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CAPTULO 2.4.3.

BRUCELOSIS BOVINA

RESUMEN
La brucelosis bovina suele estar causada por Brucella abortus, menos frecuentemente por B. melitensis y por B. suis. La infeccin est muy extendida por el mundo. Algunos pases del norte y del centro de Europa, Canad, Japn, Australia y Nueva Zelanda se consideran libres de su agente etiolgico. La enfermedad se caracteriza clnicamente por uno o ms de los sntomas siguientes: aborto, retencin de placenta, orquitis, epididimitis y, raramente artritis, con excrecin de los microorganismos en los exudados uterinos y en la leche. El diagnstico depende del aislamiento de Brucella a partir de los abortos, de las secreciones de la ubre y de los tejidos analizados postmortem. Se puede realizar un diagnstico preliminar determinando la respuesta especfica mediada por las clulas o la serolgica frente a los antgenos de Brucella. Brucella abortus, B. melitensis y B. suis son muy patgenos para el hombre y por los tanto, todos los tejidos infectados como los cultivos y el material potencialmente contaminado deben manejarse bajo condiciones apropiadas de contencin. Identificacin del agente: La evidencia preliminar de Brucella la suministra la observacin de su morfologa, mediante la tincin modificada de los cido-alcohol resistentes, en los productos del aborto o los exudados vaginales, especialmente si est respaldada por pruebas serolgicas. La reaccin en cadena de la polimerasa recientemente desarrollada, proporciona medios adicionales de deteccin. Cuando sea posible, se debe aislar Brucella en medios normales o selectivos cultivando los exudados uterinos, los fetos abortados, las secreciones de las ubres o los tejidos seleccionados, como los ganglios linfticos y los rganos reproductores masculino y femenino. Las especies y biovariedades deberan identificarse mediante fagolisis y segn criterios de cultivo, bioqumicos y serolgicos. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) puede proporcionar un mtodo complementario para la biotipificacin basado en secuencias genmicas especficas. Pruebas serolgicas y alrgicas cutneas: Las pruebas con el antgeno tamponado de Brucella, es decir la prueba con rosa de bengala y la prueba de aglutinacin tamponada en placa, as como la fijacin del complemento, el enzimoinmunoensayo (ELISA) o el ensayo de polarizacin de la fluorescencia, son pruebas adecuadas para analizar los rebaos y los animales individuales. Sin embargo, ninguna prueba serolgica aislada es adecuada para todas y cada una de las situaciones epidemiolgicas. Por tanto, la reactividad de las muestras que son positivas en las pruebas de anlisis deben confirmarse utilizando una estrategia confirmativa establecida. La prueba de ELISA indirecto o la del anillo de leche, realizadas con muestras de leche completa, son eficaces para analizar y controlar la brucelosis en las vacas lecheras, pero la prueba del anillo de leche es menos fiable en los grandes rebaos. Otra prueba inmunolgica es la prueba cutnea de la brucelina, que puede utilizarse en los anlisis o como una prueba confirmativa en los rebaos cuando existe una reaccin serolgica positiva en ausencia de factores de riesgo obvios en los rebaos no vacunados. Se ha demostrado que la prueba interfern gamma, la prueba de precipitacin que utiliza como antgeno el hapteno nativo y el ELISA indirecto en el que se utiliza como antgeno el lipopolisacrido rugoso han resultado prometedores para diferenciar entre la brucelosis y la exposicin a los microorganismos con reaccin cruzada. Se ha demostrado que las pruebas con interfern gamma, las pruebas con precipitina en las que se utiliza antgeno y hapteno nativo y el ELISA indirecto en el que se utiliza un antgeno lipopolisacrido rugoso son prometedores de cara a diferenciar entre la brucelosis y la exposicin a los microorganismos con reaccin cruzada.

