominaes de bioactividade, osseo-integrao ou osteo-integrao, adeso ssea, osteoconduo e osteo-induo. 2.4.1. Bioactividade Um material pode definir-se como bioactivo quando "um material que projectado para induzir ou condicionar a actividade biolgica" [64]. Bioactividade a capacidade de um biomaterial poder formar uma unio com os tecidos vivos [95],
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De acordo com estas definies, os materiais cermicos so includos dentro deste grupo. 2.4.2. Osseo-integrao ou Osteo-integrao A definio de osseo-integrao tem levantado bastante polmica [41, 69, 96]. Inicialmente, osseo-integrao foi definida como sendo "o contacto directo, detectado a nvel da microscopia ptica, entre o osso e o implante" [31]. Com a evoluo dos recursos e meios de anlise, que permitem maiores ampliaes e melhor observao de detalhes, verificou-se que este conceito teria de ser revisto, pois em muitas situaes no existe um verdadeiro contacto directo entre o osso e o material, mas apenas um contacto fsico. No entanto, e devido generalizao do uso deste termo em implantologia clnica, muito aceite e utilizado pela maioria dos especialistas. Clinicamente, pode traduzir-se como uma espcie de anquilose do implante ao tecido sseo [69]. As variadas interpretaes sobre o conceito de osseo-integrao na literatura mundial perpetuam a controvrsia sobre o que este conceito realmente representa [42]. O uso indevido desta classificao levou a que alguns investigadores do grupo de Brnemark procurassem esclarecer as razes da m utilizao deste conceito [41]. Estes autores referem que o termo osseo-integrao foi rapidamente expandido e usado em situaes em que evidente a existncia de uma camada de tecido fibroso entre o osso e o implante, devendo, nestes casos, ser designado por fibro-integrao ou fibro-sseo-integrao. Os motivos para esta utilizao indevida de um conceito, originalmente introduzido para se distanciar e diferenciar das interfaces fibrosas, deve-se a estar ligado ideia de sucesso, em consequncia dos ptimos resultados clnicos apresentados pelo sistema Brnemark. consequncia, tambm, da interpretao incorrecta, por muitos autores, do conceito originalmente definido por Brnemark. A osseo-integrao um conceito baseado numa definio histolgica e apenas parcialmente clnica e radiogrfica. Da se infere que a classificao de um implante como osseo-integrado apenas pelos elementos obtidos atravs do exame clnico e radiogrfico incorrecta [32]. A tentativa de esclarecer este conceito e apresentar uma classificao abrangente de todas as situaes de interface, formada entre os vrios tipos de implantes e o tecido sseo, tem sido fruto de alguns trabalhos de reviso [97]. Todavia, continua na actualidade, a manter-se uma acesa polmica sobre este assunto.
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2.4.3. Adeso ssea A adeso ao tecido sseo est restringida a um nmero limitado de materiais, que so denominados de bioactivos. A adeso ssea foi definida como sendo: "o estabelecimento, atravs de processos fsico-qumicos, de uma continuidade entre o implante e a matriz ssea" [64]. 2.4.4. Osteoconduo A osteoconduo a propriedade que alguns materiais possuem de poder guiar a formao ssea na sua superfcie, quando so implantados em tecido sseo. Este processo ocorre pela penetrao de vasos nos espaos e/ou nos poros existentes na estrutura do material, que vo induzir a deposio de osso imaturo [16]. Quase todos os materiais bioactivos, habitualmente usados, podem ser classificados como sendo materiais osteocondutores, embora existam referncias recentes que apontam para a capacidade osteo-indutora de alguns deles. 2.4.5. Osteo-induo A osteo-induo a propriedade que alguns materiais possuem de induzir a formao de tecido sseo quando so implantados em tecidos no sseos. Este fenmeno consiste na converso fenotpica de clulas dos tecidos moles em precursores do tecido sseo, atravs de uma estimulao apropriada [16]. Tem sido referida na literatura, a possibilidade da hidroxiapatite, quando associada a clulas osteoblsticas, apresentar esta propriedade [17, 21]. 2.5. Biocompatibilidade O termo biocompatibilidade foi definido, no Consensus Conference of the European Society for Biomateriais como sendo "a capacidade de um material desencadear uma resposta adequada do hospedeiro, numa aplicao especfica" [63]. A biocompatibilidade de um material no inclui apenas, como classicamente considerado, os fenmenos de interaco entre os tecidos envolventes e o implante nos quais colocado. Engloba, tambm, a biofuncionalidade que os tecidos onde implantado um material iro apresentar durante as solicitaes a que so submetidos [38].
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2.6. Fenmenos de Superfcie A composio qumica, as caractersticas fsicas e a morfologia superficial desempenham um papel muito importante nas interaces entre os materiais implantolgicos e os tecidos onde so implantados [31, 98-103]. A superfcie do material o local que contacta em primeiro lugar com os fluidos orgnicos e, com o decorrer do processo de cicatrizao tecidular, a rea onde vo ocorrer todos os fenmenos de regenerao ssea que levam manuteno e ao sucesso clnico do implante. O primeiro evento que ocorre durante a interaco dos biomateriais com os tecidos onde so implantados a adsoro, na superfcie dos implantes, do sangue e das protenas plasmticas [104-106]. Este processo dinmico e sujeito a mudanas com o tempo e com a actividade das clulas do meio ambiente envolvente [107]. Do-se, a seguir, uma srie de interaces entre as clulas e a superfcie dos implantes, induzindo a libertao de factores de crescimento e quimiotcticos que modulam a actividade celular nos tecidos circundantes [103]. Um factor crucial no sucesso da integrao do implante nos tecidos orgnicos o seu grau de contaminao superficial. A presena de resduos na superfcie de um implante pode alterar a sua composio qumica e condicionar significativamente o sucesso clnico [108]. A influncia das variveis fsico-qumicas na superfcie do material e na consequente adsoro e deposio de protenas especficas, um dos factores primrios mais relevantes no processo de regenerao tecidular [101]. Quando um biomaterial implantado num organismo vivo, forma-se uma interface entre o biomaterial e o tecido ou entre o biomaterial e o sistema de fluidos orgnicos. Neste ltimo caso, as interaces que ocorrem ao longo da interface podem ser consideradas um factor importante na determinao da biocompatibilidade do material [109], A biocompatibilidade de um material pode ser parcialmente determinada pela sensibilidade da resposta do hospedeiro aos ies especficos desse material, pelas suas propriedades de corroso e pela sua molhabilidade superficial [110]. A molhabilidade superficial de um implante est directamente relacionada com a energia superficial e influenciada pelo grau de contacto com o meio fisiolgico. O aumento da molhabilidade potencia as interaces entre a superfcie do implante e o meio biolgico envolvente.
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Em amostras de titnio com vrios tipos de preparao e passivao verifica-se que a tenso crtica de superfcie independente do tamanho do gro [110]. Os valores similares da tenso superficial e da tenso crtica de superfcie devem-se semelhana da camada oxidada superficial. As superfcies de titnio no polidas apresentam uma tenso superficial significativamente mais baixa do que as superfcies polidas [110). Sabe-se que a molhabilidade das superfcies dos implantes de titnio condicionada pela composio da camada oxidada, pelo grau de contaminao e pela morfologia superficial [100]. Foi j estudada a influncia da adsoro de protenas na molhabilidade de vrios materiais utilizados em medicina dentria [111]. Atravs da medio dos ngulos de contacto, concluiu-se que a maioria dos metais estudados tm ngulos de contacto bastante baixos e no so influenciados significativamente pela adsoro e desorpo da albumina [111]. A morfologia superficial, a molhabilidade e a tenso superficial influenciam o crescimento celular mas no desempenham papel significativo na forma e orientao das clulas nas superfcies com microtextura [106, 112]. Outros estudos referem que a composio superficial de um biomaterial afecta o metabolismo e a expresso fenotpica dos osteoblastos e dos condrcitos [113]. A rugosidade superficial tem um efeito muito marcante nas clulas e muitos dos aspectos da actividade celular so afectados por esta caracterstica superficial, incluindo a proliferao celular, a sua diferenciao e a sntese da matriz orgnica [103, 114, 115]. A resposta celular a um determinado tipo de superfcie tambm influenciada pelo estado de maturao celular. Clulas com diferentes graus de maturao apresentam comportamentos diversos aps serem colocadas em contacto com superfcies idnticas [113]. Os resultados de estudos in vivo sobre o efeito das caractersticas superficiais na resposta do tecido sseo diferem entre os vrios autores. Enquanto que para uns as caractersticas superficiais no provocam diferenas significativas [69], outros consideram que a ultra-estrutura da interface entre um implante e o tecido sseo pode ser condicionada ou modificada pela alterao das caractersticas e propriedades superficiais do material [98, 102, 116-118]. Entre as metodologias de anlise recomendadas para o estudo das caractersticas superficiais incluem-se a microscopia electrnica de varrimento, a anlise por disperso de energia de raios X, a determinao do ngulo de contacto e uma variedade de tcnicas espectroscpicas [119, 120],
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2.7. Micromovimentos Estudos experimentais e revises recentes tm apresentado provas convincentes de que as foras mecnicas desempenham, directa ou indirectamente, um importante papel na diferenciao e desenvolvimento do tecido mesinquematoso [57, 61, 121, 122]. Num estudo de reviso, Goodman e Aspenberg [61] analisaram a literatura referente ao efeito das foras mecnicas na regenerao ssea, enfatizando duas reas da investigao ortopdica: a cicatrizao das fracturas sseas e o crescimento sseo na presena de prteses com revestimento poroso. Estes autores concluram que possvel modular o ambiente mecnico com a aplicao de foras exgenas bem definidas, de maneira a promover uma resposta mais favorvel do tecido sseo. No entanto, deve ter-se em ateno que, durante a fase inicial de reparao ssea, um dos factores que condicionam o sucesso de um implante a necessidade da ausncia total de micromovimentos na interface entre o osso e o implante [121]. O aparecimento de micromovimentos ps-operatrios no implante, induzidos por uma adaptao imperfeita entre o material e o tecido sseo, interfere com os mecanismos de regenerao ssea, levando formao de tecido fibroso e encapsulao fibrosa, em alternativa deposio/formao de tecido sseo [22,36,94,121,123]. A formao de uma camada ou cpsula de tecido fibroso contribui para a instabilidade do implante e para o aparecimento de micromovimentos excessivos [86]. Estes mecanismos de diferenciao em tecido fibroso so condicionados pela manuteno de um estmulo nocivo, os micromovimentos, que induz uma resposta inflamatria crnica [58]. Estabelecendo-se este ciclo vicioso, o resultado final pode ser a perda do implante devido destruio da unio fsica entre o material e o tecido sseo. A persistncia de micromovimentos pode interferir directamente com o tecido fibroso da interface, atravs da estimulao das clulas inflamatrias, levando formao de uma bolsa. Neste caso, as clulas inflamatrias activadas produzem substncias tais como interleucina-1 (IL-1), prostaglandina E2 (PGE2) e metaloproteinases, incluindo colagenase, que podem levar reabsoro ssea e causar dor e desconforto para o doente [86]. Uma das explicaes possveis para a interferncia das foras provocadas pelos micromovimentos na diferenciao tecidular prende-se com o facto das clulas sujeitas a tenses sofrerem distores morfolgicas, podendo levar a alteraes na expresso gentica e na actividade de biossntese necessria para a formao e diferenciao dos tecidos [94].
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A presso hidrosttica pode influenciar a diferenciao celular, tanto por efeito directo na clula como pela inibio do fluxo sanguneo dos capilares que irrigam os tecidos, diminuindo a sua oxigenao e alterando o metabolismo normal, impedindo o processo fisiolgico de reparao/remodelao tecidular. Provavelmente, a inibio do crescimento sseo deve-se rotura mecnica do tecido sseo. No entanto, este processo de inibio no depende exclusivamente deste factor. O impedimento da proliferao dos pr-osteoblastos e a seleco da via diferencial de proliferao da populao celular pluripotencial contribuem para a formao de tecido fibroso [124]. Por outro lado, se o tecido da interface fibroso e existem micromovimentos, ento poder existir um aumento da concentrao de ies libertados pelo implante, devido combinao dos efeitos produzidos pela corroso e por fenmenos de desgaste, se a frequncia dos movimentos for elevada. Se as foras de carga na interface forem pequenas, o meio local e a espessura do tecido depositado na interface podem manter-se estveis durante longos perodos de tempo. Os processos de desgaste podem ocorrer, tambm, entre duas superfcies em contacto na presena de micromovimentos, ou como resultado de abraso de triplo corpo, onde as partculas libertadas a partir do material funcionam como terceiro elemento, associadas superfcie dos implantes e do tecido sseo [86]. Uma boa estabilidade do implante, que minimize as tenses distorcionais no tecido de reparao, facilita a osteognese e o crescimento sseo. Se a estabilizao do material for fraca pode assistir-se ao aparecimento de tenses axiais intermitentes e micromovimentos na interface, que produzem a distoro das clulas do tecido em fase de regenerao, provocando uma estimulao da sua diferenciao em tecido fibroso. Durante o crescimento/deposio ssea existe uma destruio da matriz inicialmente formada volta da superfcie do implante, que induzida pelos micromovimentos que eventualmente surjam em fases precoces da formao ssea, provocando uma resposta reparadora de tecido fibroso mais rpida do que a deposio de tecido sseo. Este fenmeno deve-se ao facto do processo de diferenciao celular e do crescimento tecidular conjuntivo ser mais rpido do que o do tecido sseo. Os efeitos nefastos destes micromovimentos sero reduzidos se a sua amplitude for inferior a 30 um [125]. Num estudo em ces foi observado que micromovimentos de amplitude inferior a 28 um permitem o processo de crescimento do tecido sseo. Inversamente, micromovimentos com valores superiores a 150 um de amplitude, na zona da interface, induzem a formao de tecido fibroso [126].
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Em simulaes de cargas fisiolgicas, exercidas sobre prteses femorais, verificou-se que os micromovimentos com amplitude de 150 u\m impediam o crescimento do tecido sseo, enquanto que com micromovimentos at 40 uxn se observavam sinais identificativos de crescimento sseo [127]. O revestimento com hidroxiapatite de implantes de titnio colocados nos cndilos femorais de ces adultos aumenta o crescimento sseo de 8% para 47%, quatro semanas aps a implantao [128]. Quando os implantes so sujeitos a micromovimentos, atravs de foras dinmicas que produzem uma translao axial de 500 u.m em cada ciclo, os implantes revestidos com hidroxiapatite aumentam a resistncia aos testes de traco, mas sem aumento significativo do crescimento sseo. Se o grau de micromovimentos for reduzido para 150 |im, aumenta a fora de traco dos implantes revestidos [128]. Alm disso, nos implantes sem revestimento observada a existncia de uma membrana fibrosa, enquanto que os implantes com revestimento so envolvidos por uma fina membrana de tecido fibroso ou fibrocartilaginoso com colagnio de padro irradiante [121]. Com micromovimentos descontnuos, as membranas fibrosa e fibrocartilaginosa que rodeiam ambos os tipos de implantes so substitudas, entre as 4 e as 16 semanas, por tecido sseo, indiciando a sua capacidade de diferenciao tecidular quando em presena de estmulos adequados [128]. O preenchimento do espao de adaptao entre o implante e o tecido sseo pela hidroxiapatite revela-se uma vantagem potencial para a obteno de uma fixao mais rpida ao osso do implante que submetido a foras de carga [74, 122, 129, 130]. Os implantes revestidos com uma camada porosa de hidroxiapatite atingem o valor mximo de adeso ao tecido sseo cerca de duas vezes mais rapidamente do que os implantes porosos no revestidos [11]. O desenvolvimento de uma cmara de micromovimentos em titnio comercialmente puro e a sua implantao na tbia de coelhos permitiu calcular os efeitos dos movimentos, impostos manualmente, no crescimento sseo dentro de um poro isolado de 1 mm (124,131]. Constatou-se que movimentos dirios curtos (20 ciclos/dia) com a amplitude de 0,5 mm e durao aproximada de 30 segundos, durante um perodo de 3 semanas, inibiam o crescimento do osso para o interior dos poros. Porm, quando os micromovimentos aumentaram de amplitude e de durao, verifica-se um incremento significativo no crescimento do tecido fibroso em vez de osso [124]. Micromovimentos com uma frequncia de 40 ciclos/dia, com a amplitude de 0,5 mm, contribuem, directa ou indirectamente, para a estimulao e
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a formao de um tecido conjuntivo denso em vez de tecido sseo. A hiptese de explicao para este fenmeno radica, provavelmente, em factores qumicos, libertao de mediadores solveis, ou atravs de alteraes elctricas, induzidas pelo estmulo mecnico, que modulam e condicionam a diferenciao tecidular dentro do implante [131]. O aumento da amplitude dos micromovimentos na interface entre o implante e o tecido sseo resulta numa diminuio da quantidade de osso formado [132]. A presena de uma camada de tecido fibroso interposta na interface dos implantes, que impede a remodelao ssea e o seu crescimento em direco da superfcie do implante, no pode ser apenas associada com os micromovimentos existentes na interface. Tambm atribuda s propriedades intrnsecas de cicatrizao, devido ao sangue que se deposita nos espaos formados na zona da interface, durante o processo de implantao. Existe uma ausncia de crescimento sseo quando esto presentes espaos com dimenses superiores a 50 um, em vrios locais entre o osso e o implante preenchidos por sangue [60]. A controvrsia que existe na literatura sobre este assunto deriva da extrapolao dos resultados obtidos em modelos experimentais discutveis, e no facto de muitos investigadores confundirem a remodelao ssea dinmica e o crescimento sseo com a impactao do osso nos revestimentos porosos dos implantes. , por isso, necessria mais investigao e requer-se maior cuidado nos estudos e ensaios experimentais dos materiais bioactivos antes da sua utilizao clnica rotineira [60]. Para prevenir os efeitos adversos dos micromovimentos, recomenda-se a colocao dos implantes de forma a obter uma excelente estabilidade inicial e uma elevada proximidade entre a superfcie do material e o osso adjacente [61, 133]. A morfologia, o desenho do implante e a tcnica cirrgica so variveis cruciais para a obteno de condies ideais de estabilidade na fase de colocao do material, que fundamental na sua posterior integrao no tecido sseo. Micromovimentos com 25-50 jim podem inibir o crescimento do tecido sseo. Todavia, a aplicao de foras controladas, exgenas e especficas, podem estimular o crescimento e a remodelao do osso que envolve o implante [61]. Na implantologia oral utiliza-se a tcnica de dois tempos para manter o implante isento de foras de carga que possam provocar micromovimentos durante a fase inicial de cicatrizao ssea. Num primeiro tempo, o implante mantm-se imvel e estvel durante um perodo de tempo varivel entre os
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4 a 6 meses, permitindo uma regenerao ssea adequada. No segundo tempo, procede-se sujeio do implante s foras de tenso inerentes sua funo. Se os movimentos e cargas funcionais podem interferir com a regenerao ssea envolvente do implante, existem outros factores biomecnicos que nem sempre so tidos em considerao e que contribuem para a manuteno da estabilidade do local operado. Entre esses factores salientam-se a reteno mecnica do implante dentro do osso, a aproximao da superfcie do implante margem perissea cortical e a flexo funcional do osso implantar [56]. Uma outra evoluo nos implantes dentrios, no sentido de promover a sua estabilizao primria, foi a adopo da forma de parafuso que, sendo roscado no osso sob presso, evita a sua mobilidade e pode transmitir alguma da tenso ao tecido envolvente.
3. ESTUDOS DE BIOCOMPATIBILIDADE Para alm das propriedades fsico-qumicas intrnsecas do material, o sucesso de um implante est geralmente dependente dos fenmenos que ocorrem na zona da interface formada entre o tecido sseo e o material implantado. O conceito de biocompatibilidade baseia-se nas interaces entre o material e o meio biolgico envolvente [134]. Um dos aspectos mais importantes da biocompatibilidade, no que respeita s qualidades do material, a resposta tecidular local, que normalmente permite obter uma indicao clnica sobre o sucesso do implante [135]. A anlise da resposta tecidular local implantao de um biomaterial , desde h muito tempo, reconhecida como desempenhando um papel importantssimo nos testes de biocompatibilidade. O estudo das interaces entre o meio biolgico e os biomateriais implantados, a nvel da interface entre as clulas e a superfcie dos materiais, essencial para avaliar e quantificar a sua biocompatibilidade [99, 106]. Os avanos mais significativos na rea dos biomateriais dependem de uma cuidadosa e minuciosa determinao do comportamento in vivo, em condies de utilizao funcional, dos diferentes tipos de materiais existentes [136]. O controlo da biocompatibilidade assim, sem dvida, o factor mais importante no sucesso, a longo prazo, dos implantes [137].
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Antes de ser utilizado no corpo humano, um biomaterial deve ser estudado de forma a ser avaliada a sua biocompatibilidade a vrios nveis: a) in vitro, em meio simulador do ambiente fisiolgico, e com culturas de clulas semelhantes s dos tecidos onde o material vai ser implantado [99]; b) in vivo, no animal, em condies prximas da utilizao final do biomaterial; c) in vivo, no ser humano, em condies experimentais bem controladas. Embora at h cerca de 20 anos a utilizao dos biomateriais no fosse previamente submetida a estes ensaios, sendo seleccionados em funo dos conhecimentos gerais sobre as suas propriedades fsico-qumicas e do seu comportamento em experimentao animal limitada, na actualidade esto estabelecidas normas de avaliao e seleco dos materiais e dispositivos mdicos para utilizao humana [138, 139). Antes da aplicao de um biomaterial em situaes clnicas exigida uma bateria de testes que permita aquilatar da sua segurana biolgica, toxicidade, carcinogenicidade e biocompatibilidade. Este conjunto de testes inclui ensaios in vitro e in vivo especficos. Finalmente, so efectuados ensaios controlados em seres humanos onde avaliado o seu comportamento local e efeitos sistmicos. S aps a obteno de resultados vlidos na multiplicidade de testes realizados o biomaterial pode ser utilizado clinicamente. 3.1. Estudos in vitro A variedade de processos e mecanismos que ocorrem na interface do biomaterial, quando implantado in vivo, aumenta a dificuldade do conhecimento das reaces que ocorrem a este nvel. Os ensaios com a utilizao de culturas celulares permitem a obteno de dados sobre a resposta tecidular presena de biomateriais [99,106,114, 140-142]. Esta metodologia experimental vlida no estudo das vrias etapas da resposta biolgica e das interaces entre os biomateriais e as clulas num ambiente especfico e bem controlado [82, 99, 106, 114, 141, 143, 144]. Os estudos in vitro recomendados para a avaliao da biocompatibilidade dos materiais apresentam as seguintes vantagens principais: a) so relativamente rpidos, sensveis, reprodutveis e mais baratos do que os testes in vivo [99, 145]; b) permitem um isolamento e separao dos factores que condicionam o processo a estudar [106, 115, 146];
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c) permitem eliminar, numa fase inicial do processo de desenvolvimento, os materiais que no apresentem biocompatibilidade, poupando tempo e investimento [140]; d) contribuem para a reduo da experimentao animal [99, 146]. As limitaes principais deste tipo de ensaios resultam, essencialmente, da dificuldade de reproduzir, in vitro, o ambiente fisiolgico dos tecidos orgnicos e englobar todas as interaces que existem entre todos os factores includos nos mecanismos de defesa e de reparao do organismo, aps a implantao de um biomaterial [82]. Alguns autores referem expressamente que os resultados obtidos em culturas tecidulares podem no reflectir a situao que ocorre in vivo, durante a diferenciao osteoblstica no processo formativo do tecido sseo [144]. Embora constituam uma metodologia vlida para efectuar uma pr-seleco fcil de muitos materiais desenvolvidos para utilizao mdica, os resultados obtidos nunca podero ser extrapolados directamente para as situaes clnicas, sem ter em considerao as limitaes e as condicionantes destes ensaios. preciso salientar que toda a experimentao in vitro, tanto genrica como especfica, no pode substituir os testes subsequentes in vivo [145, 146]. Muitos dos estudos in vitro apresentados na literatura referem resultados obtidos com linhas celulares modificadas [100, 140]. Este aspecto levanta a questo da sua validade, pois as clulas modificadas nunca esto envolvidas nas interaces que ocorrem in vivo entre os tecidos e os implantes [99, 142]. Alm disso, as clulas modificadas de tipo osteoblstico tm sido um dos modelos favoritos nos estudos da interaco entre os implantes e as clulas "sseas". Todavia, as primeiras interaces ocorrem com as clulas mesenquimatosas indiferenciadas ou com os condrcitos, durante as fases mais precoces da formao ssea endocondral [113]. A utilizao de clulas humanas diferenciadas obtidas a partir do tecido onde, futuramente, se vo implantar os biomateriais, revela-se um factor muito importante, porque mais representativa da reaco tecidular que ocorre in vivo [114]. Os resultados obtidos com os ensaios de biomateriais em culturas celulares tm que ser analisados cuidadosamente. A nossa experincia com culturas de osteoblastos onde foram colocados discos de Osteopatite demonstrou que os resultados obtidos in vitro so antagnicos do comportamento deste material in vivo. O facto de ser um material com grandes potencialidades de trocas inicas com o meio biolgico onde inserido levam a que o meio
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de cultura atinja um pH que interfere significativamente com o crescimento celular. Verifica-se assim que materiais que induzem grandes trocas inicas com o meio biolgico podem alterar as condies do meio de cultura e provocar respostas inadequadas nas clulas em crescimento. Neste tipo de situaes apenas se pode testar o efeito dos produtos de degradao dos materiais em culturas celulares. A presso da sociedade e de entidades oficiais para a reduo de ensaios experimentais com recurso a modelos animais contribuiu fortemente para a aceitao e implementao deste tipo de ensaios [146]. Todavia, nenhum modelo in vitro pode simular, concretamente, o meio fisiolgico real em que se processam as interaces entre os tecidos e os biomateriais. Este tipo de testes poder, fundamentalmente, contribuir para a compreenso de fenmenos isolados entre as clulas e os biomateriais e constituir um complemento precoce dos testes de biocompatibilidade [107,115,140,141,146,147]. A determinao da toxicidade dos materiais, ou seja, os efeitos negativos ou deletrios nas funes celulares normais provocados por um material, pode ser realizada em ensaios in vitro especficos [98,105,113,134,141,144]. A avaliao real da biocompatibilidade de um material deve ser feita in vivo em condies que simulem as situaes a que o material vai ser sujeito durante a sua utilizao clnica, da forma mais realstica possvel. 3.2. Estudos in vivo A utilizao de modelos animais para o estudo da regenerao do tecido sseo, in vivo, aps a implantao de biomateriais uma das etapas fundamentais para a determinao do comportamento do tecido sseo em presena desse agente estranho. Os estudos histolgicos das amostras obtidas em ensaios experimentais, realizados em condies biolgicas prximas das que os biomateriais vo encontrar durante a sua utilizao clnica, permitem analisar quantitativa e qualitativamente o tipo de interface entre o biomaterial e o tecido sseo [82]. Na anlise histolgica das amostras contendo os materiais implantados nos tecidos podem encontrar-se quatro tipos de situaes diferentes [75]: a) se o material txico, os tecidos envolventes sofrem um processo de necrose; b) se o material no txico e biodegradvel, pode ser substitudo pelos tecidos que o rodeiam ou por uma cpsula fibrosa;
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c) se o material no txico e biologicamente inactivo, forma-se uma cpsula fibrosa que o envolve; d) se o material no txico e biologicamente activo, pode formar uma unio na interface com o tecido onde foi implantado. Nos estudos experimentais que usam modelos animais, a regenerao ssea difere significativamente entre os diferentes animais e pode apresentar grandes diferenas no mesmo animal, em funo do seu estado fsico [148]. Podem usar-se vrios parmetros para quantificar e qualificar o comportamento de biomateriais que so colocados em organismos vivos. Entre eles, contam-se a quantificao da percentagem de osso que contacta directamente a superfcie dos implantes [25, 38,149-151], a determinao do tipo e quantidade de clulas imunolgicas que se concentram nos tecidos envolventes do biomaterial [134, 152-155] e a compreenso dos fenmenos e mecanismos que decorrem da implantao dos biomateriais [57, 156]. A investigao da biocompatibilidade dos vrios materiais com potencial de aplicao biomdica pode ser realizada nos tecidos moles [138, 154, 155, 157-159] ou no tecido sseo [138,158, 159], recorrendo utilizao de modelos animais ou, numa fase final dos ensaios, em humanos [82], Alguns autores, adoptando as normas ISO, preconizam a utilizao de testes de implantao dos materiais no tecido muscular animal, visto que os tecidos moles so mais sensveis s diferenas apresentadas pelos diversos biomateriais do que o tecido sseo e, alm disso, os implantes utilizados em ortopedia ou medicina dentria raramente se encontram apenas em contacto com o tecido sseo [154, 160]. Nos implantes dentrios, o contacto predominantemente feito com o tecido sseo. Todavia, fundamental a existncia de um selamento perfeito do colo do implante com o tecido conjuntivo gengival que impea a deposio e migrao de agentes patognicos. A inexistncia desta unio hermtica pode contribuir para o aparecimento de uma situao patolgica peri-implantar que, prolongando-se ao longo da interface, pode destruir a ligao entre o osso e o implante, comprometendo o seu sucesso clnico. O critrio de seleco do tipo de animal a utilizar nos ensaios com os biomateriais depende de vrios factores. Contudo, encontra-se condicionado por aspectos legais que so cada vez mais restritivos, dificultando imenso a experimentao animal [161]. O nmero mnimo de animais recomendado para permitir a obteno de resultados vlidos de dois por tempo de implantao [82]. A maioria dos investigadores utiliza pelo menos cinco ani49
mais para cada tempo de implantao, por forma a permitir o tratamento estatstico dos resultados obtidos [162]. Uma reviso da literatura permitiu coligir os resultados apresentados na tabela 2.1, que resume alguns exemplos dos vrios animais utilizados em trabalhos de investigao sobre biomateriais. Os estudos histolgicos baseados em microscopia ptica [25, 38, 39, 59, 62, 150,151, 156, 175, 180], de fluorescncia [39,43, 59, 60], electrnica de varrimento [39, 62, 156, 167, 181] e de transmisso [44, 62, 92, 156, 175], so frequentemente utilizados como mtodos qualitativos no estudo do comportamento da regenerao ssea e da interface entre o implante e o tecido sseo. Recentemente, surgiram alguns trabalhos onde foi utilizada uma tecnologia microscpica mais evoluda, como o caso da microscopia de varrimento por laser, que permite definir melhor a estrutura da interface devido superior resoluo espacial da amostra num plano simples atravs do feixe laser confocal [182, 183]. A anlise histolgica por microscopia ptica permite evidenciar o tipo de adeso do implante aos tecidos envolventes porque a sua capacidade de resoluo suficiente para caracterizar a interface e a interveno das clulas dos tecidos moles [41]. A afirmao de que as anlises ultra-estruturais no so necessrias para revelar a resposta do osso implantao de um biomaterial porque o nvel ptimo de investigao o micrmetro e no o angstrom [41] contestada por outros autores [167], que manifestam opinio contrria. Estes autores referem que, apesar da microscopia ptica ser uma tcnica rpida e adequada para o estudo da resposta biolgica implantao de um biomaterial, no permite, todavia, distinguir o contacto fsico da adeso qumica nas diferentes fases do processo de integrao. Por outro lado, a microscopia ptica apenas permite uma viso geral dos tecidos que se formam volta dos implantes devendo a caracterizao e a descrio da natureza da resposta do tecido sseo colocao dos implantes ser estudada em alta resoluo. O problema que os estudos ultra-estruturais da interface entre o osso e os implantes so pouco frequentes, porque a preparao das amostras para este tipo de anlise complexa e bastante difcil [44], A micro-radiografia possibilita o estudo do tecido sseo neoformado na zona envolvente da superfcie de um implante, permitindo efectuar a distino entre o tecido sseo mineralizado e o no mineralizado que existe na interface. Esta metodologia de estudo foi utilizada em vrios trabalhos experimentais [59, 165, 175, 177, 178, 184, 185].
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A microscopia de fluorescncia pode utilizar mltiplos marcadores e permite obter informao muito importante sobre o comportamento fisiolgico do tecido sseo, podendo marcar temporalmente a regenerao deste tecido e localizar os locais de maior actividade metablica do seu processo remodelativo [43, 59, 60, 186]. Desde que a metodologia de preparao para anlise ultra-estrutural respeite a integridade das amostras, o que nem sempre exequvel, a possibilidade de estudar em grandes ampliaes a estrutura dos tecidos da interface tem-se revelado de grande utilidade na compreenso dos fenmenos, mecanismos e interaces que ocorrem a este nvel, contribuindo para o avano da investigao sobre o comportamento biolgico dos tecidos aps a implantao dos biomateriais. A utilizao da microscopia electrnica de varrimento torna possvel estabelecer a distino entre o contacto fsico e a adeso qumica entre um biomaterial e o osso [167], tornando-se um mtodo auxiliar valioso no estudo das estruturas da interface. A histomorfometria, sendo um mtodo de anlise quantitativa da percentagem de contacto entre o osso formado e a superfcie do material implantado, fornece elementos vlidos na caracterizao e quantificao da regenerao ssea, aps a implantao de um biomaterial [56]. As tcnicas mais utilizadas recorrem a imagens obtidas atravs de microradiografias [39,177] e/ou cortes histolgicos [25,38, 59,118,149-151,180,187]. Os valores obtidos a partir da percentagem de contacto sseo directo com a superfcie do material, determinados por este mtodo, tambm so denominados como ndice de afinidade [188] ou ndice de deposio ssea [189]. Outro mtodo histomorfomtrico consiste na quantificao e identificao dos diferentes tipos de clulas que se formam na zona da interface, formada entre os implantes e o tecido sseo, e na espessura da membrana formada nessa zona [62, 153, 154, 160]. No sentido de melhorar e validar os resultados obtidos, foi proposto um outro mtodo histomorfomtrico quantitativo, associado a um mtodo semiquantitative, que consiste na avaliao da reaco do tecido sseo e das caractersticas da interface que circunda os implantes, recorrendo a uma escala histolgica graduada [151]. Esta escala consiste na classificao numrica da morfologia tecidular (inflamao, tecido fibroso, lacunas de remodelao, contacto directo entre o osso e o implante e a presena de osso imaturo ou cortical). A comparao da espessura da membrana fibrosa existente na interface, parece ser um teste insuficientemente sensvel para ser utilizado em estudos
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Tabela 2.1 - Principais animais utilizados em ensaios sobre comportamento dos biomateriais
Animal Rato Local Tbia Fmur Subcutneo Periodonto Fmur Palato Tbia Tbia Tbia Tbia Fmur Fmur Tbia Msculo Tbia Tbia Tbia Fmur Fmur Fmur Porco Ovelha Co Fmur Mandbula Mandbula Fmur Fmur Fmur Fmur Mandbula Maxilares Macaco Periodonto Maxilares Crnio Biomateriais Cimento de vidro bioactivo Implantes metlicos Hidroxiapatite e vidros bioactivos Hidroxiapatite Hidroxiapatite Hidroxiapatite e fosfatos de clcio Implantes de titnio Vidros bioactivos Implantes revestidos com hidroxiapatite Vidros bioactivos Implantes revestidos com materiais bioactivos Implantes revestidos com materiais bioactivos T6A14V e hidroxiapatite Hidroxiapatite e clulas sseas Implantes de titnio Cermicos Implantes de titnio revestido Implantes revestidos com materiais bioactivos Vidros bioactivos Implantes revestidos com materiais bioactivos Polmero e ao inox Vidros bioactivos e cermicos de vidro Implantes de hidroxiapatite Implantes revestidos com materiais bioactivos Implantes revestidos com hidroxiapatite Implantes revestidos com hidroxiapatite Implantes revestidos com materiais bioactivos Implantes de alumina e zircnia Implantes de titnio, enxerto sseo e membranas Hidroxiapatite Membranas, hidroxiapatite, implantes de titnio Hidroxiapatite 52 Autores Taguchi e col. Pazzaglia e col. Fujita e col. Kawaguchi e col. Bruijn e col. Bou-Abboud e col. Kalebo e col. Ohura e col. Jansen e col. Andersson e col. Gottlander e col. Maxian e col. Maruyama Kurashina e col. Bianco e col. Chang e col. Kitsugi e col. Klein e col. Kangasniemi e col Caulier e col. Elst e col. Gatti e col. DeLange Hayashi e col. Cook e col. Moroni e col. Hayashi e col. Tavares Becker e col. Ettel e col. Gotfredsen e col. Ripamonti Ref 163 164 79 55 156 157 148 165 166 167 168 130 129 21 169 59 170 171 172 173 174 158 175 176 177 178 73 39 18 179 30 22
Cobaia Coelho
Cabra
comparativos sobre a avaliao da reaco dos tecidos envolventes implantao de biomateriais bem tolerados [160]. Este facto deve-se a no existir uma correlao entre a espessura da membrana e os parmetros de distribuio celular. Alm disso, foi observado que a espessura praticamente no tem relao com o tipo celular, a no ser com os fibroblastos [153]. importante sublinhar que a estrutura da interface e a determinao histomorfomtrica podem, no caso dos cortes histolgicos, estar condicionados pela espessura e polimento dos cortes, assim como pelas propriedades de colorao da resina de incluso [96]. Existem outros mtodos de estudo que incluem tcnicas histoqumicas especficas para a identificao de algumas das clulas presentes na zona da interface [62, 135]. Estas metodologias permitem identificar melhor o tipo de resposta celular local e a influncia das vrias clulas na regenerao tecidular volta dos implantes. Variados factores desempenham um papel relevante no estudo da regenerao ssea e no tipo de interface formada entre os biomateriais e o tecido sseo. Entre eles podem-se incluir: raa, sexo, idade e estado geral de sade do animal; tcnica cirrgica adoptada; condies de adaptao do material s paredes sseas; foras a que so submetidos.
53
Ill MATERIAIS E MTODOS
1. MATERIAIS 1.1. Caracterizao geral dos materiais 1.1.J. Ao Inox 0 ao inox foi utilizado durante vrias dcadas na confeco de implantes dentrios e como material de osteossntese, em aplicaes ortopdicas de tratamentos de fracturas sseas [86]. A sua estrutura e propriedades dependem, fundamentalmente, de possuir o elemento carbono no seu contedo, que em teores elevados reduz a resistncia corroso. 0 contedo de crmio e nquel tambm condiciona a sua resistncia corroso. A presena de aditivos e os tratamentos trmicos ou fsico-quimicos a que seja submetido tambm interferem com a estrutura e as propriedades deste material [82, 174). O ao inox, principalmente do tipo 316LAISI, que produzido em vcuo, muito usado na fixao temporria de fracturas sseas [82,174]. Este ao uma liga metlica de base frrica, que se caracteriza por possuir um contedo baixo de carbono. A sua composio qumica percentual apresentada na tabela 3.1 e as suas caractersticas mecnicas na tabela 3.2. O ao 316L um tipo de material metlico no adequado para implantes permanentes devido sua fraca capacidade de ligao ao tecido sseo, para alm de poder apresentar problemas de corroso [174]. Tabela 3.1 - Composio qumica do ao inox 316L (ASTM, ISO) [1] Fe Cr 60-68% 16-18% Ni 10-14% Mn 2,0% Si 1,0%
55
C P S Mo 0,03% 0,045% 0,03% 2-3%
Tabela 3.2 - Propriedades fsicas e mecnicas do ao inox 316L Ao Inox 31GL
Mdulo de elasticidade (GPa) Carga de Rotura (MPa) Elongao {%) Densidade (g/cm3) Ponto de fuso aproximado (C)
200 965 20 7,9 no determinado (Adaptado de J.C. Wataha) [42]
A camada oxidada superficial do metal no estvel e pode levar libertao de ies ou partculas txicas por fenmenos de corroso. Esta libertao de ies, especialmente de crmio e, em menor quantidade, de nquel e ferro, pode induzir uma resposta inflamatria crnica com reaco de corpo estranho. Esta reaco caracteriza-se pela formao de uma cpsula fibrosa, que vai envolver o material e isol-lo dos tecidos circundantes. A lmina fibrosa formada, de pequena espessura, contem uma acumulao de ies txicos que reduzem dramaticamente a biocompatibilidade do implante e provocam desconforto doloroso nos portadores deste tipo de implantes. Um dos aspectos mais negativos destes materiais a libertao dos produtos de corroso e a sua toxicidade [190], embora Takamura e col. [191] afirmem que o grupo de aos 316L no carcinognico e, na forma de implantes, no evidencia sinais significativos de corroso superficial. Alguns dos produtos de corroso do ao inox acumulam-se no bao, provocando alteraes histolgicas e causando alteraes na populao celular, em particular, pelo esgotamento dos linfcitos. Entre esses produtos contam-se o ferro, o nquel e o crmio [190]. O ferro interfere selectivamente com a expresso do CD2, sendo um regulador importante do sistema imunolgico [192] e, ao inibir a proliferao dos linfcitos T, pode provocar uma depresso do sistema imunolgico [193]. Para o nquel, h resultados que comprovam a sua potencial toxicidade e efeito carcinognico [191]. O crmio pode existir na forma tri ou hexavalente. A forma hexavalente (Cr6+) a biologicamente mais activa, penetrando nas membranas celulares e induzindo alteraes carcinognicas ou dermatite de contacto. A actividade biolgica da forma hexavalente advm da penetrao deste io no cito56
Captulo III - Materiais e Mtodos
plasma da clula, tornando-se trivalente e provocando alteraes nas estruturas internas das clulas [66]. 1..2. Titnio O titnio, na sua forma comercialmente pura, tornou-se o material implantolgico mais utilizado em cirurgia oral e crnio-facial [69]. Em implantologia oral, a utilizao deste material processa-se, essencialmente, na forma de implantes endsseos [97]. Quer na forma de titnio puro quer em liga, a sua ampla utilizao na rea mdica deve-se boa biocompatibilidade, s propriedades mecnicas e resistncia corroso [155, 181]. uma alternativa vlida aos materiais metlicos, anteriormente utilizados, ao inox e ligas de crmio-cobalto [160]. Sendo um material utilizado em implantologia oral h mais de duas dcadas, continuam a existir muito boas razes para o considerar como o material ideal para o fabrico de implantes dentrios endsseos [194]. O titnio puro encontra-se normalmente revestido por uma camada de xidos (Ti02) com uma espessura de 5 nm, que se forma espontaneamente quando o material est exposto s condies atmosfricas. Esta camada passivada apresenta uma alta resistncia polarizao, porque isolante e limita a corroso superficial do material [82, 160]. composta por vrios tipos de xidos - TiO, Ti02, Ti 2 0 3 , Ti 3 0 4 -, reforando-se com o tempo de exposio ao ar e ainda mais em contacto com o tecido sseo [82], Em soluo aquosa, assim como em condies fisiolgicas, a camada oxidada do titnio transforma-se em Ti(OH)4 que estvel nos tecidos normais [160]. O comportamento electroqumico do titnio pode explicar a excelente tolerncia deste material, quando utilizado em condies biolgicas. So reconhecidos quatro tipos diferentes de titnio comercialmente puro utilizado na fabricao de implantes endsseos: tipos I, II, III e IV. Nos anos mais recentes foram introduzidos no mercado implantes que j utilizam na sua composio outros componentes alm do titnio, ou seja, ligas de titnio. A liga de titnio mais divulgada comercialmente denominada T6A14V, contendo 90% de titnio, 6% de alumnio e 4% de vandio [82]. Comparativamente com o titnio puro, esta liga apresenta propriedades mais favorveis, nomeadamente menor condutividade trmica e uma resistncia fadiga superior em cerca de 50%. Como principal desvantagem apontado o facto de possuir alumnio e vandio, que apresentam efeitos adversos no organismo humano [82].
57
Tabela 3.3 - Composies qumicas do titnio e da liga de titnio (% ponderal)[42] N

