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BRUCELOSIS BOVINA
RESUMEN
La brucelosis bovina suele estar causada por Brucella abortus, menos frecuentemente por B. melitensis y por B. suis. La infeccin est muy extendida por el mundo. Algunos pases del norte y del centro de Europa, Canad, Japn, Australia y Nueva Zelanda se consideran libres de su agente etiolgico. La enfermedad se caracteriza clnicamente por uno o ms de los sntomas siguientes: aborto, retencin de placenta, orquitis, epididimitis y, raramente artritis, con excrecin de los microorganismos en los exudados uterinos y en la leche. El diagnstico depende del aislamiento de Brucella a partir de los abortos, de las secreciones de la ubre y de los tejidos analizados postmortem. Se puede realizar un diagnstico preliminar determinando la respuesta especfica mediada por las clulas o la serolgica frente a los antgenos de Brucella. Brucella abortus, B. melitensis y B. suis son muy patgenos para el hombre y por los tanto, todos los tejidos infectados como los cultivos y el material potencialmente contaminado deben manejarse bajo condiciones apropiadas de contencin. Identificacin del agente: La evidencia preliminar de Brucella la suministra la observacin de su morfologa, mediante la tincin modificada de los cido-alcohol resistentes, en los productos del aborto o los exudados vaginales, especialmente si est respaldada por pruebas serolgicas. La reaccin en cadena de la polimerasa recientemente desarrollada, proporciona medios adicionales de deteccin. Cuando sea posible, se debe aislar Brucella en medios normales o selectivos cultivando los exudados uterinos, los fetos abortados, las secreciones de las ubres o los tejidos seleccionados, como los ganglios linfticos y los rganos reproductores masculino y femenino. Las especies y biovariedades deberan identificarse mediante fagolisis y segn criterios de cultivo, bioqumicos y serolgicos. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) puede proporcionar un mtodo complementario para la biotipificacin basado en secuencias genmicas especficas. Pruebas serolgicas y alrgicas cutneas: Las pruebas con el antgeno tamponado de Brucella, es decir la prueba con rosa de bengala y la prueba de aglutinacin tamponada en placa, as como la fijacin del complemento, el enzimoinmunoensayo (ELISA) o el ensayo de polarizacin de la fluorescencia, son pruebas adecuadas para analizar los rebaos y los animales individuales. Sin embargo, ninguna prueba serolgica aislada es adecuada para todas y cada una de las situaciones epidemiolgicas. Por tanto, la reactividad de las muestras que son positivas en las pruebas de anlisis deben confirmarse utilizando una estrategia confirmativa establecida. La prueba de ELISA indirecto o la del anillo de leche, realizadas con muestras de leche completa, son eficaces para analizar y controlar la brucelosis en las vacas lecheras, pero la prueba del anillo de leche es menos fiable en los grandes rebaos. Otra prueba inmunolgica es la prueba cutnea de la brucelina, que puede utilizarse en los anlisis o como una prueba confirmativa en los rebaos cuando existe una reaccin serolgica positiva en ausencia de factores de riesgo obvios en los rebaos no vacunados. Se ha demostrado que la prueba interfern gamma, la prueba de precipitacin que utiliza como antgeno el hapteno nativo y el ELISA indirecto en el que se utiliza como antgeno el lipopolisacrido rugoso han resultado prometedores para diferenciar entre la brucelosis y la exposicin a los microorganismos con reaccin cruzada. Se ha demostrado que las pruebas con interfern gamma, las pruebas con precipitina en las que se utiliza antgeno y hapteno nativo y el ELISA indirecto en el que se utiliza un antgeno lipopolisacrido rugoso son prometedores de cara a diferenciar entre la brucelosis y la exposicin a los microorganismos con reaccin cruzada.
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Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: La cepa 19 de Brucella abortus contina siendo la vacuna de referencia con la que se comparan otras vacunas. Debe prepararse a partir de los inculos de siembra derivados de EE.UU., y cada lote debe cumplir un mnimo de condiciones respecto a la viabilidad, ligereza, virulencia residual y capacidad para inmunizar ratones frente a un desafo con una cepa virulenta de B. abortus o designar las unidades formadoras de colonia (UFC) por dosis. La vacuna con la cepa RB51 de Brucella abortus se obtuvo de una cepa mutante, rugosa, de laboratorio, derivada de la cepa lisa 2308 de B. abortus. Se han completado las pruebas de eficacia de la vacuna con la cepa RB-51 en el ganado vacuno y dicha vacuna ha sido autorizada en los EE.UU. Tambin ha sido considerada como la vacuna oficial para la prevencin de la brucelosis bovina en muchos otros pases Las preparaciones de brucelina para la prueba intradrmica deben estar libres de lipopolisacrido liso y no deben producir reacciones inflamatorias inespecficas ni interferir con las pruebas serolgicas. Los antgenos para el diagnstico deben prepararse a partir de cepas lisas de B. abortus, las cepas 1119-3 99, y deben cumplir un estndar mnimo de pureza, sensibilidad y especificidad.
A. INTRODUCCIN
En el ganado vacuno la brucelosis suele estar causada por biovariedades de Brucella abortus. En algunos pases, particularmente en el sur de Europa y en el oeste de Asia, donde el ganado se cra junto a ovejas o cabras, la infeccin tambin puede ser debida a B. melitensis (41). En ocasiones, B. suis puede causar una infeccin crnica de las mamas en el ganado vacuno, pero no se ha descrito que origine abortos o se extienda a otros animales (29). Normalmente la enfermedad es asintomtica en las hembras no gestantes. Despus de la infeccin por B. abortus o por B. melitensis, las hembras adultas en gestacin desarrollan una placentitis que, por lo general, provoca el aborto entre el quinto y el noveno mes de gestacin. Incluso en ausencia de aborto se produce una gran excrecin de microorganismos a travs de la placenta, los lquidos fetales y los exudados vaginales. Las mamas y los ganglios linfticos regionales tambin pueden infectarse y los microorganismos pueden aparecer en la leche. Las gestaciones posteriores llegan, por lo general, a trmino, pero la infeccin uterina y la mamaria se repiten, con un nmero reducido de microorganismos en los productos del parto y en la leche. En las infecciones agudas, el microorganismo est presente en la mayora de los ganglios linfticos. Los machos adultos pueden desarrollar orquitis, y la brucelosis puede causar la esterilidad en ambos sexos. Una manifestacin corriente de la brucelosis en algunos pases tropicales son los higromas, por lo general en las articulaciones de las patas, que pueden representar el nico indicador de la infeccin; con frecuencia, el lquido de los higromas est infectado por Brucella. La brucelosis se ha descrito tambin en el camello de una joroba (Camelus dromedarius) y en el de dos jorobas (C. bactrianus), as como en los siguientes camlidos de Sudamrica: la llama (Lama glama), la alpaca (Lama pacos), el guanaco (Lama guinicoe), y la vicua (Vicugne vicugne) como consecuencia de contactos con rumiantes infectados con B. abortus o B. melitensis. Adems, se ha observado en el bfalo domstico (Bubalus bubalus), el bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), el yak (Bos grunniens), el alce o wapiti (Cervus elaphus), as como en el bfalo africano (Syncerus caffer) y en varias especies de antlopes africanos. Las manifestaciones de la brucelosis en estos animales son similares a las del ganado vacuno. En el manual de bioseguridad para los laboratorios elaborado por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) clasifica a los microorganismos del gnero Brucella en el Grupo de Riesgo III. La brucelosis se transmite fcilmente al hombre y causa una enfermedad febril aguda la fiebre ondulante que puede convertirse en crnica y producir complicaciones graves que afectan a los msculos esquelticos, al sistema cardiovascular y al sistema nervioso central. En las zonas en las que la enfermedad es endmica deben tomarse medidas para evitar la infeccin del hombre. A menudo la infeccin se debe a una exposicin profesional y se adquiere por va oral, respiratoria o conjuntival, pero el riesgo mayor para la poblacin general es la ingestin de productos lcteos contaminados en las zonas en las que la enfermedad es endmica. Los veterinarios y los granjeros que manejan animales infectados, fetos abortados o placentas, estn expuestos a ese riesgo laboral. La brucelosis es una de las enfermedades de ms fcil adquisicin en el laboratorio, y se deben observar precauciones de seguridad muy estrictas cuando se manejen cultivos y muestras infectadas, como lo son los productos del aborto. Existen recomendaciones especficas que han de seguirse con el material infectado por Brucella (para ms detalles vanse las referencias 2, 42, 95 y el captulo 1.1.2. Bioproteccin y seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiologa y en las instalaciones de los animales). La manipulacin de los cultivos vivos o del material animal contaminado en el laboratorio es peligrosa y debe realizarse en un nivel de contencin 3 o superior, como se indica en el captulo 1.1.2, para reducir la exposicin ocupacional. Es esencial que se utilice un nivel de contencin 3 en los lugares en los que se realicen cultivos de Brucella a gran escala (p.ej. para la produccin de antgeno o de vacunas). La evidencia gentica e inmunolgica indica que todos los miembros del gnero Brucella estn estrechamente relacionados. Sin embargo, teniendo en cuenta que existen diferencias relevantes entre las principales variantes
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Especies
Actividad ureasa
Requiere suero
104RTD
Oxidasa
RTDc
RTD
RTD
RTD
Hospedador preferido
B. abortus
+e
+f
B. suis
+g
+g
+h
S S R R
i +
+ +
+ +
+ +
+j +h +h
Tomado de las refs. 2 y 42. a b c d e f g h i j k l Fagos: Tbilisi (Tb), Weybridge (Wb), Izatnagar1(Iz1) y R/C Fase normal de presentacin : S: lisa, R: rugosa RTD: dilucin rutinaria de prueba Brucella abortus biovariedad 2 requiere generalmente suero para crecer en aislamiento primario Algunos aislamientos africanos de B. abortus biovariedad 3 son negativos Velocidad intermedia, excepto la cepa 544 y algunas cepas de campo que son negativas Algunos aislamientos de B. suis biovariedad 2 no son, o solo parcialmente, lisadas por el fago Wb o Iz1 Velocidad rpida Algunos aislamientos se lisan por el fago Wb Velocidad lenta, excepto algunas cepas que son rpidas Placas o calvas pequeas Neotoma lepida
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Fucsina bsica
Tionina
Especies
Biotipo
+b +b +b +b +o +
+ + + + + + +
+ + + + + + + + + + +
+ + + + + +c + + + e + f
+ + + + + + + + + + +
+ + + + + + +
+ +
g + +
f f
Tomado de las refs. 2 y 42. a b c d e f g Concentracin del colorante en medio de dextrosa con suero: 20 g/ml Normalmente positivo en aislamiento primario Se han aislado algunas cepas sensibles a la fucsina bsica Algunas cepas se inhiben con colorantes Se han aislado algunas cepas resistentes a la fucsina bsica Negativo en la mayora de las cepas Crecimiento a una concentracin de 10 g/ml de tionina
B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
Todos los abortos del ganado vacuno deben considerarse como casos sospechosos de brucelosis y deberan investigarse. El cuadro clnico no es patognomnico, aunque el historial del rebao puede servir de ayuda. El diagnstico inequvoco de las infecciones por Brucella solo puede hacerse mediante el aislamiento y la identificacin de Brucella, pero en situaciones en las que no es posible el anlisis bacteriolgico, el diagnstico
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1.