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Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: La cepa 19 de Brucella abortus contina siendo la vacuna de referencia con la que se comparan otras vacunas. Debe prepararse a partir de los inculos de siembra derivados de EE.UU., y cada lote debe cumplir un mnimo de condiciones respecto a la viabilidad, ligereza, virulencia residual y capacidad para inmunizar ratones frente a un desafo con una cepa virulenta de B. abortus o designar las unidades formadoras de colonia (UFC) por dosis. La vacuna con la cepa RB51 de Brucella abortus se obtuvo de una cepa mutante, rugosa, de laboratorio, derivada de la cepa lisa 2308 de B. abortus. Se han completado las pruebas de eficacia de la vacuna con la cepa RB-51 en el ganado vacuno y dicha vacuna ha sido autorizada en los EE.UU. Tambin ha sido considerada como la vacuna oficial para la prevencin de la brucelosis bovina en muchos otros pases Las preparaciones de brucelina para la prueba intradrmica deben estar libres de lipopolisacrido liso y no deben producir reacciones inflamatorias inespecficas ni interferir con las pruebas serolgicas. Los antgenos para el diagnstico deben prepararse a partir de cepas lisas de B. abortus, las cepas 1119-3 99, y deben cumplir un estndar mnimo de pureza, sensibilidad y especificidad.

A. INTRODUCCIN
En el ganado vacuno la brucelosis suele estar causada por biovariedades de Brucella abortus. En algunos pases, particularmente en el sur de Europa y en el oeste de Asia, donde el ganado se cra junto a ovejas o cabras, la infeccin tambin puede ser debida a B. melitensis (41). En ocasiones, B. suis puede causar una infeccin crnica de las mamas en el ganado vacuno, pero no se ha descrito que origine abortos o se extienda a otros animales (29). Normalmente la enfermedad es asintomtica en las hembras no gestantes. Despus de la infeccin por B. abortus o por B. melitensis, las hembras adultas en gestacin desarrollan una placentitis que, por lo general, provoca el aborto entre el quinto y el noveno mes de gestacin. Incluso en ausencia de aborto se produce una gran excrecin de microorganismos a travs de la placenta, los lquidos fetales y los exudados vaginales. Las mamas y los ganglios linfticos regionales tambin pueden infectarse y los microorganismos pueden aparecer en la leche. Las gestaciones posteriores llegan, por lo general, a trmino, pero la infeccin uterina y la mamaria se repiten, con un nmero reducido de microorganismos en los productos del parto y en la leche. En las infecciones agudas, el microorganismo est presente en la mayora de los ganglios linfticos. Los machos adultos pueden desarrollar orquitis, y la brucelosis puede causar la esterilidad en ambos sexos. Una manifestacin corriente de la brucelosis en algunos pases tropicales son los higromas, por lo general en las articulaciones de las patas, que pueden representar el nico indicador de la infeccin; con frecuencia, el lquido de los higromas est infectado por Brucella. La brucelosis se ha descrito tambin en el camello de una joroba (Camelus dromedarius) y en el de dos jorobas (C. bactrianus), as como en los siguientes camlidos de Sudamrica: la llama (Lama glama), la alpaca (Lama pacos), el guanaco (Lama guinicoe), y la vicua (Vicugne vicugne) como consecuencia de contactos con rumiantes infectados con B. abortus o B. melitensis. Adems, se ha observado en el bfalo domstico (Bubalus bubalus), el bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), el yak (Bos grunniens), el alce o wapiti (Cervus elaphus), as como en el bfalo africano (Syncerus caffer) y en varias especies de antlopes africanos. Las manifestaciones de la brucelosis en estos animales son similares a las del ganado vacuno. En el manual de bioseguridad para los laboratorios elaborado por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) clasifica a los microorganismos del gnero Brucella en el Grupo de Riesgo III. La brucelosis se transmite fcilmente al hombre y causa una enfermedad febril aguda la fiebre ondulante que puede convertirse en crnica y producir complicaciones graves que afectan a los msculos esquelticos, al sistema cardiovascular y al sistema nervioso central. En las zonas en las que la enfermedad es endmica deben tomarse medidas para evitar la infeccin del hombre. A menudo la infeccin se debe a una exposicin profesional y se adquiere por va oral, respiratoria o conjuntival, pero el riesgo mayor para la poblacin general es la ingestin de productos lcteos contaminados en las zonas en las que la enfermedad es endmica. Los veterinarios y los granjeros que manejan animales infectados, fetos abortados o placentas, estn expuestos a ese riesgo laboral. La brucelosis es una de las enfermedades de ms fcil adquisicin en el laboratorio, y se deben observar precauciones de seguridad muy estrictas cuando se manejen cultivos y muestras infectadas, como lo son los productos del aborto. Existen recomendaciones especficas que han de seguirse con el material infectado por Brucella (para ms detalles vanse las referencias 2, 42, 95 y el captulo 1.1.2. Bioproteccin y seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiologa y en las instalaciones de los animales). La manipulacin de los cultivos vivos o del material animal contaminado en el laboratorio es peligrosa y debe realizarse en un nivel de contencin 3 o superior, como se indica en el captulo 1.1.2, para reducir la exposicin ocupacional. Es esencial que se utilice un nivel de contencin 3 en los lugares en los que se realicen cultivos de Brucella a gran escala (p.ej. para la produccin de antgeno o de vacunas). La evidencia gentica e inmunolgica indica que todos los miembros del gnero Brucella estn estrechamente relacionados. Sin embargo, teniendo en cuenta que existen diferencias relevantes entre las principales variantes

