UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON FACULTAD DE MEDICINA

DESARROLLO DE UN METODO ANALITICO POR CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCION PARA LA DETERMINACION DE ACIDO FOLICO EN CEREALES ENRIQUECIDOS

POR Q.C.B, ADELINA ALEJANDRA HERNANDEZ HURTADO

Como requisito parcial para obtener el Grado de MAESTRIA EN CIENCIAS con Orientacin Terminal en Qumica Biomdica

TM TX548
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L55 H4 2004

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1080126002

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE NUEVO LEN FACULTAD DE MEDICINA

DESARROLLO DE UN MTODO ANALTICO POR CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA RESOLUCIN PARA LA DETERMINACIN DE CIDO FLICO EN CEREALES ENRIQUECIDOS

POR Q.C.B. ADELINA ALEJANDRA HERNNDEZ HURTADO

Como requisito parcial para obtener el Grado de MAESTRA EN CIENCIAS con Orientacin Terminal en Qumica Biomdica

Agosto, 2004

TEMIME8TRIA

FONDO

D E S A R R O L L O Y V A L I D A C I N DE UN M T O D O A N A L T I C O POR C R O M A T O G R A F A DE LQUIDOS DE A L T A R E S O L U C I N P A R A L A D E T E R M I N A C I N DE C I D O F L I C O EN C E R E A L E S ENRIQUECIDOS

Aprobacin de la Teis:

^ N l A WACCHA TORRES Director de Tesis

M.C. NORMA CECILIA AVAZOS ROCHA Co-Director de Tesis

DRA. NOEMWAKSMAr TORRES" Miembro de ia Comisic 'de Tesis

1 CAA /M

DR. D*GNiCtO". ALAKAlrt=tADO Subdirector de Investigacin y Estudios de Posgrado

DESARROLLO DE UN MTODO ANALTICO POR CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA RESOLUCION PARA LA DETERMINACIN DE CIDO FLICO EN CEREALES ENRIQUECIDOS

Presentado por:

Q.C.B. ADELINA ALEJANDRA HERNNDEZ HURTADO

Este trabajo se realiz en el Departamento de Qumica Analtica de la Facultad de Medicina de la Universidad Autnoma de Nuevo Len, bajo la direccin de la M.C. Lidia R. Naccha Torres y la codireccin de la M.C. Norma Cecilia Cavazos Rocha.

FIRMAS

DIRECTOR

CODIRECTOR

Dedico esta tesis con gran amor A mi esposo: Ing. Jorge A. Quiroga Guerrero Responsable directo de la finalizacin de este trabajo. Por su apoyo incondicional, por ser mi compaero, sostn y comprensin de todos los das. A la memoria de mi madre ausencia siento cada da ms. Profesora Candelaria Hurtado Gmez cuya

A mi padre Sr. Pedro Hernndez Pez por danrte la educacin necesaria para poder llegar hasta aqu.

Agradecimientos

Quisiera expresar aqu mi gratitud a todas aquellas personas que de un modo u otro me han facilitado el camino para la realizacin de ste trabajo. Primeramente a Dios que puso los medios para entrar a la maestra, me dio la fortaleza espiritual y fsica. A mis hermanos, verdaderos amigos, porque los aprecio y quiero, ya que son y sern siempre muy importantes en mi existencia. A mis sobrinos a quienes deseo xito en la vida y que logren satisfacciones perdurables. A la directora de esta tesis M.C. Lidia Naccha Torres, quien me comparti su sabidura de una manera agradable, apoyndome en todo momento y sobre todo por depositar su confianza en m. Admiro su nobleza a la vez su firmeza. A la co-directora de esta tesis M.C. Norma Cecilia Cavazos, porque sin sus conocimientos no hubiera sido posible la realizacin de este trabajo. Admiro su calidad humara. A la Dra. Noem Waksman de Torres por permitirme avanzar en mis estudios y por haberme brindado su valiosa asesora durante el desarrollo del presente trabajo. Es un ejemplo a seguir.

A mis compaeras de generacin: Marcela, Alicia y Adriana, por su amistad y por sus oraciones. A mis compaeras de trabajo Aurora y Roco que adems de compartirme sus conocimientos, supieron escucharme y me ayudaron a tomar las mejores decisiones.

A la TLC Marivel Esparza D. por su gran ayuda en la parte prctica y proporcionarme el material necesario para realizar mis experimentos. A Vctor Torres, Glora Molina, Glora Martnez porque de algn modo me facilitaron el trabajo. A CONACYT por el apoyo econmico que me brind para realizar este proyecto de tesis. A todas aquellas personas que no mencion pero que me apoyaron incondicionalmente para poder realizar un logro ms en mi vida, mil gracias.

RESUMEN
Adelina Alejandra Hernndez Hurtado Universidad Autnoma de Nuevo Len Facultad de Medicina Ttulo del Estudio: DESARROLLO Y VALIDACIN DE UN MTODO ANALTICO POR CROMATOGRAFIA DE LQUIDOS DE ALTA RESOLUCIN PARA LA DETERMINACIN DE CIDO FLICO EN CEREALES ENRIQUECIDOS Candidato para el grado de Maestra en Ciencias con orientacin terminal en Qumica Biomdica Fecha de graduacin: Agosto del 2004

Nmero de pginas:71

rea de Estudio: Qumica Analtica Propsito y Mtodo del Estudio. El cido flico es un nutriente clasificado entre las vitaminas del complejo B. Su deficiencia produce afecciones de la divisin celular y alteraciones en la sntesis proteica. Juega un papel importante a nivel mundial en los defectos del tubo neural (DTN). El mtodo oficial para su determinacin es el Microbiolgico, a pesar de ser sensible, es muy laborioso y de muy baja reproducibilidad, por lo que surgi la necesidad de implementar un mtodo analtico que permitiera la determinacin de cido flico de una manera rpida, sencilla y confiable. En el presente trabajo se desarroll un mtodo por HPLC para la cuantificacin de cido flico en cereales enriquecidos, donde se probaron dos mtodos de purificacin de la muestra, se desarroll el mtodo de extraccin y posteriormente se valid el mtodo. Contribuciones y Conclusiones: Se cuenta con un mtodo cromatogrfico rpido, sencillo y preciso para la determinacin de cido flico en cereales enriquecidos. Se analizaron muestras comerciales de corn flakes de diferentes marcas y se obtuvieron resultados similares a los reportados en la etiqueta del producto. Las condiciones cromatogrficas establecidas fueron: fase mvil ATF 0.1%:AcN 85:15, velocidad de flujo 1.4 mL/min, fase estacionara columna fase inversa dC18 5Mm X 4.6 X 150 mm, deteccin a 280 nm. La precisin del mtodo fue menor del 15% y una recuperacin de 62%.

FIRMA DEL DIRECTOR

NDICE Captulo 1. INTRODUCCIN 1.1 Vitaminas 1.1.1 Definicin 1.1.2 Clasificacin 1.2 cido Flico 1.2.1 Estructura qumica y derivados 1.2.2 Metabolismo 1.2.3 Funcin 1.2.4 Efectos y requerimientos 1.2.5 Fuentes 1.3 Fortificacin o enriquecimiento de alimentos 1.3.1 Definiciones 1.3.2 Cereales 1.3.3 El cido flico como auxiliar para prevenir enfermedades 1.3.4 Legislacin 1.4 Mtodos para la determinacin de cido flico 1.4.1 Mtodo microbiolgico 1.4.2 Mtodos por CLAR 1.5 Descripcin del problema 1.6 Objetivos 1.6.1 Objetivo general 1.6.2 Objetivos especficos 2. MATERIAL Y MTODOS 2.1 Equipo, material y reactivos 2.1.1 Equipo 2.1.2 Materiales 2.1.3 Reactivos 2.1.4 Solventes 2.2 Establecimiento de las condiciones de anlisis de cido flico por CLAR 2.2.1 Evaluacin de parmetros cromatogrficos 2.2.2 Validacin del sistema 2.2.2.1 Linealidad 2.2.2.2 Precisin 2.2.2.3 Lmite de deteccin 2.2.2.4 Lmite de cuantificacin Pgina 1 1 1 2 2 2 4 4 5 7 8 8 9 10 10 12 12 12 15 16 16 16 17 17 17 18 19 19 20 21 22 22 24 24 25

2.3 Desarrollo de un procedimiento para la extraccin de cido flico en cereales 2.3.1 Tratamiento previo de la muestra 2.3.2 Purificacin 2.3.3 Seleccin del mtodo de extraccin 2.4 Validacin del mtodo 2.4.1 Linealidad 2.4.2 Precisin 2.4.3 Exactitud 2.4.4 Estabilidad 2.4.5 Robustez 2.5 Aplicacin del mtodo desarrollado para la determinacin de cido flico en cereales enriquecidos que se expenden en el rea metropolitana de Monterrey 2.5.1 Seleccin de muestras 2.5.2 Procesamiento de las muestras 3. RESULTADOS 3.1 Condiciones cromatogrficas 3.1.1 Sistema 1 3.1.2 Sistema 2 3.2 Optimizacin de parmetros cromatogrficos 3.3 Parmetros de validacin del sistema 3.3.1 Precisin intrada 3.3.2 Precisin interda 3.3.3 Linealidad 3.3.4 Lmites de deteccin y cuantificacin 3.4 Extraccin y purificacin de la muestra 3.4.1 Porcentajes de recuperacin 3.5 Validacin de I mtodo desarrollado 3.5.1 Linealidad 3.5.2 Precisin 3.5.3 Exactitud 3.5.4 Estabilidad 3.5.5 Robustez 3.6 Niveles de cido flico en cereales enriquecidos 4. DISCUCIN 4.1 Condiciones cromatogrficas 4.1.1 Clculo de N 4.1.2 Seleccin del porcentaje de la fase mvil y velocidad de flujo

