05/12/2011

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA ( TLC)

Ctedra de Control de Calidad de Medicamentos

Aplicaciones:
Separacin Identificacin Determinacin de pureza de drogas en su estado puro, o formando parte de una especialidad medicinal, drogas vegetales, fitoterpicos y/o de muestras biolgicas.

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Cromatografa en capa fina:

Forma de cromatografa de adsorcin en la cual la fase mvil se mueve por capilaridad a travs de la fase estacionaria adsorbente) aplicada como una capa fina y uniforme sobre un soporte inerte (vidrio, plstico, lmina de aluminio).

Parmetros cromatogrficos: Rf : relacin entre la distancia recorrida por la sustancia y la distancia recorrida por el frente de la fase mvil, ambas medidas desde el punto de siembra (aproximadamente a 2 cm. del extremo inferior de la placa) al centro de la mancha si esta es redonda o al centro del rea de ms intensidad si la mancha tiene cola.

Rx: se calcula como el cociente entre la distancia recorrida por la sustancia y la distancia recorrida por la sustancia de referencia (Reference Standard), eluida bajo condiciones idnticas, ambas distancias medidas de la misma manera que las distancias para calcular Rf.
Los valores pueden estar comprendidos entre 0 y 1, mientras que los valores de Rx pueden ser mayores que 1

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Factores que afectan la reproducibilidad de Rf:

1-Fase estacionaria 2-Fase mvil 3- Cmara de desarrollo
3.1- Saturacin de la misma 3.2- Temperatura

4- Cantidad de siembra

Aplicacin en el Anlisis Farmacutico: Identificacin de principios activos (Thin-Layer Cromatographic Identification Test) Determinacin de pureza cromatogrfica mismos (Test of Cromatographic Purity) de los

Bajo condiciones controladas puede ser empleada como tcnica de cuantificacin.

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Ensayo de Pureza cromatogrfica y Sustancias relacionadas (Related Compounds)

Consiste en determinar que las impurezas que pueden acompaar a una determinada materia prima, no superen los lmites codificados o preestablecidos.

Anlisis cuantitativo:

Remover

cuidadosamente

las

manchas

desde

la

cromatoplaca, luego eluirlas con un solvente adecuado y posteriormente aplicar un mtodo cuantitativo que permita detectar pequeas cantidades (ej. Espectrofotometra UV), o bien medir intensidades de manchas por densitometra

sin necesidad de removerlas de la cromatoplaca.

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Cromatografa HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography)

Esta tcnica utiliza placas de slica gel con tamao de partcula de aproximadamente 5, mientras que en las comunes el tamao es de 20.

Condiciones tpicas Dimensiones de la placa (cm) Tamao de partcula (Silica) (m) Espesor de la placa (Analitica) (m) Volumen de muestra () Dimetro de la mancha antes de corrida (mm) Dimetro de la mancha despus de corrida (mm) Distancia de corrida (cm) Tiempo de corrida (mn) Nmero de muestras por plato Lmite de deteccin (Absorcin) (ng) Lmite de deteccin (fluorescencia) (ng) Reproducibilidad de Rf

TLC 20 x 20 alrededor de 20 100 - 250 1 - 10 <4 5 - 10 10 - 15 30 - 120 10 - 15 10 - 100 0,1 - 1 alrededor 3%

HPTLC 10 x 10 alrededor de 5 150 - 200 < 0,1 < 1,5 2-5 3-6 5 - 15 30 - 40 0,5 - 5 0,01 - 1 alrededor 1%

Reproducibilidad de cuantificacin

alrededor 5%

2% - 3%

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Aplicacin Pureza Cromatogrfica (USP) - Sustancias Relacionadas (BP- EP) Ejemplo 1:

Pureza Cromatogrfica: Metoclopramida Clorhidrato MP- USP 34. Criterio de aceptacin: ninguna mancha secundaria presente en el cromatograma de la muestra debe ser ms intensa o ms grande que el 0,5% y la suma de las intensidades de las manchas secundarias presentes en el cromatograma de la muestra no debe ser mayor que el 1,0%. Se cuenta con Metoclopramida Clorhidrato Sustancia de Referencia. Lmite de deteccin: 0,5 g.

Aplicacin Pureza Cromatogrfica (USP)- Sustancias Relacionadas (BP- EP) Ejemplo 2:

Sustancias Relacionadas: Paracetamol Tabletas- BP 2001
Preparacin de la muestra
Solucin Test 1: 1 gr Paracetamol / 5 ml ter libre de perxido. Sembrar 200 l.

Sembrar 40 l de las siguientes soluciones:

Solucin Test 2: diluir 1 ml de solucin test 1 a un Vf 10 ml con etanol 96%. Solucin 3: 4 -cloroacetanilida 0,005% P/V, medio etanol 96%. Solucin 4: 0,25 g 4 -cloroacteanilida + 0,1 g paracetamol / 100 ml etanol 96%.

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Criterios de aceptacin: Ninguna mancha correspondiente a 4 -cloroacetanilida presente en el cromatograma de la solucin Test 1 debe ser ms intensa que la mancha obtenida con la solucin 3. Ninguna mancha secundaria obtenida en el cromatograma de la solucin Test 2 con Rf menor al de 4 -cloroacetanilida debe ser ms intensa que la mancha obtenida con la solucin 3. Validez del Ensayo: el ensayo es vlido si el cromatograma obtenido con la solucin 4 muestra claramente la separacin entre las dos manchas principales, y la mancha correspondiente a la 4 -cloroacetanilida tiene mayor valor de Rf.

Aplicacin Pureza Cromatogrfica (USP)- Sustancias Relacionadas (BP- EP) Ejemplo 3:

Sustancias Relacionadas: Fluorouracilo Inyectable- BP 2001. Fluorouracilo: 50 mg/ml. Solucin 1: diluir con agua una cantidad adecuada de fluorouracilo inyectable de manera de obtener una solucin 2% P/V fluorouracilo. Solucin 2: 1 volumen de solucin 1/400 Vol. de metanol 50%. Solucin 3: preparar una solucin de 5-hidroxiuracilo al 0,005% P/V en metanol 50%.

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Revelar al UV 254 nm Criterio de aceptacin 1: ninguna mancha secundaria obtenida en el cromatograma de la solucin 1 debe ser ms intensa que la mancha obtenida con la solucin 2.

Revelar con solucin 0,5% de Fast blue B salt y luego con 0,1 M de hidrxido de sodio Criterio de aceptacin 2: ninguna mancha correspondiente al 5-hidroxiuracilo obtenida en el cromatograma de la solucin 1 debe ser ms intensa que la mancha de la solucin 3.