Se describe por el número de platos teóricos,N, o la altura de plato, H.

N: ,u(r*) H:
\A12
"
16X

dondeX expresala distanciaentreuna manchade sustanciay el puntode paftiday W el

diámetrode la mancha.Paraun recorrido de 10cm,N alcanzavaloresde hasta5000en placas
de CCFde altaeficacia(HPTLC) (comparando, al de unacolumna
estevalorde N corresponde
de CG empacadade 2 m de longitud;unacolumnade HPLCde 25 cm y diámetrointeriorde
4.6 mm alcanzalos 10 - 15.000platosteóricos).Más claroes compararla alturade un plato
teórico:losvalorestípicosson 6 a 10 p en columnasde HPLCy 12 V en placasde HPTLC.A
menoralturadel platoteórico,másetapasde separacióntienenlugarparaun mismorecorrido
y mayores la eficaciade separación.
Hay que distinguirla selectividadde la eficacia de separación.Mientrasla eficaciade
separaciónhacereferenciaal ensanchamiento del pico (verarriba),la selectividadexpresala
diferenciaentre los R1sde las sustanciasseparadas.
La Fig. 7 aclaraesta relación.
Parala aplicaciónpráctica,lo decisivoes la calidadde la separaciónde dos sustancias
Éstadependetanto de la
distintasen un sistemade CCFdado (eluyente+ faseestacionaria).

Fig. 7: Diferenciaentreeficaciade separacióny

selectividad de una separación cromatográfi-
ca.

de la resolución
Fig.8: Determinación cromato-
gráfica R".
Alta eficaciade
separación r<d>l
(: picos
estrechos)
pero baja --t
selectividad
(sustancias
separadasde
forma incompleta)

+I
Baja eficacia de separación(= picos anchos)
lYry¿rJllrwrJ
pero buena selectividad(R1sclaramentedistin-
tos).

17
eficaciade separacióncomo de la selectividaddel sistemade separación.El parámetro
correspondientees la resolución,R" (verFig. 8).

R":
1 /2 W 1 + 1/2 W 2
AsíW expresael diámetrode lasmanchasde dossustancias 1 y 2,y d es la distanciaentrelos
centrosde las manchas.Es evidenteque cuanto mayor es la distanciay menoreslos
diámetrosmediosde lasmanchasde lassustancias, mejores la resolución. Cuando1/2W1
1/2 W2: d, entoncesR. : 1 y lassustancias
están"separadas por líneade base",es decir,la -
respuestacromatográficavuelveentreellasa la líneade base (verFig. 8).-
Kaiserintrodujoun parámetroadicionalde gran utilidad,el númerode separación,SA/[14].
Este parámetroexpresael máximonúmerode sustanciasque un sistemade CCF puede
separaridealmente de maneracompletaen un determinado recorrido.En este caso ideal,
todos los pares de sustanciasvecinas estaríanseparadoscon una resolución1 (ver
arriba).
La determinación de este parámetroSN (Separation
experimental Number)es realmente
sencilla:
- Se cromatografía una mezclade sustanciascuyos Rrsson distintosy se encuentran
por todo el cromatograma.
distribuídas
- Conun densitómetro (verFig.43)se registra y se representa
un densitograma en unaescala
ampliadael anchode la mancha,medidaa la mitadde la alturadel pico,frenteal recorrido
respectivoZ¡ (verFig. 9).
- Lospuntosobtenidosse unenpor unarectay se extrapolan
losanchosde manchaboy br a
Z¡ = 0 Y Zt : 1 respectivamente.
- Se calculaSN (magnitudadimensional)
segúnla relaciónsimplificada:

sN: __zr _t
dondeZ¡ es el recorridohastael frente.

Fig. 9: Determinación
del númerode separaciónSN [14].