Ti c.p., Grau 1 Ti c.p., Grau 2 Ti c.p., Grau 3 Ti c.p., Grau 4 T6A14V 0,03 0,03 0.05 0,05 0,05
C
0,10 0,10 0,10 0,10 0,08
H
0,015 0,015 0,015 0,015 0,012
Fe
0,02 0,03 0,03 0,05 0,25
0
0,18 0,25 0,35 0,40 0,13
AI
5,6-6,5
Ti
Balano Balano Balano Balano Balano
3,5-4,5
Tabela 3.4 - Propriedades fsicas e mecnicas do titnio c.p. e da liga de titnio Ti Mdulo de elasticidade (GPa) Carga de Rotura (MPa) Elongao {%) Densidade (g/cm3) Ponto de fuso aproximado (C) 100 240 24 4,5 1660 Ti 2 100 345 20 4,5 1660 Ti 3 100 450 18 4,5 1660 Ti 4 100 550 15 4,5 1660 T6A14V 110 900 12 4,5 1670
(Adaptado de J.C. Wataha) [42]
A composio qumica dos diferentes tipos de titnio comercialmente puro e de uma liga referida na tabela 3.3 e as propriedades mecnicas na tabela 3.4. As propriedades mecnicas do titnio puro na forma de implantes de tipo cilndrico com 3 mm de dimetro, quando o implante est colocado no tecido sseo, permitem obter uma resistncia s foras axiais superior a 400 kg e, no caso das foras terem incidncia lateral, superior a 20 kg [ 194]. Possuindo um mdulo de elasticidade inferior ao do ao inox, est mais prximo dos valores apresentados pelo osso vivo, embora sejam ainda valores muito superiores aos apresentados por este tecido. Apesar do sucesso obtido pelos implantes de titnio em utilizao clnica, tm sido desenvolvidas vrias tcnicas para aumentar a sua fixao ao osso. Alguns dos processos utilizados passam pela alterao da sua estrutura superficial ou pela utilizao de revestimentos com materiais bioactivos [14, 38, 102,170]. O objectivo principal destas tcnicas a obteno de um contacto direc58
to entre o osso e a superfcie do implante, com ausncia de interposio de qualquer camada de tecido fibroso na interface, e um aumento na rapidez e quantidade de regenerao ssea [149, 168]. Permite-se, assim, que os implantes sejam colocados mais rapidamente em carga, reduzindo os tempos de espera, de 4 a 6 meses, normalmente recomendados para os implantes de titnio [170]. :' 1.1.3. Hidroxiapatite \
A hidroxiapatite um biomaterial do grupo dos cermicos bioactivos, cuja frmula qumica Ca10(PO4)6 (OH)^. Este material faz parte de uma classe mais alargada de materiais identificados como apatites, que se caracterizam pela frmula M10(XO4)6Z2. / As apatites formam um leque alargado de biomateriais slidos, que podem apresentar variaes considerveis na sua composio qumica atravs da substituio inica de todos ou alguns elementos nos pontos M, (X04) e Z [136]. Relativamente composio qumica, a hidroxiapatite apresenta, normalmente, uma relao Ca/P de 1,67, que idntica do tecido sseo mineralizado. Esta classe de materiais tem sido utilizada na substituio de tecidos duros devido sua fase mineral ser semelhante dos depsitos minerais do osso e dos dentes, ser biocompatvel, no txica e aderir bem ao tecido sseo [33], A maioria das denominadas hidroxiapatites usadas como biomateriais apresentam variaes, tanto na substituio inica dos grupos fosfato e/ou hidroxlico, como nas caractersticas estequiomtricas da hidroxiapatite padro. As diferenas na estrutura, composio e caractersticas fsicas das hidroxiapatites sintticas derivam do processo de sntese e de sinterizao, que pode ser alterado em funo das propriedades que se pretendem obter para o material. A temperatura, o tempo, o meio atmosfrico e os aditivos usados na sinterizao so alguns dos parmetros que condicionam as caractersticas finais do material [195, 196] e o seu comportamento in vitro [197] e in vivo [ 198, 199]. As propriedades fsicas mais importantes deste tipo de biomaterial so a superfcie especfica, o tamanho e a forma das partculas, a estrutura e o tamanho dos cristais, a porosidade residual aps sinterizao, e o tamanho, a forma e a distribuio dos poros [136]. 59
Tabela 3.5 - Propriedades fsicas e mecnicas da hidroxiapatite e do osso cortical Hidroxiapatite Mdulo de elasticidade (GPa) Carga de Rotura (MPa) Elongao {%) Densidade (g/cm3) 10 40 no determinada 3,1 Osso cortical 18 140 1 0,7 (seco)
(Adaptado de J.C. Wataha) \42]
As propriedades fsicas e mecnicas da hidroxiapatite so apresentadas na tabela 3.5, comparativamente com as do osso cortical [42]. Tm sido descritas metodologias de adio de partculas de alguns materiais que, em conjunto com os tempos e as temperaturas de sinterizao utilizadas, permitem obter hidroxiapatites com determinadas estruturas porosas que simulam o osso vivo [195]. Estas metodologias permitem controlar as caractersticas, o tamanho, a forma e a distribuio dos poros. A hidroxiapatite apresenta uma boa biocompatibilidade quando implantada em tecidos duros ]4] ou em tecidos moles [43], e forma uma unio firme e ntima com o tecido sseo. No apresenta reaces imunolgicas adversas ou toxicidade, quando implantado no organismo [200]. A utilizao clnica da hidroxiapatite est generalizada a vrios campos da medicina. utilizada em reconstrues do ouvido mdio [201-204], reconstruo ou aumento crnio-facial [71], preveno da reabsoro alveolar aps extraco dentria [8, 9], aumento do rebordo alveolar [91], revestimento de implantes dentrios [13-15, 168] e de prteses ortopdicas [60, 189], reconstruo de paredes da rbita, preenchimento de defeitos sseos [4, 72] e como veculo para a libertao de drogas [205-207]. A forma fsica de aplicao depende do tipo de indicao clnica e pode variar entre as formas de grnulos, pasta, bloco e camada de revestimento de implantes metlicos [16]. Relativamente ao comportamento clnico da hidroxiapatite, tm sido realizados estudos no sentido de confirmar a biocompatibilidade em situaes clnicas e comprovar os resultados dos trabalhos experimentais. Embora a hidroxiapatite isolada no possua propriedades osteo-indutoras [157], a impregnao de blocos porosos deste material com clulas cultivadas a partir da medula ssea, na presena de dexametasona, permitiu observar a induo da formao e do crescimento de tecido sseo, uma semana aps implantao no tecido conjuntivo subcutneo de Rato [17]. Tem sido
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referida na literatura a propriedade osteo-indutora da hidroxiapatite, quando associada a clulas osteoblsticas [21] ou protena morfognica do osso (BMP) [208]. Sendo utilizada como revestimento de implantes dentrios em titnio h mais de uma dcada, continua a existir alguma controvrsia sobre as vantagens da utilizao da hidroxiapatite a curto e longo prazos [13]. Nos ensaios experimentais, o revestimento de implantes metlicos com uma camada de hidroxiapatite tem revelado elevadas potencialidades destes implantes, quando comparados com implantes metlicos sem revestimento. So exemplos a rapidez da regenerao ssea, a quantidade de tecido sseo que contacta directamente com a superfcie dos implantes, e a induo de crescimento sseo, quando existe uma m adaptao do implante s suas paredes [11, 33, 130, 168, 176, 209]. Um outro aspecto relevante para este tipo de implantes dentrios a capacidade da hidroxiapatite estabelecer uma unio com as clulas do ligamento periodontal. Esta ligao feita atravs de fibras colagnicas que se unem a uma substncia depositada na superfcie da hidroxiapatite, semelhante ao cimento, que recobre as razes dentrias [209]. Uma reviso da literatura sobre os implantes dentrios endsseos revestidos com hidroxiapatite permite sugerir, face aos resultados clnicos obtidos, que os implantes revestidos com hidroxiapatite possuem valores de sucesso no mdio prazo (6 meses a 6 anos) comparveis aos resultados obtidos com implantes de titnio [13]. Estudos clnicos recentes confirmam os bons resultados a curto/mdio prazo deste tipo de implantes [211]. As suas principais indicaes so em ossos de tipo IV, implantes colocados imediatamente aps a extraco dentria, enxertos nos maxilares e/ou nos seios nasais e quando existem limitaes da espessura do osso disponvel para a colocao dos implantes (implantes com tamanhos inferiores a 10 mm) [13]. Este tipo de implantes demonstrou possuir uma boa adeso a enxertos de osso vascularizado, mantendo a camada de revestimento sem qualquer evidncia de degradao ao fim de 32 semanas [15]. Contudo, os resultados e as concluses obtidas em estudos clnicos de curto e mdio prazo necessitam de uma avaliao continuada e do estudo de vrios parmetros em ensaios com maior durao. Um parmetro fundamental no estudo do comportamento clnico destes implantes, negligenciado por alguns investigadores, a necessidade de confirmar que quer a composio qumica quer a estrutura do revestimento no apresentam diferenas significativas relativamente ao material inicial [212].
61
Sabendo-se que a temperatura de decomposio da hidroxiapatite de cerca de 1250 C, as temperaturas mais elevadas atingidas durante o processo de deposio da camada de revestimento podem induzir a transio de uma fase cristalina para uma fase amorfa [16]. Trata-se, essencialmente, do resultado da elevada velocidade de arrefecimento dos revestimentos obtidos a partir do material fundido por projeco de plasma. Quando a hidroxiapatite submetida a temperaturas superiores a 1300 C ocorre uma reaco qumica (Ca10(OH)2(PO4)6 > 2Ca3(P04)2 + Ca 4 P 2 0 9 + H20), em que se forma a-TCP (tri-fosfato de clcio) [196, 213]. Alguns autores referem que a deposio de uma camada de hidroxiapatite pela tcnica de projeco de plasma altera fortemente a estrutura cristalogrfica do material, diminuindo em 30% o grau de cristalinidade quando se compara com o material de origem [166]. Este processo de deposio da camada de revestimento pode afectar significativamente as propriedades fsico-qumicas do material [33, 171, 212-215]. As transformaes de fase no material depositado atravs deste mtodo dependem das caractersticas das partculas utilizadas [171, 214]. No caso especfico da hidroxiapatite, este material sofre um processo de desidroxilao, sendo transformado em oxihidroxiapatite e parcialmente decomposto em a-TCP e tetrafosfato de clcio [171, 214]. j v A modificao da composio qumica da hidroxiapatite, pela adio de vrios ies e pela alterao da sua porosidade, tem contribudo para o desenvolvimento de novos tipos de materiais com bom comportamento em estudos experimentais. 1.1.4. Vidros Bioactivos Os vidros bioactivos so materiais que apresentam boa biocompatibilidade e capacidade de adeso ao tecido sseo [158]. Os vidros mais simples so os do sistema binrio CaO-Si02 [216] que, alm de apresentarem bioactividade, possuem tambm a capacidade de adeso ao tecido sseo [165, 184]. Este tipo de material foi inicialmente desenvolvido em 1971, por Hench e col. [75]. Possui a composio qumica apresentada na tabela 3.6 e foi designado comercialmente por Bioglass, sendo dos primeiros materiais sintetizados pelo Homem com capacidade de estabelecer uma ligao qumica com tecido sseo. Os vidros bioactivos podem apresentar propriedades diferentes em funo de alteraes na concentrao dos seus componentes ou pela adio de
62
Tabela 3.6 - Composio do vidro bioactivo Bioglass [217) Na20 24,5% CaO 24,5% Si02 45,0% P205 6,0%
outros ies. As diferentes composies qumicas e as formas distintas de degradao cintica, influenciam a interface com os tecidos biolgicos [158]. A adio dos ies Na 2 0 e P 2 0 5 aos vidros do tipo CaO-Si0 2 aumenta a sua capacidade reactiva. Inversamente, a introduo de A1 2 0 3 e de Fe 2 0 3 na composio qumica destes materiais reduz esta capacidade [184]. A determinao terica das propriedades destes materiais pode ser realizada por computador atravs de modelos matemticos que indicam a frmula do vidro bioactivo seleccionado, considerando as propriedades que se desejam obter [218], No entanto, tem sido proposto e utilizado um modelo mais simples de representao ternria, em diagrama de fase, que permite descrever o efeito simultneo dos trs componentes principais, Si0 2 , CaO e Na 2 0/P 2 0 5 , mantendo-se os restantes compostos em proporo fixa. Estes tipos de materiais, extremamente bioactivos, apresentam srias limitaes no que respeita resistncia mecnica, nomeadamente no que se refere aos parmetros de fadiga e fractura. Esta limitao condiciona a sua utilizao clnica em situaes de solicitaes mecnicas, levando a que vrios investigadores procurassem desenvolver materiais mais resistentes atravs da precipitao de fases cristalinas em matrizes vtreas, reforando o material sobre o ponto de vista mecnico. Desde ento, vrias formulaes tm sido propostas no campo dos vidros cristalizados [16]. A ideia bsica cristalizar duas ou trs fases do vidro que possuem propriedades diferentes. A fase cristalina aumenta a resistncia e as outras duas fases actuam ambas como cimento ou como agente bioactivo. Este grupo de materiais pode ser dividido em dois tipos distintos, em funo das diferenas estruturais e da composio: os vidros bioactivos e os vidros cermicos. Os vidros bioactivos so vidros com superfcies activas que formam camadas de proteco superficial ricas em slica ou fosfatos de clcio. Os vidros cermicos so vidros com precipitao de fases cristalinas aps tratamento trmico, que apresentam actividade superficial semelhante dos vidros bioactivos [218]. A tabela 3.7 apresenta a composio qumica de alguns vidros cermicos mais conhecidos comercialmente. A tabela 3.8 mostra algumas das suas propriedades. 63
Tabela 3.7 - Composio qumica de alguns vidros cermicos bioactivos, em comercializao (% ponderal)
SO, CERAVITAL CERABONE BI0VER1TE 40-50 Py0; CaO CaF? MgO 2,5-5 Na20 5-10 KO 0,5-3 ALO, Fases
10-50 30-35
34 19-52
16,2 4-24
44,7
0,5
4,6 3-5 3-5
12-33
9-30 FO.7-7 5-15
Vidro, apatite Vidro, apatite, wolastonite Vidro, apatite/ flogopite
(Adaptado de M. H. Fernandes) [219]
Tabela 3.8 - Propriedades de alguns vidros cermicos em comercializao [219, 220].

CERAVITAL CERABONE BIOVERIT OSSO
100-150 Mdulo de ruptura (MPa) Mdulo de Young (GPa) 500 Resistncia compresso (MPa) 3 Densidade (g/cm ) Tenacidade fractura (KIC -MPa.m1/2)
215 118
1080 3,07
100-160 77-88
60-170 1-19 2-170 500 2 , 8 0,16-2,25 2-12 0,5-1
A formao, por tratamento trmico, de cristais de apatite e wolastonite numa matriz de vidro constituda por MgO-CaO-Si02 aumenta as propriedades mecnicas deste material [48], mantendo a propriedade de adeso ao tecido sseo atravs da formao de uma camada de apatite na sua superfcie, quando em contacto com os fluidos orgnicos [221]. Os ies de fsforo necessrios para a formao da camada de apatite, na superfcie dos cermicos de vidro, so fornecidos apenas pelos fluidos envolventes [79]. A dissoluo dos ies de clcio e de slica, das fases vtreas e da wolastonite suprimida pela presena de A1203, concentrado na fase vtrea, devido formao de compostos insolveis que, obviamente, aumentam a estabilidade qumica. Desta forma, aceite que a presena de A1203 aumenta a durabilidade qumica dos vidros [221]. A incluso de A1203 na composio dos vidros bioactivos e a sua consequente estabilizao reduz a adeso ao tecido sseo, mesmo quando se forma na superfcie do material uma camada rica em clcio e fosfatos [216]. Os vidros que possuem menos de 1,5 mol/% de
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A1203 formam uma camada superficial de apatite semelhante dos materiais que no possuem A1203. Os vidros com A1203 em concentraes superiores a 1,7 mol/% no geram esta camada superficial, semelhana do que ocorre nos vidros sem Si0 2 . A adio de pequenas quantidades de Al 2 0 3 suprime a bioactividade dos vidros e cermicos de vidro, atravs da inibio da formao de apatite nas suas superfcies quando implantados no organismo [184, 216]. A adio de Fe 2 0 3 aos vidros do tipo CaO-Si02 suprime mais eficazmente a formao de uma camada rica em fsforo, clcio e slica, do que a adio de Al203. A adio de valores superiores a 3% de Fe 2 0 3 suficiente para evitar completamente a formao dessa camada [184]. A dissoluo dos ies de clcio e slica contidos nos vidros bioactivos e nos materiais cermicos de vidro desempenha um papel relevante na formao da camada superficial de apatite [48,221]. Os ies de slica dissolvidos contribuem, de forma significativa, para a formao dos ncleos de apatite nas superfcies dos vidros bioactivos e nos cermicos de vidro, pois desempenham uma funo essencial durante a fase inicial deste processo. O incremento do contedo de slica diminui a cintica da reaco dos vidros bioactivos, sabendo-se que vidros com mais de 60% de slica no so bioactivos, devido formao de uma rede fechada de slica [159]. A composio e as caractersticas estruturais desta camada de apatite superficial so semelhantes s da apatite do osso [48]. A condio essencial para que os vidros bioactivos e os cermicos de vidro se unam ao tecido sseo a formao dessa camada de apatite, na sua superfcie, quando implantados no organismo [76, 159, 165, 184, 220, 222]. Esta camada superficial pode ser reproduzida numa soluo acelular que simule o fluido orgnico, com uma composio e concentrao inica iguais do plasma sanguneo humano [216, 221-223]. A sua formao deve-se a uma reaco qumica dos vidros bioactivos e dos materiais cermicos de vidro com os fluidos orgnicos que envolvem os materiais, aps a sua colocao no organismo [222]. A formao da camada de apatite hidroxicarbonatada policristalina, nos vidros bioactivos, est dependente da composio do material em Si02 [223]. Um vidro de rede menos estvel com menor concentrao de Si02 forma esta camada mais rapidamente do que um vidro com 55% de Si0 2 na sua composio. Aumentando a concentrao deste elemento at 60%, eliminada a possibilidade de formao desta camada biologicamente fundamental para a unio qumica ao osso [159, 223].
65
1.2. Caracterizao dos materiais utilizados
1.2.1. Osteopatite A Osteopatite uma hidroxiapatite que, possuindo uma composio qumica diferente da hidroxiapatite padro, tem estrutura igual da hidroxiapatite quimicamente pura. Encontram-se descritas na literatura a composio qumica e algumas propriedades deste material [9, 224-226]. A composio qumica da Osteopatite, apresentada na tabela 3.9, mostra que contm uma quantidade de caties para alm do clcio, como, por exemplo, o sdio, que induz algumas modificaes do meio envolvente, no que respeita a alteraes da sua composio qumica e alteraes do pH, sem haver uma perda significativa do peso do material [225]. Os grnulos de Osteopatite possuem uma superfcie especfica de 0,9 m2/g e uma densidade de 1,80 g/cm3 [9].
1.2.2. Cimento de Vidro Bioactivo A composio qumica e algumas das propriedades fsico-qumicas, alm do comportamento biolgico deste material j foram descritas na literatura [187,227-229]. A composio qumica do vidro bioactivo apresentada na tabela 3.10. Resumidamente, podemos referir que o processamento deste cimento consiste na reduo do vidro a p, sendo misturado com uma soluo tamponada, com pH de 7,4, de (NH 4 ) 2 HP0 4 e NH 4 H 2 P0 4 . Aps este processo, obtem-se uma pasta que ganha presa ao fim de 5 a 8 minutos. O tempo de presa pode ser determinado atravs da utilizao do teste de agulhas de Gilmore que utiliza dois penetradores cilndricos com a possibilidade de apliTabela 3.9 - Composio qumica da Osteopatite P205 Kp A1203 CaO MgO Na20 Fe203
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43,1% 1,0% 0,21% Restante 0,7% 3,1% 0,34%
Tabela 3.10 - Composio qumica do vidro bioactivo que constitui o cimento de vidro bioactivo (% ponderal) Si02 35,6 CaO 42,4 P205 17,0 Nafl 5,0
cao de tenses diferentes sobre o cimento. Pode modifcar-se o tempo de presa alterando o tratamento trmico do p de vidro, no tamanho das partculas, e nas propores da mistura entre o p e a soluo [187]. Num cimento deste tipo pode defnir-se o tempo de presa inicial como correspondendo ao incio da formao dos cristais resultantes da reaco entre o silicato e a soluo de fosfatos. Nesta fase, o material deixa de ser moldvel no permitindo a inciso da primeira agulha. Aps o incio da formao dos cristais, a deformao do material acompanhada pelo aparecimento de fissuras, tornando-se a pasta frivel. Num segundo tempo, tempo de presa final, o cimento torna-se rgido devido ao estabelecimento de ligaes entre os cristais primrios. A formao do cimento deve-se precipitao dum composto de fosfato de amnia e clcio hidratado [229], com a frmula de CaNH4P04.H20 [48]. Uma propriedade favorvel de um biomaterial utilizado como cimento sseo ou para o preenchimento de defeitos sseos estar disponvel na forma de pasta, que endurece ao fim de poucos minutos, devido sua manipulao e colocao fcil no local operatrio [163].
2. MTODOS 2.1. Caracterizao dos materiais

2.1.1. Composio qumica
A determinao da composio qumica dos materiais foi realizada atravs da microanlise por raios X, com a utilizao de uma sonda detectora da disperso de energias (EDS), acoplada a um microscpio electrnico de varrimento. Neste caso, a determinao do espectro de energia dos fotes realizada atravs da medida directa da energia absorvida por um sistema detector
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que aproveita as propriedades ionizantes da radiao, estando o sistema integrado num microscpio electrnico de varrimento, JEOLJSM 6301F (Jeol, Ltd, Japo). Esta particularidade permite aliar a realizao da microanlise por raios X com a observao em alta resoluo das amostras. O espectrmetro de disperso de energias, utilizado para a microanlise por raios X, possui como detector um cristal semicondutor de silcio, preenchido parcialmente com ltio. Este espectrmetro analisa, simultaneamente, todo o espectro de raios X emitido pelas amostras, determinando continuamente a energia de cada foto detectado [230] (Fig. 1). A realizao da microanlise por raios X requer a excitao da superfcie da amostra por um feixe de electres e a anlise dos raios X por uma microssonda, que no mais do que um espectrmetro de raios X (EDS Energy Dispersive System). Este sistema controlado por um computador, permitindo visualizar, em tempo real, o espectro global registado e o seu processamento imediato. O computador permite a realizao de um exame detalhado de todo o espectro obtido, o seu processamento e registo, para anlise qualitativa e quantitativa [230]. Nas imagens obtidas encontram-se referidos os seguintes itens, que importa legendar, para uma perfeita compreenso do grfico:
feixe de electres
amostra
PR - rejeio de empilhamento HV - alta tenso A - amplificador PA - pr-amplificador MCA - analisador multicanal
terminal grfico
Fig. 1 - Espectrmetro de raios X de disperso de energias (EDS), com detector de Si(Li).