a)
b)
Cultivo
i) Medio basal El aislamiento y cultivo directo de Brucella se realiza normalmente en un medio slido. En general, este representa el mtodo ms satisfactorio porque permite el desarrollo de colonias aisladas fcilmente reconocibles. Los medios slidos tambin limitan el establecimiento de los mutantes no lisos y el desarrollo excesivo de contaminantes. Sin embargo, el empleo de los medios lquidos puede recomendarse para muestras voluminosas o con fines de enriquecimiento. Se dispone de un amplio rango de medios basales comercializados en forma deshidratada, por ejemplo el medio base para Brucella, agar triptosa o (tripticasa)-soja (TSA). Es necesario aadir 25% de suero bovino o equino para el crecimiento de algunas cepas como la biovariedad 2 de B. abortus, y muchos laboratorios lo aaden sistemticamente al medio basal con resultados excelentes, como en el caso del agar sangre (Oxoid) o agar Columbia (BioMrieux). Se pueden utilizar otros medios satisfactorios como el agar suero-dextrosa (SDA) o el agar glicerol-dextrosa (2). El medio SDA es normalmente el de eleccin para la observacin de la morfologa colonial. Para el aislamiento de Brucella de la sangre o de la leche, y de otros lquidos del cuerpo, donde se aconseja un cultivo de enriquecimiento, se recomienda un medio bifsico no selectivo conocido como medio de Castaeda. Este medio se emplea porque las brucelas tienden a disociarse en medio lquido y esto interfiere con la tipificacin llevada a cabo mediante las tcnicas bacteriolgicas convencionales. ii) Medios selectivos Todos los medios base indicados anteriormente se pueden utilizar para la preparacin de medios selectivos. Se aaden los antibiticos apropiados para evitar el crecimiento de organismos distintos a Brucella. El medio selectivo ms difundido es el de Farrell (30), que se prepara aadiendo seis antibiticos a un medio base. Se aaden las siguientes cantidades por 1 litro de medio: sulfato de polimixina B (5.000 unidades = 5 mg); bacitracina (25.000 unidades = 25 mg); natamicina (50 mg); cido nalidxico (5 mg); nistatina (100.000 unidades); vancomicina (20 mg). Se ha comercializado un suplemento de antibiticos liofilizado (Oxoid). Sin embargo, a las concentraciones utilizadas en el medio de Farrell, el cido nalidxico y la bacitracina pueden tener efectos inhibidores sobre algunas cepas de B. abortus y B. melitensis (50). Por ello, la sensibilidad del aislamiento de B. melitensis aumenta cuando se utilizan tanto el medio de Farrell como el medio de ThayerMartin. En esencia, el medio modificado de ThayerMartin se puede preparar con medio base GC (38 g/litro; Biolife Laboratories, Miln, Italia) suplementado con hemoglobina (10 g/litro; Difco) y metanosulfonato de colistina (7,5 mg/litro), vancomicina (3 mg/litro), nitrofurantona (10 mg/litro), nistatina (100.000 Unidades Internacionales [UI]/litro = 17,7 mg) y anfotericina B (2,5 mg/litro) (todos
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c)
Identificacin y tipificacin
Cualquier colonia con una morfologa similar a la de Brucella debe analizarse por la tincin de Gram (o por la coloracin de Stamp). Como en las fases no lisas se alteran las propiedades serolgicas, tintoriales y de sensibilidad a los fagos, la morfologa colonial resulta esencial para las pruebas de tipificacin que se describen ms abajo. Los mtodos recomendados para observar la morfologa de las colonias son el mtodo de Henry mediante luz reflejada oblicua, la prueba de la acriflavina descrita por Braun & Bonestell, o el mtodo de White & Wilson de tincin de colonias con cristal violeta (2). La identificacin de los microorganismos se puede realizar mediante una combinacin de las siguientes pruebas: morfologa celular y tincin de Gram o de Stamp, propiedades de crecimiento, pruebas de ureasa, oxidasa y catalasa, y la prueba de la aglutinacin en porta con un suero policlonal anti-Brucella. La identificacin de especies y de biovariedades requiere pruebas ms elaboradas (como la lisis por fagos y la aglutinacin con sueros monoespecficos anti-A, anti-M anti-R), cuya realizacin se lleva a cabo en laboratorios de referencia con experiencia en estos mtodos. La utilizacin simultnea de varios fagos, es decir, el Tbilissi (Tb), Weybridge (Wb), Izatnagar (Iz) y RC, representa un sistema de tipificacin fgica que, con suficiente experiencia, permite identificar las especies lisas y las rugosas de Brucella. No obstante, algunas propiedades, como el requerimiento de CO2 para crecer, la produccin de H2S (detectada mediante papeles con acetato de plomo) y el crecimiento en presencia de fucsina bsica y tionina a concentraciones finales de 20 g/ml, se detectan mediante pruebas rutinarias que pueden realizarse en laboratorios no especializados moderadamente equipados (vanse los cuadros 1 y 2). Cuando se envan cepas de Brucella a un laboratorio de referencia para su tipificacin, es esencial seleccionar las cepas lisas. Los cultivos se liofilizan y se cierran en ampollas dentro de tubos con tampn de rosca o se subcultivan en agar inclinado contenido en tubos con tapn de rosca. Tambin deben enviarse cepas suspendidas en medio lquido (por ejemplo, en el medio de transporte de Ames) pero esto puede dar lugar a la aparicin de mutantes rugosas. i) Brucella est considerada entre las bacterias ms peligrosas con las que se trabaja, por el riesgo a las infecciones adquiridas en el laboratorio. Para transportar cultivos de Brucella, las tapas de los recipientes deben estar bien cerradas y selladas con tapones de PVC. Deben envolverse con papel adsorbente o con algodn, sellarse en bolsas de polietileno y empaquetarse en un contenedor rgido de acuerdo con las exigencias de la Asociacin para el Transporte Areo (IATA) para el envo de muestras peligrosas (39). Estas regulaciones se resumen en el captulo 1.1.1. Recogida y envo de muestras de diagnstico. Como los cultivos de Brucella son infecciosos, se designan UN2814 y se debe realizar una Declaracin de Muestras Peligrosas. Tambin existen restricciones para enviar muestras sospechosas de brucelosis y se deben tener en cuenta las regulaciones de la IATA antes de su envo (39). Tambin deben seguirse otras directrices nacionales e internacionales (96). Antes de enviar cultivos o muestras de diagnstico para cultivo, se debe de contactar con el laboratorio receptor para determinar si se necesita algn permiso especial y si el laboratorio tiene la capacidad de realizar las pruebas solicitadas. Si las muestras traspasan fronteras nacionales, probablemente se necesitar un permiso de importacin que debe obtenerse antes de despachar la
ii)
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d)
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Amplificacin mediante la PCR Preparacin de la mezcla base (100 pruebas) Deben disolverse los oligonucletidos sintticos en tampn TE a una concentracin de 100 (vase el cuadro anterior). El 100 stock permanece estable a 4C durante al menos dos aos siempre que se tome la precaucin de no contaminar la solucin. Se prepara el primer cctel colocando los siguiente concentrados 100 en un tubo de microcentrfuga de 1,5 ml: 233 l 2,5 l 2,5 l 2,5 l 2,5 l 2,5 l 2,5 l 2,5 l agua grado-PCR cebador especfico para IS711 cebador especfico para B. abortus cebador directo universal para 16S (control opcional para los inhibidores) cebador inverso universal para 16SR (control opcional para los inhibidores) cebador directo para eri cebador inverso para eri cebador para RB51 agua grado-PCR 10 tampn de reaccin sin MgCl2 (vase la Nota 6) 25 mM MgCl2 10 mM mezcla dNTP cctel de cebadores del paso 2 GC potenciador. Si no se usa un potenciador, debe sustituirse por 500 l de agua gradoPCR. TAQ ADN polimerasa FastStart
ii)
iii)
Se prepara la mezcla base colocando en un tubo desechable de 3 o 5 ml los siguientes ingredientes: 1130 l 250 l 150 l 200 l 250 l 500 l 20 l
iv) v)
Se mezcla completamente y con suavidad la solucin pipeteando arriba y abajo. Se hacen alcuotas de la mezcla base de 25 l en tubos PCR con una pared de 0,2 l (o alternativamente una placa de 96 pocillos certificada para PCR). Se guardan los tubos de ensayo a 20C 2C. Antes de su utilizacin, se descongela una cantidad suficiente de tubos con la mezcla base para los desconocidos y los controles, y se mezcla a fondo pero con suavidad golpeando ligeramente con el dedo. Amplificacin de productos mediante la PCR Se aade entre 1,0 y 2,5 l de la muestra desconocida o del control a cada tubo de ensayo. Debe rmezclarse por completo cada muestra inmediatamente antes de retirar la alcuota, puesto que Brucella tiende a depositarse rpidamente. Se amplifican los productos PCR utilizando los siguientes parmetros: 95C 5,0 minutos 1 ciclo
vi)
i)
iii)
La determinacin del tiempo de puesta en marcha no parece ser importante iii) Despus de la amplificacin, pueden guardarse indefinidamente las muestras sin abrir a 4C hasta el momento de la deteccin. Deteccin de los productos amplificados Se prepara un gel de agarosa al 2%, de 5 mm de espesor (en 0,5 TBE) con un nmero adecuado de pocillos. Se combina 1 l de 6 tincin de carga con 8 l de muestra amplificada y se mezcla bien antes de cargarlo en el pocillo de gel.