Puntode

- Esta imagen no es de todo correcta

1B
2.3 Empirismoilustradoo ¿qué influyeen una separacióny de qué manera?
en ordendecrecientede importancia,25parámetrosque
F. GEISS[15] cita, clasificados
influyenen la separaciónpor CCF:
1. Faseestacionaria.
2. Fasemóvil.
3. Tioo de cubeta.
4. Adsorciónpreviade una mezclade disolventes (acondicionamiento).
5. Humedadrelativa,
6. Actividadde la fase estacionaria.
7. Saturaciónde la cubetay la fase estacionariacon vaporesdel eluyente.
8. Tamañode granode las partículasen la fase estacionaria.
9. Tamañode las manchasaplicadas.
10. Distanciaentrela posicióninicialde la sustanciay el niveldel eluyenteen la cubetade
separación.
11. Gradientesde eluyente(distribución irregulara lo largodel recorridode los distintos
componentes del eluyente).
12. Alteraciones en la calidadde la faseestacionaria.
13. Velocidadde flujode la fase móvil.
14. Magnituddel Rr.
15. Temperatura.
16. Volumende la muestra.
17. Aglomerante en la faseestacionaria.
18. Espesorirregularde capa en la fase estacionaria.
19. Fabricación de la faseestacionaria.
20. Espesorde capa de la fase estacionaria.
21. Convecciones en la fasegaseosade la cubetade separación,
22. Tipo de desarrollo(flujoascendente/descendente/horizontal de la fase móvil).
23. lmourezasen el eluvente.
24. Recorrido.
25. pH.
Estalistamuestra claramente cuántosparámetros influyenenlacromatografía de capafina,porqué
el empirismoprecedea la teoríay porquése requiereun grancuidadoparaobtenerresultados
reproducibles.En el marcode esta introduccióndirigiremosnuestraatenciónsólo a la fase
de la cubeta.Al finalde estecapÍtulose encuentra
a la fasemóvily a la saturación
estacionaria, la
determinación de lascondiciones adecuadas de separación.

2.3.1 La faseestacionaria(el sorbente)

Lacomercialización y calidadconstantes
de naturaleza
de sorbentes fueunacondiciónprevia
para
esencial la propagaciónde la CCF como método de rutina.
Las característicasprincipalesy los parámetrosde los sorbentesse resumenen los tres
apartadossiguientes,
(1)Composiciónquímicay estructura.
en dos tipos:
Los numerosossorbentesse clasificanbásicamente
tambiénllamadasstraightphaseso fasesnormales.
- Fasespolares(hidrófilas),
tambiénllamadasreversedphaseso fasesreversas(abreviadas
- Fasesapolares(lipófilas),
RP).

19
Enmedioseencuentran lasfasesmedianamentepolares.Ensu mayoríasetratade sorbentes
modificadoscomoporejemplolasfasesnitriladas,dioladaso aminadas.Suspropiedades se
asemejana las de las fasesnormalo reversadependiendo del eluyente.
Lasfasespolaresse combinanen generalcon eluyentesno polarescomo cloroformo/me-
tanol.Porel contrario,lasfasesreversasse combinancon eluyentescon alto contenidoen
agua.Naturalmente, al cambiarde fasedirectaa fasereversase invierleel ordende elución.
Lossorbentesde mayorsignificación
prácticasonel gelde sílice,el gelde sílicemodificado,
et
óxidode aluminioy la celulosa.
Cercade un 90 % de las separaciones se realizansobregel de sílice,un polvoporosoy
amodo.Contieneen su superficiegruposSi-OHque puedenformarenlacespor puentede
hidrógenoentre ellos o con sustanciaspolares.La cantidadmáximade grupos S|-OH
y por lo tantola máximaactividad,la presentael gel de síliceactivadoa '150oC.
disponibles,
le haceperderel aguaadsorbiday tenerde 4 a 6 gruposSi-OHpor cada10
Estetratamiento
nm2.
Los gelesde sílicemodificadosse obtienenpor reacciónmediantesilanosapropiados.Los
gruposfuncionalescomo -NHr, DIOL o -CN quedanasí fijadosquímicamente sobre ra
superficie
delsorbente.Losgelesde sílicehidrofobizados (silanizados)
con alquilclorosilanos
son de especialinterésen cromatografía.
Paftiendode gel de sílice(faseestacionaria
polar)se obtienenfasesapolaresllamadasfases
reversas.
Se comercializan sistemasRP con 1, B o 18 átomosde carbonoen la cadena
hidrófoba:las fasesRP-2,RP-8y RP-18.
Por últimoexistentambiéngeles de sílicecon gruposfuncionalesquirales(ópticamente
activos).Estasfasespermitensepararsustancias ópticamente activasen susenantiómeros
por interacciónde diastereómeros. En la actualidad,la síntesisde productosnaturalesy
fármacoses impensable sin un controlrigurosode la purezadel enantiómero: los distintos
enantiÓmeros puedentenerdistintaspropiedades farmacológicas y, por lo tanto,debenser
investigadosseparadamente.
El uso de celulosacomo sorbenteparasepararsustanciashidrófilascomo aminoácidos
v
azúcaresproduceresultadosparecidosa los obtenidospor cromatografía
de papel.
Se vendentambiénplacasde poliamiday de silicatode magnesio(Florisil)
en cuyosdetalles
no se entraaquí.
(2)Características
de granoy de poro.
La eficaciade separaciónde un adsorbente(verCap.2.2)estádeterminadapor su estructura
geométrica. Tambiénforman parte de ella el tamaño de parlículay su distribución.La
selectividadde un adsorbente(ver Cap. 2.2) depende,por el contrario,de la estructura
químicadel material.
- Diámetrode partícula.
En principiose cumpleque cuantomenoresson las partículas y cuántomás estrechaes la
distribuciónde tamañosde granotantomejores la eficaciade separación.Losdiámetrosde
las partÍculasdeberíanser ademáslo más uniformesposible(distribución de tamañode
partícula Eldiámetrode partícula
estrecha). de losgelesde sílicecomerciales
oscilaentrelos5
y los 40 gm.