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VFS - escala de fotes libertados (valor mximo). Livetime - tempo efectivo necessrio para obter o espectro. keV- tenso de acelerao dos electres. Label - legenda introduzida pelo operador e a potncia a que observado (por exemplo 15 keV). Uma das maiores limitaes deste equipamento a dificuldade de detectar elementos presentes em baixas concentraes e a possibilidade de sobreposio dos picos de alguns compostos qumicos, por exemplo o mangans com o crmio e com o ferro. A necessidade de tornar as amostras condutoras, revestindo-as com uma pelcula de ouro ou carbono, para observao concomitante, leva ao aparecimento dos picos correspondentes a estes ies no espectro recolhido, sendo um factor de perturbao nos traados obtidos. Os espectros obtidos permitem apenas uma anlise qualitativa e semiquantitativa dos compostos qumicos presentes nas amostras estudadas. A resoluo espacial, em profundidade e lateralidade, um factor essencial na avaliao da informao obtida nos espectros de anlise pontual das amostras, principalmente na zona da interface. Conforme se pode observar na fig. 2, o efeito da energia do feixe de electres atinge uma zona, em profundidade e largura, que pode levar ao aparecimento de interferncias produzidas pela composio do material. Este efeito fundamental, principalmente quando o ponto em anlise se encontra na zona da interface, onde existe o risco da distncia da superfcie do biomaterial ser inferior a 1 um. 2.1.2. Anlise Superficial A anlise da morfologia superficial e da micro-estrutura das amostras foi realizada com recurso utilizao de microscpios electrnicos de varrimento, JEOLJSM 35C eJSM 6301F (Jeol, Ltd,Japo). Para a melhor observao dos pormenores topogrficos utilizou-se a funo de electres secundrios, que permite uma melhor visualizao do estado e das caractersticas superficiais. Os materiais metlicos, pinos, foram observados directamente no microscpio sem preparao prvia por serem materiais metlicos condutores elctricos. As amostras cermicas foram recobertas com uma camada fina de ouro, atravs de um processo de deposio catdica em equipamento especfico para esse fim, JEOL FINE COAT, ION SPUTTER JFC 1100 (Jeol, Ltd, Japo), de forma a torn-las condutoras de electres.
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1>E2
Fig. 2 - Efeito da energia do feixe de electres (E) e do nmero atmico da amostra (Z) no volume de interaco.
2.2. Preparao dos Materiais 2.2A. Pinos Metlicos (Ao Inox e Titnio) Maquinaram-se pinos com um dimetro de 2+ 0,2 mm e comprimento de 6 mm a partir de um varo de ao inox 316L e outro de titnio (pureza qumica >99,5%) adquiridos comercialmente (Thyssen Inds., Alemanha). A superfcie dos pinos apresentou algumas estrias de maquinagem, resultantes do tipo de preparao das amostras. Os pinos foram colocados num aparelho de ultrassons JULABO USRI (Julabo Labortechnick, Alemanha), contendo gua destilada desionizada, durante 15 minutos, para remover possveis resduos depositados na sua superfcie, durante a preparao. No foi realizado qualquer tratamento superficial. Seguidamente foram colocados em mangas de esterilizao, fechadas hermeticamente e colocadas em autoclave a 135 C, durante cerca de 30 minutos e a uma presso de 2 atmosferas, para se proceder esterilizao dos materiais. 2.2.2. Ostopathe A partir de um material de sntese orgnica, o produto foi modo, durante 4 horas, num moinho de bolas com 50% de gua destilada, para a obten70
o de partculas de pequenas dimenses. 0 p foi seguidamente compactado numa prensa com a aplicao de uma presso uniaxial de 150 MPa e sujeito a um processo de sinterizao (1100 C, durante 4 horas). O material obtido foi fragmentado em grnulos de diversos tamanhos, sendo feita a sua classificao por crivagem [224]. Os grnulos com as dimenses de 0,5 a 0,85 mm (-20/+100 mesh ASTM) foram seleccionados aps a sua passagem por crivos calibrados. O tamanho mnimo dos grnulos importante para prevenir eventuais fenmenos de fagocitose pelas clulas de defesa [4, 6, 7, 34, 231]. Os grnulos foram colocados em mangas hermeticamente fechadas para serem esterilizados em autoclave, durante cerca de 30 minutos, a temperatura de 135 C e presso de 2 atmosferas.
2.2.3. Cimento de Vidro Bioactivo
O p de vidro foi misturado com uma soluo de fosfato de amnia, ajustada a pH de 7,4. Esta soluo foi preparada pela dissoluo de (NH4)2HP04 e NH4H2P04 em gua destilada. A pasta obtida foi manipulada manualmente, apresentando um tempo mdio de presa de cerca de 5 minutos. Este tempo permitiu a colocao e adaptao fcil do cimento no defeito sseo antes da solidificao da pasta.
2.3. EXPERIMENTAO ANIMAL 2.3.1. Modelo Experimental
O estudo do comportamento do tecido sseo aps a implantao de biomateriais deve ser realizado, idealmente, em condies anlogas ou homlogas s que se verificam quando o biomaterial utilizado clinicamente. Contudo, em estudos experimentais de mdia durao, o recurso a modelos animais a metodologia mais recomendada por se tratar de uma fase precoce da avaliao do comportamento tecidular aps a introduo de um corpo estranho [139]. A deciso de seleccionar um animal para testar o comportamento de um tecido especfico depende de inmeros factores. Os critrios cientficos para esta seleco dependem dos objectivos do estudo. Todavia, devem ter-se em especial ateno os aspectos anatmicos, bioqumicos, fisiolgicos e patol71
gicos que condicionam os mecanismos de resposta do animal. A fundamentao da escolha do animal deve tambm ter em considerao os estudos prvios realizados em condies semelhantes, que permitem estabelecer comparaes entre os resultados obtidos no ensaio e os resultados publicados na literatura. 0 modelo experimental utilizado neste estudo referido abundantemente na literatura mundial, em estudos in vivo sobre o comportamento biolgico da maioria dos biomateriais [129,131,132,148,165-170, 182, 184, 208]. O modelo de implante transcortical um mtodo recomendado pela sua eficcia na realizao de testes sobre a determinao da fora de adeso na interface entre os biomateriais e o tecido sseo [177, 232]. A seleco do Coelho como animal de experimentao foi realizada atendendo aos aspectos referidos. A utilizao deste animal permite, de forma relativamente fcil, comprovar o comportamento dos materiais no tecido sseo e estabelecer comparaes com trabalhos publicados em revistas internacionais, onde adoptada metodologia semelhante [151,166,182]. Tratando-se de um estudo onde o objectivo fundamental a anlise do comportamento de vrios biomateriais, sendo dois deles inovadores, este tipo de modelo experimental vlido quando se pretendem obter resultados que permitam fornecer indicadores das potencialidades de integrao rpida dos materiais ensaiados no tecido sseo. Estudos experimentais de longo prazo, prvios utilizao clnica dos biomateriais, implicam a seleco de um tipo de osso, com estrutura e localizao idnticas s do tecido que os biomateriais pretendem substituir clinicamente. Desta forma, possvel realizar uma melhor avaliao e extrapolao dos resultados para a sua aplicao clnica. O recurso a modelos animais recomendado sempre que a durao do perodo experimental no ultrapassa o mdio prazo, isto , 6 meses [138]. A transposio dos resultados obtidos no Coelho pode ser feita para o Homem quando se recorre ao mesmo tipo de osso, multiplicando-se o valor dos tempos seleccionados por trs [56]. O osso regenerado volta dos implantes de titnio aparenta semelhanas significativas no Homem, Co e Coelho. O facto de a regenerao ssea ocorrer mais rapidamente no Coelho um dos factores que contribuem para a seleco deste animal [148]. O custo dos animais e da sua manuteno outro factor a ter em conta, devido s implicaes que tm na viabilidade do projecto de experimentao. O Coelho pode considerar-se um animal com custos de aquisio e manuteno dentro do razovel. Sendo mais barato que os animais de maior porte, apresenta ossos com dimenses normalmente suficientes para a im72
plantao de biomateriais, o que no acontece com o Rato ou com a Cobaia [169]. A manipulao dos animais de experimentao tem que obedecer a normas especficas e legalmente estipuladas [161, 162]. O tratamento deve ser feito por pessoal especializado e em condies adequadas, pois estes animais so muito sensveis s variaes ambientais e podem morrer facilmente durante o ensaio experimental. A legislao actualmente em vigor, em Portugal, sobre as normas tcnicas de proteco dos animais utilizados para fins experimentais e outros fins cientficos, obriga a vrios cuidados de ordem geral e de acomodao, assim como a seleco e o nmero de animais, alm de todas as condicionantes que devem regulamentar a experimentao animal [161]. O nosso trabalho contemplou todas as normas existentes na legislao vigente no que respeita experimentao animal. 0 nmero de animais a utilizar no ensaio experimental foi definido em funo de vrios parmetros: Minimizao do nmero de animais a operar - O cumprimento das normas legais em vigor no nosso Pas implica a reduo mxima do nmero de animais a utilizar nos estudos experimentais [161]. Esta norma est em conformidade com o que internacionalmente recomendado para este tipo de investigao animal [138, 139]. Como se referiu na Introduo, no caso dos testes de toxicidade o nmero de animais a utilizar de dois [162]. No estudo de biocompatibilidade, segurana biolgica e eficcia os investigadores devem usar um nmero mximo de cinco ou seis animais [139,162]. Contudo, com um mnimo de dois animais por cada tempo de implantao podem obter-se resultados vlidos para este tipo de estudos [82]. Limitaes estatsticas - Utilizao de um nmero mnimo de animais que permita realizar tratamento estatstico da variao da percentagem de contacto directo do tecido sseo com os biomateriais. Com amostras superiores a cinco animais por tempo de implantao j possvel fazer a determinao estatstica da variabilidade entre os diferentes materiais. Custos totais do projecto de investigao - O tamanho e o nmero dos animais, bem como a durao do ensaio, tm implicaes significativas nos custos da investigao. As limitaes econmicas condicionam o recurso a um nmero elevado de animais e a ensaios experimentais de longa durao.
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2.3.2. Protocolo da Cirurgia Experimentai Neste estudo experimental, foram utilizados 12 coelhos (Oryctolagus cuniculus) adultos, de raa Nova Zelndia, de ambos os sexos e com peso mdio de 3,0+ 0,4 kg. Os animais foram divididos em dois grupos de 6 coelhos cada. Este nmero de animais permite obter resultados vlidos no estudo da biocompatibilidade dos materiais ensaiados [82,162]. O protocolo experimental foi realizado em Santarm, na Estao Zootcnica Nacional, que um centro licenciado para a experimentao animal. A equipa cirrgica foi constituda por um cirurgio, um cirurgio ajudante, um anestesista, um instrumentista, um mdico veterinrio e dois tcnicos de apoio. A tcnica anestsica utilizada consistiu na perfuso intra-muscular (i.m.) de Ketamina (Ketalar, Parke-Davies S.A., Espanha), numa dose de 100 mg/ kg de peso corporal, complementada por Midazolam (Dormicum, Roche, Suia), na dose de 0,20 mg/kg, reforada com a administrao de anestesia local atravs da perfuso i.m. de 1,8 ml de Lidocaina a 2% com Epinefrina a 1:100000 (Graham Chemical Co., Jamaica) perto da zona da interveno. Durante o acto cirrgico foram utilizadas todas as condies de assepsia recomendadas para este tipo de procedimentos experimentais. Todo o material utilizado num dado animal era descartvel, embalado e esterilizado individualmente. O local seleccionado para se implantarem os materiais foi a tbia posterior, direita e esquerda, de cada coelho. Escolheu-se um acesso fcil face anteromedial da tbia, procurando produzir o menor traumatismo possvel nos tecidos intervencionados e obter um leito sseo excelente. Os materiais foram colocados, bilateralmente, na seguinte ordem: - tbia esquerda: grnulos de Osteopatite e pino de ao inox 316L; - tbia direita: cimento de vidro bioactivo e pino de titnio. Esta ordem de distribuio dos materiais foi definida tendo em conta a possibilidade de existirem possveis interaces entre os dois metais, se colocados no mesmo osso a distncias prximas. O plo que recobria as patas a operar foi cortado imediatamente antes da interveno (Fig. 3) e a superfcie exposta foi desinfectada com uma soluo drmica iodada, bactericida e antimictica (Betadine, Asta Mdica, Lisboa). A exposio da superfcie ssea foi realizada atravs de uma inciso longitudinal com cerca de 6 cm, utilizando-se um bisturi cirrgico com uma
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Captulo II! - Materiais e Mtodos
lmina n 15. A inciso permitiu o acesso ao peristeo, que foi cuidadosamente cortado e descolado, permitindo a exposio do osso onde foi realizada a colocao dos biomateriais (Fig. 4). Foram realizadas janelas sseas de tipo rectangular na superfcie do osso exposto, com as dimenses mdias de 12x3 mm, para a colocao dos materiais cermicos, perfurando a parede cortical at cavidade medular (Fig. 5). Para a implantao dos pinos metlicos, usaram-se brocas cilndricas normalizadas de tungstnio com 2 mm de dimetro. Estas brocas permitem a obteno de orifcios com um dimetro aproximado de 2,0+ 0,1 mm. Perfurando a cortical at medula ssea obtm-se um apoio firme dos pinos na parede interna da cortical oposta (Fig. 6). O corte do osso foi realizado com brocas de tungstnio a baixa rotao, e acompanhado de irrigao abundante com uma soluo de soro fisiolgico (B. Braun Medicai S.A., Espanha), prevenindo-se o sobreaquecimento do osso na zona operada. Teve-se o mximo cuidado para minimizar o trauma cirrgico durante todo o processo. Para a realizao deste procedimento, foi utilizado um equipamento comercial, desenvolvido e adaptado para a colocao de implantes dentrios, Osada XL-150 (Osada Irrigation Dispenser, Osada Electric Co. Ltd., Japo), com rotao no superior a 1500 rpm. Os materiais foram esterilizados em autoclave (135 C durante cerca de 30 minutos, a uma presso aproximada de 2 atmosferas), sendo acondicionados, previamente, em mangas de esterilizao hermeticamente fechadas. Esta tcnica de esterilizao demonstrou, em estudos realizados por outros investigadores, no alterar as propriedades de materiais semelhantes [73, 149, 173]. Durante a colocao no osso, os pinos metlicos foram pressionados para se fixarem firmemente s paredes sseas e evitar o aparecimento de micromovimentos nos implantes, que pudessem interferir com o processo regenerativo do tecido sseo. Os grnulos de Ostopathe e a pasta de cimento de vidro bioactivo foram compactados com uma esptula metlica para se adaptarem firmemente s paredes das cavidades sseas. Os materiais foram colocados a uma distncia entre os orifcios de cerca de 1,5 cm. Concluda a implantao, removeram-se todos os resduos, fragmentos do osso cortado e o excesso de materiais no local intervencionado, atravs de uma lavagem abundante com soro fisiolgico. Os tecidos foram suturados em duas camadas distintas e com dois tipos de sutura diferentes. A camada tecidular profunda foi suturada com fio de sutura reabsorvvel (Dexon II, Davis-f Gleck) e a camada superficial com fio de seda 4-0 (B. Braun SSC AG, Suia). Finalmente, o local cirrgico foi limpo e desinfectado atravs de irrigao abundante com Betadine soluo drmica.
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Fig. 3 - Patas posteriores do coelho preparadas para serem intervencionadas cirurgicamente. O plo foi cortado de modo a permitir uma correcta desinfeco e manipulao do local operatrio.
Fig. 4 - Preparao de janela ssea para a colocao dos materiais cermicos com broca de tungstnio a baixa rotao e com irrigao abundante. 76
Fig. 5 -Janela ssea, na tbia da pata esquerda, onde foram colocados os grnulos de Osteopatite. O orifcio onde foi colocado o pino de ao inox encontra-se recoberto pelos tecidos.
Fig. 6 -Janela ssea, na tbia da pata direita, onde foi colocado o cimento de vidro bioactivo. O orifcio onde vai ser colocado o pino de titnio encontra-se j preparado.
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Na fase ps-operatria, os animais foram submetidos a uma teraputica antibitica com 200000 IE de penicilina (Combi-Kel, Helsinn, Portugal), numa dose de 0,12 mg/kg, por um perodo de uma semana e tratados segundo as condies recomendadas para animais de experimentao. Os animais foram colocados em jaulas isoladas e com total liberdade de movimentos. A alimentao, igual para todos os animais, consistiu na dieta convencional de rao e gua em doses aconselhadas para coelhos. Uma semana antes do sacrifcio foi administrado, por via e.v., cloridrato de tetraciclina (Terramicina, Pfizer, Portugal), numa dose de 30 mg/kg, para servir de marcador fluorescente. A tetraciclina possui uma grande afinidade de deposio em tecidos duros, durante o processo de formao/remodelao e fluorescente mediante a incidncia de luz ultra-violeta (IN). Decorrido o perodo experimental, os animais foram sacrificados atravs de uma overdose endovenosa de anestsico (Penthotal Sdico, Lab. Abbott Lda., Portugal), 4 e 10 semanas aps a implantao dos materiais. Aps o sacrifcio, foram retirados todos os segmentos do osso contendo os materiais implantados. Os tecidos moles envolventes foram cuidadosamente dissecados e removidos. As amostras, assim preparadas, foram colocadas num frasco de vidro estril, contendo uma soluo de formol a 4%, tamponada a pH 7,4. Este procedimento foi executado temperatura ambiente (20-25 C) e, aps serem colocadas identificaes codificadas, as amostras foram transportadas em mala trmica para o laboratrio a fim de serem sujeitas ao processamento histolgico. Na altura da colheita dos blocos sseos contendo os biomateriais, estes foram observados cuidadosamente na procura de sinais macroscpicos evidentes de qualquer alterao patolgica, sendo fotografados e radiografados (Figs. 7 e 8). 2.4. Preparao Histolgica O protocolo da tcnica de preparao histolgica das amostras de tecidos duros no descalcificados, contendo implantes, foi por ns adaptado e desenvolvido no laboratrio de Anatomia Dentria da FMDUP, a partir de mtodos descritos na literatura [38, 91, 233-241). O primeiro passo deste protocolo foi a fixao das amostras. Para diminuir os tempos de fixao, reduziu-se o mximo possvel o tamanho da amostra. Quanto mais reduzida for a amostra, menor o tempo que deve ficar imersa na soluo fixadora.
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Fig. 7 - Amostra de um bloco de osso contendo materiais implantados, aps ser cortado da tbia e serem dissecados os tecidos moles.
Fig. 8 - Imagem radiogrfica de um bloco de osso com grnulos de Osteopatite e um pino de ao inox, 10 semanas aps a implantao. 79
O processo de fixao utilizado, consistiu na introduo dos blocos isolados num frasco de vidro esterilizado, contendo uma soluo de formol a 4%, que foi fechado hermeticamente por um perodo de tempo nunca inferior a 24 horas. O tempo de fixao pode ser prolongado em funo do tamanho da amostra. Decorrido o tempo recomendado para uma fixao correcta, iniciou-se a fase de desidratao, numa srie crescente de concentraes de lcool. Este processo desenvolveu-se colocando as amostras em frascos individuais, contendo etanol a 70% durante cerca de 48 horas, temperatura ambiente do laboratrio (20-25 C). Seguidamente, colocaram-se as amostras durante perodos iguais de tempo, em frascos contendo lcool etlico a 70, 80, 90 e 100%. A soluo de etanol a 100% foi substituda trs vezes. A etapa seguinte, de incluso, consistiu na colocao das amostras em frascos de vidro esterilizados e individualizados, contendo uma soluo composta por 800 ml/l de metil-metacrilato (Methyl Methacrylate BDH), 200 ml/l de Plastoid (Plastoid N, Rohm Pharma) e 1 gr/l de Perkadox (Akzo Chemicals BV, Holanda). Para remover as bolhas de ar que habitualmente se formam na soluo antes da polimerizao, os frascos abertos foram colocados num aparelho de vcuo durante 10 a 15 minutos. Aps serem hermeticamente fechados, foram colocados num equipamento de banho-maria GFL (Gesellschaft fur Labortechnik GmbH, Alemanha) temperatura de 37 C, durante cerca de 48 horas, at os blocos estarem completamente polimerizados. Quando foi confirmada a polimerizao pela verificao do endurecimento da resina, os frascos foram cuidadosamente partidos, sendo retirados os blocos cilndricos de resina que incluam as amostras de osso (Fig. 9). A localizao das posies dos implantes foi feita atravs da realizao de radiografias das amostras em pelculas Kodak DF 57, utilizadas em Medicina Dentria, para evitar o corte acidental das estruturas a estudar. Os blocos foram cortados com um disco diamantado, usando um micrtomo para tecidos duros no descalcificados (Accutom, Struers, Dinamarca), ajustado para a obteno de fatias com a espessura de 150-200 u,m. O corte foi executado a uma rotao de 2500 rpm e a baixa presso. A eliminao do risco de alteraes mecnicas e/ou trmicas durante o processo de corte foi efectuada atravs de abundante lubrificao e refrigerao com soluo especificamente indicada para este tipo de procedimentos, fornecida pelo fabricante e diluda em gua na proporo de 1:25 (Cutting Fluid, Struers, Dinamarca).
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Fig. 9 - Bloco cilndrico de resina incluindo uma amostra de osso/biomaterial, aps o processo de polimerizao estar completo.
Fig. 10 - Cortes de resina com as amostras de osso e os implantes, com 150-200 |J.m de espessura, aps o corte por disco diamantado em micrtomo para tecidos duros no descalcificados. 81
As fatias obtidas (Fig. 10) sofreram um processamento distinto, em funo da sua utilizao nos diferentes tipos de microscopia, que se descrevero adiante. A preparao das amostras para a microscopia electrnica de varrimento foi realizada de forma distinta. Cortaram-se os blocos de resina contendo o osso e o material num ponto prximo da colocao do implante e desgastaram-se at a superfcie do material estar exposta, atravs de polimento superficial. Seleccionou-se uma amostra de cada coelho, contendo os diversos biomateriais implantados, para a realizao de observaes histolgicas e anlise histomorfomtrica. 2.4.1. Microscopia ptica A espessura dos cortes destinados ao exame por microscopia ptica foi reduzida at cerca de 40+ 10 um, por desgaste num equipamento de polimento (DAPS, Struers, Dinamarca), utilizando discos com granulometrias decrescentes de #1000 (P1000, 3M 734, UK), #1200 (P1200, 3M 314, UK) e finalizado com discos de gro super fino (SF737, 3M, UK), com preveno do sobreaquecimento por irrigao abundante e simultnea de gua. A determinao da espessura final dos cortes foi realizada atravs de um micrmetro digital (Digimatic Micrometer, Mytotuyo, Japo). As amostras foram, ento, colocadas num aparelho de ultrassonsJULABO USRI (Julabo Labortechnick, Alemanha), durante 10 minutos, para a remoo de resduos ou impurezas resultantes do processo de preparao. A tcnica de colorao usualmente utilizada no nosso laboratrio feita porhematoxilina (Harris Hematoxylin Acidified, Shandon Sei. Ltd., UK) e eosina (Eosin Y, Shandon Sei. Ltd., UK). Com este tipo de colorao, os ncleos assumem cor azul, os tecidos calcificados violeta acastanhada, o tecido sseo imaturo rosa claro, a matriz cartilaginosa azul e o citoplasma, colagnio e eritrcitos vermelha. As amostras foram montadas atravs da colocao de uma gota de Permacol (Ind. Permacol UV, Adhesive 327/3, Permacol Ind., Holanda) sobre o corte, cobrindo toda a superfcie, que foi depois colocado sobre uma lmina de vidro. O Permacol foi espalhado de forma uniforme sobre a lmina com o recurso a um jacto de ar e polimerizado com luz UV. Seguidamente, colocou-se outra gota deste produto numa lamela, tendo o mximo cuidado para evitar a formao de bolhas de ar. A lmina preparada polimerizada por luz UV durante alguns segundos.
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Estando a polimerizao completa, as lminas foram identificadas e classificadas atravs da inscrio de uma nomenclatura codificada utilizada no laboratrio, num dos seus extremos (Fig. 11). As amostras foram observadas num microscpio de luz Olympus BH-2 (Olympus Optical Co. Ltd., Japo), que possui uma mquina fotogrfica acoplada, permitindo a realizao de fotografias para anlise e estudo posterior. 2.4.2. Microscopia de Fluorescncia As amostras processadas para microscopia de fluorescncia seguiram um procedimento idntico ao utilizado para a microscopia de luz convencional, com excepo de no ser realizado qualquer tipo de colorao. As lminas foram observadas e fotografadas num microscpio de fluorescncia Olympus BH-2 RFCA (Olympus Optical Co. Ltd., Japo), que possui um filtro emissor de luz UV. Este equipamento encontra-se ligado a um sistema fotogrfico, permitindo registar e guardar as imagens observadas, para anlise posterior. 2.4.3. Microscopia Electrnica de Varrimento Os blocos destinados observao e anlise por microscopia electrnica de varrimento foram radiografados para se proceder localizao dos materiais implantados e evitar a destruio acidental de estruturas importantes. Seguidamente, foram seccionados, em cortes transversais ou longitudinais, de forma a expor a superfcie do material, atravs de um disco diamantado includo num micrtomo para tecidos duros. A superfcie exposta das amostras foi submetida a um processo gradual e cuidadoso de polimento, em equipamento especfico para esse fim (DAPS, Struers, Dinamarca), utilizando discos de slica com granulometrias decrescentes de #1000 (P1000, 3M 734, UK), #1200 (P1200, 3M 314, UK) e finalizando com discos de gro super fino (SF737,3M, UK). Este procedimento foi realizado com preveno do sobreaquecimento atravs de irrigao abundante e simultnea de gua, por forma a no provocar alteraes das amostras devido a alteraes trmicas superficiais. Aps terem sido polidas adequadamente, as amostras foram colocadas e limpas num aparelho de ultrassonsJULABO USRI, durante 10 minutos, para remover as impurezas e resduos resultantes da tcnica de polimento.
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O resultado final de uma amostra com um pino metlico, preparada atravs deste processo, apresentado na figura 12. Todos os exemplares destinados a ser observados no microscpio electrnico de varrimento foram revestidos com uma pelcula fina de ouro, atravs de deposio catdica, num equipamentoJeol Fine Coat, Ion SputterJFC 1100 (Jeol, Ltd., Japo). Os microscpios electrnicos de varrimento utilizados habitualmente, foram umJEOLJSM 35C e umJSM 6301F (Jeol, Ltd. Japo), com uma acelerao de voltagem de 25 kV e 15kV, respectivamente. Estes aparelhos esto conectados a uma sonda de microanlise de raios X, detectora da energia de disperso dos electres (EDS) (Noran Intruments, Inc., EUA), acoplada a um computador com programa de anlise de espectros Voyager (Noran Intruments, Inc., EUA). Conforme se referiu anteriormente, este espectrmetro de disperso de energias baseia o seu funcionamento em detectores que geram um impulso de corrente no circuito exterior, por cada foto de raios X absorvido, em resultado da carga elctrica gerada pela ionizao do meio sensor. A amplitude do impulso da corrente proporcional energia do foto absorvido, apresentando uma disperso estatstica determinada pelo rudo do sistema e pelo processo fsico de base [230]. O espectrmetro analisa, simultaneamente, todo o espectro de raios X emitido pela amostra, determinando continuamente a energia de cada foto detectado. O sistema, controlado por computador, permite a visualizao e registo, em tempo real, do espectro global da anlise em curso e o seu processamento imediato (Fig.l). O computador de controlo permite, ainda, o exame detalhado do espectro obtido, o seu registo e processamento para anlise qualitativa e semiquantitativa [230]. A identificao das riscas caractersticas dos ies realizada tendo como referncia uma base de dados, com o apoio do sistema informtico associado ao espectrmetro de raios X. Neste caso, trata-se de um programa de anlise de espectros Voyager. Deste modo, possvel identificar os elementos presentes nas amostras, por anlise global ou pontual, determinando os elementos que constituem cada uma das fases e avaliar a respectiva concentrao relativa. Deve ter-se em ateno o ponto de anlise nas amostras, principalmente na proximidade da superfcie dos materiais, por poderem existir interferncias dos componentes do material no espectro recolhido (Fig. 2).
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J>
Fig. 11- Exemplar de uma lmina preparada para observao por microscopia ptica.
Fig. 12- Bloco de osso com pino metlico, polido e preparado para ser observado atravs de microscopia electrnica de varrimento.
85
Fig. 13 - Fotografia obtida por microscopia electrnica de varrimento, onde se visualiza todo o permetro de um implante de ao inox. Foram utilizadas imagens deste tipo para as determinaes histomorfomtricas. (MEV - Electres Retrodifundidos). Para a observao das estruturas das amostras, utilizaram-se imagens obtidas por electres secundrios, em pequenas e grandes ampliaes (30 a 30.000 X). Quando foi necessrio diferenciar os distintos tecidos depositados na interface, atravs da sua densidade e do seu nmero atmico, recorreu-se funo de electres retrodifundidos, embora com menores ampliaes (30 a 500 X). A utilizao deste tipo de imagens (electres retrodifundidos) bastante usual na investigao do comportamento biolgico dos biomateriais, porque permite estabelecer uma relao directa entre a densidade e o contedo mineral dos tecidos observados [242, 243]. A distribuio das cores, de cinza at ao preto, permite estabelecer um paralelo entre as imagens obtidas por esta tcnica e as imagens das microradiografias convencionais do tecido sseo. Esta metodologia de anlise de importncia primordial quando se estudam biomateriais implantados no tecido sseo [242, 243]. A importncia da correlao entre as observaes histolgicas e as radiografias de tecido sseo com implantes est documentada na literatura [57].
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2.4.4. Histomorfometria A quantificao da resposta tecidular na zona da interface, isto , a determinao da percentagem do contacto sseo entre os materiais e o tecido sseo, foi realizada a partir de cortes histolgicos contendo os materiais implantados. Estas amostras foram observadas e fotografadas utilizando microscopia electrnica de varrimento, em baixas ampliaes, para permitir visualizar adequadamente todo o permetro do implante. Existem alguns estudos que referem variaes estatisticamente significativas entre a percentagem de contacto sseo e a espessura das seces das amostras que so montadas nas lminas para observao histolgica [96,244]. Foi difcil obter cortes de espessura inferior a 50 u.m para as amostras que continham os pinos metlicos, o que levou opo pela realizao das determinaes histomorfomtricas em fotografias de microscopia electrnica de varrimento com electres retrodifundidos, que permitiram determinar mais exactamente quais os tecidos que esto ou no mineralizados [242, 243]. Esta metodologia j foi aplicada por outros autores [178, 189]. As fotografias foram ampliadas para as dimenses de 20x15 cm para se poder estabelecer, correctamente, a distino entre as reas onde existe contacto directo entre o material e o tecido sseo e as outras zonas, onde tal contacto feito por tecido fibroso ou conjuntivo no mineralizado. Utilizando um curvmetro, mediu-se nas fotografias, inicialmente o permetro total do implante e, depois, o permetro de contacto directo com o tecido sseo. Para todos os materiais calculou-se o permetro total do implante, o valor da superfcie em contacto com o tecido sseo e o da superfcie em contacto com o tecido no mineralizado. A seleco do implante a medir foi feita tendo em considerao que necessrio que toda a superfcie do material seja ntida na fotografia (Fig. 13). Por isso, entre as amostras observadas para cada coelho com os diferentes tempos de implantao, escolheu-se a imagem com melhor definio. Todas as medies foram realizadas por forma a garantir que, em caso de dvida, seria considerado como contacto com tecido no mineralizado todo aquele em que no houvesse a certeza absoluta de se tratar de tecido sseo mineralizado. Determinou-se, finalmente, a percentagem de contacto sseo, segundo a frmula seguinte: % de contacto sseo = permetro de contacto sseo/permetro total do implante x 100%
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Calculou-se a mdia (m) e o desvio-padro (d.p.) dos valores obtidos para cada conjunto de amostras, contendo o mesmo material e durante igual perodo de durao do ensaio. Neste mtodo manual podem ocorrer erros nas vrias fases da execuo, por exemplo, durante o desenho, a medio e a interpretao dos valores. No sentido de minimizar a ocorrncia de possveis erros, seguiu-se uma metodologia de anlise de erro, recomendada por Quirynen e col. [245] e aplicada por Schepers e col. [246]. O clculo da anlise de erro incluiu os seguintes aspectos: 1. Os erros durante a fase de desenho foram calculados em seis fotografias, desenhando e medindo as linhas do permetro da mesma amostra. Para minimizar os erros de interpretao e de medio com o curvmetro, foi escolhido um implante que apresentasse grande nitidez e contraste entre a parte em contacto com o tecido sseo e a parte em contacto com o tecido no mineralizado. 2. Todo o procedimento foi realizado pelo mesmo operador. Para determinar a calibragem intra-examinador, foram desenhadas linhas do permetro do implante e medidas atravs do curvmetro em seis duplicaes de uma fotografia original, durante seis vezes, com um intervalo de uma semana entre as medies. 2.4.4.1. Anlise Estatstica Antes de se proceder anlise estatstica dos resultados da percentagem de contacto sseo dos quatro materiais ensaiados, determinou-se a calibragem intra-examinador atravs do clculo do coeficiente de variao (C ), seguindo a metodologia anteriormente descrita. Este coeficiente, definido como sendo "a razo entre o desvio-padro e a mdia aritmtica de uma srie de valores ou distribuio de frequncias" [247], permite identificar a margem de erro intrnseca ao prprio examinador. A anlise estatstica foi realizada atravs da utilizao do programa informtico Statgraphics, verso 5.01, utilizando o teste Wilcoxon para dados no paramtricos emparelhados. Este tipo de anlise tem sido utilizado por outros investigadores no estudo comparativo da percentagem de contacto sseo [168, 189]. Foi considerado existirem diferenas estatisticamente significativas para valores de p<0,05. Os dados so apresentados com a mdia e o desvio-padro das determinaes das medidas, para os doze coelhos, com 4 e 10 semanas de implantao.
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IV RESULTADOS
1. CARACTERIZAO DOS MATERIAIS 1.1. Ao Inox
O espectro da composio qumica dos pinos de ao inox, obtido por microanlise de raios X (EDS), permitiu a identificao de picos correspondentes presena de ies de Fe, Cr, Ni, Mo e C (Fig. 14). Este espectro caracterstico de uma amostra de ao inox 316L (AISI). A observao da morfologia superficial dos pinos, atravs de microscopia electrnica de varrimento, mostrou uma superfcie relativamente lisa, apresentando algumas cavidades e riscos induzidos durante o processo de maquinagem (Fig. 15). 1.2. Titnio A figura 16 apresenta um espectro da composio qumica dos pinos de titnio utilizados neste ensaio. Observou-se apenas a presena do io de titnio. No se identificaram vestgios de oxignio nem de carbono, o que confirma a inexistncia de contaminao superficial dos implantes por qualquer material biolgico. Tendo os implantes de titnio sido expostos ao meio atmosfrico, seria natural a formao de uma camada de xidos na sua superfcie. Tal facto no passvel de identificao, por limitaes deste mtodo de anlise no que respeita a ies com concentraes muito baixas. A observao das caractersticas morfolgicas superficiais destes implantes, realizada por microscopia electrnica de varrimento, permitiu identificar uma superfcie irregular. As irregularidades foram produzidas pelo processo de maquinagem dos implantes de titnio, na forma de pinos cilndricos (Fig. 17).
89
Pioneer 35C Display - Spectrual VFS: 1400 Livetime: 60
Fe
Cr
Fe
Mo
Fe
1 Hi.
Ni
Aco I NOX 316L / 25KeV
Fig. 14- Espectro da composio qumica de um pino de ao inox 316L. (Microanlise por raios X, EDS)
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k
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H
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)
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25KU
X300
1 0 9 . 0U CEMUP
Fig. 15 - Morfologia superficial de um pino de ao inox 316L, preparado atravs de um processo de maquinagem. (Microscopia Electrnica de Varrimento - MEV Electres Secundrios)
90
Captulo IV - Resultados
Pioneer_35C Display - Spectru2