i) ii)
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iv)
dentificacin s basa en el nmero y los tamaos de los productos amplificados por la PCR (v se l vanse las La id figur ras A & B). T Todas las mu uestras, exce epto los contro oles negativos, deberan a amplificar al menos un m prod ducto, la secu uencia del 16 de 800 pb Si esta ban 6S b. nda no est presente, es p p posible que la muestra a cont tenga inhibido ores de la PC el ADN no se degrad, o no se disp CR, o pens la mues stra en la mez zcla base. Pue ser necesa diluir la muestra origina para disminu los niveles de inhibidore en la reaccin, repetir ede ario m al uir es la pr rueba con una nueva mues o simplem a stra mente repetir la prueba con la muestra orig a ginal. Todos los aislam mientos de B. abortus (biov variedades 1, 2, y 4), incl luidas las cep pas vacunales tambin plificarn un producto de 50 pb a partir del locus alkB del IS711. Ni otras espec 00 B N cies de Brucel ni otras lla amp bact terias amplific carn este pro oducto. Solo la cepa vacunal RB51 de B. abortus amp a B plificar un pr roducto de 300 pb a partir de locus wboA del IS711. To el odas las espe ecies y cepas de Brucella, e excepto la cep vacunal pa S19 de B. abortus amplificar el producto de 180 pb a pa del gen ervA, pero no as otras bacte 9 s, e artir s erias. En la secc cin B de la fig gura siguiente se muestran algunos resultados. e
Leye endas de la Fig gura Figu A. loci (fila amplificado predichos p ura as) os para varias cate egoras de desconocidos (co olumnas). A: Se muestran e los c cuatro loci para cada catego con sus c ora cebadores hibr ridantes; B: los productos pr s redichos deriv vados de la amp plificacin efic (fs se refier a la cepa na tural de B. abo caz re ortus). Figu B. Patrone tpicos amplificados a pa rtir de aislami ura es ientos bacteria anos en bovin detectados mediante nos s elec ctroforesis en g de agarosa. Carril 1: cepa natural de B. abortus; Carr 2: s19 de B . abortus; Carr 3: RB51 gel . a ril ril
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de B. abortus; Carril 4: Brucella spp. (no B. abortus); Carril 5: bacterias distintas de Brucella. Se carg un gel de agarosa al 2% con 8 l de producto amplificado y 1 l de tinte de carga por cada pocillo, se someti a electroforesis durante 2,5 horas a 70 V, se ti con bromuro de etidio, y se visualiz con luz UV. Otra nueva prueba es HOOF-Prints. Esta prueba de identificacin se ha elaborado recientemente y se ha comprobado que tiene un gran potencial como herramienta epidemiolgica (12, 13). Conocida tambin como anlisis de repeticiones en tndem de un nmero variable de locus mltiples (MLVA), esta prueba puede ser un complemento de los mtodos clsicos de biotipificacin de acuerdo con la taxonoma establecida (45). Se ha incrementado la utilizacin de procedimientos moleculares para la identificacin de las especies de Brucella y los procedimientos de la prueba han mejorado desde los aos noventa. Actualmente se dispone de otras pruebas, tales como omp 25, 2a y 2b PCR/RFLP para B. abortus, que pueden utilizarse para la identificacin de las especies de Brucella (17, 18).
e)
2.
Pruebas serolgicas
Ninguna prueba serolgica aislada es adecuada en cualquiera de las situaciones epidemiolgicas, presentando limitaciones en el diagnstico de animales individuales (36, 68). Se deben considerar todos los factores que influyen en la relevancia del mtodo de prueba y de sus resultados para una aplicacin o interpretacin diagnstica especfica. Los mtodos serolgicos que se describen en este captulo son mtodos estandarizados y validados, con caractersticas de realizacin adecuadas para ser consideradas pruebas obligadas o alternativas en el comercio internacional. Esto no impide el uso de pruebas modificadas o similares o la utilizacin de reactivos diferentes. Sin embargo, los mtodos y reactivos descritos en este captulo suponen un estndar de comparacin respecto a la realizacin esperada del diagnstico. Debe resaltarse que la prueba de la seroaglutinacin lenta en tubo (SAT) se considera inadecuada a efectos del comercio internacional. La prueba de la fijacin del complemento (FC) es ms especfica que la SAT para el diagnstico y adems posee un sistema estandarizado de unidades. Las caractersticas diagnsticas de algunos enzimoinmunoensayos (ELISA) y la prueba de la polarizacin de fluorescencia (FPA) son similares o superiores a la FC y, como son ms fciles de realizar tcnicamente y ms consistentes, es preferible su utilizacin (64, 98). Se ha comparado el rendimiento de algunas de estas pruebas. Para el control de la brucelosis en un pas o regin, son adecuadas para el anlisis las pruebas con antgeno tamponado de Brucella, es decir, la prueba con rosa de bengala (RBT) y la prueba de aglutinacin tamponada en placa (BPAT), as como ELISA y FPA. Las reacciones positivas deben volverse a comprobar utilizando una estrategia confirmativa adecuada.
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Sueros de Referencia
Los estndares primarios de referencia bovina son aquellos frente a los que se comparan y calibran todos los dems estndares. Estos estndares de referencia estn a disposicin de los laboratorios nacionales de referencia y deben utilizarse para establecer estndares secundarios o nacionales frente a los que pueden prepararse otros de trabajo para utilizacin en el diagnstico diario rutinario de laboratorio. Estos sueros se han desarrollado y designado por la OIE como Sueros Internacionales Estndar1. Su empleo favorece la armonizacin internacional de las pruebas de diagnstico y la estandarizacin de antgenos (98): Para la RBT y la FC se emplea el suero estndar internacional de la OIE (OIEISS, antes designado Segundo suero anti-B. abortus de la OMS) que contiene 1000 UI y UIFC (unidades internacionales para la prueba de fijacin del complemento). Adems, se dispone de tres sueros estndar de la OIE para ELISA. Son tambin de origen bovino y comprenden un estndar fuertemente positivo (OIEELISASPSS), otro dbilmente positivo (OIEELISAWPSS) y otro negativo (OIEELISANSS).
Produccin de clulas
En la produccin de antgenos para diagnstico debe utilizarse siempre la cepa 99 de B. abortus (Weybridge) (S99) (ver direccin en la nota 1 a pie de pgina) o la cepa 1119-3 (USDA) (S-1119-3)2. Debe destacarse que el antgeno preparado de una de estas cepas tambin se utiliza en las pruebas para infeccin por B. melitensis o B. suis. Las cepas deben ser lisas y no autoaglutinables en solucin salina con 0,1% (p/v) de acriflavina. Tienen que ser cultivos puros y cumplir las propiedades de las cepas de B. abortus biovariedad 1 que son independientes de CO2. Los cultivos originales de siembra se cultivan para producir un lote de inculo que debe tener las propiedades de estas cepas, y se conservan por liofilizacin o por congelacin en nitrgeno lquido. Para la produccin de antgeno, el inculo de siembra se utiliza para sembrar varios tubos de agar inclinado con medio de infusin de patata que se incuban a 37C durante 48 horas. Los medios slidos SDA y TSA, con adicin de un 5% de suero equino o suero de ternero neonato y un 0,1% de extracto de levadura, son satisfactorios con tal de que se utilice un inculo adecuado como se recomienda arriba. La pureza del crecimiento se comprueba suspendiendo a la cepa en PBS estril, pH 6,4, y se utiliza para sembrar frascos Roux con medio slido de infusin de patata o con glicerol-dextrosa. Estos se incuban luego a 37C durante 72 horas con la superficie inoculada hacia abajo. La pureza del crecimiento se comprueba en cada frasco mediante la tincin de Gram, y los microorganismos se recogen aadiendo a cada frasco 5060 ml de solucin salina con fenol (con un 0,5% de fenol en una solucin de cloruro sdico al 0,85%). Los frascos se agitan, se decanta la suspensin, y los microorganismos se inactivan por calentamiento a 80C durante 90 minutos. Despus de una prueba de viabilidad, el antgeno se conserva a 4C. Alternativamente, las clulas se pueden producir en medio lquido o por cultivo continuo en un fermentador (38), en un medio que contenga (por litro de agua destilada) D-glucosa (30 g), peptona de grado elevado (30 g), extracto de levadura (Difco) (10 g), fosfato sdico (9 g) y fosfato bisdico (3,3 g). El pH inicial es 6,6 pero tiende a subir a 7,27,4 durante el crecimiento. Debe comprobarse la capacidad de los lotes de peptona y de extracto de levadura para producir un buen crecimiento sin formacin de clulas anormales o disociadas. Durante el crecimiento se puede necesitar una aireacin y agitacin vigorosas y el ajuste del pH a 7,27,4 por adicin de HCl 0,1 M. El inculo de siembra se prepara como se describi anteriormente. El cultivo se incuba a 37C durante 48 horas. El cultivo continuo puede mantenerse ms tiempo, pero se necesita ms experiencia. Para confirmar su pureza deben realizarse controles del proceso del crecimiento tanto en medio slido como lquido, del nivel de microorganismos viables para que sea el adecuado y la ausencia de formas rugosas disociadas. En la fase de recogida las clulas para utilizacin como antgeno deben comprobarse de nuevo su pureza y ausencia de disociacin.
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Disponibles en el Laboratorio de Referencia de la OIE para la Brucelosis en la Veterinary Laboratories Agency (VLA) Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, Inglaterra. Disponible en el Departamento de Agricultura de los EE.UU. (USDA), National Veterinary Services Laboratories (NVSL), 1800 Dayton Road, Ames, Iowa 50010, EE. UU.