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en cuanto a la preferencia por el hospedador y a la epidemiologa, as como evidencias moleculares de variaciones genmicas, el Comit Internacional de Sistemtica de Procariotas, Subcomit de Taxonoma de Brucella, adopt en 2005 una decisin firme sobre la vuelta a las posiciones anteriores a 1986 en lo relativo a la taxonoma de Brucella; como consecuencia de ese posicionamiento se volvieron a aprobar las seis especies tipo de Brucella con sus biovariedades reconocidas. Los nombres clsicos validados de las seis especies tipo de Brucella estn publicados en las Listas Autorizadas de Nombres de Bacterias de 1980, y las cepas tpicas designadas aparecen asociadas a esos nombres vlidos publicados: B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. neotomae, B. ovis y B. canis (http://www.the-icsp.org/subcoms/Brucella.htm). Las tres primeras se subdividen en biovariedades por sus caractersticas de cultivo y las serolgicas (vanse los cuadros 1 y 2). En la ltima dcada se han aislado cepas de Brucella de mamferos marinos que no pueden adscribirse a ninguna de las anteriores especies reconocidas (18, 31). Hay investigaciones en curso para establecer su posicin correcta en la taxonoma del gnero y se ha propuesto que podran clasificarse en dos nuevas especies, B. ceti y B. pinnipedialis (18, 31, 40). Por ltimo, Brucella muestra una estrecha relacin gentica con patgenos y simbiontes de plantas de los gneros Agrobacterium y Rhizobium, as como con patgenos animales (Bartonella) y con bacterias oportunistas o del suelo (Ochrobactrum). Cuadro 1. Caracteres diferenciales de especies del gnero Brucella
Lisis por fagosa Tb Morfologa colonialb Wb Iz1 R/C

Especies

Actividad ureasa

Requiere suero

104RTD

Oxidasa

RTDc

RTD

RTD

RTD

Hospedador preferido

B. abortus

+e

+f

Vacas y otros bvidos Biovariedad 1: cerdo Biovariedad 2: cerdo, liebre

B. suis

+g

+g

+h

Biovariedad 3: cerdo Biovariedad 4: reno Biovariedad 5: roedores salvajes

B. melitensis B. neotomae B. ovis B. canis

S S R R

i +

+ +

+ +

+ +

+j +h +h

Ovejas y cabras Rata lanuda del desiertol Carneros Perros

Tomado de las refs. 2 y 42. a b c d e f g h i j k l Fagos: Tbilisi (Tb), Weybridge (Wb), Izatnagar1(Iz1) y R/C Fase normal de presentacin : S: lisa, R: rugosa RTD: dilucin rutinaria de prueba Brucella abortus biovariedad 2 requiere generalmente suero para crecer en aislamiento primario Algunos aislamientos africanos de B. abortus biovariedad 3 son negativos Velocidad intermedia, excepto la cepa 544 y algunas cepas de campo que son negativas Algunos aislamientos de B. suis biovariedad 2 no son, o solo parcialmente, lisadas por el fago Wb o Iz1 Velocidad rpida Algunos aislamientos se lisan por el fago Wb Velocidad lenta, excepto algunas cepas que son rpidas Placas o calvas pequeas Neotoma lepida