25 26 26 27 27 27 28 29 30 30 31

31 32 33 33 33 35 37 38 38 39 40 42 43 46 48 48 49 49 50 52 53 56 56 58 58

4.2 Tratamiento previo de la muestra y purificacin 4.2.1 Anlisis de una muestra virgen 4.2.2 Mtodo de tratamiento previo de la muestra 4.2.3 Purificacin 4.3 Validacin 4.3.1 Lineal/dad y lmites de deteccin y cuantificacin 4.3.2 Precisin y exactitud 4.3.3 Estabilidad 4.3.4 Robustez 4.4 Niveles de cido flico 5. CONCLUSIONES 5.1 Conclusiones BIBLIOGRAFA

59 59 59 60 62 62 63 64 64 66 67 67 69

LISTA DE TABLAS Tabla I II III IV V Niveles de nutrimentos en mg/Kg en harina de trigo Niveles de nutrimentos en mg/Kg en maz Condiciones de CLAR usados en estudios comparativos Seleccin de condiciones cromatogrficas para el anlisis de cido flico Resultados de la precisin intrada del estndar de cido flico de 1 ppm Resultados de la precisin interda del estndar de cido flico de 1 ppm Coeficiente de variacin de los factores de respuesta de las curvas de calibracin de cido flico Datos para calcular los lmites de deteccin y cuantificacin Lmites de deteccin y cuantificacin para el cido flico Comparacin de los mtodos de purificacin Resultados de la precisin del mtodo para determinar cido flico Resultados de la exactitud del mtodo para determinar cido flico Cambios en el proceso de extraccin para evaluar la robustez del mtodo Cambios en el proceso de cuantificacin para evaluar la robustez del mtodo Niveles de cido flico en cereales enriquecidos Pgina 11 ^^ 14 37 38

VI VII

39 41

VIII IX X XI XII XIII XIV

42 43 46 49 50 52 53

XV

54

LISTA DE FIGURAS Figura 1 2 Frmula estructural del cido flico Cromatograma del estndar de cido flico de 1 ppm. Fase mvil metanol:buffer de fosfatos pH 7 con TBA 0.005M (24:76), fase estacionara columna de fase inversa C18, flujo 1 mL/min y deteccin a 280 nm. Cromatograma del estndar de cido flico de 1 ppm. Fase mvil metanol:buffer de fosfatos pH 7 con TBA 0.005M (24:76), fase estacionara columna de fase inversa C18, flujo 1 mL/min y deteccin a 280 nm. Cromatograma del estndar de cido flico de 1 ppm. Fase mvil metanol:buffer de fosfatos pH 7 con TBA 0.005M (24:76), fase estacionara columna de fase inversa C18, flujo 1 mL/min y deteccin a 280 nm. Cromatograma del estndar de cido flico de 1 ppm. Fase mvil cido trifluroactico 0.1% : acetonitrilo (85:15), fase estacionara columna de fase inversa Atlantis dC18 5 M m de dimetro de partcula 4.6 X 150 mm, flujo 1.4 mL/min y deteccin a 280 nm. Cromatograma del estndar de cido flico de 1 ppm. Fase mvil cido trifluroactico 0.1% : acetonitrilo (85:15), fase estacionara columna de fase inversa Atlantis dC18 5 pm de dimetro de partcula 4.6 X 150 mm, flujo 1.4 mUmin y deteccin a 280 nm. Curva de calibracin de cido flico, rea vs concentracin. Cromatograma de la muestra virgen eluda a pH de 4.5 bajo las condiciones cromatogrficas ya establecidas. Cromatograma de la muestra virgen + cido flico eluda a pH de 4.5 bajo las condiciones cromatogrficas ya establecidas Cromatograma de la muestra virgen eluda a pH de 2.5 bajo las condiciones cromatogrficas ya establecidas. Cromatograma de la muestra virgen + cido flico eluda a pH de 2.5 bajo las condiciones cromatogrficas ya establecidas. Pgina 2 34

34

35

36

36

7 8

40 43

44

10 11

44 45

12

Cromatograma de la muestra virgen + cido flico 1 ppm con una filtracin como mtodo de purificacin bajo las condiciones cromatogrficas ya establecidas. Curva de calibracin de cido flico. rea vs concentracin. Curva de valoracin para la estabilidad del estndar de cido flico. Cromatograma para demostrar la estabilidad de las muestras fortificadas Cromatograma de una muestra de cereal de com flakes de Kellog's tote B1. Pico cromatogrfico correspondiente al cido flico con un tiempo de retencin de 2.997 min.

45

13 14

48 51

15 16

51 55

ABREVIATURAS Y SMBOLOS

Abreviatura

AcN C CLAR cm CV D DHF EPA FA FDA FI-THF FM FR F-THF g g/mL HPLC HK HP ICH k'

Aceto ni tri lo Grados centgrados Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin Centmetro Coeficiente de Variacin Dalton Dihidrofolato Agencia de Proteccin del Medio Ambiente Factor de Asimetra Administracin de Alimentos y Drogas N-5 fonniiminotetrahidrofolato Fase mvil Factor de Respuesta N-10 formiltetrahidrofolato Gramo Gramo por mililitro Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin Enzima de rin de cerdo Plasma humano liofilizado Comit Internacional de Armonizacin Factor de capacidad

M MeOH mg mg/Kg min mirri L/min mm N n nm PH ppm R2 SAX SD TBA THF to tr UV w X Mm ML

Molaridad Metanol Miligramo Miligramo por kilogramo Minuto Mililitro Mililitro por minuto milmetro Nmero de platos tericos Tamao de muestra Nanmetro Potencial de hidrgeno Partes por milln Coeficiente de correlacin lineal Intercambio aninico fuerte Desviacin estndar Tetra butil amonio Tetrahidrofolato Tiempo muerto Tiempo de retencin Ultravioleta Ancho de base de pico Promedio Micrmetro Microlitro

A 5-Me-THF 5,10-CHz-THF

Longitud de onda N-5 metiltetrahid rotolato cido 5,10 metilentetrahidroflico

CAPTULO 1

INTRODUCCIN

1.1 Vitaminas

1.1.1 Definicin

La nutricin es un importante factor en la salud, es la causa y tratamiento de varias enfermedades. El hombre requiere en su dieta de varias molculas orgnicas complejas y varios minerales inorgnicos. Existen seis categoras de nutrientes: agua, minerales, protenas, grasas, carbohidratos y vitaminas.

Las vitaminas son compuestos orgnicos de bajo peso molecular (menos de 1550 D), no pueden ser sintetizadas por el hombre o slo lo son en cantidades insuficientes. Estos compuestos son importantes porque tienen un papel central en el metabolismo. Para mantener una salud ptima, deben ser adquiridas de una fuente exgena.

1.1.2 Clasificacin

Las vitaminas se dividen en dos grupos: hidrosolubles y liposolubles; las liposolubles son las vitaminas A, D, E, y K; las hidrosolubles son las vitaminas B1 o iamina, B2 o riboflavina, B3 o niacina, B5 o pantotenato, B6 o piridoxina , B9 o cido flico, B12 o cianocobalamina, la vitamina C y la biotina. (1)

1.2 cido Flico

1.2.1 Estructura qumica y derivados

El cido flico o pteroilglutmico es un nutriente clasificado entre las vitaminas del complejo B. Est formado por una pterdina consistente en un ncleo nitrogenado de dos anillos, un cido p-aminobenzoico y un cido glutmico. (2) Figura 1
kcMo Meo (pMragtutmkso)
COOH
CH2 CHS

OH

NHCH COOH

nh2-

2-amlno-4-hodRxi-6-metAc. pa m b nUo -m oes c Ac. L-QlutfiricQ pterid n a Acido ptrolco Figura 1. Frmula estructural del cido flico.

Las vitaminas interrelacionadas varan solamente en el nmero de glutamatos, y los ms frecuentes son los que contienen 3 y 7 residuos. Los glutamatos estn unidos entre s por enlaces peptdicos, que deben ser hidrolizados para llevar la estructura hasta folato libre, forma en que se absorben las vitaminas de este grupo. En el ser humano, la hidrlisis se lleva a cabo por la accin de la conjugasa, una enzima de la mucosa intestinal que cumple numerosas funciones en el organismo. (3)

Los

anlogos

estructurales

del

cido

flico

son

los

compuestos

metablicamente activos referidos como folatos. Los folatos son poliglutamatos del cido pteroico, que exhiben actividad biolgica similar a la del cido flico. La palabra folato deriva del latn "folium" que significa hoja. Lucy Wills identific el folato como un nutriente necesario para prevenir la anemia de las mujeres embarazadas; demostr que la anemia poda ser corregida con un extracto de levadura. El folato fue identificado como una sustancia constituyente del extracto de levadura en los aos 30s y fue extrado de las hojas de las espinacas en 1941. Se pueden encontrar hasta ocho residuos de glutamato en estos compuestos que existen naturalmente. Dentro de los folatos se encuentran el cido flico o

pteroilmonoglutamato, el dihidrofolato (DHF), el tetrahidrofolato (THF), el N-5metiltetrahidrofolato (5-Me-THF), el cido 5,10-metilentetrahidroflico (5,10-CH2THF), el cido hidroximetiltetrahidroflco, el N-5-formiliminotetrahidrofolato (FlTHF) y el N-10-formiltetrahidrofolato (F-THF, cido folnico). (4)