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a)
Pruebas de antgeno tamponado de Brucella (Prueba prescrita para el comercio internacional) Prueba del rosa de bengala
Esta prueba es una prueba sencilla de aglutinacin puntual que utiliza antgeno coloreado con rosa de bengala y tamponado a pH bajo, normalmente 3,65 + 0,05 (54). Produccin de antgeno
El antgeno para la RBT se prepara depositando clulas muertas de las cepas de B. abortus S99 o S11193, recogidas por centrifugacin a 23.000 g durante 10 minutos a 4C, y resuspendindolas uniformemente en una solucin salina fenicada estril (0,5%) a razn de 1 g por cada 22,5 ml.(Nota: si se utiliza carboximetil celulosa sdica como agente sedimentador durante la preparacin del concentrado celular, los residuos insolubles deben eliminarse antes de la tincin filtrando la suspensin por un prefiltro AMF-CUNO Zeta-plus [Tipo CPR 01A]). A cada 35 ml de esta suspensin se aade 1 ml de rosa de bengala (CI No. 45440) al 1% (p/v) en agua destilada estril, y la mezcla se agita durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla se filtra a travs de una gasa estril y se centrifuga a 10.000 g para depositar las clulas teidas, que a continuacin se resuspenden uniformemente a razn de 1 g de clulas por 7 ml de diluyente (21,1 g de hidrxido sdico disueltos en 353 ml de solucin salina estril con fenol ms 95 ml de cido lctico, que se ajusta a 1.056 ml con solucin salina fenicada estril). El color de esta suspensin debe ser rojo intenso y el sobrenadante de una muestra centrifugada debe carecer de colorante; el pH debe ser 3,65 + 0,05. Despus de la filtracin a travs de una gasa, la suspensin se filtra dos veces a travs de un prefiltro de fibra de vidrio Sartorius No. 13430, se ajusta a un PCV de aproximadamente 8%, dependiendo de la estandarizacin final frente a un suero calibrado contra el OIEISS, y se guarda a 4C en la oscuridad. El antgeno debe almacenarse siguiendo las recomendaciones de los fabricantes, pero normalmente no debe congelarse. Cuando se utiliza en la prueba estndar, el antgeno RBT debe dar una reaccin positiva clara con dilucin 1/45 del OIEISS diluido en 0,5% de solucin salina con fenol, pero no a una dilucin de 1/55. Tambin es conveniente comparar la reaccin de antgeno nuevo y de lotes previamente estandarizados utilizando un conjunto de sueros definidos. i) ii) iii) iv) Procedimiento de la pruebas Poner las muestras de suero y de antgeno a temperatura ambiente (22 4C); solo debe sacarse del refrigerador el antgeno suficiente para las pruebas del da. Colocar 2530 l de cada muestra de suero en una baldosa blanca, placa esmaltada o de plstico, o en una placa para hemaglutinacin de la OMS. Agitar bien el frasco de antgeno, pero suavemente, y colocar el mismo volumen de antgeno prximo a la gota de suero. Inmediatamente despus de aadir la ltima gota de antgeno en la placa, mezclar cuidadosamente el suero y el antgeno (usando un porta limpio o una varilla de plstico para cada prueba) hasta producir una zona circular u oval de aproximadamente 2 cm de dimetro. La mezcla se agita suavemente durante 4 minutos a temperatura ambiente en un agitador circular o tridimensional (si la zona de reaccin es oval o circular, respectivamente) Comprobar la aglutinacin, justo a los 4 minutos. Cualquier reaccin visible se considera positiva. Antes de las pruebas de cada da se debe comprobar que un suero control origine una reaccin positiva mnima para verificar la sensibilidad de las condiciones de la prueba.
v) vi)
La RBT es muy sensible. Sin embargo, como toda prueba serolgica, a veces origina una reaccin positiva debido a vacunacin con S19 o a reacciones serolgicas positivas falsas (FPSR). Por tanto, las reacciones positivas deben confirmarse con estrategias confirmativas (que incluyan tanto la realizacin de otras pruebas como la investigacin epidemiolgica). Las reacciones negativas falsas se producen muy raramente, sobre todo debido a los fenmenos de prozona y en ocasiones se pueden detectar diluyendo la muestra de suero o volviendo a probarla despus de 46 semanas. Sin embargo, la RBT parece adecuada como una prueba para detectar rebaos infectados o para garantizar la ausencia de infeccin en rebaos libres de brucelosis.
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v) vi) vii)
Como la RBT, esta prueba es muy sensible, especialmente para la deteccin de anticuerpos inducidos por la vacuna, y las muestras positivas deben volverse a verificar con pruebas confirmativas. Pueden producirse reacciones negativas falsas, debidas por lo general a fenmenos de prozona, la cual puede eliminarse diluyendo el suero o volviendo a probar despus de cierto tiempo.
b)
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Existen numerosas variaciones de la prueba pero, cualquiera que sea el procedimiento, debe emplearse un antgeno preparado de una cepa lisa aprobada de B. abortus, como la S99 o la S1119-3, y que est estandarizado frente al OIEISS. El antgeno para la FC puede preparase por mtodos especiales (2, 38) o utilizar clulas enteras diluyendo la suspensin stock de modo que la PCV de la suspensin de antgeno concentrado para la FC sea aproximadamente del 2% antes de la estandarizacin frente al OIEISS. El antgeno debe estandarizarse para dar una fijacin del 50% a una dilucin 1/200 del OIEISS y debe mostrar tambin una fijacin completa a diluciones ms bajas de suero, porque una concentracin demasiado baja (o demasiado alta) de antgeno puede no producir un 100% de fijacin a diluciones ms bajas de suero. Cuando son adecuadas dos diluciones de antgeno, debe escogerse la suspensin de antgeno ms concentrada para evitar el fenmeno de prozona. La apariencia del antgeno a una dilucin 1/100 debe ser la de una suspensin blanca, uniforme y densa, sin agregacin visible ni formacin de depsito despus de incubar a 37C durante 18 horas. No debe producir efectos anticomplementarios en las condiciones de la prueba. El antgeno se guarda a 4C y no debe congelarse. Procedimiento de la prueba (ejemplo)
Los sueros problema sin diluir y los estndar de trabajo adecuados se inactivan durante 30 minutos en una bao de agua a 60C 2C. Si previamente se han diluido a la mitad con una solucin salina tamponada con veronal, se pueden inactivar a 58C 2C durante 50 minutos. En general solo se prueba rutinariamente una dilucin del suero (1/4 o 1/5, dependiendo del procedimiento escogido de la FC), pero se recomiendan diluciones seriadas a efectos de detectar la existencia de prozona. Con el empleo de placas de microtitulacin estndar de 96 pocillos de fondo redondeado (en U), la tcnica se realiza normalmente del modo siguiente: i) En el pocillo de la primera, segunda y tercera filas, se colocan 25 l de suero problema inactivado diluido. La primera fila es un control anticomplementario para cada suero. Se aade a los pocillos de la primera fila 25 l de tampn de FC (controles anticomplementario) para compensar la falta de antgeno. A todos los otros pocillos se aade 25 l de tampn de FC excepto a los de la segunda fila. A continuacin se hacen diluciones dobles seriadas transfiriendo volmenes de 25 l de suero de la tercera fila en adelante. Se descartan 25 l de la mezcla resultante en la ltima fila. A cada pocillo, excepto en la primera fila, se aaden 25 l de antgeno, diluido a la concentracin de trabajo, y 25 l de complemento, diluido al nmero de unidades requerido. Se aaden a cada pocillo volmenes de 25 l de complemento diluido hasta el nmero de unidades requerido.
ii) iii)
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v)
vi)
vii)
c)
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El sLPS de B. abortus S1119-3 S99 se prepara calentando 5 g de peso seco (o 50 g de peso hmedo) de clulas suspendidas a 66C en 170 ml de agua destilada y aadiendo 190 ml de fenol al 90% (v/v) a 66C. La mezcla se agita continuamente a 66C durante 15 minutos, se enfra y se centrifuga a 10.000 g durante 15 minutos a 4C. El fenol parduzco de la capa inferior se extrae con una cnula larga y si es necesario los restos celulares se eliminan por filtracin (utilizando un filtro de papel Whatman No.1). El sLPS se precipita aadiendo 500 ml de metanol fro que contenga 5 ml de metanol saturado con acetato sdico. Despus de 2 horas de incubacin a 4C, el precipitado se recoge por centrifugacin a 10.000 g durante 10 minutos. El precipitado se agita con 80 ml de agua destilada durante 18 horas y se centrifuga a 10.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se mantiene a 4C. El precipitado se resuspende en 80 ml de agua destilada y se agita otras 2 horas a 4C. El sobrenadante se recoge mediante centrifugacin como antes y se mezcla con el sobrenadante recogido previamente. A continuacin, se aaden 8 g de cido tricloroactico a los 160 ml del LPS crudo. Despus de agitar durante 10 minutos, el precipitado se elimina por centrifugacin y la solucin traslcida que constituye el sobrenadante se dializa frente a agua destilada (como mnimo, dos cambios de 400 ml cada uno) y luego se liofiliza. El LPS liofilizado se pesa, se reconstituye a una concentracin de 1 mg/ml en tampn carbonato 0,05 M, pH 9,6, y se sonica en un bao de hielo utilizando tres sonicaciones de 6 vatios durante 1 minuto cada vez. A continuacin, el LPS se liofiliza en fracciones de 1 ml y se guarda a temperatura ambiente. i) Procedimiento de la prueba (ejemplo) El sLPS liofilizado se reconstituye con 1 ml de agua destilada y se diluye a 1/1000 con tampn carbonato 0,05 M, pH 9,6 (o a una dilucin predeterminada por titulacin frente al suero estndar de la OIE para ELISA). Para antigenizar las microplacas, se aade a todos los pocillos 100 l de la solucin de sLPS, se cubren las placas y se incuba durante 18 horas a 4C. Despus de la incubacin, las placas se pueden usar o se mantienen selladas y congeladas a 20C hasta un ao. Las placas congeladas se descongelan antes de uso durante 3045 minutos a 37C. El antgeno no unido se elimina lavando todos los pocillos cuatro veces con PBST. A los pocillos especificados se aaden 100 l de suero diluido de 1/50 a 1/200 con PBST, pH 6,3, que contiene
ii)
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iv)
v)
vi)
ELISA competitivo
El ELISA competitivo (C-ELISA) que emplea un MAb especfico para uno de los eptopos de la Brucella OPS parece tener mayor especificidad que el I-ELISA (49, 64, 83, 92). Se realiza seleccionando un MAb con mayor afinidad que los anticuerpos con reaccin cruzada. No obstante, se ha comprobado que el CELISA elimina algunas, pero no todas, las reacciones (FPSR) debidas a bacterias con reaccin cruzada (61). El C-ELISA es tambin capaz de eliminar la mayora de las reacciones debidas a los anticuerpos residuales que se producen en respuesta a la vacunacin con S19. La eleccin del MAb y su singular especificidad y afinidad influencian las propiedades diagnsticas de la prueba. Como en cualquier prueba basada en el MAb, se debe considerar la disponibilidad general del MAb o del hibridoma para su aceptacin internacional y su utilizacin generalizada. Se han descrito algunas variaciones de C-ELISA. El C-ELISA tambin est disponible comercialmente. Para una homogenizacin internacional, los laboratorios nacionales de referencia deben utilizar los tres Sueros Estndar de la OIE para el ELISA a fin de comprobar o calibrar el mtodo concreto. La prueba debe calibrarse de tal modo que la densidad ptica del Suero Estndar de la OIE fuertemente positivo represente un punto en la zona lineal de una curva tpica de dosis-respuesta justo por encima de la meseta (es decir, prximo a la mxima inhibicin). El Suero Estndar de la OIE dbilmente positivo debe dar una reaccin que caiga en la porcin lineal de la misma curva de dosis-respuesta justo por encima del umbral positivo/negativo (es decir, inhibicin moderada). El suero negativo y el control de tampn/MAb deben dar reacciones siempre menores que el umbral positivo/negativo (es decir, inhibicin mnima). El mtodo que se describe a continuacin es un ejemplo de prueba que se ha validado internacionalmente y utilizado con una difusin mundial a travs de proyectos de cooperacin tcnica y colaboracin cientfica con financiacin internacional. Los sistemas de tampn son los mismos que los descritos para la prueba I-ELISA.