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Cuadro 2. Caracteres diferenciales de los biovariedades de especies de Brucella


Produccin de H2S Requiere CO2 Crecimiento con colorantesa Aglutinacin con sueros monospecficos

Fucsina bsica

Tionina

Especies

Biotipo

1 B. melitensis 2 3 1 2 3 B. abortus 4 5 6 9 1 2 B. suis 3 4 5 B. neotomae B. ovis B. canis

+b +b +b +b +o +

+ + + + + + +

+ + + + + + + + + + +

+ + + + + +c + + + e + f

+ + + + + + + + + + +

+ + + + + + +

+ +

g + +

f f

Tomado de las refs. 2 y 42. a b c d e f g Concentracin del colorante en medio de dextrosa con suero: 20 g/ml Normalmente positivo en aislamiento primario Se han aislado algunas cepas sensibles a la fucsina bsica Algunas cepas se inhiben con colorantes Se han aislado algunas cepas resistentes a la fucsina bsica Negativo en la mayora de las cepas Crecimiento a una concentracin de 10 g/ml de tionina

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
Todos los abortos del ganado vacuno deben considerarse como casos sospechosos de brucelosis y deberan investigarse. El cuadro clnico no es patognomnico, aunque el historial del rebao puede servir de ayuda. El diagnstico inequvoco de las infecciones por Brucella solo puede hacerse mediante el aislamiento y la identificacin de Brucella, pero en situaciones en las que no es posible el anlisis bacteriolgico, el diagnstico

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puede basarse en los mtodos serolgicos. No existe una prueba nica que permita la identificacin de Brucella. Normalmente se necesita una combinacin de las caractersticas de crecimiento y mtodos serolgicos, bacteriolgicos y/o moleculares.

1.
a)

Identificacin del agente (2, 20, 21, 42)


Mtodos de tincin
El gnero Brucella est formado por cocobacilos o bacilos cortos que miden 0,61,5 m de largo por 0,5 0,7 m de ancho. Normalmente aparecen aislados, y con menos frecuencia en pares o en grupos pequeos. La morfologa de los microorganismos del gnero Brucella es bastante constante aunque en cultivos viejos se observan formas pleomrficas. No es una bacteria mvil. No forma esporas ni flagelos, ni fimbrias o cpsulas verdaderas. Los microorganismos del gnero Brucella son Gram negativos y no suelen mostrar tincin bipolar. No son verdaderamente bacterias cido-alcohol resistentes, pero resisten a la decoloracin por cidos dbiles y se tien de rojo por la modificacin de Stamp del mtodo de Ziehl Neelsen. Este mtodo constituye el procedimiento normal para el examen de frotis de rganos o de lquidos biolgicos, que se fijan previamente con calor o con etanol, y por este mtodo los microorganismos se tien de rojo frente a un fondo azul. Tambin puede utilizarse una tcnica basada en anticuerpos conjugados a un fluorocromo o marcados con peroxidasa (77). La presencia de microoorganismos intracelulares con morfologa de Brucella, dbilmente resistentes a cidos, o inmunoespecficamente teidos, es una evidencia preliminar de la brucelosis. Sin embargo, estos mtodos presentan una baja sensibilidad en la leche y en productos lcteos donde los microorganismos del gnero Brucella se presentan a menudo en escaso nmero, y donde la presencia de glbulos de grasa impide frecuentemente una interpretacin correcta. En la interpretacin de los resultados positivos por el mtodo de Stamp tambin debe tenerse en cuenta que otros microorganismos que causan aborto son difciles de diferenciar de Brucella, como Chlamydophila abortus (antes Chlamydia psittaci) o Coxiella burnetii. Los resultados, tanto positivos como negativos, deben confirmarse por cultivo. Para demostrar el agente en diversas muestras biolgicas, se pueden utilizar mtodos basados en sondas de ADN o en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (11).