1.2.2 Metabolismo.

Los poliglutamatos de folatos que existen en la naturaleza se hidrolizan a monoglutamatos antes de su absorcin (la cual tiene lugar principalmente en el yeyuno proximal), por las clulas de la mucosa intestinal. Despus de esto, el folata entra al hgado a travs de la circulacin porta. El hgado convierte algunos de estos monoglutamatos de folato a poliglutamatos, los que probablemente son luego almacenados; otra fraccin del folato se excreta en la bilis como 5-Me-THF, el cual es reabsorbido y es la forma circulante principal de folato; en la forma de monoglutamato, entra rpidamente al plexus coroideo y al lquido cefalorraqudeo (LCR). El cido flico es transportado rpidamente desde el LCR hasta el plasma. Se ha identificado una protena fijadora de folato en el plexus coroideo, probablemente responsable de la alta relacin LCR/plasma. El catabolismo del folato involucra ruptura dei anillo de pterina, seguido de acetiacin para formar el producto excretado, cido p-acetamidobenzoilglutmico. (4)

1.2.3 Funcin

Los folatos funcionan metablicamente como coenzimas que participan en diversas reacciones de transferencia de un carbono, incluyendo sntesis de purina, as como interconversiones de aminocidos. Los folatos son esenciales en muchos procesos celulares incluyendo la sntesis de DNA y replicacin celular. El folato y la vitamina B12 estn muy relacionados metablicamente. (5)

1.2.4 Efectos y requerimientos.

La deficiencia de folato produce alteraciones en la divisin celular y en la sntesis proteica. Esta deficiencia es frecuente, y se observa en diversas

afecciones clnicas. Muchos frmacos anticonvulsivos que se emplean para tratar la epilepsia conducen al desarrollo de deficiencias de folato. Est demostrado que otros frmacos interfieren en el metabolismo del folato, entre los que se cuenta la sulfosalacina, isoniacida y cicloserina, para el tratamiento de la tuberculosis, y los anticonceptivos orales. (5)

Existen evidencias epidemiolgicas que sugieren que la homocistena elevada en plasma es un factor de riesgo para enfermedades cardiovasculares; una alta ingesta de cido flico reduce los niveles de homocistena. (5,6)

Otros ejemplos sobre un gran requerimiento de folatos incluyen las anemias hemolticas, deficiencia de hierro, premadurez y mieloma mltiple. Los pacientes que reciben tratamiento de dilisis pierden folato rpidamente. La deficiencia de folato debido a una mala absorcin da lugar a enfermedad celaca, enfermedades inflamatorias del intestino, paro cardaco e infecciones bacterianas sistmicas. Tanto las condiciones cidas como las bsicas pueden interferir con el transporte intestinal; los aniones orgnicos que se acumulan en la uremia tambin alteran la absorcin del folato. Se han reportado alteraciones genticas en la mayora de las enzimas que interconvierten el folato. Se han descrito algunos casos de nios mentalmente retardados, incapaces de transferir folatos de la

sangre al LCR; esto se debe probablemente a sistemas anormales de unin a transportadores de folato en el sistema nervioso central. (7)

Otro hallazgo reciente es que el cido flico, conjuntamente con el cinc, ayuda a mejorar la cantidad y calidad de los espermatozoides en el semen de hombres que padecen de problemas de infertilidad. Adems, el cido flico puede ser til para aumentar la respuesta de los medicamentos antidepresivos como Prozac y Paxil. (7)

Los folatos juegan un papel importante en los defectos del tubo neural. Expertos han hecho nfasis en la necesidad de ingerir cido flico durante el embarazo ya que los defectos en el sistema neurolgico del beb se desarrollan durante las primeras semanas. (8)

Los defectos

del tubo

neural (DTN)

anencefalia,

espina bfida y

encefalocele son un problema de salud pblica en el mbito mundial. Mxico ocupa el segundo lugar en incidencia, con una tasa de 36 por 10 000 nacidos vivos, precedido solamente por China. (9)

En Nuevo Len, estas malformaciones son una causa muy importante de mortalidad y morbilidad infantil. De 1994 a 1998, la tasa promedio de mortalidad por DTN observada en menores de un ao fue de 9.0 por 10 000. En 1997, se presentaron en Nuevo Len 73 casos de defuncin por DTN en menores de un ao, de los cuales 56 fueron anencefalia y 17 espina bfida. (9)

Estos defectos han sido asociados a la deficiencia de cido flico y se consideran dentro de los defectos congnitos que se pueden prevenir. En varios pases se han desarrollado diversas estrategias para llevar a cabo una reduccin de dichos defectos con la ingesta o administracin de cido flico. Estas estrategias han consistido en fomentar una dieta bien balanceada, incrementar el consumo de alimentos ricos en cido flico y fortificar harinas y cereales con esta vitamina. (9)

Las necesidades diarias de folatos son de 0.400 miligramos diarios. En el embarazo, las necesidades aumentan hasta 0.800 miligramos diarios.

Las personas que padecen de epilepsia no deben ingerir dosis mayores a los 4000 microgramos ya que existe la posibilidad de que pueden provocar un aumento en la actividad convulsiva. Adems, una dosis por arriba de 1000 microgramos diarios puede enmascarar una anemia por deficiencia de vitamina B12. (7)

1.2.5 Fuentes

Algunas de las principales fuentes alimentarias de cido flico son los vegetales de hojas verdes, el hgado, los granos integrales, los ctricos, las nueces, las legumbres y la levadura de cerveza. Algunas sustancias interfieren con la absorcin y utilizacin del cido flico, entre las que destacan el alcohol,

los estrgenos, medicamentos anticonvulsivantes y algunas drogas utilizadas en la quimioterapia.

Otro dato importante es que el cido flico se destruye con el calor, por lo que al cocinar los alimentos ms tiempo de lo necesario se reduce la cantidad de ste. Los alimentos que se almacenan a temperatura ambiente durante mucho tiempo tambin pierden gran parte del cido flico. (6,7)

1.3 Fortificacin o enriquecimiento de alimentos.

1.3.1 Definiciones

Estos

dos trminos,

aunque con

matices

diferentes,

se

emplean

generalmente como sinnimos y se utilizan indistintamente para indicar que un alimento o producto alimenticio se le han aadido algunos nutrientes,

especialmente vitaminas o minerales, para restaurar o aumentar su valor nutricional. (10)

Algunos procesos tecnolgicos, como el refinado de las harinas y de los cereales en general, provocan importantes prdidas de minerales y vitaminas con respecto al contenido del grano entero. Tambin la eliminacin de la grasa de muchos alimentos para reducir su valor calrico, conlleva la prdida de las vitaminas liposolubles, como la A o la D. Por ello mediante el enriquecimiento se

restauran o incluso se superan los niveles inicales de los nutrientes perdidos durante la manipulacin de los alimentos. El trmino fortificacin, sin embargo, se aplicara a aquellas situaciones en las que se aade un determinado nutriente a un alimento que originalmente careca de l. La adicin de yodo a la sal de mesa sera un buen ejemplo de fortificacin. (11)

Un aspecto importante en la fortificacin es elegir el alimento idneo y los nutrientes a aadir. Respecto al primero, aparte de tomar en cuenta los problemas que pueden surgir desde el punto de vista tecnolgico, es imprescindible que el alimento escogido forme parte de los hbitos alimentarios del grupo al que va destinado. Por ejemplo, un alimento muy til para aadir vitaminas liposolubles es la margarina. Sin embargo, en los grupos de poblacin en los que no se consuma habitual mente, la fortificacin de la margarina puede ser totalmente ineficaz. Por el contraro, la leche sera un alimento ideal para fortificar con ciertos nutrientes, especialmente aquellos dirigidos a los nios.

1.3.2 Cereales

Los cereales desempean un papel predominante en el aporte de nutrientes a la poblacin; constituyen la principal fuente de energa y por ende son la base de la alimentacin. Se utilizan ampliamente como vehculo de vitaminas hidrosolubles. (10,11)

1.3.3 El cido ftico como auxiliar para prevenir enfermedades.

En condiciones normales nutriconales las personas ingieren cantidades suficientes de cido ftico para sus necesidades. Sin embargo, en aos recientes se ha hecho evidente que es importante que la mujer que planifica quedar embarazada o ya lo est, ingiera una cantidad mayor de cido flico (800 microgramos al da). Esto se ha asegurado a travs de la fortificacin o enriquecimiento de productos alimenticios como granos, pan, pastas, arroz, harina y cereales. (4,5,6)

Debido a la incertidumbre de los niveles de varios folatos y a la conocida inestabilidad de muchas formas de stos bajo las condiciones del proceso trmico, los productos como las frmulas infantiles son fortificados con una forma sencilla y estable de la vitamina para alcanzar los niveles reglatenos y

nutriconales. El cido flico es una de las vitaminas de eleccin para los productos fortificados. Las comidas fortificadas contienen una forma sinttica de cido flico que es ms fcil de absorber por el cuerpo.

1.3.4 Legislacin

En 1996 la FDA (Administracin de Alimentos y Drogas), organismo encargado del control de medicinas y alimentos en Estados Unidos, orden la

adicin de cido flico en ciertas harinas incluyendo las ms enriquecidas: pan, granos, arroz, comidas de maz y diversas pastas. (10)

Los niveles que se recomienda para la adicin de vitaminas y minerales a las harinas de trigo y maz en Mxico se muestran en las tablas I y II. (12)

Nutrientes Riboflavina Niacina Acido

Nivel mnimo 2.4 28

Nivel recomendado 3.0 35

Nivel mximo 5.0 45

1.6 Flico Hierro 24

2.0

3.2

30

40

Tabla I. Niveles de nutrimentos en mg/Kg en harina de trigo.

Nutrientes Riboflavina Niacina Acido

Nivel mnimo 2.4 28

Nivel recomendado 3.0 35

Nivel mximo 5.0 45

0.4 Flico Hierro 24

0.5

0.8

30

40

Tabla II. Niveles de nutrimentos en mg/Kg en maz.