VFS: 2800 Ti L i v e t i m e : 60
Ti
Tj
0.000 L a b e l : T i CP / 25KeV
keV
Ti
1
10.220
Fig. 16- Es pectro da composio qumica de um pino de titnio. (Microanlise por raios X, EDS) M T *J~,f
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25KV X 3 0 0
0004
100.0U
CEMUP
Fig. 7 Morfologia s uperficial de um pino de titnio comercialmente puro, pre parado atravs de um processo de maquinagem. (MEV Electres Secundrios )
91
1.3. Osteopatite Os grnulos de Osteopatite apresentaram uma superfcie especfica de 0,9 m2/g e uma densidade de 1,80 g/cm3. Na forma de partculas tm uma densidade aparente de 1,64 g/cm3. Este material, colocado em contacto com uma soluo de gua destilada desionizada durante a realizao dos testes de degradao (0,5 g em 50 cc), provocou um aumento do pH, atingindo o valor de 9,6 aps 24 horas. O valor foi obtido aps imerso durante 20 minutos. A curva de pH manteve-se estvel at s 24 horas. A perda de pequenas quantidades de ies alcalinos pode beneficiar o comportamento do material aps a sua implantao. O aumento da alcalinidade do meio biolgico onde os grnulos so implantados pode incrementar a actividade osteoblstica. Esta actividade inica do material promove um aumento do pH em soluo aquosa, apesar da quantidade dissolvida ser muito pequena. Os resultados da determinao da concentrao inica dos produtos de degradao, 24 horas e 6 dias aps a imerso do material [9], apresentam-se na tabela 4.1. O espectro da composio qumica de um grnulo de Osteopatite apresentado na figura 18. A partir deste espectro pode identificar-se um material rico em clcio e fsforo, com vestgios de sdio e magnsio. O aparecimento de ies de carbono e oxignio deveu-se ao facto do grnulo analisado se encontrar implantado em tecido sseo, possuindo resduos de matria orgnica. A presena de vestgios de cobre teve origem na interferncia com o recipiente de fixao das amostras para observao em microscopia electrnica de varrimento.
Tabela 4.1 - Concentrao dos ies libertados pela Osteopatite em soluo aquosa (ppm)
24 horas Ca++ Na+ K+ 13,70 1,37 0,28
92
6 dias 22,70 2,40 0,43
A observao da morfologia superficial dos grnulos de Osteopatite mostrou o aspecto denso e microporoso deste material (Fig. 19). Um corte de um grnulo permitiu observar a sua micro-estrutura (Fig. 20), onde se identificou a existncia de interconexo entre os vrios poros, com tamanho mdio inferior a 1 u.m. A porosidade aberta, obtida por gravimetria, foi de 33,75%. Esta caracterstica de estrutura microporosa permite um contacto dos fluidos orgnicos com a parte interna dos grnulos, incrementando as trocas inicas entre o material e o meio envolvente. 1.4. Cimento de Vidro Bioactivo A resistncia compresso do cimento de vidro bioactivo foi de 41 MPa [187]. A dimenso mdia dos poros, correspondente maior fraco volumtrica da porosidade, foi de 0,3 u.m. Aps a imerso em gua, verificou-se que esta classe dimensional de poros deixa de ser a mais relevante, havendo um aumento significativo da fraco volumtrica, correspondente aos poros de maior dimenso. A porosidade aberta determinada por gravimetria foi de 16%. A estrutura porosa permitiu a comunicao entre o interior do cimento e uma soluo aquosa em que este se encontre imerso. Este facto foi determinante, condicionando o comportamento do material quando imerso em gua ou em meio fisiolgico, em virtude da porosidade aberta possibilitar uma troca inica que envolve toda a seco do material. O cimento demonstrou sofrer modificaes rpidas na composio superficial, verificando-se um aumento muito significativo da concentrao de clcio e fsforo, correspondente a fenmenos de dissoluo e precipitao. Esta alterao atingiu tambm o interior do material [229]. A utilizao de uma soluo de plasma sinttico em vez de gua provocou a formao de precipitados de fosfato de clcio sobre a superfcie das amostras, alterando o processo de transformao do material. A rugosidade superficial desapareceu levando a que superfcie ficasse isenta de relevos. Os poros de maior dimenso aumentaram consideravelmente de dimetro. Verificou-se, assim, que as modificaes da composio foram acompanhadas de alteraes morfolgicas muito importantes que se foram acentuando com o tempo de imerso [229].
93
Pioneer_35C Display - Spectrual |VFS: 2400 Ca
Livetime: 60
Ca
ii Na. , J
keV 0.000 Label: Osteopatite / 25keV
4
Cu 10.220
Fig. 18 - Espectro da composio qumica de um grnulo de Osteopatite. (Microanlise por raios X, EDS)
Fig. 19 - Grnulos de Osteopatite. Observa-se um aspecto microporoso. (MEV Electres Secundrios)
94
Fig. 20 - Imagem do corte de um grnulo de Osteopatite, podendo observar-se a micro-estrutura, a distribuio e a interconexo entre os poros. (MEV - Electres Secundrios)
Fig. 21 - Cimento de vidro bioactivo. Partculas originais de vidro e matriz do cimento resultante da reaco com a soluo de fosfato de amnia. (MEV - Electres Retrodifundidos) 95
A determinao da composio qumica da gua aps a imerso mostrou uma reduzida solubilidade dos ies de fsforo e clcio, com estabilizao do processo de dissoluo ao fim de 24 horas [227]. Em face dos resultados obtidos nos testes de degradao em gua e em meio fisiolgico verificou-se que, quando o cimento de vidro bioactivo imerso em gua, havia uma dissoluo de zonas morfolgicas preferenciais, picos, arestas e poros de maior dimenso, acompanhada de precipitao na superfcie restante. Em meio fisiolgico, as alteraes sofridas foram bastante distintas, devido formao rpida de precipitados de apatite sobre a superfcie [227]. O cimento de vidro bioactivo observado por microscopia electrnica de varrimento, aps ter sido misturado na forma de pasta, apresentou um aspecto heterogneo, observando-se vrios cristais de vidro original envolvidos por uma matriz rica em clcio e fosfatos, com tamanhos variando entre 10 e 50 um (Fig. 21). A reaco entre o p de vidro e a soluo de fosfato de amnia transformou a pasta fluida num cimento slido. O produto desta reaco foi um fosfato de clcio amonaco cristalino.
Fig. 22 - Cimento de vidro bioactivo. Imagem da microestrutura aps solidificao e corte do material. Evidenciam-se as partculas de vidro original (*), com diferentes tamanhos, rodeadas pela matriz do cimento. (MEV - Electres Secundrios)
96
Captulo I V - Resultados
Nem todas as partculas do vidro reagiram com a soluo, podendo de tectarse as partculas originais na matriz do cimento (Fig. 22). O tratamento trmico do material, o uso de partculas com diferentes tamanhos e a mudana da relao entre o lquido e o slido podem modificar o comportamento do cimento. Quando as partculas so tratadas pelo calor, a temperaturas superiores a 500 C, durante 30 minutos, a estrutura inicial amorfa do vidro modificase atravs da precipitao de uma fase cristalina. Esta fase mais estvel do que a estrutura original arrefecida, tornandose a reaco mais lenta [187]. O tempo necessrio para transformar um lquido viscoso em pasta de nominado "tempo de plasticidade". O tempo de presa inicial o tempo ne cessrio para suportar a primeira agulha de Gilmore sem qualquer marca visvel no cimento [163]. Na figura 23, observase a representao grfica da variao do tempo de plasticidade e do tempo de presa inicial do cimento de vidro utilizado neste ensaio, em funo do tamanho das partculas. A grande variao na superfcie especfica das partculas pode explicar os tempos obtidos na reaco. Alterando a relao entre as quantidades de p e de lquido usadas na preparao da pasta podem obterse grandes diferen as no tempo de plasticidade. Usandose partculas com tamanho mdio de 2,3 |im e modificandose a relao entre o p e o lquido de 2 para 1, aumen
co 100
2,3
5,2
15,0
46,0
Tamanho das Partculas (\im) m Tempo de Plasticidade Tempo de Presa I nicial
Fig. 23 Influncia do tamanho das partculas nos tempos de plasticidade e de presa inicial do cimento de vidro bioactivo.
97
Pioneer_6301F Display - Spectru6 VFS: 550 Livetime: 60
Label: CBV - Geral / 15KeV
Fig. 24 - Espectro da composio qumica do cimento de vidro bioactivo. (Microanlise por raios X, EDS)
ta-se o tempo necessrio para consumir a soluo de fosfato, e o tempo de plasticidade pode ser aumentado de 1,5 para 8 minutos. A utilizao deste biomaterial na forma de pasta, que endurece ao fim de poucos minutos, revelou-se ideal, pela facilidade de manipulao e colocao no defeito sseo criado. O espectro da composio qumica do cimento de vidro bioactivo, aps solidificao, foi obtido atravs de micro-anlise por raios X (EDS) de uma amostra do material implantado (Fig. 24). Os picos do espectro mostraram a existncia de um alto contedo de silcio, clcio e fsforo, encontrando-se vestgios de sdio. A presena de oxignio e carbono foi motivada pela existncia de componentes orgnicos no material.
2. CIRURGIA EXPERIMENTAL
Todos os animais includos no estudo recuperaram rapidamente o seu estado normal, 2 a 3 horas aps a interveno cirrgica, mantendo-se saud98
veis durante todo o ensaio experimental. No perodo ps-operatrio e na altura do sacrifcio, nenhum dos animais apresentou qualquer reaco adversa, no sendo evidentes quaisquer sinais de inflamao, infeco ou qualquer outro tipo de reaco tecidular anormal que envolvesse os tecidos no local de implantao. Na face externa do osso cortical, a generalidade dos materiais apresentou-se totalmente coberta por uma camada de tecido sseo, sendo bastante difcil a identificao do local da interveno 10 semanas aps a implantao. Verificou-se, tambm, um aumento significativo de peso, cerca de 0,5 kg, desde a data da interveno at ao sacrifcio, o que evidencia as ptimas condies em que se desenrolou a evoluo ps-operatria dos animais e os bons cuidados de tratamento a que foram submetidos.
3. HISTOLOGIA 3.1. Microscopia ptica
Nas imagens obtidas atravs da microscopia ptica foi possvel observar alguns aspectos comuns a todos os materiais e que foram consequncia da interveno cirrgica e/ou da prpria capacidade intrnseca de regenerao do tecido sseo. Um aspecto observado em todas as amostras foi a presena de uma linha tnue de separao entre o tecido sseo cortical e o osso formado na interface. Esta estrutura corresponde a uma linha de tecido necrtico resultante do trauma induzido durante o corte do tecido sseo na interveno cirrgica. Esta linha apresenta uma atenuao gradual, atravs de um processo de remodelao ssea, levando sua substituio por tecido sseo normal com o decorrer do tempo, tornando-se menos ntida nas amostras com 10 semanas e estando ausente em algumas delas. Outro aspecto a evidenciar foi o incremento da formao de tecido sseo com o tempo. Alm de existir maior quantidade de osso regenerado, as caractersticas histomorfolgicas deste tecido indicam tambm um estado de maior maturao. Finalmente, foi constante a presena de grande quantidade de tecido vascular no osso cortical e no osso formado junto da superfcie dos materiais. Alm de um aumento significativo no nmero de vasos, de salientar, tambm, o seu maior volume. Isto corresponde a uma resposta fisiolgica do
99
tecido sseo como consequncia das maiores necessidades metablicas inerentes ao processo de reparao deste tecido no local da implantao. Para alm destes aspectos comuns a todos os materiais, observaram-se comportamentos particulares para cada material, que iremos seguidamente referir. 3.1.1. Ao Inox Amostras com 4 semanas aps a implantao A observao, atravs da microscopia ptica simples, das lminas contendo amostras de tecido sseo com pinos de ao inox com 4 semanas de implantao, permitiu evidenciar, na sua generalidade, a formao/remodelao de uma camada de tecido sseo na zona de interface entre o implante e o osso cortical. Esta camada de tecido sseo, em fase de maturao, apresentou-se separada da superfcie dos pinos pela interposio de tecido fibroso e, nalguns casos, por espaos no preenchidos por qualquer tipo de estrutura orgnica evidenciada pela tcnica de preparao histolgica utilizada (Fig. 25). Nas amostras obtidas a partir de um dos coelhos foi notria a existncia de um grande espao entre o material e o osso depositado, preenchido por um tecido no diferenciado. Este facto poder dever-se a uma falta de adaptao correcta do material ao leito sseo, podendo induzir micromovimentos no implante e impedindo a regenerao ssea normal. Na anlise histolgica do permetro total dos implantes, em baixas ampliaes, verificoLi-se a ausncia de contacto directo entre o osso formado e a superfcie dos pinos, a no ser um locais pontuais (Fig. 25). A ausncia de contacto directo entre os tecidos envolventes e os pinos do ao inox, com a consequente falta de ligao fsica entre as duas estruturas, levou remoo espontnea de dois pinos durante a preparao histolgica das amostras para microscopia ptica. A figura 26 exemplifica uma imagem de uma amostra onde se verificou a perda do pino metlico durante o processo de preparao das amostras, na fase de desgaste das fatias para reduzir a espessura. Confirmou-se a existncia de uma camada de tecido sseo neoformado, prximo da interface com o material. Este tecido apresentou caractersticas de osso imaturo, com a matriz pouco mineralizada e disperso desorganizada dos ostecitos. Na parte interna, mais prxima do material, identificou-se uma camada fina de tecido fibroso.
100
Fig. 25 - Ao Inox - 4 semanas. Ausncia de contacto entre o tecido sseo neoformado e parte da superfcie do pino, existindo uma fenda no preenchida por qualquer tecido. Nalguns pontos, verifica-se a deposio de tecido sseo na proximidade do material. (M.O., H + E - 30 X)
Fig. 26 - Ao Inox - 4 semanas. Nesta amostra, o material foi removido durante a preparao histolgica. Nota-se uma camada de tecido fibroso (setas) que recobre a parte interna do osso depositado junto da interface. (M.O., H + E - 100 X) 101
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Fg. 27 - Ao Inox - 4 semanas. Nesta imagem, observa-se a presena de uma camada de tecido fibroso, interposta entre o implante e o tecido sseo neoformado, com orientao circunferencial das fibras. Abundante presena de tecido vascular. (M.O., H + E-200X)
Fig. 28 - Ao Inox - 4 semanas. Pormenor da zona da interface, onde se verifica a presena de tecido fibroso interposto entre o osso e a superfcie do material, evidenciando-se a existncia de algumas fibras. Ostecitos com morfologia tpica. (M.O., H + E-400X) 102
A camada de tecido fibroso apresentou diferenas de espessura entre amostras distintas e, na mesma amostra, em locais diferentes da interface. Esta estrutura foi observada em todas as amostras. Aumentando a ampliao, verificmos que em algumas zonas da interface esta camada de tecido fibroso possua um conjunto de feixes de fibras com orientao circunferencial, paralela superfcie do material (Fig. 27). Noutras zonas, esta orientao das fibras no era ntida e identificou-se um tecido conjuntivo, com matriz no mineralizada e feixes de fibras dispersas no seu interior. A observao pormenorizada da interface confirmou a existncia de uma matriz tecidular no mineralizada, contendo vrios conjuntos de feixes de fibras dispersos e no organizados, interposta entre a superfcie do material e o osso neoformado (Fig. 28). Este tecido sseo, em fase de maturao, possua um grau baixo de mineralizao e ostecitos, com os prolongamentos citoplasmticos irradiantes caractersticos, dispersos pela matriz sem qualquer organizao aparente. Amostras com 10 semanas aps a implantao Um dos aspectos mais significativos observados nestas amostras, foi o aumento da quantidade de tecido sseo formado/remodelado na zona da interface com os pinos de ao inox. Na generalidade, este tecido no s aumentou de quantidade como o seu estado de maturao se tornou mais evoludo, possuindo uma maior mineralizao e ostecitos dispersos pela matriz ssea. Nalguns locais da interface notou-se uma maior proximidade do tecido sseo neoformado com a superfcie do material. Todavia, observou-se sempre a interposio de uma camada fina de tecido fibroso entre o osso e os pinos (Fig. 29). Esta camada apresentou diferenas de espessura tanto na mesma amostra como entre as vrias amostras analisadas. Em maior ampliao, foi possvel caracterizar os dois tipos de estruturas tecidulares presentes na generalidade das amostras. Na maior parte da interface existia tecido fibroso (Fig. 30), embora havendo locais onde se formou tecido sseo imaturo que apresentava contacto aparentemente directo com o material, na observao por microscopia ptica (Fig. 31). A maioria do tecido formado na zona de interface apresentou caractersticas de tecido fibroso. Nalgumas zonas, verificou-se a existncia de feixes de fibras com orientao paralela superfcie do implante. Contudo, em muitos casos, este tecido apresentou uma estrutura no diferenciada e de difcil caracterizao.
103
Na figura 30, evidencia-se a presena de um tecido no mineralizado, numa camada prxima da superfcie do material, separado do tecido sseo cortical por uma camada de tecido sseo imaturo. Enquanto que a linha de interface entre o tecido sseo imaturo e o tecido no mineralizado irregular e sinuosa, a transio entre o osso cortical antigo e o osso regenerado gradual e menos evidente. Os locais onde ocorreu a formao de osso imaturo prximo da interface (Fig. 31) mostraram diferenas significativas entre as caractersticas estruturais deste tecido e as do tecido sseo cortical antigo. O osso neoformado apresentou menor grau de mineralizao da matriz e clulas osteoblsticas, em maior nmero na proximidade do osso cortical. No osso cortical observou-se o aspecto estrutural caracterstico de um osso haversiano. A anlise mais pormenorizada das estruturas da interface (Fig. 32) permitiu identificar a presena de tecido fibroso interposto entre o osso regenerado e a superfcie do material. Nalgumas imagens, foi notria a presena de vrios feixes de fibras de tecido fibroso, com orientao paralela superfcie do material. Os ostecitos do osso neoformado apresentavam caractersticas morfolgicas especficas, com os prolongamentos citoplasmticos irradiando na direco dos ostecitos vizinhos, aprisionados na matriz ssea. A observao das amostras de ao inox permitiu evidenciar que o tempo decorrido (4 a 10 semanas) contribuiu para formao mais extensa de tecido sseo, aproximando-se da superfcie do material. Todavia, manteve-se a presena de uma camada de tecido fibroso, rodeando e envolvendo estes implantes. O tecido sseo formado prximo da interface apresentou um aumento do contedo mineral com o tempo, tornando-se difcil, em alguns casos, estabelecer uma separao ntida entre este tecido e o osso cortical antigo. Nalgumas amostras, foi possvel identificar clulas com histomorfologia compatvel com a das clulas do processo inflamatrio.
3.1.2. Titnio
Amostras com 4 semanas aps a implantao Os exemplares histolgicos contendo pinos de titnio implantados durante 4 semanas no tecido sseo cortical da tbia dos coelhos evidenciaram uma formao abundante de osso imaturo na zona da interface. Este tecido contactava directamente com a superfcie dos implantes, rodeando-os numa extenso significativa do seu permetro (Fig. 33).
104
Fig. 29 - Ao Inox - 1 0 semanas. Camada de tecido fibroso na interface, com espessura varivel. Nalguns pontos existe maior proximidade do tecido sseo neoformado e a superfcie do material. (M.O., H + E - 50 X)
Fig. 30 -Ao Inox - 10 semanas. Repare-se na camada de tecido fibroso, interposta entre a superfcie do implante e o osso neoformado. Este tecido sseo apresenta uma estrutura menos organizada do que a do osso cortical. Note-se a interface irregular entre este tecido e o tecido fibroso. Identificam-se algumas clulas inflamatrias. (M.O., H + E - 100 X) 105
Fig. 31 -Ao Inox - 10 semanas. Nalguns pontos da interface, verifica-se a formao de tecido sseo imaturo entre o osso cortical e a superfcie do implante. ntida a linha de separao entre este tecido e o osso cortical (setas). (M.O., H + E 100 X)
Fig. 32 - Ao Inox - 10 semanas. Maior pormenor da zona da interface, sendo perceptvel a existncia de uma camada de tecido fibroso, com feixes de fibras paralelas superfcie do implante. Ostecitos com histomorfologia caracterstica. (M.O., H + E-400X)
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Algumas amostras apresentavam uma linha ntida de separao entre o osso cortical antigo e o osso neoformado. Esta linha de diferenciao entre os dois tecidos evidencia-se por uma colorao mais intensa do osso neoformado, consequncia de um menor grau de mineralizao e diferenciao estrutural. Nalgumas amostras observou-se o crescimento de tecido sseo na cavidade medular ocupada por parte do implante. Este crescimento fez-se a partir do endsseo e revestiu a superfcie dos implantes. Na figura 34 pode analisar-se uma imagem representativa das amostras onde se verificou este fenmeno. perceptvel a formao de uma ponte ssea a unir o endsseo ao osso que envolve o implante. As pontes sseas caracterizavam-se, histomorfologicamente, por possurem um menor grau de mineralizao e diferenciao estrutural. A anlise da interface formada entre o tecido sseo e a superfcie dos pinos de titnio permitiu observar que a generalidade do permetro dos implantes estava em contacto directo com o osso, embora fossem evidentes algumas zonas onde esse contacto no se verificava. Neste caso, era notria a interposio de tecido conjuntivo no mineralizado ou mesmo a existncia de espaos aparentemente vazios. Todavia, de salientar o facto de em nenhuma amostra se ter identificado qualquer camada de tecido fibroso interposta nesta zona. A camada de tecido sseo formada junto da interface com o material era constituda por um tecido imaturo, nitidamente distinto do osso cortical (Fig. 35). Possua clulas osteoblsticas, distribudas de forma desorganizada pela matriz ssea, e um menor grau de mineralizao. A observao pormenorizada deste tecido com maiores ampliaes evidenciou as caractersticas de tecido sseo imaturo. Foram identificados alguns ostecitos na camada externa e um grau baixo de mineralizao e de organizao estrutural da matriz ssea neoformada (Fig. 36). Notou-se, ainda, uma linha de separao ntida entre o osso neoformado e o osso cortical antigo. Amostras com 10 semanas aps a implantao Todas as amostras de titnio com 10 semanas de implantao, quando observadas por microscopia ptica evidenciaram um aumento quantitativo e qualitativo do tecido sseo formado na interface. O osso neoformado encontrava-se em contacto directo com a superfcie dos implantes, havendo uma diminuio das zonas da interface, constitudas por tecido conjuntivo no mineralizado (Fig. 37).
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Fig. 33 - Titnio - 4 semanas. Observa-se a formao de tecido sseo imaturo na zona da interface. Nota-se menor grau de mineralizao do tecido neoformado, comparativamente ao osso cortical. (M.O., H + E - 50 X)
Fig. 34 - Titnio - 4 semanas. Formao de uma ponte de osso neoformado entre o endsseo e o osso que envolve a superfcie do implante colocado na cavidade medular. (M.O., H+E - 50 X) 108
Fig. 35 - Titnio - 4 semanas. Formao de uma camada de tecido sseo na interface com a superfcie do material. Ausncia de interposio de tecido fibroso. 0 tecido neoformado apresenta menor grau de mineralizao e est separado do osso cortical por uma linha tnue (setas). (M.O., H + E - 100 X)
Fig. 36 - Titnio - 4 semanas. Pormenor da zona da interface. A camada de tecido sseo neoformado em contacto directo com o implante apresenta algumas clulas osteoblsticas e uma matriz pouco mineralizada. (M.O., H + E - 400 X)
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O tecido sseo que envolvia a superfcie dos implantes apresentou um estado de maturao mais evoludo. Nalgumas amostras, tornou-se difcil estabelecer a separao entre o osso neoformado e o osso cortical antigo (Fig. 38). Em maior ampliao, foi evidente um contacto directo entre o tecido sseo formado na interface e a superfcie dos implantes (Fig. 39). O tecido sseo neoformado caracterizou-se por possuir abundantes ostecitos que se distribuam pela matriz ssea e que, nalgumas zonas, aparentavam uma distribuio circunferencial volta dos capilares, caracterstica do sistema haversiano do osso cortical. Na observao mais pormenorizada da zona de interface, em grande ampliao, confirmou-se o bom contacto do tecido com a superfcie do material, com ausncia de interposio de qualquer tipo de tecido fibroso (Fig. 40). Identificaram-se os ostecitos, distribudos desorganizadamente pela matriz, estando alguns em contacto prximo com a superfcie do material. Uma das maiores limitaes na anlise destes exemplares deveu-se precria definio das imagens, comprometida pela excessiva espessura dos cortes realizados durante a preparao histolgica (50 a 70 um). Este facto foi determinante no aparecimento de uma sobreposio de campos nos diferentes planos de focagem do microscpio, o que perturbou as observaes. A sobreposio de clulas e outras estruturas orgnicas limitou seriamente a correcta caracterizao destas estruturas. 3A.3. Ostopathe Amostras com 4 semanas aps a implantao Os resultados histolgicos obtidos a partir das amostras contendo este material permitiram constatar uma abundante e extensa regenerao de tecido sseo, preenchendo a quase totalidade dos espaos existentes entre os grnulos. Este tecido, ainda numa fase inicial de maturao, formou-se tanto na zona cortical como na cavidade medular da tbia (Fig. 41). Em todas as amostras observadas, verificou-se um crescimento acentuado de osso imaturo ou primrio a partir das paredes do defeito sseo criado, invadindo e preenchendo os espaos entre os grnulos e prolongando-se para os grnulos localizados na cavidade medular. O tecido neoformado apresentou diferenas evidentes, a nvel ultraestrutural, quanto localizao dos grnulos. O osso que preencheu os espaos entre os grnulos com localizao cortical apresentou um grau de
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Fig. 37 - Titnio - 10 semanas. Formao de tecido sseo na interface com o implante. Verifica-se um contacto directo, nalguns pontos. 0 estado de maturao deste tecido mais evoludo. (M.O., H + E - 50 X)
Fig. 38 - Titnio - 10 semanas. Maior maturao do tecido sseo formado junto da interface, apresentando um bom contacto com a superfcie do material. (M.O., H + E - 1 0 0 X) 111
F/g. 39 - Titnio - 10 semanas. Bom contacto entre o osso neoformado e a superfcie do implante. Nalguns pontos o tecido ainda pouco mineralizado (setas). (M.O., H + E-200X)
pjg. 40 - Titnio - 10 semanas. Pormenor da zona da interface. Contacto directo entre a matriz ssea e algumas clulas osteoblsticas com a superfcie do material. (M.O., H + E-400X) 112
maturao superior ao osso que envolveu os grnulos com localizao medular. Na zona cortical observou-se uma maior quantidade de osso neoformado, envolvendo directamente os grnulos. Este tecido possua uma matriz mais mineralizada e um nmero mais elevado de clulas osteoblsticas do que o osso formado na cavidade medular. Nalgumas imagens foi ntido o contraste existente entre o osso cortical antigo e o osso neoformado entre os grnulos (Fig. 42). Alm de se verificarem diferenas significativas no grau de mineralizao, aparecendo o osso cortical antigo com uma colorao mais acastanhada, a organizao estrutural tambm foi bastante distinta. Enquanto que no osso cortical se identificou um padro tpico de sistemas haversianos, com a orientao dos ostecitos em lminas concntricas a rodearem os capilares em osteons bem definidos, no osso neoformado as clulas apresentaram uma distribuio desorganizada e sem qualquer aparncia de orientao. Um fenmeno sempre presente nestas amostras foi a abundncia de vasos de tamanho e nmero muito superior ao observado no tecido sseo normal. Tal facto teve origem nas necessidades metablicas aumentadas do tecido em fase activa de formao/remodelao, consequente ao processo reparador do tecido sseo. de salientar que apesar do osso neoformado apresentar caractersticas estruturais ntidas de osso imaturo, possui um grande ndice de contacto directo com a superfcie dos grnulos. A matriz ssea, projectando-se e crescendo a partir das paredes do defeito sseo, foi envolvendo todos os grnulos com localizao cortical e, mais tarde, os grnulos que se localizavam na cavidade medular. Este padro de regenerao ssea no anlogo com o que ocorre durante a reparao de fracturas sseas, em que o osso cresce, nas fases mais precoces, a partir do peristeo e do endsseo, e na zona cortical apenas numa fase mais tardia. 0 osso formado entre os grnulos apresentou um baixo grau de mineralizao, com matriz mais clara, e um grande nmero de clulas osteoblsticas, distribudas de forma aparentemente desorganizada ao longo da matriz ssea (Fig. 43). Foi difcil estabelecer uma relao directa entre os ostecitos e os capilares abundantes neste tecido. Estes vasos, alm de presentes em nmero elevado, apresentavam dimenses superiores ao normal, permitindo um aporte rpido e abundante de nutrientes necessrios ao intenso metabolismo das clulas envolvidas no processo reparador.
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F/g. 4 - Osteopatite - 4 semanas. Regenerao ssea, com preenchimento dos espaos existentes entre os grnulos. O crescimento do osso faz-se tambm para o interior da cavidade medular, rodeando alguns dos grnulos a localizados. (M.O., H + E-50X)
Fig. 42 - Osteopatite - 4 semanas. ntida a diferena estrutural entre o osso cortical antigo e o osso formado entre os grnulos. A linha de separao entre os dois tecidos muito evidente. A organizao estrutural e o grau de mineralizao so tambm bastante distintos. (M.O., H + E - 100 X) 114
Fig. 43 - Osteopatite - 4 semanas. Tecido sseo imaturo depositado entre os grnulos. A matriz pouco mineralizada, com clulas osteoblsticas abundantes, distribudas de forma desorganizada. Vasos abundantes com volume aumentado. Bom contacto entre o tecido formado e os grnulos. (M.O., H + E - 200 X)
Fig. 44 - Osteopatite - 4 semanas. Pormenor da zona de interface entre um grnulo e o osso. Bom contacto entre o material e o osso. Observa-se a presena de ostecitos com localizao muito prxima do material. (M.O., H + E - 400 X) 115
A anlise pormenorizada das zonas de interface entre o tecido sseo neoformado e a superfcie dos grnulos contribuiu para a confirmao de um contacto directo entre estas estruturas, sem interposio de tecido fibroso (Fig. 44). Todavia, observou-se, nalgumas zonas mais angulosas dos grnulos, um tecido menos mineralizado, distinto do restante tecido sseo neoformado. Os ostecitos presentes na matriz ssea apresentaram os prolongamentos citoplasmticos irradiantes caractersticos. Algumas das clulas estavam muito prximas da superfcie do material, aparentando um contacto directo com os grnulos. Amostras com 10 semanas aps a implantao Com o decorrer do ensaio, aumentou a formao de tecido sseo nos espaos entre os grnulos, envolvendo-os e revestindo-os totalmente, independentemente da sua localizao (Fig. 45). Todavia, os grnulos mais distantes, localizados na cavidade medular, apresentavam menos tecido sseo formado nos espaos entre eles. O osso neoformado contactava e aderia directamente superfcie da maior parte dos grnulos. Este tecido evidenciou um estado de maturao mais evoludo, relativamente s amostras com 4 semanas, apresentando uma organizao estrutural mais prxima da do osso cortical (Fig. 46). De referir o revestimento, por crescimento do peristeo, da superfcie dos grnulos com localizao mais prxima da superfcie externa do osso cortical da tbia. O osso neoformado preencheu, na totalidade, os espaos entre os grnulos que se localizavam na parte cortical do osso, assim como na parte mais externa, prxima do peristeo. Na cavidade medular tambm se verificou crescimento a partir do endsseo, envolvendo os grnulos a localizados. O tecido sseo que englobou os grnulos apresentava uma ultraestrutura com maior grau de mineralizao e uma fase de organizao lamelar mais avanada, comparativamente s amostras com 4 semanas de implantao. Manteve-se grande abundncia de tecido vascular, com vasos de calibre bastante aumentado. Apesar do estado avanado de maturao do tecido sseo neoformado, ainda foram perceptveis algumas diferenas estruturais entre este tecido e o osso cortical antigo. Embora as diferenas na mineralizao no fossem muito evidentes, no que respeita organizao estrutural existia uma distino ntida no padro de orientao e distribuio dos ostecitos. No osso cortical antigo observaram-se sistemas haversianos bem definidos, com a
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disposio concntrica dos ostecitos, rodeando os capilares centrais, enquanto que no osso neoformado a distribuio dos ostecitos era lamelar, sem a formao de osteons. Nalgumas amostras foi ainda possvel observar uma linha atenuada que separou o osso neoformado do osso cortical antigo. Esta linha foi ainda mais evidenciada pelas diferenas de arranjo estrutural entre os dois tecidos. A maior maturao do tecido sseo neoformado foi uma constante em todas as amostras estudadas. Salienta-se, tambm, o facto de existir um contacto directo e firme entre a superfcie dos grnulos e o osso. A anlise mais pormenorizada da zona da interface, com maiores ampliaes, permitiu identificar duas estruturas distintas no processo de formao de tecido sseo nesta zona. Nalgumas amostras (Fig. 47), observou-se uma estrutura ssea lamelar, paralela superfcie do material, bem distinta do osso cortical com os sistemas haversianos caractersticos. Noutras (Fig. 48), foi possvel identificar uma disposio circunferencial dos ostecitos, envolvendo os capilares centrais, num esboo do sistema haversiano caracterstico do osso cortical. Em qualquer dos casos foram abundantes os ostecitos, com caractersticas histomorfolgicas tpicas, distribudos pela matriz ssea e estando alguns deles muito prximos da superfcie do material. No se observou qualquer interposio de camada tecidular conjuntiva ou fibrosa entre o tecido sseo e o material, havendo um contacto directo entre as duas estruturas. 3.1.4. Cimento de Vidro Bioactivo Amostras com 4 semanas aps a implantao As amostras de cimento de vidro bioactivo implantadas durante 4 semanas apresentaram a formao de tecido sseo imaturo na zona da interface e em contacto directo com a superfcie do material. No se observaram sinais de interposio de qualquer camada de tecido fibroso nem a presena de clulas de reaco inflamatria. 0 osso depositado, que envolvia e contactava directamente a superfcie do material, apresentou-se numa camada com a espessura aproximada de 250 a 300 u.m. Possua um arranjo estrutural distinto, em funo da sua localizao (Fig. 49). A camada formada na zona cortical apresentava diferenas em relao ao osso neoformado na superfcie externa do material. O tecido sseo que revestia a superfcie externa do material, possua um aspecto trabecular, com as lamelas sseas rodeadas por tecido medular, projectando-se a partir dos bordos do peristeo, limtrofes do de117
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fig. 45 -Osteopatite -10 semanas. Abundante formao de tecido sseo no espao entre os grnulos. O estado de maturao e organizao estrutural deste tecido prximo do apresentado pelo osso cortical. (M.O., H + E - 50 X)
Fig. 46 - Osteopatite -10 semanas. Diferena entre o osso neoformado e o osso cortical antigo. Apesar do estado avanado de organizao estrutural, o tecido neoformado ainda no possui osteons to bem definidos como os do osso cortical. (M.O., H + E-100X) 118
Fig. 47 - Osteopatite - 10 semanas. Pormenor de uma zona de interface entre o osso neoformado e o material. Observa-se contacto perfeito entre o tecido e o material. Presena de ostecitos abundantes, orientados de forma lamelar, contrariamente aos sistemas haversianos do osso cortical. (M.O., H+E - 400 X)
Fig. 48 - Osteopatite - 10 semanas. Grande ampliao de uma zona da interface. Fase de orientao concntrica dos ostecitos em sistema haversiano. Note-se a proximidade dos ostecitos com a superfcie do material. (M.O., H + E - 400 X)
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feito sseo criado. Na zona cortical, o osso formado/remodelado possua um menor grau de mineralizao da matriz e uma distribuio celular mais desorganizada, comparativamente ao osso cortical antigo (Fig. 50). Verificou-se um bom contacto entre este tecido e a superfcie do material. Foi evidente a presena de vasos com volume muito aumentado, com localizao privilegiada entre o osso cortical antigo e o osso neoformado. Em maiores ampliaes (Fig. 51), ntido o bom contacto existente entre o tecido sseo neoformado e a superfcie do material, sem interposio de qualquer tecido conjuntivo fibroso ou no mineralizado. A matriz ssea do tecido neoformado possui grande nmero de vasos com volume razovel e de clulas osteoblsticas, aparentemente sem qualquer organizao estrutural. A superfcie mais externa do material est separada do corpo principal por uma linha mais escura e densa. Uma ampliao superior permitiu analisar mais detalhadamente a interface entre o material e o osso neoformado (Fig. 52). Identificou-se um contacto directo entre a camada externa do material e o tecido sseo formado na zona da interface, com delimitao, atravs de uma linha densa, do ncleo interno do material e a camada mais superficial, a qual possua um arranjo estrutural diferente do resto do material, correspondendo a fenmenos de degradao superficial do cimento. Amostras com 10 semanas aps a implantao Nestas amostras verificou-se um recobrimento total da superfcie externa do material, com crescimento sseo a partir do peristeo e formao/ /remodelao ssea na zona cortical. O tecido sseo neoformado apresentou maior grau de maturao e diferenciao estrutural (Fig. 53). Todas as amostras apresentaram a superfcie externa completamente recoberta por tecido sseo. O osso neoformado prolongou-se a partir do peristeo dos bordos do defeito criado, recobrindo e contactando directamente a superfcie externa do material, formando uma camada de tecido sseo de reparao que recuperou a morfologia do osso tibial (Fig. 53). O material includo na zona cortical ficou rodeado por tecido sseo, contactando directamente a sua superfcie e estabelecendo uma boa ligao sem interposio de qualquer tipo de tecido conjuntivo. Este tecido sseo neoformado/remodelado apresentou caractersticas histomorfolgicas de maturao que tornaram difcil a sua separao do osso cortical antigo (Fig. 54). A existncia de alguns vasos com calibre extremamente aumentado a evidncia de que este tecido ainda se encontra numa fase metablica activa.
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Fig. 49 - Cimento de Vidro Bioactivo - 4 semanas. ntida a formao de tecido sseo imaturo na zona de interface com o osso cortical e na superfcie externa do cimento, pelo crescimento de trabculas sseas a partir do peristeo. (M.O., H + E -50X)
Fig. 50 - Cimento de Vidro Bioactivo - 4 semanas. O osso neoformado na zona de interface encontra-se em contacto directo com a superfcie do material. Note-se a presena de grandes vasos na zona de separao entre o osso cortical e o osso neoformado. (M.O., H + E - 100 X) 121
Fig. 51 - Cimento de Vidro Bioactivo - 4 semanas. Bom contacto entre o tecido sseo regenerado junto da interface com o material. Este tecido apresenta uma grande riqueza de vasos. (M.O., H + E - 200 X)
Fig. 52 - Cimento de Vidro Bioactivo - 4 semanas. Pormenor da zona de interface. Identificam-se as clulas osteoblsticas prximas da superfcie do material. O cimento apresenta uma linha mais densa, que separa o corpo principal do material de uma camada externa de degradao. (M.O., H + E - 400 X) 122
Fig. 53 - Cimento de Vidro Bioactivo - 10 semanas. Crescimento do tecido sseo, que envolve completamente toda a superfcie do material. (M.O., H + E - 50 X)
Fig. 54 - Cimento de Vidro Bioactivo - 10 semanas. O tecido sseo neoformado, que contacta directamente a superfcie do material, apresenta um grau de maturao bastante evoludo, sendo difcil a distino com o osso cortical antigo. Presena de vasos com grandes dimenses. (M.O., H + E - 100 X) 123
Todavia, na observao mais pormenorizada de algumas zonas da interface, verificamos que a mineralizao e o arranjo estrutural do tecido sseo neoformado ainda apresentavam algumas diferenas (Fig. 55). A matriz era menos mineralizada, possuindo uma colorao mais clara do que a do osso cortical antigo, e a distribuio dos ostecitos era feita de forma menos organizada do que a do osso cortical. Neste ltimo tecido evidenciou-se a existncia de sistemas haversianos, com orientao concntrica dos ostecitos que rodeiam os capilares centrais. Na zona da interface, este padro de orientao celular no foi to evidente, embora aparecessem esboos de formao de sistemas haversianos (Fig. 55). Nestas ampliaes puderam identificar-se as partculas de vidro que no se combinaram com a soluo de fosfato do cimento, com forma polidrica, distribudas pela matriz do cimento e, na zona da interface, interpostas entre o tecido sseo que penetra nos espaos entre as partculas, contribuindo para um verdadeiro microcontacto fsico-qumico entre o osso e a camada superficial do material. A anlise mais pormenorizada da interface formada entre o osso e o material permitiu confirmar a boa unio entre as duas estruturas, com ausncia de interposio de qualquer tecido no mineralizado (Fig. 56). O osso depositado junto da interface apresentava uma matriz mineralizada com ostecitos e capilares abundantes. Os ostecitos possuam a histomorfologia caracterstica destas clulas osteoblsticas, com incluso e aprisionamento na matriz ssea. Algumas das clulas estavam em contacto muito prximo com a superfcie do material. A existncia de abundantes capilares foi um indicador precioso da alta actividade metablica dos tecidos desta zona. Relativamente ao material, identificou-se nestas ampliaes uma degradao da camada mais superficial, que se encontrava separada do corpo principal do cimento atravs de uma linha mais densa. Com esta metodologia de anlise foi impossvel caracterizar estes fenmenos de degradao superficial. O cimento de vidro bioactivo induziu a formao de uma camada de tecido sseo, que envolveu o material, englobando-o e criando um contacto directo, com ausncia de interposio de tecido conjuntivo no mineralizado. O tecido sseo neoformado apresentou uma evoluo significativa com o tempo, no que respeita ao grau de mineralizao e diferenciao estrutural. 3.2. Microscopia de Fluorescncia Utilizando um marcador de emisso fluorescente, a tetraciclina, foi possvel diferenciar, claramente, o osso regenerado do osso cortical antigo, as124
F/g. 55 - Cimento de Vidro Bioactivo - 1 0 semanas. Presena de tecido sseo, junto da interface, em fase de maturao avanada. Apesar da menor mineralizao da matriz relativamente ao osso cortical antigo, observam-se esboos da formao de sistemas haversianos. (M.O., H+E - 200 X)
Fig. 56 - Cimento de Vidro Bioactivo - 10 semanas. Pormenor da zona de interface. Identifica-se a matriz ssea com ostecitos, com morfologia caracterstica, e a degradao da camada superficial do cimento. (M.O., H + E - 400 X) 125
sim como os locais que apresentavam uma maior actividade de formao/ remodelao ssea na altura da administrao do marcador, uma semana antes do sacrifcio dos animais. Atravs da comparao das imagens observadas em microscopia de fluorescncia e as imagens de cortes das mesmas amostras obtidas em microscopia ptica convencional, foi possvel observar uma concordncia nas estruturas identificadas como sendo osso neoformado e a existncia de zonas com um processo de formao/remodelao ssea em fase de grande actividade. No sendo utilizado qualquer processo de colorao das amostras, a incidncia da luz UV nas lminas permitiu apreciar dois tipos de colorao do campo histolgico, que vo do verde escuro ao amarelo claro. As zonas com colorao mais escura correspondem aos tecidos mais antigos enquanto que as zonas de colorao mais clara correspondem aos locais de maior deposio de marcador fluorescente e, por conseguinte, s zonas de maior actividade metablica do processo remodelativo do tecido sseo. 3.2.1. Amostras Metlicas (Ao Inox e Titnio) As amostras com implantes de ao inox e titnio, observadas atravs da microscopia de fluorescncia, no foram muito elucidativas quanto aos aspectos fundamentais da estrutura ssea que rodeava os implantes. Este facto, observado em todas as lminas contendo amostras com pinos metlicos, deveu-se, provavelmente, maior espessura destas amostras (>50 um), que impossibilitou uma boa observao das estruturas por sobreposio de diferentes planos de focagem. Apesar desta significativa limitao, verificou-se a existncia de uma camada tecidular, com caractersticas de tecido fibroso, interposta entre o osso e a superfcie dos implantes de ao inox (Fig. 57). Esta camada de tecido fibroso apresentou diferenas de espessura ao longo do permetro da interface, parecendo existir, nalguns pontos, um contacto entre o osso e o material. Nas amostras de titnio pouco mais se observou do que um contacto prximo entre o osso e a superfcie dos implantes deste material. Notou-se, ainda, que a camada de tecido formado junto superfcie do material apresentava uma maior fluorescncia do que o osso cortical antigo. Este fenmeno pode ser indicador de maior actividade de remodelao ssea a este nvel (Fig. 58). 126
Fig. 57- Ao Inox - 4 semanas. Estrutura do tecido sseo com pouca nitidez devido espessura das amostras. Maior fluorescncia junto da interface. Identifica-se tecido fibroso interposto entre o pino e o osso neoformado. (Microscopia de Fluorescncia - 1 0 0 X)
Fig. 58 - Titnio - 4 semanas. Identicamente figura anterior, observa-se pouca nitidez na estrutura dos tecidos sseos e da zona da interface. Maior fluorescncia da camada tecidular depositada junto da interface. (Microscopia de Fluorescncia -100X) 127
Pelas razes anteriormente apontadas, a observao das amostras contendo os pinos metlicos (duas lminas para cada tempo seleccionado) no permitiu realizar uma boa caracterizao das estruturas destas amostras. 3.2.2. Osteopatite As imagens das amostras contendo os grnulos de Osteopatite, observadas atravs da microscopia de fluorescncia, evidenciaram linhas de grande deposio do marcador utilizado. Nas zonas do tecido sseo regenerado, em posio mais prxima da superfcie dos grnulos, nos vasos e nos pontos correspondentes localizao das clulas osteoblsticas, identificou-se uma intensa colorao amarelo clara, correspondente s zonas de maior actividade metablica e de deposio da tetraciclina (Fig. 59). Em todas as amostras analisadas, observou-se a localizao preferencial de zonas de maior intensidade fluorescente nos locais onde a formao/remodelao ssea foi mais intensa. Foi possvel identificar, de forma clara, a orientao concntrica das lamelas sseas que envolviam os vasos, posicionados centralmente, com disposio e orientao caracterstica do sistema haversiano do osso cortical. No tecido sseo depositado nos espaos entre os grnulos foram evidentes os sinais identificativos de um estado precoce de diferenciao estrutural. Notou-se uma organizao de osso lamelar que contactava directamente a superfcie dos grnulos. Um indicador do processo evolutivo da reparao ssea o facto do tecido sseo regenerado, a partir do peristeo e endsseo, apresentar maior fluorescncia comparativamente ao tecido depositado na parte central do osso cortical. Isto permitiu considerar que o tecido formado nestes locais apresentava um estado de desenvolvimento mais tardio no processo de formao/remodelao ssea. A evoluo deste processo reparador do defeito sseo preenchido pelos grnulos no semelhante ao que ocorre durante o processo fisiolgico de reparao de fracturas sseas, onde o crescimento mais precoce se inicia a partir do peristeo e endsseo. 3.2.3. Cimento de Vidro Bioactivo As amostras de cimento de vidro bioactivo estudadas com esta metodologia mostraram a existncia de grande actividade de formao/remodelao do tecido sseo que envolvia o material (Fig. 60). A camada de tecido sseo neoformado volta da superfcie do material
128
Fig. 59 - Osteopatite - 4 semanas. Maior deposio do marcador fluorescente junto dos vasos, no tecido sseo formado entre os grnulos e na linha de separao entre o osso cortical e o neoformado. De evidenciar as linhas lamelares de clulas osteoblsticas activas que constituem os sistemas haversianos do osso cortical. (M. de Fluorescncia - 100X)
Fig. 60 - Cimento de Vidro Bioactivo - 4 semanas. Maiorfluorescnciado osso neoformado a partir do crescimento do peristeo que recobre a parte externa do material. O osso formado na interface mais fluorescente do que o osso cortical antigo. Maiorfluorescnciado tecido vascular e de algumas clulas osteoblsticas. (M. de Fluorescncia - 100 X) 129
apresentou estados distintos de diferenciao e maturao em funo da sua localizao. O osso que recobriu parte da superfcie externa do material tinha um aspecto trabecular, com linhas limtrofes de grande fluorescncia, indicativa de um fenmeno de crescimento activo dessas estruturas a partir do peristeo antigo. Estas trabculas do osso esponjoso encontravam-se envolvidas por tecido medular. Na zona da interface do osso cortical com a superfcie do material, foi evidente a formao de uma camada fina de tecido sseo em fase de organizao lamelar, com espessura superior a 50 um, interposta entre a superfcie do material e o osso cortical. Este tecido apresentou caractersticas que o diferenciaram perfeitamente do osso cortical antigo, havendo mesmo uma linha ntida de separao entre estes dois tecidos. Nesta zona verificou-se a existncia de linhas de intensa fluorescncia nos tecidos vasculares e em alguns locais da matriz ssea, que correspondiam a clulas osteoblsticas em fase de grande actividade metablica. A distino entre o osso cortical antigo e o osso formado junto da interface estabeleceu-se no s pela diferena de colorao mas tambm devido presena de sistemas haversianos bem definidos no osso cortical, que no se visualizaram no osso neoformado. Em algumas amostras observou-se o aparecimento de uma linha de fractura, com localizao na interface formada entre a camada superficial e o ncleo do cimento. Esta linha resultou de um artefacto induzido durante o processo de preparao histolgica, possivelmente na fase de desidratao (Fig. 60), que origina fenmenos de contraco diferentes para cada material. 3.3. Microscopia Electrnica de Varrimento 3.3.1. Ao Inox Amostras com 4 semanas aps a implantao Nestas amostras, observou-se a deposio de uma camada de tecido sseo imaturo, que envolveu a superfcie dos implantes de ao inox, embora no existisse contacto directo entre o osso e o material. Interposta entre o osso neoformado e a superfcie dos pinos, formou-se uma camada fina de tecido conjuntivo (>10 um), que apresentou uma estrutura ligeiramente diferente do osso regenerado, mas que de difcil diferenciao na anlise por electres secundrios (Fig. 61). A espessura desta camada tecidular apresentou variaes significativas na mesma amostra e nas diversas amostras observadas.
130
Atravs da observao das amostras por electres retrodifundidos foi possvel obter uma melhor caracterizao dos tecidos depositados na zona da interface (Fig. 62). A possibilidade de obter imagens onde existia uma relao directa entre o contedo mineral dos tecidos e a sua colorao nas imagens, permitiu distinguir a camada de tecido conjuntivo no mineralizado, que apresentou uma cor preta, enquanto que os tecidos mineralizados eram cinzentos. Esta caracterstica foi importante na diferenciao do contedo mineral dos tecidos. Nalgumas imagens, obtidas em electres secundrios, foi possvel identificar a estrutura fibrosa da camada tecidular mais prxima da superfcie dos implantes (Fig. 63). Nestas imagens evidenciaram-se os feixes de fibras que se dissociaram da matriz conjuntiva e da superfcie do material, deixando a percepo da formao de um espao de separao entre os tecidos e o material. Na generalidade das amostras, a interface formada entre o tecido sseo cortical antigo e a superfcie dos implantes caracterizou-se pela existncia de duas estruturas distintas. Na proximidade da superfcie dos implantes de ao inox, formou-se uma camada fina de tecido conjuntivo no mineralizado, tecido fibroso, com uma espessura entre 10 e 30 um. Esta camada tecidular apresentou alguns contactos pontuais com a superfcie do material mas, na generalidade, existia uma fenda de separao ntida entre o tecido formado e o material. Esta separao foi mais acentuada na microscopia electrnica de varrimento, pois o vcuo a que as amostras foram submetidas, necessrio para a observao correcta das amostras, induziu a criao de tenses que levaram separao dos tecidos nas zonas mais frgeis. A camada de tecido fibroso ficou interposta entre a superfcie do implante e uma camada de tecido sseo regenerado, imaturo, com contedo mineral e arranjo estrutural distinto do osso cortical antigo. As imagens obtidas atravs de electres retrodifundidos permitiram estabelecer uma melhor distino entre estas estruturas, comparativamente com a utilizao dos electres secundrios. Todavia, mesmo na funo de electres secundrios, foi possvel diferenciar as vrias estruturas presentes na interface (Fig. 64). Observou-se tambm, um espao de separao ntido entre o material e o tecido depositado neste local. Amostras com O semanas aps a implantao Com o decorrer do tempo do ensaio, verificaram-se algumas diferenas nas amostras com 10 semanas de implantao. A camada de tecido fibroso
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Fig. 61 - Ao Inox - 4 semanas. Podem observar-se as estruturas da interface: osso cortical (O), osso imaturo (01), tecido no mineralizado (*) e o implante de ao inox (Al). (MEV - Electres Secundrios)
Fig. 62 - Ao Inox - 4 semanas. Atravs deste mtodo de observao, so mais ntidas as diferenas entre as estruturas da interface: osso cortical O), osso imaturo (01), tecido no mineralizado (*) e o implante de ao inox (AI). (MEV- Electres Retrodifundidos) 132
Fig. 63 - Ao Inox - 4 semanas. Imagem exemplificativa da constituio fibrosa da camada tecidular que se deposita na superfcie do implante. So evidentes os feixes de fibras (*) que fazem parte deste tecido. Note-se a linha de separao entre o osso imaturo e o osso cortical antigo (setas). (MEV - Electres Secundrios)
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Fig. 64 - Ao Inox - 4 semanas. Maior pormenor das estruturas interfaciais. Osso cortical (0), osso imaturo (01), tecido no mineralizado (*) e implante de ao inox (AI). Salienta-se a falta de adeso entre o tecido depositado e a superfcie do material. (MEV - Electres Secundrios) 133
interposta entre o material e o osso regenerado, diminuiu de espessura, embora se mantivesse presente na globalidade das amostras. Esta camada separou-se facilmente da superfcie do material por falta de reteno mecnica, dando lugar ao aparecimento de um espao vazio na interface. O osso formado/remodelado na zona da interface apresentou um estado de maturao mais evoludo, comparativamente s amostras com 4 semanas, sendo praticamente indistinguvel do osso cortical antigo no que respeita ao arranjo estrutural, embora ainda persistissem algumas zonas dispersas de tecido conjuntivo no mineralizado. Notou-se, tambm, o nmero elevado de vasos dispersos pela matriz deste tecido (Fig. 65), indicativo da alta actividade metablica existente. A presena de alguns vasos com tamanho considervel e de uma linha tnue de separao entre o osso cortical e o osso neoformado delimitaram a camada de tecido sseo em fase mais activa de formao/remodelao (Fig. 66). O tecido fibroso, embora no aderindo s irregularidades superficiais dos implantes, mostrou uma adaptao perfeita sua morfologia externa, mas sem possuir qualquer tipo de reteno ou adeso mecnica, dado formar-se uma fenda ntida entre o material e o tecido. Esta separao acentuou-se quando a superfcie do implante apresentava poucas irregularidades (Fig. 67). Nalgumas imagens, identificou-se a manuteno de uma camada de tecido fibroso envolvendo os implantes, mas o osso neoformado na interface apresentou um grau de maturao semelhante ao osso cortical antigo, sendo difcil definir os seus limites (Fig. 67). A observao em pormenor da zona de interface, em grandes ampliaes, permitiu confirmar a separao entre a superfcie do material e o tecido depositado (Fig. 68). Nestas imagens, identificou-se a ausncia de deposio de estruturas orgnicas na superfcie irregular do implante. A anlise global das amostras contendo implantes de ao inox evidenciou a falta de adeso entre os tecidos neoformados na interface e a superfcie dos implantes. Os implantes encontravam-se separados do osso cortical por uma camada de tecido fibroso e por uma outra camada de tecido sseo imaturo. Com o decorrer do tempo de permanncia dos implantes, verificou-se uma diminuio geral da espessura da camada do tecido fibroso, mantendo-se, todavia, uma separao ntida entre o implante e o tecido neoformado. Esta separao foi incrementada pelas foras de tenso induzidas pelo vcuo do microscpio, provocando o aparecimento de uma fenda de tamanho considervel em quase todo o permetro.
134
Fig. 65 - Ao Inox - 10 semanas. Verifica-se a formao de um tecido sseo na zona da interface aparentando bastantes semelhanas estruturais com o osso cortical. Presena de algumas zonas com tecido conjuntivo no mineralizado (*), a abundante distribuio de vasos pela matriz e a existncia de uma fenda na interface. (MEV - Electres Secundrios)
Fig. 66 - Ao Inox -10 semanas. Formao de uma camada de tecido sseo regenerado (01), separado do osso cortical (O) por uma linha ntida. Presena de um vaso de grandes dimenses neste tecido. A zona da interface est preenchida por uma camada de tecido no mineralizado (*), separado do material por uma fenda. (MEV - Electres Secundrios) 135
Fig. 67 - Ao Inox -10 semanas. Imagem representativa da falta de contacto directo entre o tecido neoformado e a superfcie do material. Camada de tecido no mineralizado, interposta entre o osso e o implante. A fenda observada na interface incrementada pelo vcuo do microscpio. (MEV - Electres Secundrios)
Fig. 68 -Ao Inox - 1 0 semanas. Pormenor da fenda de separao entre a superfcie do implante (AI) e o tecido envolvente (*). De salientar a ausncia de qualquer vestgio orgnico na superfcie do material. (MEV - Electres Secundrios) 136
A camada de tecido sseo regenerado sofreu, com o tempo, um incremento no contedo mineral e no estado de maturao estrutural. Nalgumas amostras com 10 semanas de implantao foi extremamente difcil estabelecer uma diferena ntida entre o osso cortical antigo e o osso regenerado. A microanlise por raios X das estruturas da interface no revelou qualquer evidncia de difuso de ies a partir dos implantes de ao inox para os tecidos envolventes. A camada tecidular, mais prxima da superfcie do material, revelou caractersticas de tecido orgnico no mineralizado, com altos teores de carbono e oxignio, mas sem vestgios de clcio nem fsforo. Nas amostras com 4 semanas de implantao, o osso formado junto da interface possui algum clcio e fsforo, o que compatvel com um tecido pouco mineralizado. O contedo destes elementos foi mais elevado nas amostras com 10 semanas, aproximando-se dos teores apresentados pelo tecido sseo cortical antigo. 3.3.2. Titnio Amostras com 4 semanas aps a implantao A observao por microscopia electrnica de varrimento das amostras de titnio com 4 semanas de implantao mostrou, na generalidade, a formao de tecido sseo imaturo, que contactava directamente parte da superfcie dos implantes (Fig. 69). As imagens analisadas apresentaram evidncias da deposio de um tecido sseo menos mineralizado na zona da interface, que se distinguiu perfeitamente do osso cortical, no s pela sua estrutura mas porque possua uma grande riqueza de vasos, com calibres variando entre 2 e 10 u.m. Na funo de electres retrodifundidos (Fig. 70), a distino entre o tecido sseo cortical e o osso formado na interface foi mais notria. Para alm das diferenas estruturais observadas em electres secundrios, verificou-se que o tecido sseo regenerado apresentava um menor contedo de componentes minerais. Tal facto no impediu, contudo, a identificao de pontos de contacto directo entre o tecido sseo neoformado e a superfcie dos implantes. O contacto na interface promoveu uma reteno mecnica suficiente para resistir s foras de tenso provocadas pelo vcuo do microscpio, pois a fenda de separao apareceu localizada na camada tecidular e no entre o material e o tecido neoformado. A penetrao de parte da superfcie dos implantes de titnio na cavidade medular no impediu que ocorresse o crescimento de tecido sseo nesta
137
Fig. 69 - Titnio - 4 semanas. Formao de tecido sseo imaturo na zona da interface, contactando o implante em alguns pontos. Refira-se a grande abundncia de vasos neste tecido e a existncia de uma camada com estrutura diferente na zona mais prxima da superfcie do material. (MEV - Electres Secundrios)
Fig. 70 - Titnio - 4 semanas. Mesmo campo da imagem anterior. Melhor identificao do grau de mineralizao das estruturas da interface. Note-se a unio entre o tecido mineralizado depositado e a superfcie do material. (MEV - Electres Retrodifundidos) 138
zona. A observao de vrias amostras em que os pinos de titnio se localizavam na cavidade medular permitiu constatar o crescimento de tecido sseo trabecular rodeando e envolvendo os pinos de titnio (Fig. 71). As trabculas sseas, rodeadas por tecido medular, cresceram a partir do endsseo na direco da superfcie do implante envolvida por este tecido. Em maiores ampliaes, na zona da interface, foi possvel observar um contacto directo entre o tecido neoformado e a superfcie dos implantes (Fig. 72). O tipo de adeso, contacto fsico directo com reteno mecnica do tecido, foi suficientemente forte para manter a unio na interface entre o osso e o material. Nalgumas imagens verificou-se a formao de uma fenda de separao mas, contrariamente ao que ocorreu com os pinos de ao inox, no se localizou na interface entre o material e o tecido neoformado mas sim entre a linha de separao deste tecido menos mineralizado e o osso cortical. Este facto demonstrativo da boa integrao do material nos tecidos envolventes, decorridas 4 semanas aps a implantao do material no osso cortical do coelho.
Amostras com 10 semanas aps a implantao
A anlise das amostras de titnio com 10 semanas de implantao mostrou um aspecto global de maior contacto entre o tecido sseo neoformado e a superfcie dos implantes. O osso depositado apresentou um estado de maturao mais avanado, comparativamente com as amostras implantadas durante 4 semanas. A observao das estruturas da interface permitiu identificar uma camada de tecido sseo bastante mineralizado junto da superfcie do material, mas que ainda se distinguiu do osso cortical antigo pela persistncia de uma linha ntida de separao. O tecido sseo depositado na superfcie dos implantes preencheu as reentrncias e irregularidades superficiais do titnio mantendo um bom contacto com o material, e suportando as tenses produzidas na amostra durante a observao neste tipo de microscpio (Fig. 73). A resistncia mecnica e a boa unio do tecido ao mineral confirmada pela manuteno da unio, resistindo retraco provocada pelo vcuo do microscpio e levando ao aparecimento de linhas de fractura na matriz tecidular (Fig. 74). A observao mais pormenorizada da zona da interface, permitiu identificar a deposio de uma camada de tecido sseo com cerca de 10 |im de espessura, que se encontrava em contacto directo com a superfcie dos im139
Fig. 71 - Titnio - 4 semanas. Crescimento e formao de tecido sseo na parte do implante que se localiza na cavidade medular. Este tecido apresenta um aspecto de osso trabecular rodeado por tecido medular. (MEV - Electres Secundrios)
Fig. 72 - Titnio - 4 semanas. Contacto directo entre o tecido neoformado e a superfcie do material. A fora de adeso suficiente para que a linha de fractura surja entre o tecido neoformado e o osso cortical, mantendo-se ntegra a unio com a superfcie do material. (MEV - Electres Secundrios)
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F/g. 73 - Titnio 1 0 semanas. Contacto perfeito entre o tecido sseo neoformado na zona da interface e a superfcie do material. A camada de tecido sseo encon trase separada do osso cortical por uma linha ntida. (MEV Electres Secundri os)
Fig. 74 - Titnio 10 semanas. A fora de unio do tecido sseo neoformado superfcie do implante suficientemente forte para resistir s foras criadas pelo vcuo do microscpio, levando a que as linhas de fractura surjam na matriz do tecido e no na interface. (MEV Electres Secundrios) 141
plantes (Fig. 75). O arranjo estrutural deste tecido foi semelhante ao do osso cortical, fazendo-se a distino entre os dois tecidos atravs da presena de uma linha tnue de separao. Evidenciou-se a interpenetrao do tecido neoformado nas irregularidades superficiais do implante, aumentando a superfcie especfica de adeso fsica entre as duas estruturas. A microanlise por raios X das vrias estruturas da interface permitiu quantificar a sua composio elementar. A determinao da composio qumica da camada tecidular depositada na zona da interface permitiu obter o registo apresentado na figura 76. Os picos correspondentes aos vrios elementos presentes nesta estrutura permitiram classificar este tecido como sendo um tecido conjuntivo mineralizado, apresentando uma relao Ca/P bastante elevada. Identificou-se, tambm, a presena de titnio. O traado obtido a partir da anlise do tecido neoformado localizado prximo do osso cortical apresentado na figura 77. Confirma-se a presena de titnio, embora de forma vestigial, no ponto que dista da superfcie do implante em cerca de 180 a 200 |im. No osso cortical (fig. 78), num ponto analisado a cerca de 300 u.m da superfcie do implante, no foram encontrados vestgios de titnio.
Fig. 75 - Titnio - 10 semanas. Pormenor de uma zona de interface entre o osso neoformado e a superfcie do implante. Confirma-se a existncia de uma unio perfeita entre o tecido e o material. perceptvel uma diferena estrutural atenuada entre o osso cortical e o osso neoformado. (MEV - Electres Secundrios) 142
Pioneer6301F Display - Spectru2