b)

Cultivo
i) Medio basal El aislamiento y cultivo directo de Brucella se realiza normalmente en un medio slido. En general, este representa el mtodo ms satisfactorio porque permite el desarrollo de colonias aisladas fcilmente reconocibles. Los medios slidos tambin limitan el establecimiento de los mutantes no lisos y el desarrollo excesivo de contaminantes. Sin embargo, el empleo de los medios lquidos puede recomendarse para muestras voluminosas o con fines de enriquecimiento. Se dispone de un amplio rango de medios basales comercializados en forma deshidratada, por ejemplo el medio base para Brucella, agar triptosa o (tripticasa)-soja (TSA). Es necesario aadir 25% de suero bovino o equino para el crecimiento de algunas cepas como la biovariedad 2 de B. abortus, y muchos laboratorios lo aaden sistemticamente al medio basal con resultados excelentes, como en el caso del agar sangre (Oxoid) o agar Columbia (BioMrieux). Se pueden utilizar otros medios satisfactorios como el agar suero-dextrosa (SDA) o el agar glicerol-dextrosa (2). El medio SDA es normalmente el de eleccin para la observacin de la morfologa colonial. Para el aislamiento de Brucella de la sangre o de la leche, y de otros lquidos del cuerpo, donde se aconseja un cultivo de enriquecimiento, se recomienda un medio bifsico no selectivo conocido como medio de Castaeda. Este medio se emplea porque las brucelas tienden a disociarse en medio lquido y esto interfiere con la tipificacin llevada a cabo mediante las tcnicas bacteriolgicas convencionales. ii) Medios selectivos Todos los medios base indicados anteriormente se pueden utilizar para la preparacin de medios selectivos. Se aaden los antibiticos apropiados para evitar el crecimiento de organismos distintos a Brucella. El medio selectivo ms difundido es el de Farrell (30), que se prepara aadiendo seis antibiticos a un medio base. Se aaden las siguientes cantidades por 1 litro de medio: sulfato de polimixina B (5.000 unidades = 5 mg); bacitracina (25.000 unidades = 25 mg); natamicina (50 mg); cido nalidxico (5 mg); nistatina (100.000 unidades); vancomicina (20 mg). Se ha comercializado un suplemento de antibiticos liofilizado (Oxoid). Sin embargo, a las concentraciones utilizadas en el medio de Farrell, el cido nalidxico y la bacitracina pueden tener efectos inhibidores sobre algunas cepas de B. abortus y B. melitensis (50). Por ello, la sensibilidad del aislamiento de B. melitensis aumenta cuando se utilizan tanto el medio de Farrell como el medio de ThayerMartin. En esencia, el medio modificado de ThayerMartin se puede preparar con medio base GC (38 g/litro; Biolife Laboratories, Miln, Italia) suplementado con hemoglobina (10 g/litro; Difco) y metanosulfonato de colistina (7,5 mg/litro), vancomicina (3 mg/litro), nitrofurantona (10 mg/litro), nistatina (100.000 Unidades Internacionales [UI]/litro = 17,7 mg) y anfotericina B (2,5 mg/litro) (todos