1.4 Mtodos para la determinacin de cido flico.

1.4.1 Mtodo microbiolgico

El mtodo oficial para la determinacin de cido flico es el microbiolgico. (12). Este ensayo est basado en la medicin del crecimiento del microorganismo Lactobacillus casei, el cual requiere cido metiltetrahidroflico para su desarrollo. El crecimiento del microorganismo est directamente relacionado con la

concentracin de folato en la muestra y es monitoreado por medicin de la turbidez de la solucin de crecimiento. (13)

Aunque el ensayo microbiolgico es altamente sensible, es tardado, laborioso y de reproducibilidad no consistente. La respuesta en el crecimiento del microorganismo vara dependiendo de las diferentes formas de folato. Adems, ciertos compuestos del mismo alimento pueden estimular o inhibir el crecimiento bacteriano, dando resultados no confiables. Por esta razn, el mtodo

microbiolgico es un mtodo no deseable para el anlisis de cido flico. (14-17)

1.4.2 Mtodos por Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (CLAR)

Se han reportado numerosos artculos acerca de la determinacin de cido flico y folatos en diferentes alimentos por Cromatografa de Lquidos de Alta

Resolucin; en ellos los resultados demuestran que el mtodo asegura la separacin y determinacin de cido flico y de los diferentes tipos de folatos. (18-23)

En la tabla III se presenta los resultados de un estudio Inter-laboratorio para la determinacin de cido flico en donde se muestra que, en general, todos los mtodos llevan a cabo un proceso de extraccin, purificacin y anlisis; sin embargo cada uno de ellos emplea diferentes condiciones de trabajo.

Los resultados de precisin reportados, demuestran que la variacin tanto i ntrala borato rio como interlaboratorio, para la determinacin de folato, es menor cuando se emplea Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin que cuando se emplea el mtodo Microbiolgico. (24)

Laboratorio 1

Laboratorio 2

Laboratorio 3

Extraccin

Buffer de acetatos HK

Buffer de fosfatos HK-HP

Buffer de acetatos HK-HP

Purificacin

SAX

SAX

Filtro 0.45 pm

Sephadex A25

Merck

Columna

C18

Merck RP-18

ODS Hypersil

Fase Mvil

KH2P04:CH3CN

H3P04:CH3CN:Me0H 86.5:11:2.5

H2OMeOH 70:30

90:10

Tabla III. Condiciones de CLAR usados en estudios comparativos

1.5 Descripcin del problema

La necesidad de mtodos analticos rpidos para la cuantificacin de vitaminas en alimentos fortificados es cada vez mayor, debido al incremento del proceso de fortificacin y al nfasis en la informacin nutricional que deben mostrar los alimentos enriquecidos con cido flico.

Debido a la importancia clnica del cido Flico y dadas las bondades que ofrece el mtodo de CLAR, consideramos importante implementar en nuestro medio un mtodo analtico alterno al microbiolgico que permita la determinacin de cido flico en confiable. cereales enriquecidos de una manera rpida, sencilla y

1.6 Objetivos

Por lo anterior, el presente trabajo se llev a cabo bajo el siguiente objetivo:

1.6.1 Objetivo general

Desarrollar un mtodo analtico por Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin para la determinacin de cido flico en cereales enriquecidos.

1.6.2 Objetivos especficos

1 .-Desarrollar un mtodo de anlisis de cido flico por Lquidos de Alta Resolucin.

Cromatografa de

2.-Desarrollar un mtodo de extraccin de cido flico en cereales enriquecidos.

3.- Validar el mtodo analtico desarrollado.

4.- Aplicar el mtodo desarrollado para la determinacin de cido flico en cereales enriquecidos que se expenden en el rea metropolitana de Monterrey.

CAPTULO 2

MATERIAL Y MTODOS

2.1 Equipo, material y reactivos

2.1.1 Equipo

a)

Cromatgrafo de Lquidos de Alta Resolucin Waters 2690 con Detector UV-Visible 996 con arreglo de diodos.

b) c) d) e) f)

Bao de agua con control de temperatura CRAFT. Potencimetro Beckman 61 Balanza analtica Sartorus modelo BA-1105 Bomba de vaco Gast Emerson Placa de agitacin.

2.1.2 Materiales

a) Cartuchos SAX Strata SAX (55pm, 70a) b) Columna fase reversa ODS Beckman 5 pm de tamao de partcula, 4.6mm x 150 mm c) Columna fase reversa dCia Atlantis 5pm de tamao de partcula, 4.6 x 150 mm d) Sistema de filtracin Millipore e) Pipeta automtica de 10 a 100 pL y puntillas f) Pipeta automtica de 100 a 1000 \iL y puntillas

g) Matraces de aforacin de 10, 50, 100, 250 y de 1000 mL h) Tubos de ensaye de 13 X 100 mm i) Agitadores de vidrio j) Vasos de precipitado de 10, 50, 150, 250 y 400 mL

k) Matraces Erlenmeyer de 250 mL I) Papel parafilm

m) Barras magnticas n) Papel filtro Whatman No. 40 de 7 cm de dimetro o) Mortero y pistilo de porcelana p) Pipetas lineales de 10 mL q) Filtros para solventes Millipore GV 0.22pm r) Filtros para agua Millipore HA 0.45pm s) Termmetro t) Embudos de filtracin

u) Esptulas v) Guarda columna Sentry Guard Holder Universal 50 x 75 mm

2.1.3 Reactivos

a) Estndar de cido flico Sigma b) Fosfato dicido de potasio (KH2PO4) c) Fosfato monocido de potasio (K2HPO4) d) cido fosfrico (H3PO4) e) Fosfato monocido de sodio (Na2HPC>4) al 5% f) Fosfato de tetra butil amonio Backer Analyzed grado HPLC (TBA)

g) cido ascrbico al 0.05% h) cido trifluroactico al 0.1% i) j) Enzima alfa amilasa Sigma 250,000 U Acetato de sodio (NaC 2 H 3 0 2 ) 0.1M

2.1.4 Solventes

a) Metanol (MeOH) grado HPLC b) Acetonitrilo (AcN) grado HPLC c) Hexano

2.2 Establecimiento de las condiciones de anlisis de cido flico por CLAR

Para

el establecimiento de

las diferentes

condiciones de

anlisis

cromatogrfico se trabaj con el estndar de cido flico de 1 ppm y se probaron dos sistemas:

Sistema 1.

Cromatgrafo de Lquidos de Alta Resolucin Detector UV-Vs con arreglo de diodos a una A de 280 nm. Columna de fase inversa ODS Beckman de dimensiones 4.6 mm x 150 mm y 5 \im de dimetro de partcula

Fase mvil metanokbuffer de fosfatos pH 7 con TBA 0.005M en una relacin 24:76

Elucin socrtica Velocidad de flujo de 1 mL/min. Volumen de inyeccin 10pL.

Sistema 2.

Columna de fase inversa Atlantis d C l 8 dimensiones 4.6 x 150 mm y 5pm de dimetro de partcula

Fase mvil cido trfluroactico 0.1%:acetonitrilo relacin 85:15 Elucin socrtica Velocidad de flujo de 1.4 mL/min. Volumen de inyeccin 10pL. Deteccin a 280 nm.

Se hicieron cambios en la composicin de la fase mvil y en la velocidad de flujo y se inyect el estndar de cido flico en cinco ocasiones bajo las diferentes condiciones de ensayo. Los porcentajes de la fase mvil que se probaron fueron: 83:17, 85:15, 87:13 de ATF 0.1% : AcN respectivamente, cada uno de ellos a tres diferentes velocidades de flujo: 1.2,1.4 y 1.6 mL/min.

2.2.1 Evaluacin de parmetros cromatogrficos.

Para seleccionar las mejores condiciones de anlisis se evaluaron los siguientes parmetros: el Nmero de Platos Tericos (N), el Factor de capacidad (k') y el Factor de Asimetra (FA), los cuales fueron calculados a partir de los cromatogramas obtenidos por medio de las siguientes ecuaciones: (22)

N= 16 (tr/w)2 donde: tr= tiempo de retencin en minutos.

(ecuacin 1)

w= ancho de base en minutos.

k'= (tr-to)/to donde: to= tiempo muerto. tr= tiempo de retencin.

(ecuacin 2)

FA= A/B donde:

(ecuacin 3)

A= distancia medida en la base, del inicio al centro del pico B= distancia medida en la base, del centro al final del pico

2.2.2 Validacin del sistema

Una vez seleccionadas las condiciones ptimas se valid el sistema con los siguientes parmetros:

2.2.2.1 Linealidad.

Para establecer la linealidad del sistema desarrollado se emple el coeficiente de variacin (CV) de los factores de respuesta.

Se prepararon estndares de cido flico en la fase mvil seleccionada en el rango de 0.1 a 4.0 ppm para la elaboracin de una curva de calibracin, se grfico la respuesta del detector en funcin de la concentracin. Se calcularon los factores de respuesta (FR) para cada uno de los puntos de la curva empleando la ecuacin: (25-28)

FR= respuesta del detector/concentracin del estndar.

(ecuacin 4)

Para nuestro caso la respuesta del detector correspondi al rea del pico. Una vez obtenidos los factores de respuesta en cada uno de los puntos de la curva de calibracin se calcul el coeficiente de variacin (CV) con la ecuacin:

CV= (SD X 100) / "X donde: CV= es el porciento del coeficiente de variacin SD= desviacin estndar de los factores de respuesta calculados empleando el programa Microsoft excel. X== promedio de los factores de respuesta.

