VII Congreso Nacional de Ciencias y Tecnologa de Alimentos Lambayeque 2005

OPTIMIZACIN DE UN SISTEMA CONTNUO CON ETAPA INTERMEDIA DE LAVADO PARA PURIFICACIN DE LIPASA OPTIMIZATION OF A CONTINUOUS SYSTEM WITH INTERMEDIATE STAGE OF WASHING FOR PURIFICATION OF LIPASE Oscar Mendieta-Taboada(1,2), Francisco Maugeri F.(3)
(1)

Facultad de Ingeniera Agroindustrial, Universidad Nacional de San Martn Tarapoto. e-mail: oscar_men_98@yahoo.com (2) Centro de Estudios, Promocin y Desarrollo en Selva, CEPDES, Tarapoto, Per. (3) Universidade Estadual de Campinas, Departamento de Engenharia de Alimentos, So Paulo, Brasil. RESUMEN Las lipasas son un grupo de enzimas con diversas aplicaciones en la industria farmacutica, de qumica fina, oleoqumica y alimentaria. Estas enzimas estn presentes en animales y plantas y pueden ser producidas por microorganismos como hongos y bacterias. La recuperacin y purificacin de estas enzimas para ser utilizadas como biocatalizadores ha sido efectuada de diferentes maneras, entre ellas la cromatografa. En el presente trabajo se ha efectuado la simulacin de un proceso CARE (Continuous Adsorption Recycle Extraction), con etapa intermedia de lavado, utilizando las constantes cinticas de adsorcin de la enzima sobre Butyl Sepharose determinadas experimentalmente. La lipasa fue producida por el hongo Geotrichum sp. en medio complejo compuesto por agua de maceracin de maz (5%), nitrato de amonio (0,5%) y aceite de oliva (1%), obtenindose valores de actividad lipoltica prximos a 20 U/mL. La optimizacin del proceso de purificacin fue efectuado a travs de planeamiento experimental y metodologa de superficie de respuesta, permitiendo determinar zonas de operacin que permiten tener rendimiento (recuperacin de enzima en torno de 60%) y factor de purificacin (14 veces) elevados, aun cuando el factor de concentracin es bajo. Palabras clave: Adsorcin, recuperacin, Butyl Sepharose, cromatografa. ABSTRACT Lipases are an enzyme group with diverse applications in the pharmaceutical industry, fine chemistry, oil chemistry and food industries. These enzymes are present in animals and plants and can be produced by microorganisms like fungi and bacteria. The recovery and purification of these enzymes for being used as biocatalysts have been carried out by different methods, among them the chromatography. In the present work the simulation of a process CARE ("Continuous Adsorption Recycle Extraction"), with intermediate stage of washing, for lipase purification has taken place, using the kinetic constants of lipase adsorption on Butyl Sepharose determined experimentally. Lipase was produced by Geotrichum sp. fungus in the complex medium made up of corn steep liquor (5%), ammonium nitrate (0,5%) and olive oil (1%), obtaining values of lipolytic activity in around 20 U/mL. The optimization of process purification was carried out through experimental planning and response surface methodology. Operation ranges obtained allow yields (recovery of the enzyme) around 60% and a high purification factor (14 times), but concentration factor is low. Key words: Adsorption, recovery, Butyl Sepharose, chromatography. microorganismos (SHAHANI, 1975). Las aplicaciones de las lipasas son diversas pudiendo mencionarse las industrias de alimentos lcteos, panificacin, bebidas, carne y pescado, aceites y grasas, qumicas, farmacuticas, cuero, papel y limpieza. An cuando es menos selectiva que la cromatografa por afinidad, la cromatografa de interaccin hidrofbica es una tcnica

I. INTRODUCCIN Enzimas lipolticas, como lipasas y estearasas, constituyen un importante grupo de enzimas asociadas con el metabolismo y con la degradacin de lpidos. Estas enzimas estn ampliamente distribuidas en la naturaleza estando presentes en tejidos y fluidos de origen animal, vegetal y en