VFS: 480 Livetime: Ca 60
Fig. 76 - Titnio - 10 semanas. Espectro da composio qumica do tecido da interface. O traado confirma tratar-se de um tecido mineralizado, rico em clcio e fsforo. Os vestgios de titnio concentrado neste ponto, a cerca de 5 |xm da superfcie do material, podem ser atribudos a uma possvel interferncia do implante. (Microanlise por raios X - EDS) Pioneer_6301F Display - Spectru4
Fig. 77 - Titnio - 10 semanas. Espectro da composio qumica do tecido da interface, prximo do osso cortical. Trata-se de tecido mineralizado, rico em clcio e fsforo. Os vestgios de titnio encontrados a cerca de 180-200 \xm da superfcie do material correspondem dissoluo de ies de Ti a partir do implante. (Microanlise por raios X - EDS)
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Pioneer_6301F Display - Spectru3

VFS: 460 Livetime: Ca 60
Fig. 78 - Titnio - 10 semanas. Espectro da composio qumica do osso cortical. No foram detectados vestgios de titnio neste tecido. (Microanlise por raios X EDS)
Estes resultados foram confirmados noutras amostras com 10 semanas de implantao na camada tecidular depositada junto da interface, com uma espessura que varia entre os 150 a 250 |im. Nas amostras com 4 semanas de implantao, utilizando esta metodologia de microanlise, no foram detectados vestgios de qualquer tipo de titnio, a no ser em pontos muito prximos da superfcie dos implantes. Neste caso, a presena destes ies foi atribuda a interferncias, por interaco do feixe de electres com a superfcie do material, devido grande proximidade dos locais de determinao com a superfcie dos implantes.
3.3.3. Ostopathe Amostras com 4 semanas aps a implantao
Nas amostras de Osteopatite observadas 4 semanas aps a implantao no osso cortical da tbia dos coelhos por microscopia electrnica de varrimento, verificou-se uma extensa regenerao de tecido sseo imaturo que preencheu parte dos espaos existentes entre os grnulos deste material (Fig. 79).
144
ObservoLi-se um maior crescimento do tecido sseo no espao central do defeito sseo, localizado no osso cortical, orientando-se tambm para os grnulos colocados na cavidade medular. 0 osso neoformado era composto por lamelas que penetram nos espaos entre os grnulos, envolvendo-os e contactando directamente com a sua superfcie. O espao entre as lamelas de osso imaturo foi preenchido por tecido medular. A observao do tecido sseo neoformado permitiu caracteriz-lo como sendo um tecido sseo imaturo envolvendo a totalidade da superfcie da maioria dos grnulos. Verificou-se a formao de um contacto directo entre o tecido sseo e a superfcie do material, sem interposio de qualquer camada de tecido conjuntivo no mineralizado (Fig. 80). A matriz do tecido sseo era perfurada por um nmero elevado de vasos, apresentando alguns deles um calibre bastante aumentado. Este facto confirma a alta actividade metablica inerente a um tecido em fase de formao/remodelao activa que necessita de um aporte abundante de nutrientes atravs da corrente sangunea. Os vasos distriburam-se ao longo da matriz ssea formada, encontrando-se alguns deles localizados muito prximo da superfcie do material (Fig. 81). A anlise pormenorizada da interface formada pelo tecido sseo e a superfcie dos grnulos conduziu a observaes interessantes. Em algumas zonas da interface foi possvel identificar uma fase precoce da formao da matriz ssea nas porosidades existentes entre as partculas dos grnulos (Fig. 82). Verificou-se, nestes locais, a produo de fibras de colagnio que penetravam nas porosidades superficiais, numa profundidade de cerca de 10 um. Seguiu-se a deposio de substncia fundamental amorfa, originando a matriz ssea mineralizada atravs da deposio de cristais de hidroxiapatite. As fibras de colagnio tipo I so o constituinte fundamental no processo de osteognese. A penetrao do tecido sseo nas porosidades um indicador da alta capacidade de adeso deste tecido ao material e das suas boas propriedades biolgicas que motivam a induo da formao/remodelao de tecido sseo no interior das suas porosidades. Os feixes de fibras projectaram-se da matriz ssea em formao, penetrando nas porosidades e aderindo firmemente s partculas que revestem as suas paredes (Fig. 83). Verificou-se um contacto directo e contnuo entre a superfcie do material e a matriz ssea em formao, observvel em grandes ampliaes. No se observou a deposio de qualquer estrutura mais densa a nvel da interface formada entre os grnulos da Osteopatite e o tecido sseo depositado na sua superfcie. 145
Fig. 79 - Osteopatite - 4 semanas. Grnulos rodeados por trabculas sseas que invadem os espaos inter granulares. Presena abundante de vasos e tecido medular. O crescimento sseo processa-se na direco dos grnulos. (MEV - Electres Secundrios)
Fig. 80 - Osteopatite - 4 semanas. Envolvimento de um grnulo pelo tecido sseo. Salienta-se o contacto directo entre o osso e a superfcie do grnulo e a riqueza de vasos, dispersos pela matriz ssea. (MEV - Electres Secundrios) 146
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Fig. 81 - Osteopatite - 4 semanas. Pormenor do tecido sseo depositado entre dois grnulos. Evidenciam-se vasos com calibre aumentado e boa adeso do tecido sseo s superfcies dos grnulos. (MEV - Electres Secundrios)
Fig. 82 - Osteopatite - 4 semanas. Interface entre o tecido sseo neoformado e a superfcie de um grnulo. Penetrao de fibras de colagnio no interior das irregularidades do grnulo, aderindo s partculas. Estas fibras so precursoras fundamentais do processo de osteognese. (MEV - Electres Secundrios) 147
Fig. 83 - Osteopatite - 4 semanas. Grande ampliao da zona da interface. Visualizase a penetrao do tecido sseo nas irregularidades de um grnulo. So evidentes as fibras de colagnio que crescem e se projectam para o interior do grnulo, a partir da matriz ssea. (MEV - Electres Secundrios)
Tambm no foi perceptvel qualquer sinal de degradao superficial dos grnulos, mantendo as partculas a sua morfologia normal, mesmo as mais superficiais e portanto mais sujeitas ao efeito do meio fisiolgico envolvente. Amostras com 10 semanas aps a implantao O decurso temporal entre as 4 e as 10 semanas contribuiu para que a formao de tecido sseo no s aumentasse de quantidade como tambm sofresse mudanas significativas no seu estado de maturao. As amostras observadas evidenciaram o preenchimento da totalidade do espao existente entre os grnulos, por um tecido sseo mais maduro e diferenciado (Fig. 84). Continuaram presentes um elevado nmero de vasos, de calibre aumentado, distribuindo-se por toda a matriz ssea formada, estando alguns deles localizados prximos da superfcie dos grnulos. O tecido sseo depositado entre os grnulos contactava directamente a superfcie do material, penetrando nas suas porosidades superficiais e estabelecendo uma unio firme e ntima com o material (Fig. 85). No se observou em qualquer das amostras a interposio de uma camada de tecido no 148
mineralizado na zona da interface. O tecido sseo neoformado possua uma matriz mineralizada e uma estrutura homognea, rodeando e envolvendo a superfcie do grnulo. A anlise pormenorizada da interface (Fig. 86) no evidenciou a presena de qualquer estrutura no mineralizada nesta zona. Confirmou-se o preenchimento das reentrncias superficiais por tecido sseo de estrutura idntica do osso depositado nos espaos entre os grnulos. A ausncia das fibras de colagnio na matriz ssea um indicador do estado avanado de maturao e diferenciao do tecido sseo neoformado. Uma observao evolutiva, em termos de incremento de ampliaes, da mesma zona da interface, permitiu confirmar a boa adeso do tecido sseo superfcie dos grnulos, com interpenetrao tecidular nos espaos formados pela porosidade aberta dos grnulos (Fig. 87). A penetrao do tecido sseo, numa profundidade de cerca de 10 um, foi um indicador da boa integrao do material no tecido e do estabelecimento de uma unio fsico-qumica entre as duas estruturas. No foram identificados sinais evidentes de degradao superficial dos grnulos de Osteopatite durante os perodos de implantao utilizados neste ensaio. A realizao da microanlise por raios X, concomitante com a observao microscpica, foi feita em trs pontos fundamentais das amostras: grnulo implantado, interface entre o material e o novo osso formado e no osso cortical. Esta anlise demonstrou a existncia de uma relao Ca/P com bastantes semelhanas nas trs determinaes (Figs. 88, 89 e 90). Os espectros obtidos, representativos do contedo inico dos trs pontos seleccionados, confirmam uma relao de Ca/P semelhante. Este facto no surpreendente se tivermos em ateno que a composio qumica deste material bastante semelhante do osso humano e que o tecido sseo formado nas zonas envolventes dos grnulos apresentava um grau de mineralizao significativo. A Osteopatite um material cermico que induz um bom comportamento biolgico do tecido sseo onde implantado, e forma uma ligao perfeita e directa com o tecido sseo regenerado. 3.3.4. Cimento de Vidro Bioactivo Amostras com 4 semanas aps a implantao As amostras do cimento de vidro bioactivo, observadas em microscopia electrnica de varrimento, revelaram uma boa integrao do material no te149
Fig. 84 - Osteopatite - 10 semanas. Grnulo rodeado por tecido sseo. Este tecido apresenta um estado de maior maturao, comparativamente com as amostras de 4 semanas, e um contacto perfeito com a superfcie do material. Visualizam-se alguns vasos, com calibre aumentado, dispersos pela matriz do osso formado e em proximidade da superfcie dos grnulos. (MEV - Electres Secundrios)
Fig. 85 - Osteopatite - 10 semanas. Formao de um tecido sseo homogneo que contacta directamente a superfcie do grnulo. Este tecido penetra e preenche as porosidades existentes entre as partculas. (MEV - Electres Secundrios) 150
Fig. 86 - Osteopatite - 10 semanas. Pormenor da zona da interface entre o osso neoformado e a superfcie de um grnulo. Nota-se a penetrao e preenchimento das irregularidades do grnulo pelo tecido sseo neoformado. No se observam sinais de degradao superficial do material. (MEV - Electres Secundrios)
Fig. 87 - Osteopatite - 10 semanas. Observao da interface atravs de maior ampliao. evidente a unio entre o tecido sseo e a superfcie do material. As partculas superficiais do material encontram-se totalmente envolvidas pelo tecido sseo, que penetra nas porosidades. (MEV - Electres Secundrios) 151
Pioneer_6301F Display - Spectrual VFS: 650 Au F Ca Livetime: 150
1i
uMq k l J
Au
HAU
1 Ca
5.110
0.000 keV L a b e l : Osteo - Granulo / 15l<eV
Fig. 88 - Osteopatite - 10 semanas. Espectro da composio qumica de um grnulo implantado. No se encontram sinais da presena dos ies Na e Mg, constituintes naturais do material. (Microanlise por raios X - EDS)
Pioneer_6301F Display - Spectru3 VFS: 420
Livetime: 90
Label : Osteol
/ 15KeV
Fig. 89 - Osteopatite - 10 semanas. Espectro da composio qumica do tecido depositado na zona da interface. Este espectro compatvel com um tecido sseo mineralizado, rico em clcio e fsforo, apresentando vestgios de Na e Mg. (Microanlise por raios X - EDS)
152
Pioneer_6301F Display - Spectru2 VFS: 440