Laboratorio de Referencia de la OIE para la Brucelosis, Animal Diseases Research Institute, 3851 Fallowfield Road, Nepean, Ontario K2H 8P9, Canada.
699
El sLPS de la cepa S1119-3 de B. abortus se prepara y se utiliza como para el I-ELISA. i) Procedimiento de la prueba El sLPS liofilizado se reconstituye con 1 ml de agua destilada y se diluye a 1/1000 con tampn carbonato 0,05 M y pH 9,6. Para antigenizar las microplacas, se aade a todos los pocillos 100 l de la solucin de LPS, se cubren las placas y se incuban durante 18 horas a 4C. Despus de la incubacin, las placas se pueden usar o mantenerlas selladas y congeladas a 20C hasta un ao. Las placas congeladas se descongelan antes de uso durante 3045 minutos a 37C. El antgeno no unido se elimina lavando todos los pocillos cuatro veces con PBST. A cada pocillo se aaden 50 l de MAb (M84 en este caso) convenientemente diluido en PBST/EDTA e inmediatamente otros 50 l de suero diluido 1/10 en PBST/EDTA. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitacin, por lo menos durante los 3 minutos iniciales. Se aaden a las placas los sueros problema y se ensayan por separado o en duplicado. Los controles, calibrados con Sueros Estndar de la OIE para ELISA, se disponen en pocillos duplicados e incluyen un suero control fuertemente positivo, otro dbilmente positivo, un suero control negativo y un control del tampn. El suero no unido se elimina lavando cuatro veces con PBST. A cada pocillo se aade 100 l de conjugado comercial de IgG anti-ratn de cabra (cadena H y L) unida a HRPO y diluida en PBST (predeterminado por titulacin) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos. El exceso de conjugado se elimina con cuatro lavados. A cada pocillo se aade 100 l de substrato/cromgeno (1,0 mM de H2O2 y 4,0 mM de ABTS), se agitan las placas durante 10 minutos y el color desarrollado se determina con un espectrofotmetro a 414 o 405 nm. Si se desea, se puede aadir directamente a todos los pocillos 100 l de SDS al 4% como agente de parada de la reaccin. Los pocillos control que contienen el suero fuertemente positivo se consideran como una inhibicin del 0% y todos los datos se calculan de estas lecturas de absorbancia (entre 1.000 y 1.800) empleando la ecuacin: Porcentaje de inhibicin (%I) = 100 (absorbancia [muestra problema]/absorbancia [control de tampn] 100). Con fines de estandarizacin y de investigacin se encuentran disponibles el antgeno sLPS, pequeas cantidades del MAb especfico para la cadena pesada del la IgG1 bovina, programas para la generacin de datos empleando espectrofotmetros particulares y un protocolo estandarizado para la prueba C-ELISA (ver direccin en nota 3 a pie de pgina). Mediante este protocolo descrito para C-ELISA, u otro similar calibrado frente a los Sueros Estndar de la OIE para ELISA, la sensibilidad diagnstica debe ser equivalente a los BBAT y el I-ELISA en pruebas con ganado infectado (63, 64, 66). La especificidad diagnstica del C-ELISA debe ser equivalente o superior a la de la FC e I-ELISA en pruebas con ganado sin vacunar o en el caso de FPSR. La especificidad diagnstica de C-ELISA es mayor que la de la FC y el I-ELISA en pruebas con ganado vacunado con S19.
ii)
iii)
iv)
v)
vi)
d)
700
El OPS se prepara a partir de 5 g de peso seco (o 50 g de peso hmedo) de B. abortus S1119-3 aadiendo 400 ml de cido actico al 2% (v/v), autoclavando la suspensin durante 15 minutos a 121C y eliminando los restos celulares mediante centrifugacin a 10.000 g durante 10 minutos a 4C. A continuacin, el sobrenadante se trata con 20 g de cido tricloroactico para precipitar las protenas y los cidos nucleicos. El precipitado se elimina de nuevo mediante centrifugacin a 10.000 g durante 10 minutos a 4C. El sobrenadante se dializa frente, al menos, 100 volmenes de agua destilada y se liofiliza. Se disuelven 3 mg de OPS en 0,6 ml de hidrxido sdico 0,1 M (4 g NaOH/litro) y se incuba a 37C durante 1 hora. Despus se aade 0,3 ml de ismero 1 de FICT a una concentracin de 100 mg/ml en dimetil sulfxido y se incuba otra vez durante 1 hora a 37C. El OPS conjugado se aplica a una columna de 1 10 cm de DEAE (dietilaminoetil) Sephadex A 25 equilibrada con tampn fosfato 0,01 M, pH 7,4. La primera fraccin (despus de 1015 ml de elucin con tampn) es verde fuerte, y despus se cambia el tampn a fosfato 0,1 M, pH 7,4. Se eluyen 1015 ml de tampn seguidos luego de 2040 ml donde se obtiene el material verde fluorescente. Este ltimo material es el antgeno utilizado en FPA. La preparacin de antgeno se puede aumentar proporcionalmente. La cantidad de antgeno utilizada por prueba se determina diluyendo el material antes obtenido hasta lograr una intensidad de fluorescencia de 250.000300.000 en el FPM. El antgeno se guarda como un lquido durante varios aos a 4C en un frasco opaco o se puede liofilizar en frascos opacos. Se puede disponer de pequeas cantidades de antgeno marcado para la investigacin y estandarizacin de procedimientos operativos relacionados con la obtencin de antgeno y la realizacin de FPA (para direccin, ver nota 3 a pie de pgina). i) Procedimiento de la pruebas Se aade 1 ml de tampn Tris a tubos de vidrio de borosilicato de 10 75 mm y despus 10 l de suero o 20 l de sangre tratada con EDTA. Para el formato de 96 pocillos, se aaden 20 l de suero a 180 l de tampn. Es importante mezclar bien. Se obtiene una lectura en el FPM para determinar la dispersin de la luz. Se aade al tubo un volumen de antgeno que corresponda a una intensidad total de fluorescencia de 250300 103 y se mezcla bien. Este volumen puede variar de un lote a otro, pero en general es de unos 10 l. Se obtiene una segunda lectura en el FPM despus de una incubacin a temperatura ambiente de 2 minutos para suero y de 15 segundos para sangre tratada con EDTA. Una lectura superior al umbral predeterminado indica una reaccin positiva. En cada serie de pruebas se incluye un suero estndar de trabajo fuertemente positivo, otro dbilmente positivo y un suero negativo (calibrados frente a los Sueros Estndar de la OIE).
ii)
iii) iv)
La sensibilidad y la especificidad diagnstica de la FPA en la brucelosis bovina son casi idnticas a las de C-ELISA. La especificidad diagnstica en ganado recientemente vacunado con la cepa S19 supera el 99% (62). Sin embargo se desconoce en la actualidad la especificidad de la FPA en condiciones de FPSR. La FPA debe estandarizarse de modo que los sueros positivos fuertes y dbiles de la OIE suministren resultados positivos repetitivos.
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3.
a)
Otras pruebas
Prueba cutnea de la brucelina
Una prueba inmunolgica alternativa es la prueba cutnea de la brucelina, que puede utilizarse para el diagnstico en rebaos no vacunados siempre que se utilice una preparacin antignica purificada (libre de LPS) y estandarizada (por ejemplo, brucelina INRA). La prueba cutnea de la brucelina tiene una especificidad muy elevada, de modo que los animales sin vacunar que son serolgicamente negativos y reaccionan positivamente en la prueba de la brucelina deben considerarse animales infectados (78). Adems, los resultados de esta prueba pueden ayudar a interpretar reacciones serolgicas que se consideran como FPSR debidas a una infeccin por bacterias que tienen una reaccin cruzada, especialmente en reas libres de brucelosis (23, 74, 78). No todos los animales infectados reaccionan, por lo que esta prueba sola no es recomendable como prueba nica a efectos del comercio internacional. Es esencial utilizar una preparacin estandarizada y definida de brucelina que no contenga antgenos sLPS, ya que este puede producir reacciones inflamatorias inespecficas o interferir con pruebas serolgicas posteriores. Una preparacin de ese tipo es la brucelina INRA preparada de una cepa rugosa de B. melitensis que est comercializada4. i) ii) iii) iv) Procedimiento de la prueba Se inyecta intradrmicamente 0,1 ml de brucelina en el repliegue caudal, en la piel del costado lateral, o de un lado del cuello. La prueba se lee despus de 4872 horas. El grosor de la piel en el sitio de la inyeccin se mide con un calibrador Vernier antes y despus de la inyeccin. Una reaccin positiva fuerte se reconoce fcilmente como una inflamacin local e induracin. No obstante, las reacciones dudosas requieren una interpretacin cuidadosa. Un engrosamiento de la piel de 1,52 mm debe considerarse como una reaccin positiva.