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simple con mltiples aplicaciones. Es un excelente complemento para la cromatografa de intercambio inico y permeacin en gel. PUNGOR et al. (1987) propusieron un proceso de extraccin continua con reciclo utilizando cromatografa por afinidad, donde la purificacin es conducida en dos reactores agitados, interconectados en serie, y no en un lecho fijo de partculas adsorbentes. Este proceso, conocido como CARE - Continuous Adsorption Recycle Extraction, fue propuesto con la finalidad de superar algunas limitaciones operacionales relativas a la cromatografa por afinidad en lecho fijo, tales como alto costo, dificultad de operacin en gran escala, dificultad en la ampliacin de escala y operacin continua, adems de limitaciones difusionales. El proceso CARE bsico consiste de dos reactores, uno de adsorcin y otro de desorcin, con reciclo del soporte. El reactor de adsorcin es alimentado a partir del fermentador conteniendo la enzima a ser purificada y sus contaminantes. En esta etapa, la enzima se liga al soporte mientras que los contaminantes son eliminados utilizando tampn de lavado. El soporte junto con la enzima es bombeado al segundo reactor, donde ocurre la desercin con tampn de elusin. A continuacin, el soporte es reciclado al reactor de adsorcin. Los dos reactores estn perfectamente agitados y el adsorbente permanece en los reactores debido a la presencia de un filtro macroporoso. El producto es removido continuamente a travs del filtro de retencin (PUNGOR et al., 1987; AFEYAN et al., 1989; GORDON et al., 1990). El proceso CARE ha sido simulado y optimizado para purificacin de diferentes bioproductos como -galactosidasa (PUNGOR et al., 1987), lisozima (RODRIGUES, 1993), cefalosporina C (BARBOZA, 1998), dextranasacarasa (CURRALERO et al., 1998) y lipasa de Geotrichum sp. (MENDIETA, 1999).

II. MATERIALES Y MTODOS 2.1 Modelado del proceso CARE El proceso CARE considerado en el presente trabajo consiste de tres reactores de igual volumen, uno de adsorcin, uno de lavado y otro de desorcin. El reactor de adsorcin es alimentado a partir del fermentador (F1), conteniendo la enzima a ser purificada (Co) y sus contaminantes (CTo). En esta etapa la enzima es ligada al soporte siendo enviada a la segunda etapa (C1) donde ocurre el lavado con adicin de tampn con sal (F2) para eliminar parte de los contaminantes. Entonces es enviada a la tercera etapa, donde ocurre la desorcin con tampn sin sal (F3). Los tres reactores estn bien agitados y el flujo volumtrico de adsorbente reciclado (Fr), permanece en los reactores debido a la presencia de un filtro macroporoso. El producto (C3) es removido continuamente a travs del filtro de retencin. El modelado fue efectuado considerando que los reactores estn perfectamente agitados y que la adsorcin ocurre en la superficie del soporte, sin tener en cuenta la resistencia de pelcula a la transferencia de masa. Basados en las corrientes indicadas en la Figura 1, fueron realizados los balances de masa para cada etapa, llevando en cuenta las ecuaciones cinticas que representan la adsorcin y desorcin. Como el proceso es isotrmico, cambios de energa no fueron considerados, y la cada de presin en el sistema fue considerada despreciable. En el modelado fue considerado tambin que en las tres etapas existe un equilibrio entre adsorcin y desorcin, cuyas constantes (k1 y k2) varan con la concentracin de sal presente en el sistema.

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FIGURA 1. Esquema del proceso CARE con tres etapas 2.1.1-Etapa de adsorcin

re = rq = [k 2 Q1 k 1 C1 (Q m Q1 )]

(1)

dC 1 3 = (C C ) C3 + [k Q k C (Q Q )] 2 3 2 3 1 3 m 3 1 dt 1
dC T3 ( C T2 C T3 ) C T3 = dt 1 1

(12) (13)

dC 1 + ( C C ) +[k Q k C (Q Q )] 1 ..(2) 1 = Co C 3 1 2 1 1 1 m 1 dt 1 1

dC T1 C To C T1 = + ( C T3 C T1 ) 1 1 dt
dS1 S o S1 ( S3 S1 ) = + dt 1 1

(3)

dS 3 ( S 2 S3 ) S3 = dt 1 1 dQ3 ( Q2 Q3 ) + [k1 C3 (Qm Q3 ) k2 Q3 ] = dt 1

(14)

(4)