Au
Livetime: 90
ljUAlllllImidjH
Label: Osteol
Osso / 15KeV
Fig. 90 - Osteopatite - 10 semanas. Espectro da composio qumica do osso prximo da zona da interface. A presena dos ies Ca, P, C e O caracterstica de um tecido orgnico mineralizado. Tambm se encontram presentes vestgios de ies de Na e Mg. (Microanlise por raios X - EDS) eido sseo. Verifica-se uma deposio/remodelao de osso na zona da interface e o recobrimento da superfcie externa do material, a partir do crescimento de trabculas sseas, que se prolongam do peristeo (Fig. 91). O osso formado na proximidade da interface, numa camada com cerca de 300 |im, apresenta caractersticas estruturais em conformidade com um estado de remodelao activa. A presena de grandes vasos e o menor grau de mineralizao, comparativamente com o osso cortical antigo, so caractersticas constantes em todas as amostras observadas. O osso neoformado adere firmemente superfcie do cimento, mantendo uma unio suficiente para resistir s tenses resultantes do vcuo criado pelo microscpio. Estas foras provocam o aparecimento de uma linha de fractura que separa a camada externa do cimento do bloco principal do material (Fig. 92). A linha de fractura um artefacto que surge durante a observao das amostras, sendo visvel o seu aparecimento e crescimento ao longo do campo observado durante a anlise das amostras. O facto destas foras no serem suficientes para separar a camada externa do material do tecido sseo um possvel indicador da unio firme que se estabelece entre o material e o osso neoformado. Por outro lado, o facto 153
Fig. 91 - Cimento de Vidro Bioactivo - 4 semanas. Formao de tecido sseo na zona da interface e na superfcie externa do cimento. O osso cresce a partir do peristeo, recobrindo a superfcie externa do material. Na interface identifica-se uma unio directa entre o tecido e o material. (MEV - Electres Secundrios)
Fig. 92 - Cimento de Vidro Bioactivo - 4 semanas. O osso formado na zona da interface com o material apresenta uma grande riqueza de vasos, alguns com calibre muito aumentado. Existe uma adeso firme entre o cimento e o osso neoformado. (MEV - Electres Secundrios) 154
desta linha separar uma camada externa do corpo principal do cimento, fenmeno detectado nos outros tipos de anlise microscpica, contribuem para a especulao da existncia de caractersticas estruturais distintas desta camada externa, em consequncia de possveis fenmenos de degradao superficial do cimento. A degradao superficial dos vidros bioactivos um fenmeno conhecido e aceite como relevante para a formao de unies estveis com o tecido sseo. Uma anlise pormenorizada da zona da interface entre o cimento e o osso regenerado permitiu evidenciar a interposio do tecido sseo entre as partculas de slica do material, formando uma zona da adeso perfeita (Fig. 93). Nestas imagens, identificam-se alguns sinais evidentes de degradao superficial do material. A degradao da superfcie do material consiste na dissoluo da matriz que rodeia as partculas de slica. Estas partculas mantm uma morfologia polidrica constante, indicadora de que no foram ainda sujeitas a fenmenos de degradao (Fig. 94). Os elementos observveis nesta ampliao da interface, confirmam uma transio gradual e contnua do material para o tecido sseo, no se observando a deposio de qualquer tecido conjuntivo. A reabsoro da matriz do cimento levou sua substituio por tecido sseo, formando uma ligao perfeita entre as duas estruturas.
Amostras com 10 semanas aps a implantao
Com o decorrer do tempo do ensaio, observou-se um aumento da quantidade de tecido sseo formado volta do cimento de vidro bioactivo. Diminuram os espaos ocupados por tecido vascular e medular, havendo um recobrimento total da superfcie externa do material pelo crescimento sseo a partir do peristeo. Simultaneamente, verificou-se uma evoluo da maturao e diferenciao deste tecido na vizinhana da superfcie do cimento, sendo mais difcil estabelecer uma distino entre o tecido sseo neoformado e o osso cortical antigo. Na zona da interface entre o material e o tecido sseo, verifica-se uma interpenetrao perfeita do osso neoformado nos espaos entre as partculas do cimento, aps reabsoro parcial da matriz (Fig. 95). Este tipo de unio entre as duas estruturas motiva uma transio gradual entre o cimento e o osso depositado na sua superfcie. A anlise pormenorizada da interface (Fig. 96), confirma a unio directa do tecido sseo superfcie do material, atravs de interdigitao do osso no cimento, sendo difcil de definir os limites de separao entre as duas estruturas. O contacto perfeito entre o osso e o cimento e a transio gradu155
Fig. 93 - Cimento de Vidro Bioactivo - 4 semanas. Pormenor da interface. Verificase uma boa unio entre o cimento e o osso. A parte externa do material apresenta alguns sinais de degradao da camada superficial. (MEV- Electres Secundrios)
Fig. 94 - Cimento de Vidro Bioactivo - 4 semanas. Maior ampliao da zona da interface. As partculas de vidro original (*) mantm a sua morfologia enquanto que a matriz do cimento sofreu alguma degradao superficial, permitindo a penetrao do tecido sseo nos espaos formados. (MEV - Electres Secundrios) 156
Fig. 95 - Cimento de Vidro Bioactivo - 10 semanas. Interface entre a superfcie do cimento e o tecido sseo. Existe uma ligao perfeita entre as duas estruturas. A camada superficial do cimento apresenta alguns sinais de degradao. (MEV- Electres Secundrios)
Fig. 96 - Cimento de Vidro Bioactivo - 10 semanas. Maior ampliao da zona da interface. Existe uma interpenetrao do osso na matriz superficial do cimento, que foi parcialmente reabsorvida. Este facto torna impossvel a distino entre as duas estruturas. (MEV - Electres Secundrios) 157
ai do material para o tecido sseo, so demonstrativos da grande capacidade de integrao deste material (Fig. 97). Nestas imagens possvel observar uma ligeira alterao da morfologia das partculas de slica, indicativa dos efeitos de degradao a que so submetidas. Uma determinao da composio qumica em alguns pontos seleccionados das amostras, atravs da microanlise por raios X, revelou a composio do cimento, da zona da interface e do osso cortical. O espectro obtido de um ponto do cimento implantado (Fig. 98) apresenta a predominncia do silcio isolado, que no pode ser representativo da composio global do material, correspondendo antes a fenmenos localizados de degradao. Na zona da interface, no se identificaram vestgios da presena de silcio (Fig. 99). O espectro obtido compatvel com a presena de uma camada de tecido mineralizado com contedo mineral semelhante ao do osso cortical (Fig. 100). 3.4. Histomorfometria O procedimento necessrio para a determinao da percentagem de contacto sseo directo com a superfcie dos implantes, ndice de afinidade, incluiu uma avaliao prvia da calibragem do examinador atravs da determinao do coeficiente de variao intra-examinador (Cv), segundo a metodologia anteriormente descrita. As medies foram realizadas em seis diferentes fotografias da mesma imagem, obtida por microscopia electrnica de varrimento, na funo de electres retrodifundidos. A seleco da imagem teve em considerao a necessidade de apresentar uma boa definio e um campo de observao que englobasse todo o permetro do implante em contacto com o tecido envolvente. As determinaes da percentagem de contacto sseo directo com a superfcie do material foram realizadas com intervalos de uma semana, sendo sempre executadas em condies semelhantes e pelo mesmo examinador. Os resultados obtidos apresentam-se na tabela 4.2. Os valores obtidos nas medies para o clculo da anlise de erro demonstraram um coeficiente de variao intra-examinador (Cv) de 0,01%. A determinao da percentagem de contacto directo entre a superfcie dos implantes e o tecido sseo foi realizada em imagens obtidas atravs da funo de electres retrodifundidos, em microscopia electrnica de varrimento, a baixas ampliaes (30 X). As imagens foram ampliadas para fotografias com um tamanho padro de 20x15 cm.
158
Fig. 97- Cimento de Vidro Bioactivo 1 0 semanas. Maior pormenor da zona da interface. Nota se a perfeita integrao do material no tecido sseo. Observase alguns sinais de degradao superficial do material. As partculas de vidro original (*) apresentam um aspecto mais arre dondado e existem alguns vasos (V) no interior da matriz do cimento. (MEV Electres Secun drios) Pioneer__6301F Display Spectru!
VFS: 700
Livetime: 60
Si
Ca
Label: C B V partcula
Fig. 98 Cimento de Vidro Bioactivo 10 semanas. Espectro da composio do cimento implantado num ponto muito prximo da interface. Identificase a pre sena predominante de Si, de compostos orgnicos (C e O) e vestgios de Ca. (Microanlise por raios X EDS) 159
Pioneer 6301F Display - Spectru2 VFS: 750
Label: CBV
ace
15KeV
Fig. 99 - Cimento de Vidro Bioactivo - 10 semanas. Espectro de um ponto da interface formada entre o cimento e o tecido sseo (10 \im), correspondente camada de apatite precipitada. (Microanlise por raios X - EDS)
Pioneer_6301F Display - Spectru! VFS: 750
Label: CBV tecido sseo
15KeV
Fig. 100 - Cimento de Vidro Bioactivo - 10 semanas. Espectro da composio qumica de uma camada de tecido depositado prximo da zona da interface (200 {im). (Microanlise por raios X - EDS) 160
Tabela 4.2 - Resultados dos valores determinados para a anlise de erro Medies
1 2 3 4 5 6
% de contacto sseo
63,6 64,4 64,6 63,2 64,1 62,8
Mediai desvio-padro
63,8 0,7
Os resultados obtidos para os distintos materiais so apresentados na tabela 4.3 e na fig. 101. Um aspecto a salientar dos resultados obtidos o incremento que se verifica na percentagem de contacto sseo com o decorrer do tempo de implantao, que de 66,7% para o ao inox, 73,8% para o titnio, 27,7% para a Osteopatite e de 27,2% para o cimento de vidro bioactivo. Tabela 4.3 - Resultados da determinao da percentagem do contacto sseo dos diferentes biomateriais, obtidos atravs da histomorfometria
Ao Inox
Coelho n 4 sem 2,5% 8,3% 6,0% 10 sem Titnio 4 sem 17,8% 28,9% 12,8% 5,8% 2,9% 25,7% 12,6% 7,8% 4,6% 3,6% 3,4% 6,7% 6,0% 4,3% 24,8% 8,0% 29,5% 34,1% 1 0 sem Osteopatite 4 sem 54,6% 69,7% 72,9% 29,4% 37,8% 81,3% 59,0% 52,6% 47,6% 44,8% 39,8% 43,1% 10,0% 65,4% 11,2% 61,3% 94,6% 92,3% 77,8% 84,4% 83,2% 10,9% 87,9% 72,5% 70,7% 14,2% 64,7% 85,1% 62,2% 98,8% 93,9% 72,9% 94,7% 89,9% 10,4% 0 sem Cimento de VB 4 sem 85,7% 51,4% 64,3% 97,8% 81,4% 0 sem
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Mdia d. padro
0 %
0 %
0 %
161
miH
semanas
IO ' :s e m a n a s
Ao inox
Titnio
Osteopatite
C V B
Fig. 01- Resultados da determinao do contacto sseo dos diferentes biomateriais (mdia desvio-padro). CVB - Cimento de vidro bioactivo. A percentagem de contacto sseo do ao inox significativamente inferior (p<0,05; teste de Wilcoxon), comparativamente com todas as outras amostras para o mesmo tempo de implantao. 0 titnio apresenta uma percentagem de contacto sseo significativamente superior ao ao inox e significativamente inferior s amostras de Osteopatite e cimento de vidro bioactivo (p<0,05; teste de Wilcoxon), para os mesmos tempos de implantao. A Osteopatite e o cimento de vidro bioactivo apresentam uma percentagem de contacto sseo significativamente superior s amostras metlicas, no existindo diferenas estatisticamente significativas entre estes dois materiais, para os mesmos tempos de implantao (p<0,05; teste de Wilcoxon).
162
V DISCUSSO
O conjunto de resultados apresentados no captulo anterior demonstra que, para alm dos factores comuns, inerentes ao modelo animal e tcnica cirrgica, existem interaces distintas entre os quatro biomateriais e o tecido sseo cortical do Coelho. Consideramos, tambm, que as reaces na interface entre os biomateriais e o tecido sseo correspondem a fenmenos importantes na determinao da sua biocompatibilidade. Este facto aceite pela generalidade dos investigadores, salientando-se a importncia deste tipo de estudos na avaliao do comportamento dos tecidos vivos, aps a implantao de biomateriais [53]. O sucesso clnico da utilizao dos biomateriais, em implantologia oral, pressupe uma perfeita integrao dos implantes nos tecidos envolventes, recuperando e substituindo as caractersticas morfofuncionais dos tecidos ou rgos que visam substituir. No estudo das interaces entre biomateriais e tecido sseo necessrio salientar que existe um conjunto multifactorial de parmetros que interferem e condicionam o processo de integrao e, consequentemente, a unio entre os materiais e os tecidos onde so implantados. A resposta do tecido hospedeiro colocao de um biomaterial avaliada atravs da observao morfolgica e histolgica dos tecidos que envolvem o implante e, em funo do comportamento desses tecidos, define-se o tipo de biocompatibilidade do material [53]. Neste trabalho foi realizada esta avaliao atravs da utilizao das microscopias ptica, de fluorescncia e electrnica de varrimento. Complementmos, por histomorfometria, os dados histolgicos recolhidos com a determinao do ndice de afinidade, percentagem de contacto directo entre os materiais e o osso neoformado. Finalmente, efectuamos a caracterizao qumica elementar de diversas estruturas, atravs da microanlise por raios X (EDS).
163
Os resultados obtidos permitiram-nos verificar a existncia de respostas especficas do osso cortical para cada um dos materiais utilizados, embora tenham sido tambm observados comportamentos gerais, comuns a todos. Estas respostas inespecficas no dependem essencialmente das caractersticas dos biomateriais utilizados, mas sim da capacidade reparadora intrnseca do tecido sseo, em resposta ao trauma que lhe induzido pela interveno cirrgica. Um aspecto a realar, que foi observado em algumas das amostras estudadas, a existncia de vrios artefactos que condicionam significativamente o valor dos resultados obtidos. Um exemplo foi a identificao da sobreposio de distintos campos de focagem, nos cortes com espessura superior a 50 um, observados em microscopia ptica e de fluorescncia. Na anlise dos resultados histolgicos, fundamental ter em considerao o mtodo seleccionado de preparao histolgica. Sendo uma metodologia complexa, torna-se essencial a identificao e eliminao dos artefactos que facilmente podem ser criados durante as vrias fases de preparao das amostras. Uma das maiores dificuldades nas tcnicas de preparao histolgica, de tecidos duros no desmineralizados, reside na obteno de cortes muito finos das amostras [241]. Durante a observao de alguns exemplares, em microscopia electrnica de varrimento, foram observadas linhas de fractura ou fendas, provocadas pelas tenses geradas pelo vcuo do equipamento. Quando submetidos a vcuo elevado, devido s diferenas estruturais, os tecidos orgnicos e os biomateriais apresentam graus de contraco distintos que podem provocar estas linhas de fractura. Este tipo de artefactos tambm referenciado por outros autores, que utilizaram tcnicas semelhantes de preparao das amostras para microscopia electrnica de varrimento [7, 96, 159, 167, 183, 244]. Os cortes histolgicos, obtidos atravs da tcnica de corte e desgaste descrita no captulo III, apresentaram uma variao mdia de espessura entre os 30 e 60 um. Estas diferenas de espessura foram significativas no caso das amostras a seccionar inclurem implantes metlicos. Foi extremamente difcil conseguir obter cortes com espessura inferior a 50 um, sem remover os pinos metlicos (Fig. 26). Em consequncia da espessura elevada tivemos dificuldades na interpretao de algumas lminas, principalmente em microscopia de fluorescncia (Figs. 57 e 58). No caso dos materiais cermicos foi mais fcil a diminuio da espessura das amostras sem danificao das zonas mais importantes para o estudo.
164
Captulo V - Discusso
A avaliao da interface dos biomateriais com o tecido sseo, e da sua ultraestrutura, teve em considerao a influncia dos artefactos produzidos pela tcnica histolgica. A produo de falsas imagens aparentando contacto directo do osso com o material um aspecto reconhecido por vrios autores [96, 182]. A resoluo histolgica da zona da interface depende do ngulo e da espessura da seco da amostra. Sendo bastante difcil controlar o ngulo de corte, a nica forma de diminuir a probabilidade de falsas imagens reduzir a espessura das seces, para evitar a sobreposio dos diferentes planos de focagem do microscpio. Com a utilizao da microscopia electrnica de varrimento pretendeu-se no s confirmar o contacto fsico directo entre os biomateriais e o tecido sseo, que pode ser obtido atravs da microscopia ptica [41], mas tambm observar a sua adeso fsica e qumica [167]. Com o decorrer do ensaio, observou-se um incremento na quantidade e qualidade de tecido sseo neoformado volta de todos os biomateriais bem como um aumento quantitativo e qualitativo do tipo de osso neoformado na zona da interface, com maior grau de maturao e mineralizao. Estes resultados vm de encontro aos apresentados por diversos investigadores, em ensaios que seguiram metodologia semelhante [22, 25, 73, 101, 151, 177]. A informao mais relevante sobre as interaces dos biomateriais com os tecidos orgnicos foi obtida atravs da anlise ultraestrutural da interface. Sendo um local altamente dinmico, desempenha um papel essencial e crtico na determinao da integrao dos biomateriais nos tecidos envolventes e, consequentemente, no sucesso a longo prazo dos implantes. O estudo da interface habitualmente realizado atravs do recurso a vrias tcnicas histolgicas especficas e observaes em diferentes tipos de microscopia. Se possvel fazer uma caracterizao estrutural pormenorizada desta zona, ainda continuam a existir algumas limitaes na compreenso de vrios dos fenmenos celulares e moleculares que aqui ocorrem. Este facto resulta das grandes limitaes inerentes metodologia de preparao de seces muito finas (< 10 u.m) das amostras de tecidos duros, sem se proceder descalcificao dos tecidos e/ou dos biomateriais [241]. A utilizao de culturas celulares permite compreender alguns dos fenmenos isolados que ocorrem a nvel ultraestrutural, mas a extrapolao dos resultados para os ensaios in vivo ainda levanta muitas reservas. No caso concreto de um dos biomateriais utilizados neste trabalho, a Osteopatite, ocorreram dificuldades na realizao de ensaios com culturas de osteoblastos 165
do osso alveolar humano, devido s alteraes do meio de cultura, induzidas pela troca inica do material com esse meio. Como se observou neste trabalho, estas alteraes, que se revelam benficas no comportamento in vivo deste material, interferem significativamente com a viabilidade das clulas em cultura, quando se utilizam discos com 5 mm de dimetro e 1 mm de altura, em placas normalizadas para culturas celulares de 96 poos. Tal facto motivado pela quantidade limitada do meio de cultura (100 ul) que colocado em cada poo, e pela troca inica deste material com o meio envolvente, que produz uma elevao do pH pouco compatvel com o desenvolvimento normal das clulas em cultura. A caracterizao dos tipos de adeso, que se podem formar entre os tecidos e a superfcie de vrios biomateriais, tem sido apresentada atravs da descrio de vrias microestruturas na zona da interface. referida a presena de uma camada electrodensa na interface do tecido sseo e a superfcie de vrios materiais, entre os quais se contam o ao inox 316L [248], o titnio [249, 250], a hidroxiapatite [141, 183, 251] e os vidros bioactivos [252]. Esta camada, composta por mucopolissacardeos, glicosaminoglicanos e protenas [248, 249, 253], podendo funcionar como uma camada adesiva do tecido sseo superfcie dos materiais, foi sempre observada em amostras descalcificadas ou em culturas celulares. Pelo facto de no ser normalmente identificada em amostras no descalcificadas, como no caso deste estudo, somos levados a considerar que, eventualmente, esta estrutura possa resultar de um artefacto produzido pelo processo de descalcificao. Contudo, alguns investigadores referem que a inobservncia desta estrutura em amostras no descalcificadas assenta no facto dos depsitos de tecido sseo, na zona da interface, impedirem a sua observao [248]. A determinao quantitativa da percentagem de tecido sseo, que contacta directamente a superfcie do material, um elemento fundamental na caracterizao do comportamento biolgico dos biomateriais. Existem vrias tcnicas que permitem quantificar a percentagem do contacto directo com o tecido sseo, recorrendo a imagens obtidas em microscopia ptica, electrnica de varrimento e microrradiografia [25, 38, 39, 59, 118,149-151, 177, 180, 187]. Neste trabalho, utilizmos imagens obtidas por microscopia electrnica de varrimento, na funo de electres retrodifundidos, por serem consideradas mais elucidativas na distino perfeita entre o tecido sseo mineralizado e os tecidos no mineralizados, presentes na zona da interface [178, 189, 242, 243]. Este tipo de metodologia permite fazer uma distino ntida entre 166
as estruturas que apresentam graus de mineralizao diferentes, dependentes do nmero atmico mdio das estruturas analisadas. Segundo Bloebaum e col. [189], os estudos onde so apresentados resultados de recobrimento completo dos implantes sem utilizao de imagens obtidas atravs desta tcnica devem ser analisados com cepticismo, porque os nicos mtodos de observao onde se obtm uma caracterizao tecidular, em funo do seu contedo mineral, so a microrradiografia e os electres retrodifundidos. De forma a melhor caracterizar, sobre o ponto de vista da composio qumica, as vrias estruturas observadas no espao circundante dos implantes, realizamos, na zona da interface, microanlise por raios X (EDS) em pontos seleccionados. Os traados obtidos permitiram verificar a existncia de elementos importantes na identificao mais exacta dos graus de mineralizao tecidular, a observao de fenmenos de degradao superficial dos materiais e a presena de vestgios de alguns elementos dos implantes (Figs. 76, 77, 78, 88, 89, 90, 98, 99 e 100). Atravs da anlise das imagens foi possvel avaliar algumas das composies qumicas destas estruturas, identificando-se vrios fenmenos que ocorreram durante o processo de integrao dos biomateriais no tecido sseo, quer a nvel de modificaes superficiais dos diferentes biomateriais quer durante a evoluo das camadas tecidulares formadas prximo da superfcie dos implantes. Para alm destes aspectos gerais, foram observados comportamentos especficos de cada biomaterial, que sero discutidos seguidamente.
1. Ao Inox 316L Os resultados obtidos neste trabalho justificam uma limitao da utilizao clnica do ao inox como material implantar permanente, o que est em concordncia com a generalidade dos autores [82]. A comprovao da ausncia de contacto directo com o tecido sseo e o conhecimento sobre a libertao de ies potencialmente txicos condicionam a utilizao clnica destes materiais, de acordo com os padres de biocompatibilidade actualmente exigidos [42, 66, 191]. Apesar destes efeitos indesejveis, este material continua a ser utilizado ainda em algumas aplicaes ortopdicas, principalmente na fixao e imobilizao temporria de fracturas sseas [174].
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Conforme observmos atravs dos diversos tipos de microscopia utilizados, este material biotolerado pelos tecidos orgnicos, induzindo a formao de uma camada de tecido fibroso na zona da interface, que impede qualquer tipo de ligao fsica aos tecidos envolventes (Figs. 22, 27, 29, 54, 60, 64, 65), facto que frequentemente referido na literatura e aceite pela generalidade dos investigadores [82). Contrariamente, em ensaios in vitro, parece existir um contacto dos osteoblastos em cultura com os discos de ao inox, em cuja superfcie, passivada durante 30 minutos em cido ntrico a 30%, se verificou tambm a deposio de uma matriz extracelular [248]. Estes resultados devem ser analisados luz das limitaes destes ensaios, referenciadas no captulo II. A implantao de pinos de ao inox 316L no osso cortical dos coelhos, permitiu observar a deposio de uma camada de tecido fibroso, interposta entre a superfcie dos implantes e o osso neoformado (Figs. 29 e 60). Os vrios tipos de anlise histolgica confirmaram sempre a presena desta camada de tecido fibroso, verificando-se, nalgumas imagens, a orientao paralela dos feixes de fibras, includos na matriz do tecido conjuntivo, relativamente superfcie dos implantes (Fig. 60). Esta camada tecidular diminuiu de espessura com o tempo de ensaio, tendo-se verificado uma reduo da espessura da camada fibrosa nas amostras com 10 semanas, comparativamente s de 4 semanas de implantao. Face a estes dados podemos afirmar que o tempo de implantao um parmetro que condiciona significativamente a maturao e a diferenciao dos tecidos neoformados na interface dos implantes de ao inox com o osso, facto que corroborado por outros investigadores [164, 174]. Comparativamente com o titnio comercialmente puro, o ao inox 316L caracteriza-se por, numa fase inicial, induzir uma resposta fibroctica mais baixa, mas, com o decorrer do tempo, esta resposta celular no sofre qualquer reduo, contrariamente ao que se verifica nos implantes de titnio [160]. A anlise do comportamento do tecido sseo, aps a implantao dos pinos de ao inox 316L, leva-nos a especular que o crescimento e a neoformao de tecido sseo verificados na proximidade da superfcie dos pinos se deveu, predominantemente, aos mecanismos intrnsecos da reparao ssea em resposta ao trauma mecnico sofrido durante o processo de colocao dos implantes. importante salientar que a zona de remodelao do tecido sseo, junto da interface, depende muito da adaptao do implante s paredes do defeito sseo. Neste trabalho, houve a preocupao de realizar orifcios no tecido sseo com dimenses uniformizadas em todo o
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permetro, por forma a permitir contacto perfeito entre as paredes do defeito sseo e toda a extenso da superfcie dos implantes. Esta metodologia foi resultante das concluses obtidas em estudos experimentais por ns realizados anteriormente, em que a falta de uniformizao dos orifcios provocou m adaptao dos implantes, motivando o aparecimento de grande quantidade de tecido fibroso e espaos aparentemente vazios, que provavelmente promoveram o aparecimento de fenmenos de micromovimentos nos implantes, condicionando significativamente o tipo de neoformao do tecido sseo, conforme descrito no captulo II. Refira-se, no entanto, que apenas temos a certeza de uma adaptao perfeita entre os pinos e as paredes sseas se os implantes tiverem forma de rosca, e forem colocados sobre presso, pelo que nunca pode ser totalmente excluda a possibilidade da existncia de zonas pontuais de mau contacto da superfcie dos pinos com as paredes sseas dos orifcios, usando a metodologia preconizada neste trabalho. O valor mdio da percentagem de contacto directo entre estes implantes e o tecido sseo foi baixo, respectivamente de 3,6 3,4% para as amostras com 4 semanas e de 6,04,3% para as amostras com 10 semanas aps a implantao (tabela 4.3). O facto de termos mesmo assim considerado algumas zonas como possuindo contacto directo com o osso, deve-se seguramente a uma limitao na distino entre contacto e no contacto sseo, motivada pelas baixas ampliaes com que foi determinado este parmetro. A figura 13 exemplificativa das dificuldades inerentes a este procedimento e da possibilidade significativa de medir falsos contactos. Esta hiptese avanada em consequncia de alguns factos verificados durante as nossas observaes. Em primeiro lugar, a anlise pormenorizada da zona da interface mostrou nunca existir um verdadeiro contacto entre o osso e o material. Nas poucas situaes em que se verificou proximidade entre o tecido sseo e a superfcie do material, concluiu-se que correspondia, fundamentalmente, a um fenmeno de adaptao do tecido s irregularidades do material e no a uma verdadeira unio fsica. Em segundo lugar, e no seguimento desta falta de adeso do material ao osso, alguns pinos foram facilmente removidos durante o processo de preparao histolgica. Este fenmeno suficientemente comprovativo da falta de reteno mecnica do material no tecido sseo neoformado. A observao das amostras de ao inox em microscopia electrnica de varrimento, implicou a necessidade de serem submetidas ao vcuo elevado
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deste equipamento, verificando-se a formao de uma fenda de separao entre os pinos e os tecidos neoformados na interface. Este fenmeno poder ser atribudo ao diferente grau de contraco apresentado pelos pinos metlicos e pelas estruturas orgnicas. Tendo sido observado apenas com este material, pode ser indicativo de que no existem foras de adeso suficientemente fortes para manterem a ligao entre a superfcie destes implantes e os tecidos. Algumas amostras preparadas para observao em microscopia ptica e de fluorescncia tambm mostraram a formao de um espao, aparentemente no preenchido por qualquer tecido, na zona da interface. A criao deste artefacto poder ser motivada por um mecanismo diferente do observado para a microscopia electrnica de varrimento, sendo, provavelmente provocado pela retraco dos tecidos durante a fase de desidratao [167]. Como o processo de desidratao idntico para todas as amostras, poder-se- pensar que o mesmo fenmeno ocorreu durante a preparao dos exemplares para observao em microscopia electrnica de varrimento. No entanto, e contrariando este pressuposto, identificmos a formao e o aumento das fendas, que interpretmos como sendo indicadores dos efeitos das tenses criadas nestas amostras pelo vcuo do equipamento. Neste estudo no foram controlados alguns parmetros que condicionam o comportamento do tecido sseo aps a colocao de implantes, tais como a caracterizao da superfcie dos implantes e a sua fixao firme ao tecido sseo. A superfcie dos implantes no sofreu qualquer tipo de tratamento especfico e as irregularidades apresentadas pelos pinos foram, fundamentalmente, uma consequncia da metodologia de fabrico dos pinos metlicos, atravs de um processo de maquinagem normal. No que respeita fixao dos pinos de ao inox, estes foram colocados sob presso e bem adaptados aos orifcios sseos. Alm disso, e apesar dos animais serem colocados em liberdade absoluta, o local de colocao dos biomateriais estava protegido de foras de carga directa ou possveis movimentos dos implantes. Todavia, e devido ao facto dos pinos no serem roscados, no pode ser totalmente excluda a hiptese de, pontualmente, existir uma m adaptao do material ao osso e aparecerem fenmenos de micromovimentos limitados, podendo condicionar a formao e a diferenciao tecidular na zona da interface [122]. De qualquer forma, os resultados obtidos com o ao inox 316L onde se verificou a existncia generalizada de uma camada de tecido fibroso inter170
posta entre o tecido sseo neoformado e a superfcie dos implantes, no podem ser atribudos a uma tcnica experimental incorrecta, mas sim s propriedades intrnsecas do material que o identificam como biotolerado enquanto que o titnio, submetido mesma metodologia experimental apresentou um comportamento significativamente diferente.
2. Titnio Os resultados obtidos neste trabalho comprovam que o titnio comercialmente puro um material que, por apresentar boas propriedades mecnicas e ter capacidade de osseointegrao, pode ser amplamente utilizado como material implantolgico. A formao de um contacto directo com o tecido sseo um facto confirmado por vrios trabalhos experimentais [150, 166], que tm validado o conceito de osseointegrao, introduzido por Brnemark h quase trinta anos [31, 41]. Existe alguma controvrsia quanto ao tempo necessrio para a obteno da integrao dos implantes de titnio no osso cortical dos coelhos. Os nossos resultados indicam que este fenmeno ocorrer entre as 4 e as 10 semanas, aps a implantao dos pinos de titnio e so confirmados por outros trabalhos onde indicada a sexta semana como sendo o perodo onde se verifica o processo de osseointegrao [148,167], emborajansen e col. [166] refiram ter observado este fenmeno duas semanas aps a colocao de implantes de titnio na tbia do Coelho. Verificamos tambm que as reaces na interface do osso com os implantes de titnio no so condicionadas apenas pelas propriedades intrnsecas do material, mas tambm por factores que incluem a tcnica cirrgica e as tenses a que o implante submetido imediatamente aps a sua colocao. No foi dada muita relevncia neste trabalho influncia do tipo de superfcie dos implantes, devido ao processo de maquinagem dos pinos de titnio ter sido idntico ao adoptado para os de ao inox. Por esta razo as irregularidades superficiais dos dois materiais no podero ser justificativas dos distintos comportamentos biolgicos verificados. De forma geral, os pinos de titnio mostraram boa biocompatibilidade, estabelecendo uma percentagem significativa de contacto directo com o tecido sseo, sem interposio de qualquer camada de tecido fibroso. Observou-se a deposio de tecido sseo imaturo, numa camada prxima da zona da interface, contactando directamente com grande parte da superfcie dos 171
implantes. Esta camada de formao/remodelao ssea diminuiu de espessura com o decorrer do ensaio, aumentando, simultaneamente, o seu grau de mineralizao e de diferenciao estrutural. As amostras com 10 semanas, analisadas por microanlise de raios X (EDS), permitiram obter um valor de cerca de 1,89 para a relao Ca/P, existente em alguns pontos do tecido sseo neoformado, correspondendo deposio de um contedo mineral superior ao do tecido sseo que de 1,67. Este valor elevado tem que ser avaliado, tendo em conta a metodologia utilizada [230]. No entanto, a obteno destes valores confirma, pelo menos, o facto de se tratar de um tecido sseo mineralizado, depositado na zona envolvente dos implantes de titnio. O conjunto das observaes histolgicas realizadas, confirma o conceito de osseointegrao do titnio comercialmente puro [12, 31, 32, 41, 42]. O contacto directo da superfcie dos implantes com o tecido sseo neoformado foi observado por microscopia ptica e confirmado, em maiores ampliaes, em microscopia electrnica de varrimento. As observaes numa resoluo superior (Fig.75), atravs da microscopia electrnica de varrimento, permitiram confirmar claramente a adeso do tecido sseo superfcie destes implantes para alm de um simples contacto fsico [167]. Contrariamente ao que se verificou nas amostras de ao inox (Fig. 67 e 68), a fora de adeso entre as estruturas da interface suficientemente forte para resistir s tenses provocadas pelo vcuo do microscpio electrnico de varrimento. Este facto permitiu concluir que a unio entre os implantes e os tecidos envolventes mais forte do que a ligao entre as estruturas da matriz do tecido neoformado, demonstrando boa integrao do material no tecido sseo. O mesmo tipo de comportamento no referenciado para a liga de titnio T6A14V. Nesta liga foi observada a deposio, em muitas zonas da interface, de uma membrana fina de tecido fibroso, existindo poucos locais onde houve deposio ssea directamente na superfcie dos implantes, 4 semanas aps a sua colocao no fmur de Co [73]. A caracterizao ultraestrutural da interface dos implantes de titnio com o tecido sseo, apresentou algumas limitaes neste trabalho, pelo que no foram identificadas as estruturas referenciadas em outros estudos, realizados in vitro [254] e in vivo [116]. De facto, no foi possvel confirmar a existncia de qualquer camada ultraestrutural, entre a superfcie do titnio e os tecidos envolventes, com as metodologias de anlise utilizadas.
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Alguns estudos referem a presena de uma zona amorfa, electrodensa, com alguns nanmetros de espessura, depositada directamente na superfcie do material pela matriz extracelular das clulas osteoblsticas [ 116, 254]. Esta camada constituda por aglomerados de fosfatos de clcio e substncias proteicas que funcionam como uma substncia cimentante que promove a unio tecidular superfcie do material. A formao deste tipo de interface in vitro, segue um processo semelhante produo, pelos osteoblastos, da linha cimentante, na periferia dos sistemas haversianos [254]. Esta estrutura interpe-se entre a superfcie do titnio e a zona fibrilar, precursora da matriz ssea que possui um alto contedo de fibras de colagnio tipo 1. A tcnica de preparao das amostras no descalcificadas e a resoluo dos equipamentos microscpicos utilizados no nos permitiram atingir estes nveis de anlise. Todavia, confirmmos a adeso directa e firme entre o tecido sseo e a superfcie dos implantes em ampliaes significativas. Mesmo quando os tecidos foram sujeitos a tenses que provocaram o aparecimento de linhas de fractura na matriz neoformada no se perdeu a aderncia superfcie dos implantes. Um fenmeno observado nalgumas amostras foi a neoformao de osso, a partir do endsseo, para a cavidade medular e que envolveu parte significativa da superfcie dos pinos de titnio colocados neste espao anatmico (Figs. 34 e 71). Foram perfeitamente identificadas as pontes sseas que uniram o endsseo ao osso neoformado que rodeava a parte dos implantes localizada na cavidade medular. Esta capacidade osteocondutora dos implantes de titnio, colocados na tbia de coelhos, tambm apontada em trabalhos de outros autores [151, 166]. Porm, e contrariamente ao que afirmado nesses trabalhos, consideramos que a pretensa capacidade osteocondutora do titnio no determinante para o crescimento sseo na cavidade medular. Deve ter-se em considerao que durante o processo de trepanao do osso cortical at cavidade medular, para a realizao dos orifcios onde so colocados os implantes, se libertam pequenos fragmentos de osso que se depositam na cavidade medular, podendo, potencialmente, funcionar como ncleos indutores do crescimento sseo. Esta hiptese fundamenta-se, tambm, nos resultados de vrios estudos que referem a necessidade dos implantes de titnio se encontrarem bem adaptados s paredes sseas para haver neoformao ssea em contacto directo com o material [56, 61, 209]. A deteco de vestgios de titnio nos tecidos neoformados na camada circundante dos implantes foi uma observao que levantou algumas ques173
toes, por no existir inicialmente uma explicao plausvel para este facto. A consulta de alguns trabalhos publicados foi fundamental para esclarecer os mecanismos possivelmente implicados neste processo de deposio do titnio nos tecidos envolventes dos implantes [65, 82, 169, 209, 255-257]. Embora no tenham sido determinados os valores absolutos da quantidade de titnio presente nos tecidos, identificmos vestgios da sua presena atravs da microanlise por raios X (EDS). A presena de vestgios de titnio distribuiu-se por uma camada com cerca de 200 a 250 pm de espessura, correspondente ao tecido sseo neoformado, entre o osso cortical antigo e a superfcie dos pinos. Inicialmente, foi atribuda a origem deste elemento a uma possvel contaminao, por disperso de fragmentos do material para os tecidos envolventes, durante o processo de preparao das amostras. A confirmao da presena localizada do titnio, em vrias amostras, na camada tecidular neoformada e no no tecido sseo cortical antigo, aliada ao facto de alguns pontos de determinao estarem prximos do tecido sseo cortical, permitiu avanar com a hiptese de que existiu uma deposio preferencial no tecido sseo neoformado. Este fenmeno poder ser originado por um processo de difuso a partir dos implantes de titnio [65, 82, 169, 209, 257). A presena de vestgios de titnio na camada de tecido neoformado foi identificada prximo da interface, em pontos distando entre 10 e 200 pm da superfcie dos implantes. A interpretao destes resultados no pode excluir a importncia da localizao dos pontos analisados. No caso do ponto analisado se localizar muito prximo da superfcie do implante, a menos de 1 pm, poder levar a que ocorram fenmenos de interferncia no espectro recolhido, por fenmenos de vizinhana do material [230], conforme se pode inferir atravs da interpretao da figura 2. A resoluo em profundidade e lateralidade um factor essencial na avaliao da informao obtida por medidas pontuais, atravs das sondas de EDS. A resoluo lateral determinada pela extenso do volume de interaco do feixe de electres com as amostras, estando condicionada pela energia do feixe de electres, pelo nmero atmico da amostra e pela excitao e emisso das radiaes teis [230]. Desta forma, deve ter-se particular ateno aos pontos de medio, pois se se encontrarem prximos das superfcies dos materiais (cerca de 1 pm) podem induzir interferncias significativas no espectro recolhido. O traado obtido num ponto prximo da zona de separao entre o osso cortical e o osso neoformado, que dista cerca de 180 a 200 pm da superfcie
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do implante (Fig. 77), confirma a presena de vestgios de titnio. A hiptese de se tratar de uma interferncia a partir do material est afastada, atendendo distncia a que o ponto analisado se encontra da superfcie do implante, que superior distncia mxima que a resoluo lateral do feixe de electres pode atingir [230]. No se confirmando a presena do titnio no osso cortical (Fig. 78), num ponto analisado a cerca de 300 u,m da superfcie do implante, ser de concluir que a presena destes vestgios de titnio, no osso neoformado na zona da interface, se deve a um fenmeno de difuso para os tecidos envolventes, por dissoluo a partir dos implantes de titnio, tal como referido por outros autores [65, 82, 169, 209, 257]. Estas observaes tambm foram confirmadas noutras amostras com 10 semanas de implantao, na mesma camada tecidular, com uma espessura variando entre os 150 a 250 u.m. Nas amostras com 4 semanas de implantao, utilizando a mesma metodologia de microanlise, no foram detectados vestgios de titnio, a no ser em pontos muito prximos da superfcie dos implantes. Neste caso, a presena destes vestgios foi atribuda a interferncias do material, devido grande proximidade dos locais de determinao e a superfcie dos implantes (< 1 |im). Uma interpretao semelhante para este fenmeno de deposio de titnio na camada de tecidos neoformados avanada por alguns investigadores que verificaram ser limitado este fenmeno s amostras que continham implantes de titnio sem revestimento. Nos implantes de titnio revestidos com uma camada de hidroxiapatite no se detectou a presena de titnio. Por isso, concluram que sendo o ncleo de ambos os implantes constitudo por titnio, era pouco provvel que a disperso dos fragmentos se devesse ao processo de preparao das amostras, funcionando antes a camada de hidroxiapatite como uma barreira inibidora da libertao dos ies metlicos [209]. Tambm est confirmado que o tecido sseo pode servir como um local privilegiado de deposio e armazenamento dos ies de titnio [257]. O contedo normal deste elemento nos tecidos orgnicos de 50 ppm, sendo frequente a deteco de valores de 100 a 300 ppm nos tecidos moles que envolvem os implantes, produzindo uma ligeira alterao da colorao destes tecidos [82]. Segundo Bianco ecol. [169], a presena de ies de titnio foi detectada a uma distncia de 100 \im da interface na matriz do tecido sseo em quantidades superiores a 100 ppm, e de 300 a 600 ppm nos ostecitos. Os canais de Havers, localizados a 85 u,m da superfcie do implante, continham mais de 1600 ppm destes ies.
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De realar que este trabalho alm de relatar a deposio de titnio nos tecidos envolventes do local de implantao, quantificou e correlacionou os valores obtidos com o tempo de implantao, utilizando um modelo experimental semelhante ao do nosso ensaio. Assim poderemos estabelecer possveis correlaes com os resultados apresentados no nosso trabalho, embora se saliente o facto de no ter sido possvel quantificar os valores de titnio, devido a limitaes da metodologia de anlise. Em face do conjunto de elementos apresentados, podemos concluir que existe uma deposio de ies de titnio nos tecidos envolventes do local de implantao, atravs de um processo de dissoluo passiva do titnio. Os valores desta deposio so incrementados com a existncia de tenses, micromovimentos e irregularidades na superfcie dos implantes [169]. A percentagem de contacto directo entre o osso e a superfcie dos implantes de titnio - ndice de afinidade - foi respectivamente, de 24,79+ 8,01 % para as amostras com 4 semanas e de 43,01 10,04% para as amostras com 10 semanas (tabela 4.3). Estes resultados incluem-se dentro da faixa de valores apresentados noutros estudos [102, 150, 168]. Refira-se que so significativamente superiores aos obtidos para as amostras de ao inox (p<0,05; teste de Wilcoxon), mas significativamente inferiores aos valores obtidos para os materiais cermicos, Osteopatite e Cimento de Vidro Bioactivo (p<0,05; teste de Wilcoxon) (Fig. 101). O aumento de 73,8% na percentagem de contacto directo com o tecido sseo, entre as 4 e as 10 semanas, pode ser explicado pelo facto do processo de osseointegrao dos implantes de titnio implantados no osso de coelhos apenas poder ser considerado completo a partir da sexta semana [148,167]. Os bons resultados obtidos neste trabalho, no que respeita ao comportamento do tecido sseo aps a implantao dos pinos de titnio, com a ocorrncia da integrao ssea deste biomaterial ao fim de algumas semanas, confirmam o sucesso em estudos clnicos de mdio e longo prazo [12, 13, 32]. Apesar da libertao de ies para os tecidos envolventes, da necessidade de adaptao perfeita e firme ao leito sseo e das limitaes destes implantes no osso de tipo IV, justifica-se a utilizao clnica, em vrias especialidades mdicas, de implantes de titnio comercialmente puro. Comparativamente com os pinos de ao inox, verificmos a inexistncia de uma camada de tecido fibroso interposta na zona da interface com o titnio; antes pelo contrrio, verificou-se uma significativa integrao destes implantes no tecido sseo. As foras de adeso dos tecidos neoformados superfcie dos implantes foram suficientemente fortes para resistir s ten176
soes induzidas por algumas formas de observao microscpica, inversamente ao que ocorreu com as amostras de ao inox, onde a formao de uma fenda ntida foi constantemente observada. A hidroxiapatite um biomaterial com reconhecidas propriedades de adeso ao tecido sseo, estando indicada no recobrimento dos implantes metlicos, provocando uma melhoria significativa na quantidade e rapidez da regenerao ssea [168] alm de prevenir a libertao dos ies de titnio para os tecidos envolventes [209]. Como seguidamente discutiremos, a Osteopatite rene as condies necessrias para poder ser utilizada com este objectivo.