Aunque la prueba intradrmica de la brucelina es una de las ms especficas de la brucelosis (en animales no vacunados) el diagnstico no puede hacerse basndose solamente en reacciones intradrmicas positivas en unos cuantos animales del rebao, y debe apoyarse en una prueba serolgica fiable. La inoculacin intradrmica de la brucelina puede originar una anergia temporal de la respuesta inmune celular. Por tanto, en general se recomienda un intervalo de 6 semanas entre dos pruebas realizadas sobre el mismo animal. La prueba cutnea, realizada con brucelina de la RB51 homloga tras la vacunacin de los terneros con RB51, produce una respuesta humoral anamnsica. De esta forma, la asociacin de la prueba cutnea y la prueba de FC con RB51 puede aportar un sistema de diagnstico para identificar los animales individuales vacunados con RB51 (23).
b)
Brucellergne OCB, Synbiotics Europe, 2 rue Alexander Fleming, 69007 Lyon, Francia.
702
c)
d)
Pruebas en la leche
Un medio eficaz de examinar a las vacas lecheras es recurrir a la leche de los tanques de recogida. De estos tanques se puede obtener leche de forma ms barata y frecuente que las muestras de sangre, y habitualmente estn disponibles en las centrales lecheras. Cuando se obtiene un resultado positivo, todas las vacas que aportan leche deben comprobarse individualmente analizando sus muestras de sangre. La prueba I-ELISA en leche es sensible y especfica, y resulta particularmente til para llevarla a cabo en grandes poblaciones de animales. La prueba del anillo de leche (MRT) es una alternativa adecuada cuando no se dispone de ELISA. I-ELISA en leche
Como con el I-ELISA para suero, se utilizan numerosas variaciones del I-ELISA para leche. Se han comercializado varios I-ELISA que se han validado en ensayos de campo y son de uso amplio. A efectos de una armonizacin internacional, los laboratorios nacionales de referencia deben utilizar los tres Sueros Estndar de la OIE para ELISA con el fin de comprobar o calibrar el mtodo particular de la prueba en cuestin. El I-ELISA debe estandarizarse de modo que el estndar positivo fuerte positivo de la OIE para ELISA diluido a 1/125 en suero negativo y diluido despus a 1/10 en leche negativa se comporte repetidamente como positivo. Las muestras de leche completa se comprueban generalmente con diluciones mucho ms bajas que el suero, es decir, de 1/2 a 1/10 en tampn de dilucin, y el resto de la prueba es similar a lo descrito para suero. La prueba C-ELISA no debe utilizarse con leche completa pero puede usarse con muestras de suero. Prueba del anillo de leche
En los animales lactantes, la prueba del anillo de leche o MRT (sigla inglesa para milk ring test) puede utilizarse para el diagnstico de la brucelosis en rebaos. En poblaciones grandes (>100 terneros lactantes) la sensibilidad de la prueba tiene menos fiabilidad. La MRT puede ajustarse para compensar el factor de dilucin de las muestras de leche entera procedente de rebaos grandes. Las muestras se ajustan de acuerdo con la siguiente frmula: tamao del rebao <150 animales usan 1 ml de leche. 150450 usan una muestra de leche entera de 2 ml. 451700 usan una muestra de leche de 3 ml. Pueden presentarse reacciones positivas falsas en animales vacunados 4 meses antes de la prueba, en muestras de leche anormal (como el calostro) o en casos de mamitis. Por tanto, no se recomienda la utilizacin de esta prueba en granjas muy pequeas, donde estos problemas presentan un mayor impacto en los resultados de la prueba.
El procedimiento detallado puede obtenerse del Departamento de Sanidad Animal, Servicio de Investigacin Agraria/DGA, Apartado 727, 50080 Zaragoza, Espaa.
703
Produccin de antgeno
El antgeno para MRT se prepara a partir de suspensiones concentradas de bacterias muertas de B. abortus S99 o S1119-3, cultivadas como se ha descrito con anterioridad. Se centrifugan a 23.000 g durante 10 minutos a 4C y se resuspenden en solucin de colorante hematoxilina. Se emplean varios mtodos satisfactorios; un ejemplo es el siguiente: se aaden 100 ml de hematoxilina al 4% (p/v) (Cl No. 75290), disuelta en 95% de etanol, a una solucin de sulfato amnico alumnico (5 g) en 100 ml de agua destilada y 48 ml de glicerol. A la solucin se aaden 2 ml de iodato sdico al 10% (p/v) recin preparado. Despus de 30 minutos a temperatura ambiente, la solucin de color prpura oscuro se aade a 940 ml de sulfato amnico alumnico al 10% (p/v) en agua destilada. El pH de la mezcla se ajusta a 3,1 y la solucin se deja envejecer mantenindola a temperatura ambiente durante 4590 das en la oscuridad. La solucin de colorante se agita antes de utilizarlas y se filtra a travs de una gasa. Las clulas empaquetadas se suspenden en la solucin de colorante a razn de 1 g por cada 30 ml de colorante y se mantienen a temperatura ambiente durante 48 horas (en vez de esto, algunos laboratorios prefieren calentar 80C durante 10 minutos). Las clulas teidas se concentran por centrifugacin y se lavan tres veces con una solucin de cloruro sdico (6,4 g), cido lctico al 85% (1,5 ml) e hidrxido sdico al 10% (4,4 ml) en 1,6 litros de agua destilada, a pH final de 3,0. Las clulas lavadas se resuspenden a razn de 1 g en 27 ml de un diluyente que consiste en solucin salina con fenol al 0,5%, ajustada a pH 4,0 por adicin de cido ctrico 0,1 M (aproximadamente 2, 5 ml) y fosfato bisdico 0,5 M (aproximadamente 1 ml), y se mantiene a 4C durante 24 horas. La mezcla se filtra a travs de una gasa, se comprueba el pH, y se determina el PCV ajustndolo aproximadamente al 4%. La sensibilidad del lote nuevo debe compararse con la de un lote previamente estandarizado utilizando un juego de muestras de varios grados de reaccin preparado diluyendo un suero positivo en leche. El antgeno debe estandarizarse frente al OIEISS de modo que una dilucin 1/500 sea positiva y una dilucin 1/1.000 sea negativa. El antgeno debe almacenarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero generalmente debe guardarse a 4C. El pH del antgeno debe estar entre 3,3 y 3,7 y su color debe ser azul oscuro. Se permite la existencia de un poco de colorante libre en el sobrenadante de una muestra centrifugada. Cuando se diluye en leche de un animal sin brucelosis, el antgeno debe producir una coloracin uniforme de la capa de leche sin formar depsitos ni coloracin en la capa cremosa. Procedimiento de la prueba
La prueba se lleva a cabo sobre las muestras del tanque de leche entera. Si es necesario, las muestras se pueden pretratar con un conservante (formalina al 0,1% o bronopol al 0,02%) durante 23 das a 4C antes de su utilizacin. i) ii) iii) Se debe procurar que las muestras de leche y el antgeno se mantengan a temperatura ambiente (20 3C). Debe retirarse de la nevera solo el antgeno necesario para las pruebas del da. Se agita suavemente la botella de antgeno. La prueba se lleva a cabo aadiendo 3050 l de antgeno a 12 ml de leche completa (el volumen de leche puede aumentarse para muestras de poblaciones grandes. Vase ms arriba la prueba del anillo de leche). La altura de la columna de leche en el tubo debe ser como mnimo de 25 mm. Las muestras de leche no deben haber sido congeladas, calentadas, sometidas a agitacin violenta o guardadas durante ms de 72 horas. Normalmente, las mezclas de leche y antgeno se incuban a 37C durante 1 hora junto con los estndares de trabajo positivos y negativos. Sin embargo, la incubacin durante la noche a 4C aumenta la sensibilidad de la prueba y permite una interpretacin ms fcil. Una reaccin fuertemente positiva se indica por la formacin de un anillo azul oscuro por encima de la columna blanca de leche. Cualquier anillo azul en la interfase de leche y de crema debe considerarse como positivo y podra ser significativo, especialmente en el caso de grandes poblaciones. La prueba es negativa si el color de la leche supera al de la capa cremosa.
iv)
v)
vi)
vii)
viii) Cuando se ajusta la MRT para aplicarla en rebaos de gran tamao (utilizndose 2 o 3 ml de leche), se aade 0,1 ml de una mezcla de nata negativa al tubo de ensayo y a continuacin 3050 l del antgeno de la prueba del anillo. Despus de mezclar, se incuba y se lee de la misma forma que para la MRT no ajustada. La mezcla de nata negativa se recoge mediante la separacin de la leche entera y sin pasteurizar procedente de un rebao de 25 o ms vacas que sean negativas a la brucelosis.
704
e)
f)
C1. Brucelina
La brucelina INRA es un extracto libre de LPS de la cepa B115 de B. melitensis en fase rugosa. Esta preparacin no provoca la formacin de anticuerpos reactivos en la BBAT, la FC o el ELISA.
1.
a)
Control de inculos
Caractersticas del inculo
La produccin de brucelina INRA se basa en un sistema de lotes de siembra como el descrito para los antgenos y las vacunas. El inculo original de la cepa B115 de B. melitensis para produccin de brucelina6 debe cultivarse para producir un lote de siembra que debe conservarse mediante liofilizacin o congelacin en nitrgeno lquido. Debe presentar las propiedades de un cultivo puro de una cepa rugosa de B. melitensis y no producir LPS liso de Brucella. Debe producir cantidades razonables de una mezcla de antgenos proteicos reactivos frente a antisueros contra cepas rugosas y lisas de Brucella.
b)
c)
Se puede obtener del Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Laboratoire de Pathologie Infectieuse et Immunologie, 37380 Nouzilly, Francia.