(ecuacin 5)

2.2.2.2 Precisin

Para evaluar la precisin del sistema se emple un estndar de 1 ppm, el cual se inyect y analiz bajo las condiciones cromatogrficas previamente seleccionadas, en cinco ocasiones consecutivas y en tres das diferentes.

De los cromatogramas obtenidos se tomaron los datos de tiempo de retencin y rea del pico cromatogrfico.

Con los 15 datos obtenidos tanto del tiempo de retencin como del rea del pico se calcul el promedio, la desviacin estndar y el coeficiente de variacin haciendo uso del programa Microsoft excel.

2.2.2.3 Limite de deteccin.

El lmite de deteccin del mtodo desarrollado se determin basndonos en el mtodo descrito por Quatrocchi (22) y que consiste en considerar tres desviaciones estndar del blanco, de acuerdo a la siguiente ecuacin:

Lmite de deteccin = Ybl + 3 (Sbl / b) donde: b= pendiente de la curva de calibracin (rea vs concentracin)

(ecuacin 6)

Ybl= respuesta del blanco, estimada por extrapolacin de la respuesta a concentracin cero en la curva de calibracin obtenida a concentraciones bajas. Sbl= desviacin estndar de la respuesta del blanco.(Ybl)

2.2.2.4 Lmite de cuantficacin.

El lmite de cuantficacin se obtuvo considerando 10 veces la desviacin estndar del blanco; se emple la siguiente ecuacin:

Lmite de cuantificacin = Ybl + 10 (Sbl / b)

(ecuacin 7)

2.3 Desarrollo de un procedimiento para la extraccin de cido flco en cereales.

Antes de empezar a trabajar con las muestras comerciales, se procedi a analizar una muestra de cereal no fortificada a la que le llamamos virgen, para conocer la presencia o ausencia de cido flico. sta fue proporcionada por la empresa Kellog's, y se almacen en un recipiente metlico de tapa hermtica, para evitar la humedad y el contacto con la luz.

El desarrollo del procedimiento para la extraccin de cido flico en cereales se llev a cabo en dos etapas: la primera consisti en el tratamiento previo de la muestra y la segunda correspondi al proceso de purificacin.

2.3.1 Tratamiento previo de ia muestra

El mtodo consisti en homogenizar 2 g de la muestra en 45 mL de K2HPO4 0.1M a un pH entre 8 y 9, y llevar a agitacin constante por espacio de 1 hora. Despus de la hora se ajust a un pH de 7 para poder llevar a cabo la digestin enzimtica, para lo cual se adicion 1mL de la enzima alfa amilasa (a una concentracin de 25 mg/mL ) por cada gramo de muestra en un bao de agua a 65 C por 1 hora. Despus de la hora se inactiv la enzima elevando la temperatura a 90C, se enfri la muestra y se afor a 50 mL con buffer de fosfatos, posteriormente se filtr con papel filtro Watman No. 40. (29)

2.3.2 Purificacin

Los filtrados obtenidos del tratamiento previo de la muestra fueron sometidos a una extraccin en fase slida empleando cartuchos SAX de intercambio amnico fuerte. El proceso consisti en activar los cartuchos con 3mL de hexano seguido de 3mL de metanol y 5 mL de K2HPO4 0.1M a un pH de 7. Posteriormente se pasaron 4 mL del filtrado por el cartucho a un flujo de 0.3 mL/min; finalmente se eluy el cido flico del cartucho con 4 mL de una mezcla de acetato de sodio 0.1M (pH 4.5), Na 2 HP0 4 5%(p/v) y 0.05% de cido ascrbico. (29,30)

2.3.3 Seleccin del mtodo de extraccin

Los extractos purificados fueron analizados por CLAR con las condiciones establecidas durante el desarrollo y optimizacin del mtodo; los parmetros evaluados fueron la reproducibilidad y la recuperacin.

2.4 Validacin del mtodo

Para validar el mtodo desarrollado para el anlisis de cido flico en cereales enriquecidos se emplearon los siguientes parmetros: precisin, exactitud, estabilidad y robustez. linealidad,

2.4.1 Linealidad.

Para establecer la linealidad del mtodo desarrollado se emple el coeficiente de variacin (CV) de los factores de respuesta.

Se prepararon estndares de cido flico los cuales fueron adicionados a la muestra de cereal virgen en el rango de 0.1 a 4.0 ppm para la elaboracin de una curva de calibracin; se grfico la respuesta del detector en funcin de la concentracin. Esto se realiz por triplicado. Se calcularon los factores de respuesta (FR) para cada uno de los puntos de la curva.

FR- respuesta del detector/concentracin del estndar

(ecuacin 4)

Para nuestro caso la respuesta del detector correspondi al rea del pico. Una vez obtenidos los factores de respuesta en cada uno de los puntos de la curva de calibracin se calcul el coeficiente de variacin (CV) con la ecuacin:

CV= (SD X 100) / X donde: CV= es el porciento del coeficiente de variacin SD= desviacin estndar de los factores de

(ecuacin 5)

respuesta

calculados

empleando el programa Microsoft excel. X= promedio de los factores de respuesta.

2.4.2 Precisin

La precisin del mtodo se realiz a medio y alto.

3 niveles de concentracin: bajo,

Se

tomaron

muestras

virgen

adicionadas

para

cada

nivel

de

concentracin y se procesaron de acuerdo con el mtodo de tratamiento previo y purificacin seleccionados. Estas muestras se inyectaron en el cromatgrafo y de los cromatogramas obtenidos se tomaron los datos de tiempo de retencin, rea y altura del pico cromatogrfico.

Con los 15 datos obtenidos se calcul el promedio, la desviacin estndar y el coeficiente de variacin; se us el programa Microsoft excel.

2.4.3 Exactitud.

La exactitud se obtuvo como el porcentaje de recuperacin. Se realiz a tres niveles; bajo, medio y alto. Se adicion a la muestra virgen 0.2,1.2 y 3.2 ppm de cido flico. Se tomaron 5 muestras por cada nivel, se procesaron bajo las condiciones ya establecidas y se obtuvieron los cromatogramas. Con los datos obtenidos de las reas de los picos se calcul el porcentaje de recuperacin aplicando la ecuacin:

% de recuperacin = (A.M.C.-A.M.S.C.) 100/A.St. donde: A.M.C. = es el promedio de las reas de las muestras contaminadas.

(ecuacin 8)

A.M.S.C.= es el promedio de las reas de las muestras sin contaminar. A. St.= promedio de las reas de las reas del estndar.

Las muestras fueron tratadas de acuerdo al mtodo de extraccin y purificacin seleccionadas.

2.4.4 Estabilidad

La estabilidad se prob tanto para el estndar como para las muestras. El estndar de cido flico se prepar y se inyect al cromatgrafo el mismo da para obtener el rea del pico cromatogrfico. Posteriormente fue guardado en refrigeracin a 4C y en oscuridad. Peridicamente se inyectaba ese estndar para obtener el rea del pico cromatogrfico y compararla con la obtenida el da de su preparacin. De la misma manera se hizo para las muestras; por medio de una grfica de rea vs los das de almacenamiento, se obtuvo la estabilidad del estndar y de las muestras.

2.4.5 Robustez

Para medir la robustez del mtodo se realizaron modificaciones en el proceso de extraccin y en el proceso de anlisis cromatogrfico.

Proceso de extraccin:

Se modific la cantidad de amilasa agregada; aumentando a 2mL de solucin/g de muestra, se proces y analiz bajo esta condicin; se obtuvo el porcentaje de recuperacin y por medio de una prueba estadstica se observ si haba diferencia significativa.

Proceso de anlisis cromatogrfico:

Se modific el porcentaje de fase mvil a dos niveles: uno por encima y otro por debajo de los porcentajes ptimos de anlisis. Se inyect un estndar de 1 ppm de cido flico en 5 ocasiones consecutivas bajo estas condiciones, as como tambin en las condiciones ya establecidas.

Se calcul el factor de capacidad, el nmero de platos tericos y el tiempo de retencin. Los nuevos parmetros obtenidos con los pequeos cambios realizados se compararon con los obtenidos bajo las condiciones cromatogrficas ya establecidas empleando una prueba t student de dos colas. (31,32,33)

2.5 Aplicacin del mtodo desarrollado para la determinacin de cido flico en cereales enriquecidos que se expenden en el rea metropolitana de Monterrey.

2.5.1 Seleccin de muestras

Se seleccionaron 10 muestras al azar de cereales enriquecidos que se expenden en la zona metropolitana de Monterrey para determinar los niveles de cido flico aplicando el mtodo desarrollado; se verific que proveyeran de diferentes lotes.

2.5.2 Procesamiento de las muestras

Las muestras se procesaron aplicando el mtodo seleccionado de tratamiento previo de la muestra y purificacin, se inyectaron en el cromatgrafo de lquidos y se trabaj bajo las condiciones previamente establecidas.

Los niveles de cido flico fueron reportados en pg/100 g.

CAPTULO 3

RESULTADOS

3.1 Condiciones cromatogrficas

Para

el establecimiento de

las diferentes

condiciones

de

anlisis

cromatogrfico se trabaj con el estndar de cido flico de 1 ppm y se probaron dos sistemas que fueron descritos en el captulo 2.

3.1.1 Sistema 1.

Se obtuvieron los cromatogramas que se muestran en las figuras 2, 3 y 4. La figura 2 muestra un pico simtrico que corresponde al estndar de cido flico de 1 ppm, con un tiempo de retencin de 14.870 min.

S O04 0-

Figura 2. Cromatograma del estndar de cido flico de 1 ppm. Fase mvil metanol:buffer de fosfatos pH 7 con TBA 0.005M (24:76), fase estacionaria columna de fase inversa C18, flujo 1 mL/minuto y deteccin a 280 nm.