En la Figura10 se muestrandistribuciones
típicasde tamañode grano.

20
 Capaspreparadas
HPTLC CCF Gelesde sílicede CCF Gelesde sílicede CCFclásicos

comerciales.
de tamañosde granode sorbentes
Fig.10: Distribución

- Super-ficie.
Seexpresaen m2/ g. A mayorsuperficie,másintensasson lasinteracciones entremuestray
El poderde adsorciónes mayor,es decir,la retenciónes másfuerte.Las
faseestacionaria.
superficiesde los geles de sílicecomercialesestán comprendidasentre 400 y 600
m'/9.
- Volumende poro y su distribución.
Se expresaen ml/g (unvalortípicoes 0.8 ml/g).Unavariablerelacionadaes el diámetrode
poro, expresadoen nm (unvalortípicoes 6 nm).
(3)Parámetrosde capa.
El espesorde las capasde separación analíticasse sitúatípicamente entre100 y 250 pm,
mientrasqueel de lascapasde separación nqrmalesestáalrededor de los y el de las
250 ¡-rm,
capas de CCF de alta eficacia(HPTLC)alrededorde los 200 ¡rm. Para separaciones
preparativasexistenptacascon espesoresentre0.5 y 2 mm. Raspandodeterminadaszonas
de la placadespuésde laseparación y solubilizandoposteriormente lassustancias adheridas,
es oosibleaislarestassustancias.
Tambiéninfluyenen las propiedadesde las capas los aglomerantesempleados,que
aumentansu estabilidad y fijación(p. ej.,el yesoo aglomerantes orgánicos).
Tambiénse comercializanplacasconzonasde concentracón.ldealmente,en estaszonasde
concentrándoseen una
concentraciónlas sustanciasavanzancon el frente del eluy"ente,
banda estrecha(p. ej., procesosde separaciónadsortivos).Al alcanzarsela capa de
separaciónempieza la cromatografíapropiamentedicha. La línea de partida de la

21
cromatografíase encuentraen la fronteraentre la zona de concentracióny la capa de
se mantieneasi
El tamañode la manchaen la direcciónde la cromatografía
cromatografía.
pequeñoy se mejorala resolución.