705
2.
Las clulas de la cepa B115 de Brucella melitensis se inactivan despus del cultivo elevando la temperatura a 70C durante 90 minutos, se enfran a 4C, y se recogen por centrifugacin a 9.000 g durante 15 minutos a 4C. Las clulas se lavan con agua destilada estril y fra y se deshidratan precipitndolas con tres volmenes de acetona a 20C, y luego se deja reposar a 20C durante 2448 horas. Despus de lavados repetidos con acetona fra y de un lavado final con dietil ter, las clulas se secan sobre cloruro clcico y se mantienen a 4C. Las clulas secas se someten a una prueba de viabilidad. Se resuspenden en cloruro sdico estril al 2,5% hasta una concentracin final del 5% (p/v) y se agitan durante 3 das a 4C. Las clulas bacterianas se eliminan mediante centrifugacin como se ha descrito con anterioridad y el sobrenadante se concentra a un cuarto de su volumen mediante ultrafiltracin con una membrana Diaflo PM10 (Amicon) y se precipita aadiendo tres volmenes de etanol fro. La mezcla se mantiene a 4C durante 24 horas y el precipitado se centrifuga y el concentrado se redisuelve en agua destilada y se dializa para eliminar el etanol. Despus de centrifugar a 105.000 g durante 6 horas a 4C, el sobrenadante, que es la brucelina sin estandarizar, se determinan mediante anlisis sus protenas y carbohidratos. Puede liofilizarse en su totalidad o despus de distribuirla en sus envases.
3.
Debe comprobarse la esterilidad del extracto crudo de brucelina despus de su extraccin con acetona para comprobar la inactivacin de las clulas de Brucella, y una vez ms al final del proceso, a fin de comprobar una posible contaminacin. Deben determinarse el pH y la concentracin de protena y realizarse pruebas de identidad en la totalidad del material obtenido antes de proceder al llenado de los envases.
4.
a)
Control de lotes
Esterilidad
La esterilidad de las preparaciones de alrgenos debe comprobarse como se describe en el captulo 1.1.9.
b)
Inocuidad
Las muestras de brucelina en sus recipientes finales deben someterse a la prueba estndar de esterilidad y tambin deben comprobarse la toxicidad anormal de las preparaciones. Se inyectan intraperitonealmente dosis equivalentes a 20 dosis de ganado (2 ml) en un par de cobayas normales que no se hayan expuesto con anterioridad a Brucella o a sus antgenos. Tambin se inyectan subcutneamente cinco ratones normales con 0, 5 ml de brucelina examinada. Los animales se observan durante 7 das y no debe haber reaccin local o generalizada a la inyeccin. La capacidad dermonecrtica se examina mediante la inoculacin intradrmica de 0,1 ml del producto examinado en el costado previamente afeitado y desinfectado de tres cobayas albinos normales que no se hayan expuesto con anterioridad a Brucella o a sus antgenos. No debe observarse reaccin cutnea alguna. La ausencia de sensibilizacin alrgica o serolgica se comprueba mediante la inoculacin intradrmica de tres cobayas albinos normales, tres veces cada 5 das, con 0,1 ml de una dilucin al 1/10 de la preparacin examinada. Se suministra una inyeccin similar 15 das despus a los mismos tres animales y a un lote control de tres cobayas del mismo peso que no se hayan inyectado previamente. Los animales no deben convertirse en seropositivos cuando se examinan 24 horas despus de la ltima inoculacin por las pruebas estndar de brucelosis (RBT, FC) ni deben desarrollar respuestas de hipersensibilidad retardada.
c)
Potencia
La potencia de las preparaciones de brucelina se determina mediante la inyeccin intradrmica de dosis graduales de brucelina en cobayas que se han sensibilizado con inoculacin subcutnea con 0,5 ml de brucelina de referencia7 con adyuvante completo de Freund de 1 a 6 meses antes. Se determina y mide la reaccin eritematosa a las 24 horas y se calcula el ttulo por comparacin con una brucelina de referencia8. Este mtodo solo es vlido para comparar preparaciones de brucelina obtenidas por el mismo protocolo que
7 8
Se ha producido por el INRA-PII (F-37380 Nouzilly, Francia) una brucelina de referencia nacional que puede obtenerse del Laboratorio de Referencia de la OIE para la Brucelosis, AFSSA, 23 avenue du Gnral-de-Gaulle, 94706 MaisonsAlfort Cedex, France. El procedimiento estadstico puede obtenerse del Laboratorio de Referencia de la OIE para Brucelosis, AFSSA, BP67, 94706 Maisons-Alfort Cedex, France.
706
d)
Duracin de la sensibilidad
La duracin de la sensibilidad es dudosa. El grado de hipesensibilidad a la brucelina de los animales vara individualmente de forma considerable. Los animales en la fase inicial de la infeccin, o con infecciones crnicas, pueden no manifestar hipersensibilidad a la inyeccin intradrmica.
e)
Estabilidad
La preparacin liofilizada mantiene ntegramente su actividad durante varios aos. La preparacin comercial lquida debe mantener su potencia hasta la caducidad recomendada.
f)
Conservantes
No se recomienda el uso de conservantes en las preparaciones liofilizadas. En la forma lquida, se puede utilizar mertiolato sdico como conservante (mximo 0,1 mg/ml). Si la preparacin est liofilizada no debe reconstituirse hasta inmediatamente antes de su uso.
g)
Precauciones (riesgos)
La brucelina no es txica. Sin embargo, puede provocar reacciones graves de hipersensibilidad en individuos sensibilizados que se exponen accidentalmente a ella. Debe tenerse cuidado en evitar la inyeccin accidental o la contaminacin de las mucosas. El equipo de inyeccin utilizado y los recipientes deben descontaminarse cuidadosamente o eliminarse por incineracin en contenedores adecuados de desecho.
5.
a)
b)
Potencia
Se realiza por inyeccin de una nica dosis en cobayas segn el procedimiento descrito en la seccin C1.4.c.
707
1.
a)
Control de inculos
Caractersticas del inculo
El inculo original de B. abortus S19 para producir vacunas debe obtenerse del USDA (para direccin, ver nota 2 a pie de pgina) y utilizarse para producir un lote de inculos conservado por liofilizacin o por congelacin en nitrgeno lquido. Las propiedades de este lote de inculos deben ser las de un cultivo puro
708
b)
Mtodo de cultivo
Para producir la vacuna de cepa S19 de B. abortus se cultiva en un medio libre de suero o de otros productos animales, bajo condiciones similares a las descritas antes para las cepas S99 S1119-3 de B. abortus (2). La cepa RB51 de B. abortus sigue mtodos similares de cultivo.
c)
2.
Mtodo de produccin
Para la produccin de la vacuna S19 se pueden utilizar los procedimientos descritos anteriormente, excepto que las clulas se recogen en PBS, pH 6,3, y se depositan por centrifugacin o aadiendo carboximetil celulosa sdica a una concentracin final de 1,5 g/litro. El producto obtenido de un fermentador o las clulas agrupadas de un lote de cultivos en frascos de Roux que se hayan inoculado al mismo tiempo y con el mismo lote de inculo constituye una cosecha individual. Se puede juntar ms de un lote para formar la masa final que se utiliza para llenar los recipientes terminales de un lote de vacuna. Antes de mezclarlas, en cada lote individual se ha de comprueba la pureza, concentracin celular, disociacin e identidad. Deben hacerse las mismas pruebas en el producto final, que debe tener un nmero de microorganismos viables comprendido entre 8 y 24 109 UFC/ml. Los ajustes de concentracin se hacen aadiendo PBS a la vacuna presentada en forma lquida o un estabilizador a la forma liofilizada. Si se emplea un estabilizador debe tenerse en cuenta la prdida de viabilidad en la liofilizacin, y no debe superar el 50%. El producto final desecado no debe someterse a temperaturas superiores a 35C durante el secado y el contenido en humedad residual debe ser el 12%. Los envases deben cerrarse al vaco o en nitrgeno seco inmediatamente despus del secado, y han de mantenerse a 4C. El proceso de produccin para la cepa BR51 de B. abortus es muy similar al utilizado para la S19.
9 Colorado Serum Company, 4950 York Street, P.O. Box 16428, Denver, Colorado 80216-0428, EE.UU.; o Veterinary Technologies Corporation, 1872 Pratt Drive, Suite 1100B, Blacksburg, Virginia 24060, EE.UU.
709
3.
La pureza y la fase lisa de la vacuna con B. abortus S19 debe comprobarse durante la preparacin de cada cosecha individual. Tambin debe comprobarse la concentracin celular, que puede realizarse mediante medidas de opacidad, pero en los lotes finales de llenado debe realizarse una determinacin de microorganismos viables. Tambin debe comprobarse su identidad mediante pruebas de aglutinacin con antisuero contra el antgeno A de Brucella. La concentracin de microorganismos viables en los recipientes finales no debe ser inferior a 50 109 por cada dosis estndar despus de la liofilizacin y al menos el 95% de las clulas deben estar en la fase lisa. La pureza y le fase rugosa de la vacuna con cepa RB51 de B. abortus debe probarse durante la preparacin de cada cosecha individual. Tambin debe comprobarse la concentracin celular. En los lotes finales de llenado debe realizarse una determinacin de microorganismos viables. Su concentracin en los recipientes finales debe ser de 13,4 1010 UFC por dosis (dosis de 2 ml aplicadas subcutneamente) y el 100% de las clulas deben estar en fase rugosa. Todas las colonias deben ser negativas en pruebas puntuales con MAb especficos para el antgeno OPS.