Sin embargo, al tratar de reproducir las condiciones, no se obtuvo el mismo pico cromatogrfico, lo que se observa en las figuras 3 y 4. La figura 3 muestra un cromatograma con un pico ancho con un tiempo de retencin de 17.367 que corresponde al estndar de cido flico de 1 ppm inyectado por segunda vez.

2.0o

-too

eoo

a.oo

IO'OO Minutas

u'oo

1 o 4 o

leoo

is'oo

zo'oo

Figura 3. Cromatograma del estndar de cido flico de 1 ppm. Fase mvil metanohbuffer de fosfatos pH 7 con TBA 0.005M (24:76), fase estacionara columna de fase inversa C18, flujo 1 mL/minuto y deteccin a 280 nm.

La figura 4 muestra un cromatograma con un pico muy pequeo y deforme con un tiempo de retencin de 12.061 min, inyeccin del estndar de cido flico de 1 ppm. que corresponde a la tercera

Figura 4. Cromatograma del estndar de cido flico de 1 ppm. Fase mvil metanol:buffer de fosfatos pH 7 con TBA 0.005M (24:76), fase estacionaria columna de fase inversa C18, flujo 1 mL/minuto y deteccin a 280 nm

Como podemos observar el pico cromatogrfico no permanece constante, se deforma y el tiempo de retencin vara, es decir la precisin no es buena, por lo que decidimos probar el sistema 2.

3.1.2 Sistema 2

Se obtuvieron los cromatogramas mostrados en las figuras 5 y 6. La figura 5 muestra un cromatograma con un pico simtrico con un tiempo de retencin de 2.963 min que corresponde al estndar de cido flico de 1 ppm.

O 01 o0 00fro ooe0 004-

0 002-

oooo-1 Figura 5. Cromatograma del estndar de cido ftico de 1 ppm. Fase mvil cido trfluroactico 0.1% : acetonitrilo (85:15), fase estacionara columna de fase inversa Atlantis dC18 5gm de dimetro de partcula 4.6 x 150 mm., flujo 1.4 mL/minuto y deteccin a 280 nm.

Posteriormente, se decidi inyectarlo en 5 ocasiones para

observar la

precisin. La figura 6 muestra un cromatograma con un pico simtrico con un tiempo de retencin de 2.963 min, que corresponde al estndar de cido ftico de 1 ppm.

OC Dh I

Figura 6. Cromatograma del estndar de cido folieo de 1 ppm. Fase mvil cido trfluroactico 0.1%:acetonitrilo (85:15), fase estacionara columna de fase inversa. Atlantis dC18 5pm de dimetro de partcula 4.6 x 150 mm, flujo 1.4 mL/minuto y deteccin a 280 nm

En las siguientes inyecciones se obtuvieron los mismos resultados: el pico cromatogrfico permaneci constante y present una buena precisin, por lo que decidimos optimizar y validar estas condiciones cromatogrficas.

3.2 Optimizacin de parmetros cromatogrficos

Para la optimizacin se hicieron cambios en los porcentajes de la fase mvil y en la velocidad de flujo, y se evaluaron los parmetros de N, k' y FA; se obtuvieron los resultados mostrados en la tabla IV. Las condiciones

cromatogrficas seleccionadas para el resto del estudio son las resaltadas en negrita.

ATF 0.1%: AcN Velocidad de Flujo mL/mirr/ / Parmetros tr N k' F.A. 2.461 2192 0.311 1.06 y/ 1.2

83:17

85:15

87:13

1.4

1.6

1.2

1.4

1.6

1.2

1.4

1.6

2.381 2267 0.320 1.06

2.191 2276 0.360 1.06

3.040 2187 0.580 1.03

2.979 2271 1.030 1.03

2.558 1675 0.598 1.08

4.191 2189 1.121 1.10

4.016 2867 1.231 1.10

3.080 2243 1.114 1.08

Tabla IV. Seleccin de condiciones cromatogrficas para el anlisis de cido flico.

3.3 Parmetros de validacin del sistema

Para la validacin del sistema se evaluaron los parmetros de precisin, linealidad, lmite de deteccin y lmite de cuantificacin, obtenindose los resultados mostrados en las tablas de la V a la IX, as como en la figura 7.

3.3.1 Precisin intrada

En la tabla V se muestran los resultados de la precisin intrada para el estndar de 1 ppm de cido flico

tr 2.875 2.903 2.902 2.885 2.864 2.835 2.812 2.792 2.799 2.862

rea 17776 17163 17102 16938 17269 17122 17015 17298 17300 17251 17223 229 1.33

altura 3091 3008 2995 2996 3051 3094 3108 3140 3130 3059 3067 54 1.76

x= s= %cv=

2.852 0.041 1.44

Tabla V. Resultados de la precisin intrada del estndar de cido flico de 1 ppm. (n=10)

3.3.2 Precisin interda

En la tabla VI se muestran los resultados de la precisin interda para el estndar de 1 ppm de cido flico

tr 2.963 2.928 3.011 3.024 3.044 3.042 2.988 2.875 2.903 2.902 2.885 2.864 2.835 2.812 2.792 2.799 2.862 2.959 2.849 2.831 2.821 2.816 2.806 2.797 2.787 2.796 2.866 x= s= %cv= 2.883 0.083 2.88

rea 16328 16114 16343 15954 15961 16159 17108 17776 17163 17102 16938 17269 17122 17015 17298 17300 17251 15515 15782 15649 16100 15944 15672" 15850 16225" 16039" 15662 ~ 16468" 672 v 4.07 "

altura 2825 2836 2743 2673 2683 2713 2926 3091 3008 2995 2996 3051 3094 3108 3140 3130 3059 2646 2816 2807 2884 2894 2885 2899 2971 2881 2759 2908 149 5.13

Tabla VI. Resultados de la precisin jnterda del estndar de cido flico de 1 ppm. (t-^27)

3.3.3 Linealidad

En la figura 7 se muestra la curva de calibracin para el cido flico, donde se observa la linealidad en el rango de 0.1 a 4 ppm, se present un coeficiente de correlacin lineal de 1 con coeficiente de variacin de 3.27%

ppm Figura 7. Curva de calibracin de cido flico, rea vs concentracin.

Se realizaron 6 curvas de calibracin; se obtuvieron las siguientes ecuaciones de la recta:

y= mx + b

1 y = 17500 X - 470 2.- y= 16834 X +139

r 2 =0.9996 r 2 =0.9998

3.4.5.6.-

y= 16800 X - 1 9 1 y= 16820X+108 y= 17300 X - 1 8 4 y= 17200 X - 7 7 . 8

r2 =0.9997 r 2 =0.9998 r 2 =0.9999 r 2 =0.9999 r2 = 1

Curva de calibracin de cido flico promedio y= 17037 X - 119.43

Se obtuvo tambin el coeficiente de variacin de los factores de respuesta, mostrado en la tabla VII.

[]
ppm 0.1 0.3 0.5 1 2 3 4 X S %cv

FR rea/[ ] 15511.90 16987.03 16783.10 16822.72 17070.30 17077.79 17010.91 16708.80 547.00 3.27

Tabla VII. Coeficiente de variacin de los factores de respuesta de las curvas de calibracin de cido flico.

3.3.4 Lmites de deteccin y cuantificacin

LD=Ybl+3Sbl/b y donde: Ybl = intercepto de la curva de linealidad Sbl = intercepto de la grfica S vs. [ ] b = pendiente de la curva de linealidad

LC=Ybl+10Sbl/b

Los datos para la determinacin de la desviacin estndar del blanco se muestran en la tabla VIII.

rea

concentracin en ppm 0.03 0.04 845 427 762 560 598 686 692 716 464 740 548 106 ppm 0.03 0.04 0.05 Sb1 b 750 60 S 106.156 60.251 52.093 180.959 -2703.15

0.05 895 855 976 865 850 888 52

X S

Tabla VIII. Datos para calcular los lmites de deteccin y cuantificacin.

Los resultados para los lmites de deteccin y cuantificacin se presentan en la tabla IX.

Curvas de linealidad 1 2 3 4 5 6 X

Lmite de Lmite de deteccin en ppm cuantificacin en ppm 0.076 0.041 0.040 0.115 0.020 0.096 0.038 0.113 0.093 0.020 0.098 0.027 0.031 0.098

Tabla IX. Lmites de deteccin y cuantificacin del cido flico.

3.4 Extraccin y purificacin de la muestra

En las figuras 8 y 9 se muestran los cromatogramas obtenidos de la muestra virgen y de la muestra virgen contaminada con cido flico, ambas eludas a pH de 4.5

Figura 9. Cromatograma de la muestra virgen + cido flico 1 ppm eluda a pH de 4.5 bajo las condiciones cromatogrficas ya establecidas.

El cromatograma de la muestra adicionada muestra una seal muy pequea de cido flico, similar a la muestra virgen, ambas eludas a pH 4.5. Bajo estas condiciones se obtuvo un porcentaje de recuperacin de 29.81%, el cual era muy bajo, por lo se decidi cambiar el pH de elucin de 4.5 a 2.5

En las figuras 10 y 11 se muestran los cromatogramas obtenidos de la muestra virgen y de la muestra contaminada con cido flico, ambas eluidas a pH de 2.5.

O O j o

y Vu
a

Figura 11. Cromatograma de la muestra virgen + cido flico 1ppm eluda a pH de 2.5 bajo las condiciones cromatogrficas ya establecidas.

Con estas condiciones el porcentaje de recuperacin aument a 43%, sin embargo segua bajo.