2.3.2 La fasemóvil.
su actividad,la eleccióndel eluyente
Ademásdel sorbentey (parasorbenteshidrófilos)
en la separación.El eluyentedisuelvedel sorbentelas
también influyedecisivamente

segúnHALPAAP[17].
Tabla1: Serieeluotrópica
Serie Fórmula Indicede Cons- Masa Punto Presión Valor
eluotrópica polaridad tante motar oe de MAK
segun dieléctrica ebulli- vapor 1983
Snyder-) ción

(20o [mbar] Iml/m3]

25"C) Ig/mol] rcl (20"c) o [ppm]

n-heptano u7n 16 1.9 '100.21 98.4 48 500

n-hexano C o H,¿ 0 .0 1.9 8 6 . 1B 68.9 160 100

ciclohexano C o H,e 0.0 2.0 8 4 . 16 80.7 104 300

¡sooctano C a H,u 0.4 1.9 114.23 99.2 CI 500
1,1,2-tricloro- ctrFccctF2 2.4 '187.38 47"7 368 1000
trifluoroetano

tetraclorurode cc14 1 .7 153.82 76.5 120 10

carbono
tolueno c6H5cH3 2 .3 2.4 92.14 11 0 . 6 29 200

cloroformo cHC13 4.4 4.8 11 9 . 3 8 ot./ 210 10

dicloro- ctcHrcH2cl 3 .7 10.6 98.97 83.4 87 20

etano

dicloro- cH2cl2 AA 9.1 84.93 40.0 100

metano
'1-butanol .100
cH3(cHr)3oH 3 .9 17.8 74.12 117.2 6.7

acetonitrilo cH3cN 6-2 41.05 8 1. 6 07 40

2-propanol cH3cH(oH)cH3 4.3 18.3 6 0 . 10 82.4 4J 400

acetato de etilo cH3cooc2Hs +.ó 6.0 88.10 77.1 400

acetona cH3cocH3 5.4 20.7 58.08 56.2 233 1000

etanol crH50H 5.2 24.3 46.07 78.5 1000

1,4-dioxano c4H8o2 4.8 2.2 88,.11 101.0 41 50

tetfahidrofurano c4H80 7.4 72.11 66.0 200 200

metanol cH30H 6.6 32.6 32.O4 65.0 128 200

agua HrO 9. 0 80.2 18.01 100.0 23

.) L. R. Snyder:J. Chromatogr.92,223-230 (1974)

¿¿
 __.>
Precarga Capa seca
-_+
---> Capa seca

Papel de
filtro
--¡>
saturado ,/

por capi- Saturación

-"+
laridad capilar

--
+
I
tt
Cubeta saturada Cubeta no saturada
de la atmósfera
Fig.11: Influencia del cromatograma.
de la cubetasobreel desarrollo

sustanciasa separar,haciéndolasavanzar.Cuanto más eluyente se adsorbe sobre el

sorbente,mayores el poderde eluciónde éste (poderde desplazamiento). Si la sustancia
tienemayorafinidadpor el eluyente que por el sorbente,se eluyemás próxima al frente.
Conviene en estemomentoadvediracercade unaconfusiónde concepto:la composiciÓn de
la mezclaeluyente (comunmente llamada fase móvil)puede, aunque no necesarlamente
debe,ser idénticaa la fase móvilefectivacromatográficamente porqueel eluyentetambién
está sometidoal proceso cromatográfico. Este fenómeno se pone de relievecuandose
utilizaneluyentesde más de un componente, dando lugara la apariciónde los llamados
"frentes8", especialmenteen cubetas"sandwich"(verCap. 3).
Un ejemplonosva a dejarestomásclaro:cromatografiamos sobreunacapade gel de sílice
empleandocomo eluyente ciclohexanoy éter.El éter,polar,
se retrasacromatográficamente,
conlo queel frentese compone únicamentede ciclohexano. A una cieftadistanciadel mismo
emptezaa aparecer una mezcla de ciclohexano y éter. En este punto hay un salto en la
polaridaden el eluyente,lo quese conocecomo"frente8".Lassustancias pocopolares,que
no avanzan conciclohexano sólo,seagrupanenestaposición.Lo mismolesocurrea menudo
a las impurezasde la propiacapa.Al fenómenodescritose le superponenademásotros
efectoscomo la evaporacióny la condensación(versaturaciónde la cubeta).
Se ha comorobadola utilidadde ordenarlos eluyentes en unasucesiónde poderde elución
creciente.Esta "serieeluotrópica"se correspondeesencialmente con la ordenaciónde los
eluyentes según su polaridado su constante Estrictamente
dieléctrica. hablando,unaserie
etuótrópica es válidasólo paraun sorbente determinado.Con todo, las seriesparael gel de
sílicey el óxidode aluminioson casiiguales,mientrasque la serieparaunafaseRPtieneun
aspectototalmentedistinto.
LaTabla1 muestraunaselecciónde loseluyentes másimporlantes del
de la serieeluotrópica
gel de sílice.