4.
a)
Control de lotes
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin en los materiales biolgicos se encuentran en el captulo 1.1.5.
b)
Inocuidad
La vacuna S19 es per se un producto virulento y debe mantenerse con mnima virulencia para que sea eficaz (vase la seccin C2.4.c.). Sin embargo, no se realiza rutinariamente una prueba de inocuidad. Si se desea, puede realizarse en ganado cuando se inicia un nuevo proceso de fabricacin o cuando se espera alguna modificacin de la seguridad de la vacuna. Este control debe realizarse como sigue: la prueba utiliza 12 terneras de 46 meses. Seis de las hembras se inyectan con una o con tres dosis recomendadas. Cada lote de seis terneras se mantiene por separado y se observan durante 21 das. No deben producirse lesiones locales o sistmicas significativas. Si para una dosis y una va de administracin dadas la prueba da buenos resultados para un lote representativo de vacuna, no tiene que repetirse con lotes de inculo o de vacuna preparados con el mismo inculo original y con el mismo proceso de fabricacin. Tambin debe realizarse una prueba de seguridad de la vacuna S19 en cobayas. A grupos de 10 animales como mnimo se inyectan por va intramuscular dosis de vacuna diluida en PBS, pH 7,2, que contengan 5 109 microorganismos viables. Los animales no deben mostrar signos nocivos ni debe haber mortalidad. Normalmente, no se realizan pruebas de inocuidad con la vacuna de la cepa RB51 de B. abortus. Si se desea, se pueden inyectar intraperitonealmente ratones Balb/c hembras de 810 semanas con 1 108 UFC y se cultivan los bazos a las 6 semanas post-inoculacin. Los bazos deben estar libres de la cepa RB51 y los ratones no deben desarrollar anticuerpos anti-OPS.
c)
710
iii) iv) v)
vi)
viii) Si se confirma el paralelismo, comparar estadsticamente los valores RT50 obtenidos para la cepa problema y de referencia utilizando el SAS diseado para este propsito. Para ser aceptable para la produccin de vacunas, el RT50 obtenido con la cepa problema no debe diferir significativamente del
711
Esta prueba utiliza tres grupos de seis ratones CD1 hembras, de 57 semanas, que se eligen al azar. i) ii) iii) Preparar y ajustar espectrofotomtricamente las suspensiones de vacuna como se indic anteriormente. Inyectar subcutneamente una suspensin de la vacuna examinada (vacuna problema) que contenga 105 UFC (en un volumen de 0,1 ml/ratn) a cada uno de los seis ratones del primer grupo. Inyectar subcutneamente una suspensin de la vacuna de referencia S19 que contenga 105 UFC de bacterias vivas en cada uno de los seis ratones del segundo grupo. El tercer grupo sirve como grupo control sin vacunar y se inocula subcutneamente con 0,1 ml de BSS. El nmero exacto de UFC inoculado se comprueba despus por siembra en placa de diluciones decimales sobre un medio adecuado (se recomienda agar sangre o TSA). 30 das despus de la vacunacin (e inmediatamente despus de 16 horas de ayuno) todos los ratones se someten a una inoculacin intraperitoneal de desafo con una suspensin (0,1 ml/ratn) que contenga 2 105 UFC de la cepa 544 de B. abortus (dependiente de CO2), preparada, ajustada y comprobada como antes. Sacrificar los ratones 15 das ms tarde por dislocacin cervical. Cada bazo se corta aspticamente, se elimina la grasa, y se pesa y homogeniza. Alternativamente, los bazos pueden congelarse y mantenerse a 20C de 24 horas a 7 semanas.
iv) v)
vi) vii)
viii) Cada bazo se homogeniza aspticamente con un desintegrador de vidrio (o con un Stomacher en sacos estriles adecuados) en nueve veces su peso con BSS, pH 6,8, y de cada homogenizado se hacen tres diluciones decimales seriadas (1/10, 1/100 y 1/1.000) en el mismo diluyente. Por cuadruplicado, se extienden 0,2 ml en placas con medio slido y se incuban dos placas a 37C durante 5 das en atmsfera con un 10% de CO2 (permite el crecimiento de la cepa vacunal y la desafo) y otras dos placas en atmsfera normal (se inhibe el crecimiento de la cepa de desafo B. abortus 544 que es dependiente de CO2). ix) Se cuentan las colonias de Brucella en las placas que contengan menos de 300 UFC. Cuando no se cuentan colonias en la placa de la dilucin 1/10, se considera que el bazo est infectado con cinco bacterias. Este nmero de Brucella por bazo se anota como X y se expresa como Y, despus de hacer la siguiente transformacin: Y = log (X/log X). Se calcula la respuesta de cada grupo de seis ratones como media y desviacin estndar. Las condiciones del experimento son adecuadas cuando: i) la respuesta de los ratones no vacunados (media de Y) es por lo menos 4,5; ii) la respuesta de los ratones vacunados con la vacuna S19 de referencia es menor de 2,5; y iii) la desviacin estndar calculada en cada lote de seis ratones es inferior a 0,8. Se realizan comparaciones estadsticas (se recomienda la prueba de diferencias menos significativas [LSD]) de los valores de inmunogenicidad obtenidos en los ratones vacunados con la cepa S19 que se prueba respecto a los obtenidos en los ratones vacunados con la vacuna de referencia y el grupo control no vacunado. La vacuna problema es apta si el valor de inmunogenicidad obtenido en ratones vacunados es notablemente inferior al obtenido en los controles sin vacunar y si, adems, no difiere significativamente del obtenido en ratones vacunados con la vacuna de referencia. (Para una informacin detallada de este procedimiento, ver la nota 5 a pie de pgina con la direccin de contacto).
x)
xi)
Si esta prueba se realiza con buenos resultados en un lote representativo de vacuna problema, no tiene que repetirse rutinariamente con otros lotes de vacuna preparados del mismo lote de inculo y utilizando el mismo proceso de produccin.
712
Vacuna RB51
Como la dosificacin (UFC) del inculo primario se correlacion con la proteccin como parte de la autorizacin de la RB51 para el ganado vacuno en EE.UU., las pruebas de potencia in vivo no se aplican de forma rutinaria para las series de vacunas con RB51. En EE.UU. se han aprobado y utilizado los recuentos de placas de microorganismos viables para medir la potencia (este enfoque es idntico al utilizado en las pruebas de potencia para la vacuna con S19 en EE.UU). Se ha propuesto una prueba con ratones Balb/c hembras utilizando 1 104 microorganismos de la cepa 2308 de B. abortus como cepa de desafo, pero la correlacin de la prueba con la proteccin de la vacuna en el ganado vacuno no est completamente determinada. En EE.UU. se ha aprobado y utilizado la determinacin en placa de microorganismos viables (85). Se ha discutido con bastante detalle sobre las vacunas rugosas para la brucelosis (55).
d)
Duracin de la inmunidad
Se considera que la vacunacin de los terneros con una dosis completa de vacuna S19 confiere inmunidad duradera, y no se recomiendan dosis posteriores. Sin embargo no existe evidencia probada de esto y en reas endmicas puede ser aconsejable la revacunacin.
e)
Estabilidad
La vacuna S19 de B. abortus preparada a partir de inculos de orgenes apropiados muestra unas caractersticas estables siempre que se cumplan los requisitos descritos anteriormente sobre el control del proceso y de los lotes, y no tiene tendencia a revertir a la virulenta. La vacuna liofilizada muestra una prdida gradual de microorganismos viables pero debe conservar su potencia hasta el el final del perodo de caducidad recomendado. En funcin de este fenmeno se establece un cierto margen de seguridad, de tal forma que el nmero de viables antes de la liofilizacin sea superior al mnimo exigido. El mantenimiento de la cadena de fro durante la distribucin de la vacuna asegura su viabilidad. La cepa RB51 de B. abortus no muestra tendencia a revertir a la fase lisa de Brucella virulenta despus de muchos pases in vivo o in vitro. Esto se debe probablemente a la naturaleza y localizacin de las mutaciones en esta cepa. La cepa RB51 de B. abortus tiene una disrupcin en el gen wboA debida a un elemento IS711 que impide la sntesis de OPS. Datos no publicados indican que tambin contiene una segunda mutacin que afecta al transporte de OPS a la superficie externa bacteriana o al acoplamiento de OPS con el ncleo del LPS, o a ambos procesos.
f)
Conservantes
En las vacunas vivas S19 o con la cepa RB51 de B. abortus no deben utilizarse conservantes antimicrobianos. Para la preparacin de la vacuna liofilizada se recomienda un estabilizador que contenga 2,5% de hidrolizado de casena, por ejemplo Triptona (Oxoid), un 5% de sacarosa y un 1% de glutamato sdico, disuelto en agua y esterilizado por filtracin.
g)
Precauciones (riesgos)
Aunque son cepas atenuadas, B. abortus S19 y RB51 son an capaces de causar enfermedad en el hombre. los cultivos celulares y las suspensiones deben manejarse bajo condiciones apropiadas de contencin para bioseguridad. La reconstitucin y el posterior manejo de las vacunas deben hacerse con cuidado para evitar una inyeccin accidental o la contaminacin de los ojos o la piel. Los residuos de vacuna y el equipo de inoculacin deben descontaminarse con un desinfectante adecuado (de tipo fenlico, iodforo o aldehdo) a la concentracin adecuada. En caso de exposicin accidental debe requerirse atencin mdica. No se ha establecido adecuadamente la eficacia del tratamiento antibitico de las infecciones causadas por las cepas S19 y RB51 en el hombre; sin embargo, el CDC suministra recomendaciones para el tratamiento. Si se produce contaminacin por la cepa S19, se recomienda un tratamiento combinado con doxiciclina y rifampicina. En caso de contaminacin con la RB51 (que es resistente a rifampicina) debe evitarse el tratamiento con rifampicina y debe utilizarse un rgimen de doxiciclina y estreptomicina o gentamicina, excepto en las mujeres embarazadas, que deben tratarse con trimetoprim sulfametoxazol. Sin embargo, existen estudios parciales sobre el tratamiento de los humanos expuestos a la RB51 (5) y ha habido al menos un informe de infeccin en humanos con RB-51. La cepa RB51 es muy susceptible a la tetraciclina y el tratamiento solo con doxiciclina puede ser satisfactorio (5).
5.
a)
713
b)
Potencia
Para la vacuna liofilizada, la potencia debe determinarse en el producto final. El procedimiento es como el descrito en la seccin C2.4.c.
REFERENCIAS
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