(15)

dQ1 ( Q3 Q1 ) + [k1 C1 (Qm Q1 ) k 2 Q1] (5) = dt 1

Considerando que los reactores tienen igual volumen (V1 = V2 = V3 = VL) se obtienen las siguientes expresiones para los tiempos hidrulicos:
h1 = VL F1 + Fr VL h2 = F2 + Fr h3 = VL F3 + Fr

2.1.2-Etapa de lavado
re = rq = [k 2 Q 2 k 1 C 2 (Q m Q 2 )]
dC 1 2 = (C C ) C2 + [k Q k C (Q Q )] 1 2 2 2 1 2 m 2 dt 1 1

(16) (17) (18)

VL Fr (1 )

(6) (7)

dC T2 C = ( C T1 C T2 ) T2 dt 1 1 dS 2 S o S 2 ( S1 S 2 ) = + dt 1 1
dQ2 ( Q1 Q2 ) + [k1 C2 (Qm Q2 ) k 2 Q2 ] = 1 dt

(8)

s1 = s2 = s3 =

(19)

(9)

Para analizar el desempeo del proceso o sea selectividad, rendimiento y concentracin, se tienen las siguientes relaciones: Factor de purificacin (FP)
FP =

(10)

2.1.3-Etapa de desorcin
re = rq = [k 2 Q3 k1 C3 (Qm Q3 )]

(C3 (Co

C T3 ) C To )

(20)

(11)

Rendimiento REND(%)

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REND =

C 3 F3 C o F1

(21)

alimentacin y lavado (moles/litro) III. RESULTADOS Y DISCUSIN

Factor de concentracin FC
FC = C3 Co

(22)

2.2- Simulacin y optimizacin del proceso CARE La simulacin del proceso CARE tuvo por objetivo verificar el comportamiento de la concentracin de enzima libre (lipasa), de los contaminantes y del cloruro de sodio, en la salida en cada etapa. Fueron asumidos valores para los tiempos de residencia hidrulicos en cada etapa, como tambin para el tiempo de residencia de slidos, calculndose los valores de las variables respuesta como rendimiento, factor de purificacin y factor de concentracin. Para la simulacin fueron escogidos valores arbitrarios pero relacionados con las pruebas efectuadas en tanque agitado en el laboratorio; estos valores son presentados en la Tabla 1. El valor para el tiempo de residencia de slidos (Taus) fue escogido en base a las recomendaciones de BARBOZA (1998), quien indica que el tiempo de residencia de slidos debe ser superior al mayor tiempo hidrulico (Tauh1); el valor para el tiempo hidrulico de slidos fue el mismo en cada una de las tres etapas del sistema (adsorcin, lavado y desorcin), ya que se consider que los tres reactores tenan igual volumen. TABLA 1 Valores utilizados en la simulacin del proceso CARE para purificacin de lipasa de Geotrichum sp. a partir de caldo bruto de fermentacin Concentracin de enzima en la alimentacin (Co), U/litro Tiempo hidrulico en la primera etapa (Tauh1), horas Tiempo hidrulico en la segunda etapa (Tauh2), horas Tiempo hidrulico en la tercera etapa (Tauh3), horas Tiempo hidrulico de slidos (Taus), horas Fraccin lquida (Porosidad) Concentracin de contaminan-tes (g/litro) Concentracin de NaCl en la 2x104 1,0 0,5 0,4 2,0 0,85 4,0 2,0

3.1 Simulacin del proceso CARE Los valores de operacin calculados a partir de los datos de entrada de la Tabla 1, son presentados en la Tabla 2, incluyndose tambin los valores de rendimiento (%), factor de purificacin y factor de concentracin correspondientes. TABLA 2 Valores de operacin obtenidos por simulacin del proceso CARE para purificacin de lipasa de Geotrichum sp. de caldo bruto de fermentacin Flujo volumtrico en la primera etapa (F1), litro/hora Flujo volumtrico en la segunda etapa (F2), litro/hora Flujo volumtrico en la tercera etapa (F3), litro/hora Fraccin de reciclo (Fr), litro/hora Rendimiento (%) Factor de purificacin Factor de concentracin 0,5 1,5 2,0 0,588 84,2 8,21 0,21