3. Osteopatite A Osteopatite uma hidroxiapatite modificada que apresenta uma composio qumica semelhante do tecido sseo (Fig. 18). A modificao qumica, com a introduo de ies comuns ao tecido sseo vivo, permite que este material se comporte de forma semelhante aos enxertos do tecido sseo sem componente orgnica [9]. Todavia, os grnulos possuem uma estrutura microporosa (Figs. 20 e 21) e um grau de degradao insignificante, comparativamente com outras hidroxiapatites que simulam no s a composio qumica como a estrutura porosa do tecido sseo [19]. As trocas inicas entre os grnulos de Osteopatite e os fluidos orgnicos tm um papel importante na fase inicial, imediata, aps a implantao, conforme se pode concluir a partir da tabela 4.1. Contudo, a Osteopatite no sofre fenmenos de degradao significativos nem reabsorvida [258], porque a velocidade de dissoluo comea a baixar rapidamente aps ser colocada em contacto com os fluidos orgnicos [225]. No entanto, as mudanas do meio fisiolgico envolvente, induzidas pelas trocas inicas que este material produz quer pelo fornecimento de ies necessrios ao processo de osteognese quer pela alcalinizao do pH, funcionam como um catalizador do crescimento e maturao do tecido sseo neoformado [225]. Outro aspecto de grande relevncia, quando se utiliza hidroxiapatite na forma de grnulos para o preenchimento de defeitos sseos, o das dimenses mdias dos grnulos. Para a seleco do tamanho mdio dos grnulos de Osteopatite, entre -20 e +100 mesh (ASTM), foram tidos em considerao os resultados obtidos em estudos anteriores, onde demonstrado que a dimenso dos grnulos condiciona o comportamento celular [34, 231]. No
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caso das dimenses serem muito baixas, inferiores a 100 mesh (ASTM), as partculas so largamente fagocitadas pelos macrfagos da cavidade peritoneal do murganho [231]. Clinicamente, na biopsia de um tecido onde foram colocadas partculas de pequenas dimenses de hidroxiapatite, foi observada a presena de tecido fibroso envolvendo as partculas que no foram destrudas por processos de fagocitose, trs anos aps a sua colocao para preenchimento de um defeito sseo [34]. Os resultados obtidos neste estudo permitiram caracterizar dinamicamente a formao de uma adeso mecnica e qumica entre o tecido sseo e a superfcie dos grnulos da Osteopatite. Comprovou-se, assim, o bom comportamento do tecido sseo aps a implantao de grnulos deste material, quando so respeitadas as dimenses recomendadas (-20/+100 mesh), o que confirma os bons resultados de outros trabalhos experimentais [8,226,258,259]. Nas amostras com 4 semanas, identificmos uma fase osteognica precoce, junto da interface. O osso cresceu entre os espaos existentes entre os grnulos, contactando e envolvendo as suas superfcies. A matriz ssea imatura e pouco mineralizada contactou a superfcie do material, prolongando-se para o interior das porosidades externas, atravs de fibras de colagnio precursoras da osteognese (Figs. 82 e 83). Esta camada menos mineralizada, localizada na interface, referida por outros autores [3, 183]. A ancoragem das fibras de colagnio superfcie da hidroxiapatite, atravs de foras de adeso elevadas, foi observada em alguns estudos e demonstrativa do seu alto grau de biocompatibilidade com as fibras colagnicas [209]. Este fenmeno de adeso firme das fibras do colagnio foi observado nas amostras com 4 semanas, aps a implantao de grnulos de Osteopatite, verificando-se a penetrao das fibras de colagnio nas porosidades e a sua adeso s partculas dos grnulos, numa fase inicial da neoformao ssea. Nas amostras com 10 semanas de implantao, o tecido sseo neoformado na interface apresentou um grau de maturao mais evoludo, contactando directamente a superfcie dos grnulos. Verificmos, tambm, a penetrao nas porosidades superficiais, preenchendo totalmente os espaos entre as partculas, numa profundidade de alguns micra, sendo a penetrao de tecido sseo nas porosidades da hidroxiapatite tambm apontada por outros autores [22] e confirmada no nosso trabalho, tendo os espaos entre os grnulos sido totalmente preenchidos por tecido sseo neoformado, nas amostras com este tempo de implantao.
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Nas nossas observaes, com os meios de estudo utilizados, no foi possvel identificar qualquer tipo de lmina electrodensa interposta entre o material e o tecido sseo, que referida por alguns autores [156]. Possivelmente, tal facto deve-se sobreposio da camada de tecido sseo neoformado, que esconde totalmente esta estrutura [182]. A hiptese da hidroxiapatite, em contacto com os fluidos biolgicos, sofrer uma solubilizao parcial, dando origem a uma camada superficial orgnica [183], no foi claramente confirmada no presente trabalho, embora a obteno de valores da relao Ca/P superiores na zona da interface, comparativamente com o valor da hidroxiapatite-padro e do osso (1,67), possa ser um indicador de uma camada rica em apatite (Fig. 89). Estes resultados tambm tm sido referidos por outros autores [92, 209]. Confirmou-se, assim, a deposio, por precipitao, de cristais de fosfato de clcio no tecido sseo neoformado junto da superfcie deste material. Alguns autores sugerem que o osso depositado na zona da interface com a hidroxiapatite se enriquece com ies carbonatados, produzindo cristais de hidroxiapatite rica em carbonato. Esta variao do contedo de C0 3 atinge valores da relao Ca/P superiores aos da hidroxiapatite pura [92]. Outro facto comprovativo da grande capacidade de induo da formao de uma camada superficial de apatite, rica em clcio e fosfatos, foram os resultados obtidos num estudo in vitro [260], onde amostras deste material foram imersas numa soluo acelular com uma composio inica semelhante dos fluidos plasmticos. A Osteopatite apresentou valores de bioactividade mais elevados, quando comparada com uma hidroxiapatite-padro, quer na espessura da camada de apatite depositada quer na rapidez com que essa camada se formou [260]. Um aspecto tambm observado nas amostras com grnulos de Osteopatite foi a identificao de ostecitos na proximidade da zona da interface, demonstrando a proximidade destas clulas com a superfcie do material, isto , a sua integrao perfeita no tecido sseo, fenmeno este que tambm referido por outros autores [156, 183], destacando-se as imagens de microscopia electrnica de transmisso de Bruijn e col. [156], que mostram a orientao dos prolongamentos citoplasmticos dos ostecitos em direco superfcie da hidroxiapatite. Ainda que utilizando meios de observao mais limitados - microscopia ptica - foi possvel confirmar este fenmeno de proximidade dos ostecitos e dos seus prolongamentos citoplasmticos em direco superfcie dos grnulos de Osteopatite, em grandes ampliaes (400X), de vrias amostras (Figs. 44, 47 e 48). 179
A partir da anlise das imagens obtidas por microscopia de fluorescncia pode especular-se que a mineralizao do osso depositado entre os grnulos sofre duas frentes de mineralizao; uma prximo da superfcie do osso cortical antigo e outra na proximidade da superfcie do material. O facto das zonas de maior actividade metablica se localizarem nos espaos intermdios e prximo das zonas vascularizadas, com colorao mais intensa, comparativamente com o tecido sseo cortical e com o osso neoformado na proximidade dos grnulos, pode ser indicativo deste fenmeno, que tem sido referido na literatura [183, 189]. 0 crescimento de tecido sseo, na forma trabecular, a partir das margens do defeito sseo, em direco aos grnulos, outro factor indicador da capacidade osteocondutora deste material. Estes estudos reforam os resultados obtidos atravs da microanlise por raios X do osso neoformado, na zona da interface, comparativamente com os valores calculados para a Osteopatite e para o osso cortical, respectivamente de 1,82 0,8 e 1,70+ 0,5 (Fig. 90). Contudo, preciso sublinhar, mais uma vez, que a variao e os desvios inerentes a este tipo de quantificao apresentam valores significativos, o que representa uma limitao sria validade destes resultados que, no obstante, confirmam as indicaes deste material quer na preveno da reabsoro do osso alveolar aps a extraco dentria [8, 9, 226] quer no preenchimento de defeitos sseos [225]. Alguns estudos experimentais onde foram utilizados grnulos de Osteopatite no preenchimento de defeitos sseos criados no osso tibial de Coelho, na forma isolada [258] ou com veculos de estabilizao [9, 87, 226, 259], confirmam os bons resultados obtidos neste ensaio experimental. Comparativamente com a hidroxiapatite-padro, adquirida comercialmente, a Osteopatite demonstrou sempre um melhor comportamento [258]. Nalguns trabalhos foi utilizado um veculo de fixao dos grnulos, para obstar sua desintegrao e perda, a partir do defeito sseo. A utilizao de gesso de Paris, como matriz aglutinadora dos grnulos, contribuiu para uma melhor adaptao cavidade ssea. O gesso rapidamente reabsorvido e substitudo por tecido sseo neoformado, que rodeia e envolve os grnulos, preenchendo os espaos entre eles e, consequentemente, dificultando a sua libertao a partir defeito sseo, mesmo quando sujeitos a ligeiras foras mastigatrias [9, 226, 259]. A utilizao de membranas de PTFE, como forma de reteno dos grnulos no defeito sseo, demonstrou grandes potencialidades e bons resultados, que podero ser extrapolados para situaes clnicas onde exista a necessidade de preenchimento de defeitos sseos, com localizao susceptvel
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de existirem perdas dos grnulos por exposio directa ao meio oral, ou por se encontrarem expostos s foras mastigatrias [87]. Os bons resultados clnicos obtidos com a utilizao de vrios tipos de hidroxiapatites, indicam este tipo de material para aplicaes clnicas diversificadas. O preenchimento de defeitos sseos [22, 72], a preveno da reabsoro alveolar aps extraco dentria [8, 9], o aumento do rebordo sseo e o revestimento de implantes metlicos [60, 189], tm sido alguns dos campos onde o grupo das hidroxiapatites preferencialmente usado. Os valores da percentagem de contacto directo da Osteopatite com o tecido sseo (tabela 4.3) foram bastante semelhantes aos apresentados pelo cimento de vidro bioactivo, no existindo diferenas estatisticamente significativas (p<0,05; teste de Wilcoxon). De facto, o comportamento do tecido sseo aps a implantao destes dois biomateriais cermicos foi bastante similar no que respeita aos valores do ndice de afinidade e podem estabelecer-se mesmo algumas semelhanas no tipo de adeso do tecido sseo aos dois materiais, com a formao de uma camada de apatite na zona da interface. No entanto, conforme se ir discutir seguidamente, os dois materiais so bastante distintos, bem como as suas indicaes clnicas.
4. Cimento de Vidro Bioactivo A observao das amostras de cimento de vidro bioactivo mostrou que este material induz uma boa resposta do tecido sseo, promovendo a deposio e crescimento deste tecido na sua superfcie e formando uma unio firme na interface. Esta adeso resulta da reabsoro parcial da matriz superficial do cimento sendo substituda por tecido sseo neoformado. Entre as 4 e as 10 semanas, verificou-se um maior crescimento do tecido sseo e uma evoluo do grau de maturao e diferenciao deste tecido. A formao e crescimento do tecido sseo foi maior na zona da interface, a nvel da parte central do osso cortical. Observou-se, tambm, o desenvolvimento de uma camada superficial, de osso mais trabecular, a partir do peristeo, recobrindo a face externa do material, nas amostras com 4 semanas de implantao (Figs. 49, 50, 60 e 91). Nas amostras com 10 semanas, verificmos um aumento significativo do crescimento de tecido sseo, que contactava directamente toda a superfcie do material, envolvendo a totalidade do seu permetro (Fig. 53). O tecido neoformado apresentou um grau de diferenciao e maturao mais desen181
volvido, tornando extremamente difcil a sua distino do osso cortical antigo (Figs. 54 e 55). Dos resultados obtidos neste estudo confirma-se que os mecanismos de adeso ao tecido sseo dos vidros bioactivos e dos vidros cermicos so diferentes. Tal como este cimento, os vidros bioactivos formam na sua superfcie uma camada rica em slica que tem a capacidade de induzir a precipitao do fosfato de clcio, formando-se a apatite por nucleao [172]. Inversamente, alguns vidros cermicos no formam esta camada rica em slica, mas apresentam a capacidade de produzir a camada de apatite necessria para a sua ligao ao tecido sseo. A formao desta camada rica em slica est dependente da composio qumica dos materiais, alm de que a rapidez da sua formao depende da estabilidade da rede dos vidros bioactivos que est condicionada pelo contedo de Si02. Sabe-se que se este xido estiver presente numa percentagem superior a 60%, no se forma esta camada de apatite [158, 221], fundamental para a ligao do material ao tecido sseo [75, 164, 183,218,220]. De facto, a possibilidade destes materiais formarem uma unio forte com o tecido sseo est dependente da formao desta camada de apatite, como consequncia da interaco entre a superfcie do material e os fluidos orgnicos. A capacidade de induzir a formao de uma camada rica em apatite foi demonstrada neste estudo, atravs da microanlise por raios X (EDS) da camada superficial do cimento (Fig. 99). Este fenmeno e os mecanismos que intervm neste processo podem ser compreendidos pelo estudo do comportamento do cimento, aps imerso em diferentes solues [227, 229]. A actividade qumica deste cimento pode ser avaliada pelos produtos de reaco com a soluo de fosfatos de amnia. As mudanas estruturais da superfcie do material e o aumento do pH dos fluidos envolventes podem ser explicadas pela libertao gradual de amnia e pela precipitao de clcio. O tipo e a cintica destas reaces dependem da composio da soluo onde o material colocado. Verificou-se um comportamento distinto quando o material foi colocado em gua desionizada, soro fisiolgico e em plasma sinttico [227, 229]. Quando o clcio est presente na soluo em que o material imerso, como no caso dos fluidos orgnicos ou no plasma sinttico, observa-se um aumento muito significativo da rapidez de deposio da camada de apatite. Comparativamente com a imerso em gua e soro fisiolgico, quando o material imerso em plasma sinttico o aumento da deposio do clcio na
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superfcie do cimento 40% mais rpida. Este fenmeno devido ao facto de que, quando colocado em gua e em soro fisiolgico, o clcio provm do prprio material, o que reduz em cerca de metade a sua velocidade de deposio [227]. A deposio de fsforo est dependente da presena de clcio na soluo. Neste caso parece ser libertado numa fase inicial e, ento, reprecipitado. As mudanas na concentrao de Ca e P diminuem a concentrao superficial de Si. A imerso do cimento de vidro bioactivo em gua, soro fisiolgico e plasma sinttico, produz alteraes superficiais diferentes conforme o meio. Na gua e no soro fisiolgico, a superfcie do material torna-se mais lisa pelo desaparecimento das partculas superficiais e podem observar-se alguns orifcios 12 horas aps a imerso. A imerso em plasma sinttico produziu dois efeitos: um similar ao observado em gua e soro fisiolgico, com eroso da superfcie, e outro, que se tornou evidente aps as 12 horas de imerso, com aumento da topografia superficial resultante da precipitao de "cogumelos" de apatite. A microanlise de cortes transversais do cimento demonstraram que a composio do cimento sofreu alteraes progressivas desde a superfcie at ao ncleo do material. Aps 24 horas de imerso em soro fisiolgico e plasma sinttico, a composio qumica num ponto a 50 u.m da superfcie diferia da composio de pontos localizados mais profundamente, a 450 um da superfcie [227]. As alteraes da composio qumica do cimento dependem do tempo de imerso e do tipo de soluo [227, 229]. Estes mecanismos de degradao superficial do cimento foram comprovados nas observaes histolgicas, tendo-se verificado, na generalidade das amostras, logo a partir dos primeiros tempos do ensaio, uma degradao superficial do cimento de vidro bioactivo (Figs. 51 e 52). Este fenmeno evidenciado pelas caractersticas diferentes da camada externa do cimento, sendo notria uma linha de separao entre estas duas estruturas do material, observada em microscopia ptica. Confirmando as alteraes estruturais verificadas a este nvel, identificou-se o aparecimento de linhas de fractura entre a camada superficial e a parte interna do cimento, nas amostras observadas em microscopia de fluorescncia e electrnica de varrimento (Figs. 60 e 92). Nas observaes histolgicas tambm referenciada a manuteno da estrutura das partculas do vidro original durante o ensaio (Figs. 52, 56 e 94). Apenas nalgumas imagens de maiores ampliaes da camada superficial do
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cimento parece existir uma atenuao da morfologia superficial de algumas das partculas (Fig. 97). A manuteno da estrutura e da composio destas partculas foi tambm confirmada nos ensaios de degradao [227]. A composio qumica dos vidros bioactivos e a formao de uma camada superficial rica em clcio e fsforo, est directamente relacionada com a capacidade de adeso ssea destes materiais [48, 172, 222]. Os factores que contribuem para o aumento da espessura desta camada parecem aumentar os valores de adeso ssea [136]. Sendo a composio e a estrutura desta camada semelhante da apatite do osso [144], pode esperar-se que os osteoblastos possuam as condies preferenciais, na superfcie da camada de apatite, para se desenvolverem. Consequentemente, o tecido sseo envolvente entra em contacto directo com os cermicos de vidro sem a interveno de tecido fibroso. Quando esta situao ocorre, forma-se uma unio qumica forte entre a apatite superficial e a apatite ssea [48]. A interface formada in vitro entre um vidro bioactivo e o colagnio existente na matriz extracelular, produzida por osteoblastos em cultura, um componente crtico do mecanismo de adeso ssea associado implantao de materiais bioactivos [252], De facto, a primeira fase da osteognese na zona da interface pressupe a sntese de colagnio tipo I na matriz ssea orgnica que vai sofrer os posteriores fenmenos de mineralizao e maturao. A adeso inicial entre estas fibras e a camada de apatite superficial dos cimentos de vidros bioactivos um fenmeno crucial no desenvolvimento de uma adeso adequada entre estes materiais e o tecido sseo neoformado. Relativamente a algumas partculas de vidros bioactivos referido um processo de degradao preferencial no centro das partculas, quando estas possuem um tamanho intermdio entre as 300 e 400 um, que explica um tipo de particular de neoformao ssea [261]. Nas porosidades assim criadas, evidenciou-se a existncia de osteoblastos dispostos em camadas, por cima do tecido sseo neoformado. Com o decorrer do tempo, as reaces dos grnulos de vidro na zona de interface resultaram em reentrncias superficiais, que se expandem, tornando-se bolsas de proteco. As clulas osteoprogenitoras aderem a estas bolsas e, posteriormente, diferenciam-se em osteoblastos. No exterior das partculas no existe regulao das clulas indiferenciadas em clulas com fentipo osteoblstico. Estes eventos correspondem formao inicial de tecido sseo. O fenmeno anteriormente descrito no se verificou, no nosso estudo, nas partculas de vidro residuais distribudas na matriz do cimento. Provavel184
mente, este facto deve-se, por um lado, dimenso destas partculas que no ultrapassam os 50 |im (Figs. 21 e 22); por outro lado, a composio do vidro usado para preparar o cimento contm poucos elementos solveis, o que origina a estabilidade das partculas residuais, contrariamente ao fenmeno de degradao sofrida pela matriz, conforme j referido. A interface formada nos vidros bioactivos pode ainda ser classificada como interface de tipo 1 (adeso no colagnica) ou de tipo II (observao de interdigitao directa do colagnio com a superfcie rica em clcio e fsforo) [252]. No que respeita aos cimento de vidro referido que a possibilidade destes materiais formarem uma unio forte com o tecido sseo est dependente da formao de uma camada de apatite na superfcie do material, como consequncia da interaco entre este e os fluidos orgnicos. Os osteoblastos podem rapidamente multiplicar-se e crescer na superfcie desta camada de apatite, que possui caractersticas qumicas e cristalogrficas muito similares s da apatite que constitui o componente inorgnico dos tecidos duros [ 144]. As fibras de colagnio - componentes orgnicos - so incorporadas na camada de apatite formada, estabelecendo pontos de conexo directos entre o osso e o material. Uma outra funo importante desta camada consiste na preveno de posterior dissoluo da superfcie, assegurando a estabilidade do implante [6]. Contrariamente ao que se observou nas amostras de Osteopatite com 4 semanas, no foi possvel identificar qualquer componente colagenoso na zona da interface entre o cimento de vidro bioactivo e o osso formado. Verificmos, antes, a existncia de uma interdigitao da matriz ssea nos espaos entre as partculas superficiais do vidro original, possivelmente devido degradao da matriz superficial do cimento e sua substituio pelo tecido sseo. Tal facto interpretado luz do avanado estado de maturao tecidular. A observao da deposio de fibras de colagnio na interface um fenmeno inicial do processo da osteognese. Se a osteognese se encontrar num estado mais avanado no possvel diferenciar as fibras de colagnio da matriz ssea atravs dos meios de observao utilizados neste trabalho. A necessidade de realizar estudos com tempos curtos de implantao referida por alguns autores [81 ]. Logo aps a implantao dos cermicos de vidro que seria eventualmente possvel observar a deposio de uma camada rica em apatite. Esta camada de apatite forma-se na presena de um fluido biolgico acelular com concentrao inica igual do plasma sanguneo [220-222,262].
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A sua composio inclui cristais pequenos e hidroxiapatite carbonatada com estrutura amorfa. Esta teoria formula a hiptese de que a formao desta camada deve-se a fenmenos dependentes do biomaterial [222]. Os resultados obtidos a partir de culturas celulares e de estudos in v/Vo[81 ] permitem especular que os osteoblastos sintetizam uma matriz extracelular na superfcie dos cermicos de vidro, que engloba uma camada sem colagnio e sofre um processo rpido de mineralizao. Os mecanismos de adeso ao tecido sseo dos vidros bioactivos e dos vidros cermicos so diferentes. Enquanto os vidros bioactivos formam uma camada rica em slica na superfcie, que tem a capacidade de atrair os ies de clcio e fsforo e induzir a formao de apatite por nucleao [172], alguns dos vidros cermicos no formam esta camada rica em slica, embora apresentem a capacidade de produzir uma camada de apatite. Os resultados deste trabalho confirmam estes mecanismos de adeso ao tecido sseo com a presena de uma camada de rica em apatite, de que o traado apresentado na figura 99, obtido atravs de microanlise por EDS da zona da interface, um exemplo. Durante a observao histolgica atravs dos vrios tipos de microscopia, foi detectada a formao de linhas de factura ou fissuras na camada superficial do cimento. Este fenmeno referido por alguns autores [7, 159], justificando o seu aparecimento como resultado da contraco exercida pela formao da camada superficial rica em clcio e fsforo. O facto desta camada superficial se manter firmemente unida ao tecido sseo neoformado permite pensar que a fora de ligao entre este tecido e a referida camada superior fora de coeso entre a camada de degradao superficial e o ncleo interno do material. A microanlise por raios X, realizada na zona da interface do cimento de vidro bioactivo com o tecido sseo, no evidenciou a presena de silcio. Contudo, verificmos a presena de uma camada rica em clcio e fsforo, o que confirma as observaes feitas por outros autores sobre a formao de uma camada superficial de apatite [7, 159, 172, 262]. A slica presente nos cermicos de vidro bioactivos gradualmente reabsorvida, aps se transformar num gel de slica, por um processo de dissoluo [262]. Tambm referido um fenmeno semelhante de reabsoro do sdio presente em alguns destes materiais [7], Nas nossas amostras, este mecanismo justifica a ausncia de deteco destes ies na zona da interface do cimento com o tecido sseo neoformado, embora continue presente nas par186
tes no degradadas do cimento. Este fenmeno tambm foi observado nos ensaios de degradao do material [227]. Os resultados obtidos no nosso estudo no permitem estabelecer comparaes sobre a velocidade de adeso ao tecido sseo entre o cimento de vidro bioactivo e os vidros bioactivos mais conhecidos. Todavia, possvel afirmar que no se verificou um desempenho inferior ao apresentado pela Osteopatite. A percentagem de contacto directo deste material com o tecido sseo apresenta valores significativos ao fim das 4 semanas de ensaio e um incremento de 27,2% nos valores obtidos entre as 4 e as 10 semanas. Relativamente sequncia da deposio do tecido sseo na superfcie do material, os resultados obtidos nas observaes realizadas por microscopia de fluorescncia permitem avanar com a hiptese de que o tecido sseo se deposita mais precocemente na zona da interface cortical, relativamente ao osso formado a partir do peristeo. Esta concluso retirada do facto de o tecido que cresce a partir do peristeo apresentar um menor grau de maturao, na fase inicial, e possuir uma fluorescncia mais intensa, quando comparado com o osso cortical antigo e o osso depositado na zona da interface (fig. 60). A percentagem de contacto directo do cimento de vidro bioactivo com o tecido sseo bastante elevada, respectivamente de 70,7 14,2% para as 4 semanas e 89,9+ 10,4% para as 10 semanas aps implantao. O tratamento estatstico revelou existirem diferenas estatisticamente significativas com os materiais metlicos (p<0,005; teste de Wilcoxon), e no significativas com a Osteopatite para ambos os tempos de implantao. Finalmente, um dos aspectos que tambm gostaramos de referir o a facilidade de manipulao do material e sua colocao nos defeitos sseos. Possuindo uma boa plasticidade e um tempo de presa que pode ser modificado em funo da alterao da relao entre a quantidade de p e da soluo lquida, usadas na preparao da pasta, bem como a facilidade de uma adaptao perfeita cavidade ssea, devido sua forma de pasta, o cimento torna-se um material de fcil aplicao clnica. Este aspecto conjuntamente com o excelente comportamento biolgico indicam a sua utilizao num nmero considervel de situaes clnicas. Para melhor se compreenderem as diferenas de comportamento evidenciadas pelos quatro materiais utilizados neste estudo experimental apresentada uma sntese na tabela 5.1, onde so apresentadas as diferenas e semelhanas entre eles bem como os mecanismos de adeso ao tecido sseo.
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VI CONCLUSES
Os resultados obtidos neste estudo permitiram obter as seguintes concluses: 1. O modelo animal utilizado permite distinguir os diversos biomateriais do ponto de vista da sua ligao ao tecido sseo. Os resultados obtidos com este modelo experimental so concordantes com o comportamento clnico de trs dos biomateriais utilizados, ao inox, titnio e Osteopatite. 2. No caso dos implantes metlicos, a formao/remodelao do tecido sseo parece ser favorecida por uma tcnica cirrgica minuciosa e cuidadosa. 3. A preparao histolgica realizada permitiu obter amostras que podem ser estudadas com vrios tipos de microscopia. 4. A microscopia ptica permitiu no s estudar qualitativamente, o crescimento e maturao do tecido sseo que envolve os biomateriais, como tambm identificar o contacto fsico entre o tecido sseo regenerado e a superfcie dos biomateriais. 5. A microscopia de fluorescncia contribuiu para a identificao dos locais de maior actividade de formao/remodelao ssea. 6. A microscopia electrnica de varrimento revelou-se um mtodo til para o estudo qualitativo da resposta do tecido sseo, permitindo obter indicaes sobre o tipo de contacto estabelecido entre os tecidos e a superfcie dos biomateriais. A identificao da composio qumica elementar, de pontos seleccionados nas amostras, atravs da microanlise por raios X (EDS), simultaneamente com a sua observao por MEV, um auxiliar precioso na caracterizao das vrias estruturas. 7. Atravs da histomorfometria, foi possvel calcular o ndice de afinidade entre o osso e os biomateriais, que mostrou ser um elemento quantitati189
vo muito importante para a determinao da sua integrao no tecido sseo. A utilizao de imagens obtidas por electres retrodifundidos (microscopia electrnica de varrimento) garantiu uma maior preciso na identificao do tecido sseo mineralizado em contacto com a superfcie dos biomateriais. 8. O ao inox um material com indicao clnica muito limitada, face sua fraca biocompatibilidade e ao comportamento do tecido sseo aps a sua implantao. A ausncia de contacto directo com o tecido sseo, um dos factores que condiciona a sua utilizao clnica. 9. O titnio um material com boas propriedades mecnicas e com bom comportamento biolgico, o que o torna um material de indicao obrigatria em vrias situaes clnicas, de que os implantes dentrios so um exemplo. Realamos o facto de termos identificado vestgios comprovativos de fenmenos de difuso e acumulao de ies deste material nos tecidos envolventes ao local de implantao. 10. A Osteopatite um material cermico bioactivo que promove o crescimento do tecido sseo, aderindo firmemente a este tecido. um material com grande potencial de utilizao clnica no preenchimento de defeitos do tecido sseo e na preveno da reabsoro do osso alveolar. Face aos resultados obtidos, pode colocar-se a hiptese de que implantes metlicos revestidos com Ostepatite possam constituir uma soluo alternativa para casos em que o tecido sseo seja de fraca qualidade ou em que a adaptao parede ssea no seja a ideal. 11.0 cimento de vidro bioactivo demonstrou um bom comportamento biolgico. Possui uma manipulao fcil e propriedades fsico-qumicas que o indicam no preenchimento de defeitos do tecido sseo de diversas etiologias. 12. Face ao comportamento demonstrado pelos biomateriais cermicos no ensaio realizado, podemos consider-los com alto potencial de utilizao clnica. 13. Para se poder confirmar o excelente comportamento destes biomateriais, sero necessrios estudos de longo prazo em animais, e ensaios controlados em humanos.
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Captulo VI - Concluses
Sugestes para futuras linhas de investigao: O estudo dos biomateriais um campo de compromissos, j que basta alterar uma das suas propriedades para ocorrerem muitas alteraes no seu comportamento. O mbito de uma tese de doutoramento no se esgota na obteno de resultados, sua discusso e concluses finais. A experincia e conhecimentos acumulados durante o estudo e a realizao dos ensaios, bem como os aspectos que gostaramos de esclarecer com mais profundidade, permite projectar e definir linhas de investigaes futuras. A caracterizao das superfcies dos biomateriais e a sua influncia na energia livre superficial e na adsoro proteica uma rea de grande interesse na investigao bsica do comportamento biolgico dos biomateriais e dos factores que o condicionam. A utilizao de culturas celulares, tendo sido uma rea onde realizamos alguns ensaios que no foram includos nesta tese, representa um mtodo acessvel e vlido no estudo da biocompatibilidade e na compreenso dos fenmenos que ocorrem entre as clulas/tecidos e os biomateriais. Permite, ainda, estudar as microestruturas formadas na interface, entre a superfcie dos biomateriais e a matriz extracelular, produzida pelas clulas osteoblsticas, e o estudo de factores isolados na formao dessa interface. Relativamente aos estudos histolgicos, tendo implementado no nosso laboratrio uma tcnica de preparao de tecidos duros no descalcificados, gostaramos de melhorar as tcnicas de colorao, com a utilizao de tcnicas histoqumicas de identificao/quantificao de clulas e tecidos na zona da interface. No que respeita microscopia de fluorescncia, quando utilizados diversos marcadores, uma metodologia muito til no estudo e quantificao da remodelao ssea volta dos implantes. A microscopia electrnica de varrimento permite a obteno de imagens fundamentais para a interpretao do contacto fsico e da adeso qumica do osso ao implante. A explorao de tcnicas de preparao diferentes das utilizadas neste trabalho, a criofractura e o desenvolvimento de mtodos especficos de desidratao para tecidos vivos, sero muito importantes para o avano dos conhecimentos sobre os mecanismos de interaco dos biomateriais com os tecidos envolventes.
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Para o estudo ultraestrutural das clulas e tecidos, o recurso microscopia electrnica de transmisso um mtodo valioso. O investimento no desenvolvimento de tcnicas de preparao e anlise para este tipo de microscopia , portanto, um caminho fundamental a seguir para a compreenso dos fenmenos e mecanismos ultraestruturais que ocorrem na interface entre os implantes e os tecidos envolventes. O ensaio em condies prximas da utilizao final dos biomateriais em seres humanos, estando condicionado por aspectos ticos e legais difceis de ultrapassar, quando os meios so limitados, representa, no entanto, o culminar do desenvolvimento e do estudo do comportamento biolgico de um biomaterial que um clnico gostaria de realizar. A aplicao dos biomateriais associados a clulas sseas desenvolvidas em cultura e/ou a de factores de crescimento sseo, parecem ser uma via altamente interessante na investigao e desenvolvimento de materiais e tcnicas de substituio ou de reparao de tecidos. Poder, desta forma, aumentar a rapidez da regenerao ssea e potencializar as propriedades de osteoconduo e osteoinduo de alguns biomateriais. Por ltimo, gostaramos de confirmar a deposio de ies de titnio nos tecidos envolventes dos implantes dentrios e determinar a sua quantidade, em diferentes perodos de tempo aps a colocao dos implantes.
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Resumo
0 estudo do comportamento dos biomateriais, utilizando modelos animais, uma das etapas fundamentais do seu desenvolvimento e investigao. A compreenso dos fenmenos e mecanismos que ocorrem aps a colocao de um biomaterial num tecido vivo permite aperfeioar e melhorar as qualidades e propriedades dos materiais com aplicao biomdica. O objectivo deste trabalho foi estudar as interaces entre quatro biomateriais, representativos do conjunto dos materiais mais utilizados em implantologia oral, e o tecido sseo cortical. O modelo experimental utilizado foi o osso tibial das duas patas posteriores de 12 coelhos, onde foram implantados ao inox 316L, titnio, Osteopatite e um cimento de vidro bioactivo, por um perodo de 4 e 10 semanas. O protocolo experimental obedeceu a todas as normas legais vigentes e foram adoptados todos os procedimentos recomendados para este tipo de intervenes. A cirurgia experimental decorreu num centro experimental especfico, com uma equipa cirrgica multidisciplinar e em condies de boa assepsia. Os animais foram sacrificados atravs de overdose anestsica, decorridos os tempos de ensaio estipulados. Aps serem recolhidos, os blocos de tecido sseo contendo os distintos biomateriais foram processados segundo protocolo histolgico para tecidos duros no descalcificados. As amostras obtidas foram estudadas em microscopia ptica, de fluorescncia e electrnica de varrimento. Foi, ainda, determinada a percentagem de tecido sseo neoformado que contactava directamente com a superfcie dos implantes, atravs de tcnica histomorfomtrica, e realizado o estudo estatstico dos valores obtidos. Os resultados observados em microscopia ptica permitiram identificar a presena de uma camada de tecido fibroso, interposta na interface entre o osso neoformado e a superfcie dos pinos de ao inox 316L. Nas amostras de titnio observou-se deposio de osso na zona da interface que contactava directamente a superfcie dos implantes, numa percentagem significativa do seu permetro. O contacto entre o tecido sseo neoformado e a superfcie dos implantes de titnio sofreu um incremento com o decorrer do ensaio. ldentificou-se, tambm, uma maior maturao do tecido sseo depositado na interface.
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As amostras de Osteopatite demonstraram uma grande capacidade osteocondutora, apresentando-se os grnulos deste material totalmente envolvidos por osso neoformado e em contacto ntimo na interface. A percentagem de osso neoformado aumentou com o tempo do ensaio. O cimento de vidro bioactivo evidenciou um bom comportamento no tecido onde foi implantado, apresentando uma regenerao ssea extensa e em contacto directo com a sua superfcie. A quantidade de osso neoformado aumentou com o tempo do ensaio. Observou-se uma ligeira degradao superficial do material, apresentando-se a camada mais externa com caractersticas distintas do ncleo do cimento. A percentagem de contacto directo com o tecido sseo obtido com os distintos biomateriais foi de 3,6+ 3,4% para o ao inox, de 24,8+ 8,0% para o titnio, de 65,4+ 11,2% para a Osteopatite e de 70,7 14,2% para o cimento de vidro bioactivo, nas amostras com 4 semanas de implantao. Nas amostras com 10 semanas de implantao foi de 6,0+ 4,3% para o ao inox, de 43,1+ 10,0% para o titnio, de 83,2+ 10,9% para a Osteopatite e de 89,9 10,4% para o cimento de vidro bioactivo. No que respeita percentagem de contacto sseo, o ao inox e o titnio apresentaram diferenas estatisticamente significativas em relao aos restantes biomateriais, nos dois tempos de implantao (p<0,05; teste de Wilcoxon). Os resultados obtidos neste trabalho permitiram concluir que: a) o ao inox no apresenta um bom comportamento quando implantado no tecido sseo cortical, no sendo indicado em implantes permanentes; b) o titnio apresenta uma boa integrao no tecido sseo, sendo um material com recomendao indicada em implantes permanentes; c) os materiais cermicos possuem boas propriedades osteocondutoras e capacidade de adeso com o tecido sseo, sendo indicados na substituio do osso e no preenchimento de defeitos sseos.
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Summary
The study of the behaviour of biomaterials using animal models, is one of the fundamental steps of their development and research. The understanding of the phenomena and mechanisms which occur after implanting a biomaterial on living tissue, allows for the perfection and improvement of the qualities and properties of biomaterials with biomedical application. The aim of this work was to study the interaction between four biomaterials, representing materials mostly used in oral implantology, and cortical bone tissue. The experimental model used were the posterior tibiae of 12 rabbits, where stainless steel 316L, titanium, and Osteopatite and a glass bioactive cement, were implanted during 4 and 10 weeks. The experimental protocol accomplished with all legal requirements, and all procedures were carried out according to current guidelines applicable to this type of study. The experimental surgery took place in a specific experimental centre with a multidisciplinary group and in good asepsis conditions. Animals were sacrificed with an anaesthesia overdose during the prescribed trial time. After being gathered, the biomaterial bone tissue blocks were processed according to a histological protocol for hard tissues without decalcification. The samples were studied by light, fluorescence, and scanning electron microscopy. The percentage of new bone which contacted directly with the surface of the implants was still determined by a histomorphometric method, and the statistical analysis was performed. The light microscopy observation permitted the identification of the presence of a fibrous tissue layer between the new bone and the stainless steel (316L) pins. The titanium samples permitted the observation of bone deposition in the interface area which had contacted directly with the implant surface in a significant percentage of the perimeter. The contact between the new bone tissue and the titanium implant surface was increased with the trial time. A major maturation of the bone tissue deposited on the interface was also identified.
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The Osteopatite samples presented a significant osteoconductive capacity. The granules of this material were totally surrounded by new bone tissue, showing an intimate contact on the interface. The percentage of new bone was increased with the trial time. The bioactive glass cement showed evidence of good bone tissue behaviour, presenting a vast bone regeneration in direct contact with its surface. The quantity of new bone increased with the trial time. A slight surface degradation of the material was observed and an superficial layer with different characteristics from the bulk of the cement was present. The percentage of the biomaterial surface in direct contact with bone tissue was 3.6+ 3.4% for stainless steel, 24.8 8.0% for titanium, 65.4 11.2% for Osteopatite, and 70.7 14.2% for the bioactive glass cement, in the samples with four weeks after implantation. In the samples with 10 weeks of implantation time, the percentage of direct contact was 6.0 4.3% for stainless steel, 43.1+ 10.0% for titanium, 83.2 10.9% for Osteopatite, and 89.9+ 10.4% for bioactive glass cement. By the statistical analysis of the data, the stainless steel results were shown to be inferior to those of the other biomateriais, in both implantation periods (p<0.05; Wilcoxon test). The titanium was also significantly inferior in comparison with the ceramic biomateriais (p<0.05; Wilcoxon test). The ceramic materials presented no statistical differences between each other. The results obtained in this work allowed for the following conclusions: a) Stainless steel does not show an acceptable performance when implanted in cortical bone tissue. Because of this, the stainless steel implant is not indicated for permanent implants; b) Titanium presents a good integration in bone tissue, being recommended in permanent implants; c) Ceramic materials have good osteoconductive properties and capacity to adhere to the bone tissue. Their principal application field is for bone replacement and the filling of bone defects.
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Rsum
L'tude du comportement biologique des biomatriaux, utilisant des modles animaux, est une des tapes fondamentales son dveloppement et investigation. La comprhension des phnomnes et mcanismes qui surviennent aprs la colocation d'un biomatriel sur un tissu vif, permettent de perfectionner et amliorer les qualits et les proprits des biomatriaux qui ont application biomdicale. L'objectif de ce travail a t d'tudier les interactions entre quatre biomatriaux, reprsentatifs de l'ensemble des matriaux les plus utiliss en implantologie orale, et le tissu osseux cortical. Le modle exprimental utilis ont t les tibias postrieurs de 12 lapins, o ont t implants l'acier inox 316L, le titanium, l'Osteopatite et un ciment de verre bioactif, pendant 4 et 10 semaines. Le protocole exprimental a obi tous les normes lgales en viguer et ont t adopts tous les procds rcommands pour ce type d'interventions. La chirurgie exprimentale a pris cours dans un centre exprimental spcifique pour ce genre d'interventions, avec une quipe chirurgique multidisciplinaire et en bonnes condicions d'asepsie. Les animaux ont t sacrifis par overdose anesthsique, couls les temps d'essai stipuls. Aprs avoir t rcueillis, les blocs de tissu osseux contenant les distincts biomatriaux ont t processs selon le protocole histologique pour tissus durs non dcalcifis. Les chantillons obtenus ont t tudis en microscopie optique, fluorescence et lectronique de vallaiage. A aussi t dtermin le pourcentage de tissu osseoux neo-form qui contactait directement avec la surface des implants, travers la technique histomorphomtrique, et ralise l'tude statistique des valeurs obtenues. Les rsultats observs en microscopie optique ont permis d'identifier la prsence d'une couche de tissu fibreux, interpose sur l'interface entre l'os neo-form et la surface des tiges d'acier inox 316L. Les chantillons de titanium ont permis d'observer la dposition d'os sur la zone de l'interface, qui contactait directement la surface des implants sur un pourcentage significatif de son primtre. Le contact entre le tissu osseux neo-form et la surface des implants de titanium a souffert un incrment au
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long de l'essai. Une plus grande maturation du tissu osseux dpos sur la surface a aussi t identifi. Les chantillons d'Osteopatite ont prsent une grande capacit osteoconductrice, tant les grains de ce matriel totalement envelopps par l'os neo-form qui prsentait un contact intime sur l'interface. Le pourcentaje d'os form a augment avec le temps de l'essai. Le ciment de verre bioactif a prsent un bon comportement du tissu sur lequel il a t implant, prsentant une rgnration osseuse tendue en contact direct avec sa surface. La quantit d'os a augment avec le temps de l'essai. Une degradation superficielle lgre du materiel a t observe et la couche plus externe prsentait des charactristiques distinctes du noyau du ciment. Le pourcentage de la surface des biomatriaux en contact direct avec le tissu osseux a t de 3,6 3,4% pour l'acier inox, de 24,8+ 8,0% pour le titanium, de 65,4+ 11,2% pour l'Osteopatite et de 70,7+ 14,2% pour le ciment de verre bioactif, pour les chantillons avec 4 semaines d'implantation. Pour les chantillons avec 10 semaines d'implantation , il a t de 6,0 4,3% pour l'acier inox, de 43,1+ 10,0% pour le titanium, de 83,2+ 10,9% pour l'Osteopatite et de 89,9+ 10,4% pour le ciment de verre bioactif. Le traitement des donns a permis d'obtenir des diffrences statistiquement significatives, infrieures pour l'acier inox comparativement tous les autres biomatriaux, pour les 2 temps d'implantation (p<0,05; test de Wilcoxon). Le titanium a aussi prsent des differences statistiquement significatives, infrieures comparativement aux biomatriaux cramiques (p<0,05; test de Wilcoxon). Les matriaux cramiques n'ont pas prsent de diffrences statistiquement significatives. Les rsultats obtenus sur ce travail ont permis de conclure que: a) l'acier inox ne prsente pas un bon comportement quand implant sur le tissu osseux cortical, n'tant pas, ainsi, indiqu pour implants permanents; b) le titanium prsente une bonne intgration sur le tissu osseux, tant un matriel recommand pour implants permanents; c) les matriaux cramiques possdent de bonnes proprits osteoconductrices et la capacit d'adhsion au tissu osseux, ayant comme indication principale, le remplacement de l'os et le remplissage de dfauts osseux.
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Maquetizao, composio, impresso e acabamento: MEDISA - Edies e Divulgaes Cientficas, Lda Piso 01 - Faculdade de Medicina do Porto /Hospital de S. Joo 4200 Porto Telefone 02-592164 Fax 02-592177 e-mail: medisa@mail.cesae.pt Rua Gonalo Cristvo, 347 - Centro Empresarial Mapfre, s/ 217 4000 Porto Telefone 02-2001479 Fax 02-2001490 e-mail: medisa@mail.telepac.pt http://www.medisa.pt ISBN: 972-8105-11-8 Depsito-legal: 121899/98