23
La saturaciónde la cubetainfluyede maneraimportanteen el resultadode la separación.La
Fig.11 muestraesquemáticamente lo que sucedeen una cubetano saturada.La placade
capa fina se ha introducidoinmediatamente despuésde verterel eluyente.Durantela
separaciónse evaporaeluyentede la placa,predominantemente en la zona del frente.Se
requieremás eluyentepara un mismo recorridodel frente y los Rls aumentan.Si por el
contrariose revistela cubetacon papelde filtro empapadocon el eluyente,sus vaporesse
distribuyenen pocotiempoportodo el volumende la cubeta,con lo queéstase satura.Si se
introduceuna placade separaciónen unacubetapreparadade esta manera,la capasecase
impregnade eluyente.Se requiereentoncesmenoseluyenteparaun mismoavancedelfrente
y los R1sson menores.
La diferenciaentrelos R¡sde cubetasno saturadasy saturadases sin embargosóloaparente.
En el primercasoha fluídopor la placamáseluyentedel que correspondería al recorridodel
frente.En el segundo,el vapordel eluyentecondensapor delantedelfrente,aparentando un
mayorrecorridodel mismo.
Por último,y como ejemplo,vamosa mostrarla influencia de variosdisolventes
sobreuna
separación. La Fig. 12 muestracómo una mezclaproblemade colorantesse eluyemás al
utilizareluyentesde poder de elución creciente.Mientrasque el n-hexano,apolar,deja
inmóviles lassustancias adsorbidasenel puntode partida,laacetona,máspolar(situadamás
abajo en la serie eluotrópica)arrastralas sustanciasun largo trecho. En ambos casos la
separaciónes nula.Los eluyenteso mezclasque se encuentranentreestos dos disolventes
en la serieeluotrópica consiguen,algunosmejorque otros,separarla mezcla.
En la secciónsiguienteveremoslas indicaciones
prácticasparaoptimizaruna separación
determinada.

2.3.3 Determinaciónde las condicionesadecuadasde separación.

En la práctica diaria se puede recurrir,para numerososproblemasde separación,a la
experienciapropiao ajenay consultarla abundantebibliografía.Presentamos a continuación
algunasreglasgenerales y experienciasque facilitanla determinación
de lascondiciones
de
separaciónen el sentido del "ilustrado".
Una aclaraciónen primerlugar:al considerarlógicamentelas interrelaciones
de los factores
fasemóvil,faseestacionariay sustanciaaanalizarse obtieneel esquemageneralde la Fig.13.
Cuandosedirigeunvérticedeltriángulo haciaunapropiedad dadade unode lostresfactores,
las de los otros dos quedanmás o menos"automáticamente" determinadas.
Este recursoproporcionasólamenteun punto de referencia.En la mayoríade situaciones
prácticasdebe intervenirel empirismopara resolverel problema.Hablandoclaro:pruebay

':i . .:.
j ,. l rú.
ü -
' :I
ir
je
a * .l
:=_=a r ü : Fig. 12: Influenciade varios eluyentesen la
¿
j"'it I
"
. separacióncromatográficade una mezcla pro-
blema de colorantes.De izouierdaa derecha:
f.,,,,.,"'"'
j-'jj:'.:É=
n-hexano, benceno, benceno-cloroformo(1 +
;,,--. ::i ::''.i:r 1), cloroformoy acerona.

24