Los perfiles de concentracin de lipasa libre en cada etapa pueden ser observados en la Figura 2(a). Puede verificarse que el equilibrio es alcanzado en un tiempo aproximado de 10 horas. Para el caso estudiado, el rendimiento (%) fue elevado, aunque el factor de purificacin y el factor de concentracin fueron bajos. Este comportamiento podra deberse a la conformacin propia del sistema de tres etapas, que requiere de un gran volumen de tampn para la elucin de la lipasa adsorbida en la resina. El factor de purificacin es otro parmetro importante para el anlisis del proceso, que est en funcin de la concentracin inicial de contaminantes en la alimentacin a la primera etapa y en la salida de la tercera etapa, obtenindose un factor de purificacin de 8,21 veces, valor inferior a los obtenidos en la purificacin de lipasa en columna cromatogrfica hidrofbica. La enzima adsorbida en la resina hidrofbica, en las diferentes etapas del proceso CARE, est representada en la Figura 2(b). Puede verse que en las dos primeras etapas la cantidad de enzima adsorbida en la resina es elevada, debido a los altos contenidos de cloruro de sodio, mientras que en la etapa de desorcin

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la mayor parte de lipasa es eluda del soporte, pero no totalmente, debido a la presencia de sal en baja concentracin. Este comportamiento disminuye el aprovechamiento de la capacidad total de la resina en la etapa de adsorcin, originando en consecuencia una disminucin en el rendimiento.
10000

50

40

Q (U/g resina)

30

1a etapa 2a etapa 3a etapa

20

10

(b)

Enzima libre (U/litro)

8000

1a etapa 2 etapa
a

10

20

30

40

Tiempo (horas)

6000

3a etapa

4000

Figura 2. Perfiles de concentracin en cada etapa de (a) lipasa libre, (b) enzima adsorbida a la resina 3.2 Optimizacin del proceso CARE para purificacin de lipasa El proceso CARE fue optimizado utilizando la tcnica de planeamiento experimental y anlisis de superficie de respuesta, obtenindose fajas que permiten maximizar las respuestas (rendimiento, factor de purificacin y factor de concentracin) dentro de las limitaciones cinticas de la purificacin de lipasa por adsorcin sobre resina hidrofbica Butyl Sepharose. En la Tabla 3 se encuentran los niveles de las variables independientes para el planeamiento factorial completo.

2000

(a)
0 0 10 20 30 40

Tiempo (horas)

Tabla 3. Niveles de variables consideradas para planeamiento factorial completo Variable Tauh1 (horas) Tauh2 (horas) Tauh3 (horas) Taus (horas) - 3,0 0,1 0,1 6 -1 3,50 0,35 0,35 7 Niveles 0 4,0 0,6 0,6 8 +1 4,5 0,85 0,85 9 + 5,0 1,1 1,1 10

Tabla 4. Matriz de planeamiento para optimizacin del proceso CARE para purificacin de lipasa TAUH1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 TAUH2 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 TAUH3 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 -1 TAUS -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 REND 18,68 21,51 31,02 36,35 17,79 20,68 29,72 35,14 13,52 15,95 FP 7,85 7,03 5,36 4,88 8,08 7,29 5,53 5,07 9,29 8,53 FC 0,010 0,006 0,016 0,011 0,025 0,016 0,041 0,027 0,009 0,006 RO 1,44 0,95 2,71 1,88 3,54 2,40 6,76 4,81 1,08 0,88

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11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

-1 1 -1 1 -1 1 0 -2 2 0 0 0 0 0 0

1 1 -1 -1 1 1 0 0 0 -2 2 0 0 0 0

-1 -1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 -2 2 0 0

1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 -2 2

22,90 27,37 12,95 15,36 21,99 26,44 23,43 19,03 26,88 7,82 32,72 24,33 22,44 32,48 17,72

6,48 6,02 9,44 8,71 6,59 6,16 6,74 7,30 6,18 13,52 5,12 6,57 6,90 5,38 7,84

0,015 0,011 0,021 0,016 0,036 0,028 0,019 0,026 0,013 0,006 0,027 0,003 0,036 0,018 0,017