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los productos de Sigma Chemical, St Louis, EE. UU) (50). A diferencia de otras biovariedades de B. abortus, el crecimiento de B. melitensis no es dependiente de la presencia de una atmsfera con 5 10% de CO2 (Cuadro 2). Como el nmero de microorganismos de Brucella en la leche, en el calostro y en algunas muestras tisulares, es probablemente menor que en material de abortos, se recomienda un enriquecimiento. En el caso de la leche, los resultados tambin mejoran por centrifugacin y cultivo de la capa cremosa y del precipitado. El enriquecimiento se puede realizar en medio lquido con suero-dextrosa, con caldo de triptosa o caldo de (tripticasa)-soja (TSA) o con caldo para Brucella suplementado con una mezcla de antibiticos que lleve al menos anfotericina B (1 g/ml) y vancomicina (20 g/ml) (concentraciones finales). El medio de enriquecimiento debe incubarse a 37C en atmsfera aerobia con 510% (v/v) de CO2 hasta 6 semanas, con subcultivos semanales a un medio slido selectivo. Si se prefiere, se puede utilizar un sistema bifsico con un medio selectivo lquido y slido en la misma botella (tcnica de Castaeda) para reducir el subcultivo. Para el aislamiento de Brucella de la leche se recomienda a veces un medio selectivo bifsico que se compone del medio base de Castaeda al que se aaden los siguientes antibiticos en la fase lquida (las cantidades que se indican son por litro de medio): sulfato de polimixina B (6000 unidades = 6 mh); bacitracina (25.000 unidades = 25 mg); natamicina (50 mg); cido nalidxico (5 mg); anfotericina B (1 mg); vancomicina (20 mg); D-cicloserina (100 mg). Todos los medios de cultivo deben someterse a controles de calidad y deben permitir el crecimiento de cepas difciles de cultivar, como la biovariedad 2 de B. abortus, a partir de inculos pequeos. Dado que este organismo es un agente selecto en EE.UU., los laboratorios que no tienen permiso para tener agentes selectos pueden sustituirlos por una cepa no regulada, como la cepa 19 o la RB51 para el control de la calidad del medio, sabiendo que estas cepas estn adaptadas para el laboratorio y crecen en medios que inhiben las cepas de Brucella ms difciles de cultivar. En medios slidos adecuados, las colonias de Brucella son visibles despus de 23 das de incubacin. A los 4 das las colonias son redondas, de 12 mm de dimetro, con bordes lisos. Son translcidas y de color miel plido a la luz del da en medio transparente. Vistas desde arriba son convexas y de color blanco perla. Posteriormente las colonias se hacen ms grandes y ligeramente ms oscuras. Los cultivos en fase lisa de Brucella (S) presentan tendencia a sufrir variaciones durante el crecimiento, especialmente con subcultivos, y aparecen formas rugosas (R). Las colonias son entonces mucho menos transparentes, presentan una superficie mate ms granular y el color vara de blanco mate a marrn con luz reflejada o trasmitida. La comprobacin de esta transicin se realiza fcilmente por tincin con cristal violeta: las colonias rugosas aparecen rojas y las lisas de color amarillo plido. Si las colonias son lisas deben comprobarse con un antisuero anti-B. abortus en fase lisa, o preferiblemente con antisueros monoespecficos contra los antgenos de superficie A y M. En el caso de colonias rugosas, las colonias deben comprobarse con antisuero contra el antgeno R de Brucella. Por lo general, los cambios de morfologa de las colonias se asocian con cambios en la virulencia, en las propiedades serolgicas y/o en la sensibilidad a los fagos. La aglutinacin positiva con un antisuero anti-Brucella es una identificacin preliminar de que el aislamiento corresponde a Brucella. La identificacin posterior completa se realiza mejor en un laboratorio de referencia. iii) Toma y cultivo de muestras Para el diagnstico de la brucelosis animal mediante cultivo, la eleccin de las muestras depende en general de los sntomas clnicos observados. Las muestras ms adecuadas incluyen fetos abortados (contenido estomacal, bazo y pulmones), membranas fetales, exudados vaginales (frotis), leche, semen y lquidos de las artritis o de los higromas. Los tejidos preferidos para cultivo de las canales animales son los del sistema retculo-endotelial (ganglios linfticos de la cabeza, mamarios y genitales, y el bazo), el tero inmediatamente antes o despus del parto, y las ubres. El crecimiento aparece generalmente despus de 34 das, pero no se deben desechar los cultivos como negativos hasta despus de 810 das. Tejidos: Las muestras se toman aspticamente con instrumentos estriles. Las muestras de tejido se preparan retirando el material irrelevante (por ejemplo la grasa), cortado en pequeos trozos y se maceran con un Stomacher o en un homogenizador de tejidos con una pequea cantidad de solucin salina estril tamponada con fostato (PBS), antes de inocularlas en medios slidos. Descargas vaginales: Una fuente excelente para recoger Brucella es un frotis vaginal tomado despus del aborto o del parto, y es menos arriesgado para el personal que el material del aborto. El frotis se siembra directamente medios slidos. Leche: Las muestras de leche deben recogerse con limpieza despus de lavar y secar toda la ubre y desinfectar los pezones. Es esencial que las muestras contengan leche de todas sus fracciones, y se deben tomar 1020 ml de cada cuartern. Los primeros chorros se desechan y la muestra se recoge directamente en un recipiente estril. Se ha de tener cuidado para evitar el contacto entre la leche y las manos del ordeador. La leche se centrifuga a 6.0007.000 g durante 15 minutos o a 2.000 g durante 30 minutos en tubos cerrados (para evitar el riesgo de formacin de aerosoles que contagien al personal), y se extienden sobre los medios slidos la capa cremosa y el precipitado por separado o