La figura 12 muestra el cromatograma obtenido de la muestra virgen contaminada con cido flico de 1 ppm inyectado directamente empleando slo la filtracin, se aument el porcentaje de recuperacin a 61.33%. Cabe mencionar que se utiliz una guarda columna para alargar la vida media de la columna

filtracin como mtodo de purificacin bajo las condiciones cromatogrficas ya establecidas.

3.4.1 Porcentajes de recuperacin

En la tabla X se muestran los resultados de los porcentajes

de

recuperacin y reproducibilidad del mtodo de extraccin, comparando las dos condiciones empleadas.

Purificacin Parmetros. Reproducibilidad

Extraccin en Filtro Millipore fase slida (0.45 pm)

4.20 %CV Recuperacin 43.00 %R

0.67

61.33

Tabla X. Comparacin de los mtodos de purificacin.

Considerando estos resultados, el mtodo desarrollado de extraccin y purificacin de la muestra fue el siguiente:

Extraccin

Triturar la muestra en un mortero de porcelana Homogenizar 2 g de la muestra en 45 mL de K2HPO4 0.1M a un pH entre 8 y 9

Llevar a agitacin constante en una placa de agitacin por espacio de 1 hora Despus de la hora ajustar a un pM de 7 Realizar una digestin enzimtica, la cual se lleva a cabo adicionando 1 mL de la enzima alfa amilasa (a una concentracin de 25 mg/mL ) por cada gramo de muestra en un bao de agua a 65 C por 1 hora Despus de la hora inactivar la enzima elevando la temperatura a 90C Enfriar la muestra a temperatura ambiente Aforar a 50 mL con buffer de fosfatos Filtrar con papel filtro Watman No. 40

Purificacin

Filtrar a travs de una membrana de 0.45 \im. Inyectar en el cromatgrafo

3.5 Validacin del mtodo desarrollado

3.5.1 Linealidad

En la figura 13 se muestra la curva de calibracin promedio para el cido flico graficando el rea vs la concentracin, e n un rango de 0.1 a 4 ppm, con un coeficiente de correlacin de 0.9994 y coeficiente de variacin de los factores de respuesta de 9.82%.

Curva de calibracin de cido flico

ppm

Figura 13. Curva de calibracin de cido flico. rea vs concentracin.

3.5.2 Precisin

Los resultados de la precisin del mtodo a

los tres niveles

de

concentracin, para tr, rea y altura de pico se muestran en la tabla XI.

\Parmetro Nivel d e \ . concentracin Bajo 0.2 ppm Medio 1ppm Alto 3.2 ppm

tr %CV

rea %CV

Altura %CV

0.06 0.03 0.03

1.50 0.67 2.03

4.77 2.03 4.83

Tabla XI. Resultados de la precisin del mtodo para determinar cido flico. (n=15)

3.5.3 Exactitud

Los resultados de la exactitud del mtodo a

los tres niveles

de

concentracin, por medio de la evaluacin del porcentaje de recuperacin y el coeficiente de variacin se muestran en la tabla XII.

Nivel concentracin Bajo Medio Alto

Parmetro

% de Recuperacin

%CV

0.2 ppm 1.2 ppm 3.2 ppm

62 60 62

1.90 1.02 3.00

Tabla XII. Resultados de la exactitud del mtodo para determinar cido ftico. (n=l5)

3.5.4 Estabilidad

La estabilidad se prob tanto para el estndar como para las muestras fortificadas.

La figura 14 muestra la curva de valoracin para la estabilidad del estndar de cido flico de 1 ppm; en ella se grfico el rea del pico cromatogrfico promedio 2S vs das de almacenamiento a 4C. Se observ que es estable hasta 74 das despus de ser preparado.

Estabilidad del estndar de cido flico 1 ppm

+2S X 2 * -2S

17358 16358 15358 14358 13358 12358 0 20 40 60 80 100

das

Figura 14. Curva de valoracin para la estabilidad del estndar de cido flico.

La inestabilidad de una muestra de cereal fortificado, 2 das despus de su procesamiento, se observa en la figura 15; en donde es notable la disminucin del rea del pico cromatogrfico, as como una prdida de simetra del mismo.

3 ooo*8

Figura 15. Cromatograma para demostrar la estabilidad de las muestras fortificadas.

3.5.5 Robustez

En las tablas XIII y XIV se muestran los resultados que se obtuvieron al realizar pequeos cambios tanto en el proceso de extraccin como en el proceso de cuantificacin, respectivamente. Al comparar estos resultados con los

parmetros obtenidos bajo las condiciones ya establecidas empleando una prueba estadstica de t de dos colas, se observ que, no hay diferencia estadsticamente significativa en el porcentaje de recuperacin, sin embargo en el proceso de anlisis, s existe diferencia estadsticamente significativa en la mayora de los parmetros evaluados.

Ami lasa 25mg/mL

%
Recuperacin

Prueba t de dos colas

1mL/g

62% No existe diferencia significativa

2mL/g

58%

Tabla XIII. Cambios en el proceso de extraccin para evaluar la robustez del mtodo.

Parmetro

Cambio realizado 83:17 87:13 1.2 mL/min 1.6 mL/min

Parmetro evaluado N no si no si k' si si si si tr si si si si

Composicin de fase mvil (85:15) Velocidad de Flujo (1.4 mL/min)

Tabla XIV. Cambios en el proceso de cuantificacin para evaluar la robustez del mtodo. Los valores ptimos estn en parntesis, no = no existe diferencia significativa, s = si existe diferencia significativa. Prueba t de dos colas.

3.6 Niveles de cido flico en cereales enriquecidos

Los niveles de cido flico determinados en cereales enriquecidos en pg/100 g se muestran en la tabla XV. Se analizaron un total d 10 muestras, de las cuales 7 corresponden a Com Flakes de la marca Kellog's de diferentes lotes, y el resto de otras marcas.

PRODUCTO

LOTE

Fecha de caducidad

cido flico determinado en M9/I00g 642.36 764.17 1174.66 795.82 975.00 1040.00 599.20 305.95 670.Q5 293.00

cido Flico Reportado etiqueta en pg/100g 666.66 666.66 666.66 666.66 666.66 666.66 333.33 400 400 320

Com Flakes Kellog's Corn Flakes Kellog's Com Flakes Kellog's Com Flakes Kellog's Com Flakes Kellog's Com Flakes Kellog's Com Flakes Kellog's Com Flakes Hill Country Com Flakes Nestl Com Flakes Quaker

B8 C8 A10 C10 C12 B1 C3 Jl 3B 7 MA

02/01/04 16/02/04 11/03/04 22/03/04 01/04/04 12/05/04 27/05/04 22/06/04 12/04/04 24/09/04

Tabla XV. Niveles de cido ftico en cereales enriquecidos.

En la figura 16 se presenta un cromatograma representativo de una muestra de cereal enriquecido.

Figura 16. Cromatograma de una muestra de cereal de com flakes de Kellog's lote B1. Pico cromatogrfico correspondiente al cido flico con un tiempo de retencin de 2.997 min.

CAPTULO 4

DISCUSIN

4.1 Condiciones cromatogrficas

El cido flico es una vitamina que se encuentra en muy pequeas cantidades en alimentos enriquecidos, incluyendo los cereales; adems se descompone fcilmente con la luz y el calor, por lo que es muy difcil su determinacin. Por esta razn se requieren de mtodos muy sensibles tales como el empleo de mtodos cromatogrficos.

En el presente trabajo primero se emple el sistema cromatogrfico reportado por Elolo S. Ossey (29), el cual consisti en el uso de un agente par inico, el fosfato de tetra butil amonio. Como fase estacionara se emple una columna Ca de fase inversa; como fase mvil se us un buffer de fosfatos y metanol. Inicialmente se obtuvieron buenos resultados, sin embargo, se observ una deformacin y prdida de simetra del pico cromatogrfico. El tiempo de retencin no presentaba una buena precisin ya que vanaba de inyeccin a

inyeccin. Por otra parte, el tiempo necesario para acondicionar la columna era muy prolongado y no se podan realizar muchas inyecciones el mismo da debido a que sta se saturaba fcilmente.

Observando estos inconvenientes, aunado a los tiempos de corrida prolongados (de 20 a 25 minutos por corrida) y el gasto de reactivos, se vio la necesidad de cambiar las condiciones de nuestro sistema.

Se prob una columna Atlantis dCis

marca Waters que tiene la

particularidad de que, adems de separar compuestos no polares, puede separar tambin compuestos polares permitiendo el uso de fases mviles muy acuosas. (34)

Se utiliz como fase mvil cido trifluroactico y acetonitrilo, segn las condiciones recomendadas en las especificaciones de la columna para la separacin de vitaminas hidrosolubles; se observaron mejores resultados, un

pico cromatogrfico muy simtrico, reproducible y con tiempo de retencin muy corto, por o que se pudo continuar con la optimizacin del sistema.

4.1.1 Clculo d e N

Para el clculo de nmero de platos tericos a partir de los picos cromatogrficos se decidi emplear la ecuacin N= 16(tr/w)2, ya que los picos eran muy simtricos.

4.1.2 Seleccin del porcentaje de la fase mvil y velocidad de flujo

La seleccin de las condiciones finales se hizo bajo el criterio de tratar de obtener el mayor nmero de platos tericos, con el menor factor de asimetra y una k' entre 2 y 10. (25)

Se calcularon los parmetros de nmero de platos tericos (N), el factor de capacidad (k') y el factor de asimetra (FA). Como se observa en la tabla IV, el mayor nmero de platos tericos se obtuvo con la composicin 87:13 con una velocidad de flujo de 1.4 mL/min. Sin embargo, el pico cromatogrfico era ancho y menos simtrico que el de la proporcin 85:15. A pesar de que esta proporcin presentaba menor nmero de platos tericos a 1.4 mL/min, el pico cromatogrfico era ms angosto y simtrico que el anterior; por lo que se decidi trabajar con esta proporcin (85:15) en el desarrollo del mtodo.