2,17 1,83 2,59 2,14 5,22 4,50 3,00 3,57 2,18 0,67 4,44 0,49 5,54 3,15 2,36

Los 25 ensayos correspondientes al planeamiento factorial completo que proporciona un modelo cuadrtico, para las variables consideradas, son presentados en la Tabla 4 junto con los valores obtenidos, por simulacin, para las respuestas (rendimiento, factor de purificacin y factor de concentracin), incluyendo tambin los valores de la respuesta optimizada (RO) definida como el producto de las tres variables respuesta obtenidas en la simulacin (rendimiento * factor de purificacin * factor de concentracin). El anlisis de los efectos indic que todas las variables independientes tienen efecto significativo en la respuesta optimizada, siendo mayor este efecto en el caso de Tauh2 y Tauh3. El efecto de Tauh3 sobre la variable RO es debido a la influencia que l tiene sobre el factor de concentracin, ya que la RO fue definida como el producto del rendimiento, factor de purificacin y factor de concentracin. Observando las figuras 3, 4 y 5 se verifica un fuerte efecto del tiempo hidrulico en la tercera etapa (Tauh3) sobre la RO, obtenindose los mayores valores de esa respuesta para la faja de Tauh3 comprendida entre 1,0 h y 1,1 h. En la Figura 4 se puede notar un fuerte efecto de la interaccin Tauh2Tauh3 en la RO, que alcanza valor mximo en torno de 10 para valores de Tauh2 y Tauh3 en la faja de 1,0 h 1,1 h. A partir de la Figura 6 se puede indicar que la Respuesta optimizada es favorecida cuando se opera en la faja de Tauh2 entre 1,0 h 1,1 h, y de Taus entre 5 h 6h. El efecto de la variable Tauh1 fue bastante pequeo comparado con los efectos de las otras variables independientes.

Figura 3-Superficie de respuesta para RO en funcin de Tauh1 y Tauh3 (Tauh2=0,6h, Taus = 8 h)

Figura 4-Superficie de respuesta para RO en funcin de Tauh2 y Tauh3 (Tauh1=0,6h, Taus = 8 h)

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compromiso. Tabla 5. Comportamiento del proceso CARE bajo diferentes condiciones de operacin (Para todos los casos: Co=1,5x104 U/litro; =0,8) Caso
Variable (h) Favoreciendo rendimiento Favoreciendo factor purificacin Solucin de compromiso

Tauh1 Tauh2 Tauh3

Figura 5-Superficie de respuesta para RO en funcin de Tauh3 y Taus (Tauh1 = 3,5h, Tauh2 = 1,0 h)

Taus
Rend(%)

FP FC RO

5 1,1 0,6 6 56,7 3,37 0,01 1,91

4 0,1 1,1 10 5,81 15,43 0,01 0,90

5 0,35 1,0 5,5 22,51 7,05 0,02 3,17

Figura 6-Superficie de respuesta para RO en funcin de Tauh2 y Taus (Tauh1 = 3,5 h, Tauh3 = 1,0 h) El modelo de 2o orden para la RO est representado por la ecuacin (23).
RO = 1 ,137 1,26 Tauh1 + 6,75 Tauh2 + 9,77 Tauh3 0,18 Taus 0,12 Tauh12 1,77Tauh2 2 + 0,061 Taus2 0,78Tauh1 * Tauh2 12Tauh1 * Tauh3 + 0,34 Tauh1 * Taus + 6,38 Tauh2 * Tauh3 0,2 Tauh2 * Taus 0,51 Tauh3 * Taus (23)

Los valores de rendimiento (%) y factor de purificacin obtenidos por simulacin, para purificacin de lipasa de Geotrichum sp., son comparables a los obtenidos experimentalmente en columna de Butyl Sepharose, siendo los valores reportados de 41,2% para la actividad recuperada (rendimiento) y de 12,7 veces para el factor de purificacin (MENDIETA y MAUGERI, 2005), y a los obtenidos por mtodos convencionales que incluyen precipitacin de la enzima y cromatografa en columnas de intercambio inico o hidrofbica (BAILLARGEON & McCARTHY, 1991; HEDRICH et al., 1991; ASAHARA et al., 1993; IKEMOTO & OTA, 1996). IV. CONCLUSIONES Con base en los resultados presentados podemos concluir que con el proceso CARE de tres etapas, aplicado a la purificacin de lipasa de Geotrichum sp., se pueden obtener rendimientos en torno de 60% y factores de purificacin de hasta 16 veces, an cuando el factor de concentracin sea bajo, pudindose escoger fajas de operacin que permitan favorecer el rendimiento o el factor de purificacin o trabajar con una solucin de compromiso. Los valores de rendimiento (%) y factor de purificacin obtenidos por simulacin del proceso CARE, para purificacin de lipasa de Geotrichum sp., son comparables a los obtenidos experimentalmente en columna de Butyl Sepharose, siendo los valores reportados de 41,2% para la actividad