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BIOMATERIAIS E TECIDO SSEO

AMRICO DOS SANTOS AFONSO

Amrico dos Santos Afonso

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Concha e ao Z Pedro, a quem devo esta tese

Aos meus Mestres

Aos Docentes da Faculdade de Medicina Dentria da Universidade do Porto

Captulo H I - Materiais e Mtodos

1.1. Caracterizao Geral dos Materiais 1.1.1. Ao Inox 1.1.2. Titnio

I CONTEXTO E OBJECTIVOS DO TRABALHO

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Captulo I - Contexto e Objectivos do Trabalho

Interaco entre Biomateriais e Tecido sseo

Captulo I - Contexto e Objectivos do Trabalho

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Ill MATERIAIS E MTODOS

C P S Mo 0,03% 0,045% 0,03% 2-3%

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Tabela 3.2 - Propriedades fsicas e mecnicas do ao inox 316L Ao Inox 31GL

200 965 20 7,9 no determinado (Adaptado de J.C. Wataha) [42]

Captulo III - Materiais e Mtodos

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Tabela 3.3 - Composies qumicas do titnio e da liga de titnio (% ponderal)[42] N

(Adaptado de J.C. Wataha) [42]

Captulo III - Materiais e Mtodos

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Captulo III - Materiais e Mtodos

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Captulo III - Materiais e Mtodos

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4,6 3-5 3-5

9-30 FO.7-7 5-15

Vidro, apatite Vidro, apatite, wolastonite Vidro, apatite/ flogopite

(Adaptado de M. H. Fernandes) [219]

Tabela 3.8 - Propriedades de alguns vidros cermicos em comercializao [219, 220].

60-170 1-19 2-170 500 2 , 8 0,16-2,25 2-12 0,5-1

Captulo III - Materiais e Mtodos

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1.2. Caracterizao dos materiais utilizados

43,1% 1,0% 0,21% Restante 0,7% 3,1% 0,34%

Captulo III - Materiais e Mtodos

2. MTODOS 2.1. Caracterizao dos materiais

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PR - rejeio de empilhamento HV - alta tenso A - amplificador PA - pr-amplificador MCA - analisador multicanal

Fig. 1 - Espectrmetro de raios X de disperso de energias (EDS), com detector de Si(Li).

Captulo III - Materiais e Mtodos

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Captulo III - Materiais e Mtodos