4.2 Tratamiento previo de la muestra y purificacin

4.2.1 Anlisis de una muestra virgen.

La muestra virgen, es decir, libre de cido flico fue, proporcionada por la empresa Kellog's.

Los resultados del anlisis de la muestra virgen confirman la presencia, en forma natural, de cido flico en este producto, como se muestra en la figura 10, debido a que en los cromatogramas obtenidos se observa una pequea seal con un tiempo de retencin igual al del cido flico; adems su espectro de absorcin es el mismo. De esta manera, se tuvo que restar la cantidad de cido flico de la muestra virgen y asi obtener la cantidad real de cido flico en las muestras enriquecidas.

4.2.2 Mtodo de tratamiento previo de la muestra

Como primera opcin se desarroll el tratamiento previo de la muestra segn reporta Elolo S. Ossey (29); ste consisti en una homogenizacin con K2HPO4 con agitacin constante por 1 hora, y posteriormente, una hidrlisis enzimtica en un bao de agua a 65C tambin por 1 hora.

La enzima que se utiliz fue alfa amilasa, la cual requiere un pH de 7.0, por lo que fue necesario llevar la muestra a ese pH antes de la hidrlisis. Este procedimiento se efectu para poder hidrolizar los carbohidratos presentes en la muestra y poder liberar todo el cido flico presente. Este tratamiento es muy sencillo y muy rpido, se debe tener control en la temperatura del bao ya que la temperatura ptima de trabajo de la enzima es de 65C. Para inactivarla se elev la temperatura del bao exactamente a 90C debido que a una mayor temperatura se puede desnaturalizar y perder el cido flico.

4.2.3 Purificacin

Al principio se prob el mtodo de purificacin utilizado por Elolo S. Ossey; se emple una extraccin en fase slida, mtodo tambin referido por Paul M. Fingas (24) en un estudio interlaboratoros de estandarizacin de tcnicas por HPLC para la determinacin de folatos en alimento. La recuperacin obtenida fue muy baja (29.81%) de tal manera que se decidi probar un pH de elucin menor (2.5), para tratar de asegurar que el cido flico estuviera en su mayor parte en forma no ionizada y se retuviera mayormente en la fase estacionaria del cartucho. El porcentaje de recuperacin aument a 43%, sin embargo, segua bajo, por lo que nos planteamos la pregunta en qu paso se estaba perdiendo el cido flico, en el proceso de extraccin o en el de purificacin?

Se pas el estndar de cido flico directamente por el cartucho y

se

observ que se perda un 20% en el proceso de purificacin; por lo que se inyect la muestra directamente al cromatgrafo, previa filtracin con una membrana de 0.45 pm y empleando una guarda columna. De esta manera el porcentaje de recuperacin aument a 61.33%, por lo que se consider que se poda eliminar el empleo del cartucho

Se compararon los resultados obtenidos mediante ambos mtodos, el de extraccin en fase slida y el de filtracin. El primero arroj 4.20% de

reproducibilidad y 43% de recuperacin. En cambio, el segundo dio 0.67% de reproducibilidad y 62% de recuperacin.

Finalmente, adems de aumentar el porcentaje de recuperacin y la reproducibilidad, el empleo de la filtracin trajo la ventaja de reduccin en el tiempo y gasto de reactivos.

A pesar de que el porcentaje de recuperacin es bajo, el mtodo es preciso, por lo que es aceptable. A partir del porcentaje de recuperacin se calcul un factor de correccin el cual fue aplicado para la cuantificacin de cido flico en las muestras estudiadas.

4.3 Validacin

4.3.1 Linealidad y lmites de deteccin y cuantrficacin

Para establecer la linealidad del mtodo, se emple la curva de calibracin y su coeficiente de correlacin lineal, adems del factor de respuesta (FR), el cual representa la relacin del rea del pico entre la concentracin (figura 13). El resultado que se obtuvo fue de 9.82%, el cual es aceptable segn la Administracin de Alimentos y Drogas (FDA), ya que sta considera que el coeficiente de variacin de los factores de respuesta debe estar por debajo del
15%. (26)

El rango lineal que se obtuvo fue de 0.1 a 4.0 ppm, el cual permiti cuantificar los niveles de cido flico en nuestras muestras de cereal.

Los lmites de deteccin y cuantificacin obtenidos por nuestro sistema permiten detectar y cuantificar adecuadamente los niveles esperados de cido flico en las muestras problema.

4.3.2 Precisin y exactitud

Se evalu la precisin a tres niveles de concentracin (bajo, medio y alto) seleccionando el rea del pico cromatogrfico para la cuantificacin. Se obtuvo una excelente precisin en los tres casos, ya que los valores de CV fueron

menores del 15%, como lo recomienda la FDA ; dichos resultados se muestran en la tabla XI del captulo 3,

Estos resultados de precisin, tanto para el sistema como para el mtodo, permitieron cuantificar correctamente los niveles de cido flico en los cereales, an cuando la recuperacin del mtodo fue de 62%.

La exactitud se evalu mediante el porcentaje de recuperacin a tres niveles de concentracin (bajo, medio y alto); se obtuvo un valor muy semejante para los tres diferentes niveles.

Para determinar el porcentaje de recuperacin fue necesario tomar en cuenta que la muestra virgen en forma natural tena una cantidad detectable de cido flico.

4.3.3 Estabilidad

Para el

estndar de 1 ppm de cido flico se comprob que, una vez

preparado, almacenado en refrigeracin a 4C y en oscuridad, permaneca estable hasta 74 das despus de su preparacin (figura 14). Despus de ese tiempo empieza a descomponerse y se hace ms difcil la integracin del pico cromatogrfico. Adems, aparecieron otros picos que probablemente se deban a la formacin de compuestos derivados del cido flico.

Por otro lado, las muestras de cereal fortificadas que se probaron, mostraron que an en refrigeracin y en oscuridad se descomponen fcilmente; desde el segundo da disminuy la seal como se muestra en la figura 15. Por lo tanto, la muestra debe trabajarse el mismo da que se procesa.

4.3.4 Robustez

Segn la ICH (Comit Internacional de Armonizacin), la robustez de un mtodo indica el grado de confiabilidad del ensayo ante cambios de variables comunes. Nuestros resultados de robustez arrojaron que ligeros cambios en la composicin de la fase mvil producen cambios significativos en la eficiencia del mtodo, demostrado en la tabla XIII. Debido a esto, se considera que es importante controlar estos parmetros para obtener resultados precisos. Sin embargo, un aumento en la concentracin de la enzima, en el proceso de hidrlisis

de la muestra, no dio lugar a cambios significativos que puedan interferir en la eficiencia del mtodo (tabla XIV).

En resumen, el mtodo desarrollado y validado fue una modificacin del usado por Elolo S. Osseyi (29). Con respecto al tratamiento de la muestra, no hubo modificacin. Sin embargo, en el anlisis cromatogrfico se modificaron tanto la fase mvil como la fase estacionaria. A pesar de que presenta la recuperacin que

Osseyi fue de 93%, no reporta datos de precisin del mtodo. En el

presente trabajo, si bien se tiene una recuperacin del 61.33%, el CV es de 1.40%.

Con respecto al tiempo de anlisis, se disminuy considerablemente ya que Osseyi reporta un tiempo de retencin de 15 minutos. En el mtodo desarrollado el tiempo de retencin fue de 2.9 minutos.

En cuanto al lmite deteccin, se obtuvo 0.031 pg/mL que es menor que el reportado por Elolo (0.1 pg/mL).

La simplicidad del mtodo, la rapidez, adems de su precisin, son ventajas que hicieron que este mtodo se aplicara para la cuantificacin de cido flico en cereales enriquecidos.

4.4 Niveles de cido ftico

El alimento que se seleccion para la determinacin de cido flico fue cereal; esto debido a que los cereales desempean un papel predominante en el aporte de nutrientes a la poblacin y constituyen la principal fuente de energa; por ende son la base de la alimentacin. Se utilizan ampliamente como vehculo de vitaminas hidrosolubles.

Con

el

mtodo

establecido

se

analizaron

muestras

de

cereal,

especficamente com flakes, y se compararon los resultados obtenidos con los valores marcados en la etiqueta del producto; se observaron valores por encima de lo reportado, tal como lo muestra (a tabla XV. Es posible que durante a fortificacin se adicione una cantidad mayor de cido flico para asegurar que el producto cumpla con las especificaciones caducidad. de etiquetado al tiempo de su

CAPTULO 5

5.1 CONCLUSIONES

1.- Se desarroll y valid el mtodo cromatogrfico para el anlisis de cido flico en cereales bajo las siguientes condiciones:

a) Tratamiento previo de la muestra: Hidrlisis enzimtica Filtracin

b) Condiciones cromatogrficas: Fase mvil : ATF 0.1%-AcN 85:15 Velocidad de flujo: 1.4 mL/min Fase estacionara: columna fase inversa dC18 5pm de tamao de partcula 4.6 x 150 mm. Deteccin : 280 nm.

2.- El mtodo desarrollado y validado es sencillo, rpido y preciso.

3.- La eliminacin del proceso de extraccin en fase slida dio como resultado un aumento tanto en el porcentaje de recuperacin como en la reproducibilidad del mtodo.

4.- El proceso de extraccin en fase slida fue sustituido por la filtracin y el uso de una guarda-columna, sin observarse cambios en el cromatograma ni en los parmetros cromatogrficos.

5.- La poca estabilidad evidencia que las muestras deben analizarse el mismo da del proceso.

6.- El mtodo cromatogrfico desarrollado es recomendado para el monitoreo de cido flico en cereales.

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