En la Tabla 5 se presentan valores obtenidos para las variables respuesta Rendimiento (%), FP, FC y RO, a diferentes condiciones de operacin. Puede verse que es posible obtener rendimientos en torno de 60% y factores de purificacin de hasta 16 veces, an cuando el factor de concentracin es bajo. Dada la versatilidad del proceso CARE se puede escoger fajas de operacin que permitan favorecer el rendimiento o el factor de purificacin o trabajar con una solucin de

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recuperada (rendimiento) y de 12,7 veces para el factor de purificacin, y a los obtenidos por mtodos convencionales de recuperacin de enzimas. V. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS [1] SHAHANI, K.M. Lipases and Estearases. In: Reed, G., Enzymes in Food Processing, p. 181217 , New York, Academic Press, Inc., 1975. [2] PUNGOR, E.; AFEYAN, N.B.; GORDON, N.F.; COONEY, C.L. Continuous affinityrecycle extractions: A model proteins separations technique. Bio/Technology, v.5, p.604608, 1987. [3] AFEYAN, N.B.; GORDON, N.F.; COONEY, C.L. Mathematical modeling of the continuous recycle extraction purification technique. Journal of Chromatography, v. 478, p. 119 , 1989. [4] GORDON, N.F.; MOORE, C.; COONEY, C.L. An overview of continuous protein purification processes. Biotechnology Advances; v. 8, p. 741762 , 1990. [5] RODRIGUES, M.I. Modelagem, simulao e controle de um processo contnuo de purificao de enzimas. Campinas, 1993. Tese (Doutor em Engenharia de Alimentos) Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas. [6] BARBOZA, M. Estudo cintico de adsoro, modelagem dinmica e otimizao de processo contnuo de purificao de Cefalosporina C. Campinas, 1998. Tese (Doutor em Engenharia de Alimentos) Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas. [7] CURRALERO, I.C.B.; MATSUBARA, S.; RODRIGUES, M.I.; MAUGERI F, F. Sistema bifsico mltiplo estgio para

sntese de dextrana. Anais do XII Congresso Brasileiro de Engenharia Qumica, Porto Alegre, 1998. [8] MENDIETA, O. Purificao de lipase de Geotrichum sp. por resina cromatogrfica de interao hidrofbica. Modelagem, simulao e validao de parmetros. Campinas, 1999. Tese (Doutor em Engenharia de Alimentos) Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas. [9] MENDIETA, O.; MAUGERI F, F. Cromatografia de interao hidrofbica. In: Purificao de Produtos Biotecnolgicos, Pessoa Jr., A.; Vahan-Killikian, B. (Ed.), Editorial Manole, So Paulo, Brasil, 2005. [10] BAILLARGEON, M.W.; McCARTHY, S.G. Geotrichum candidum NRRL Y-553 lipase: purification, characterization and fatty acid specificity. Lipids, v.26, n.10, p.831-836, 1991. [11] HEDRICH, H.C.; SPENER, F. Largescale purification, enzymic characterization, and crystallization of the lipase from Geotrichum candidum. Enzyme Microbiology and Technology, v. 13, p. 840847, 1991. [12] ASAHARA, T.; MATORI, M.; IKEMOTO, M.; OTA, Y. Production of two types of lipases with opposite positional specificity by Geotrichum sp. FO401B, Bioscience, Biotechnology & Biochemistry, v. 57, n. 3, p. 390394, 1993. [13] IKEMOTO, M.; OTA, Y. Production of two types of non-specific lipases by Geotrichum sp. FO274A: A fish-oil assimilating strain. Journal of General Applied Microbiology, v. 42, p. 371379, 1996.