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conjuntamente. Si las brucelas estn presentes en la leche completa, su nmero suele ser muy bajo y es improbable el aislamiento a partir de tales muestras. Derivados lcteos: Los productos lcteos, como los quesos, deben cultivarse en los medios descritos arriba. Como es probable que estos materiales contengan un nmero pequeo de microorganismos, se recomiendan cultivos de enriquecimiento. Se necesita que las muestras estn homogenizadas cuidadosamente antes del cultivo, despus de haberlas sometido a un triturador de tejidos, a un Stomacher o a una batidora elctrica con un volumen adecuado de PBS estril. Deben cultivarse las capas superficiales (corteza y regin adyacente) y el interior del producto. Como las brucelas viven, crecen y desaparecen rpidamente, su distribucin por las diferentes partes del producto vara en funcin de las condiciones fsico-qumicas locales relacionadas con la tecnologa especfica del proceso. Despus de la toma, todas las muestras deben enfriarse rpidamente y transportarse al laboratorio lo antes posible. A su llegada, la leche y las muestras de tejidos deben congelarse si no se cultivan de inmediato. El empleo de animales de laboratorio debe evitarse a menos que sean absolutamente necesarios, aunque a veces constituyen el nico medio para detectar la presencia de Brucella, sobre todo cuando las muestras estn muy contaminadas o contienen un nmero bajo de microorganismos del gnero Brucella. La inoculacin animal puede ser subcutnea o a travs de la piel afeitada de cobayas o, con preferencia, intravenosa en ratones. Este trabajo debe realizarse en condiciones de bioseguridad como se indica en el Captulo 1.1.2. Los bazos de los ratones se cultivan durante 7 das despus de la inoculacin y, en el caso de los cobayas, se somete una muestra de suero a pruebas especficas a las 3 y 6 semanas de la inoculacin, y a continuacin se cultivan los bazos.

c)

Identificacin y tipificacin
Cualquier colonia con una morfologa similar a la de Brucella debe analizarse por la tincin de Gram (o por la coloracin de Stamp). Como en las fases no lisas se alteran las propiedades serolgicas, tintoriales y de sensibilidad a los fagos, la morfologa colonial resulta esencial para las pruebas de tipificacin que se describen ms abajo. Los mtodos recomendados para observar la morfologa de las colonias son el mtodo de Henry mediante luz reflejada oblicua, la prueba de la acriflavina descrita por Braun & Bonestell, o el mtodo de White & Wilson de tincin de colonias con cristal violeta (2). La identificacin de los microorganismos se puede realizar mediante una combinacin de las siguientes pruebas: morfologa celular y tincin de Gram o de Stamp, propiedades de crecimiento, pruebas de ureasa, oxidasa y catalasa, y la prueba de la aglutinacin en porta con un suero policlonal anti-Brucella. La identificacin de especies y de biovariedades requiere pruebas ms elaboradas (como la lisis por fagos y la aglutinacin con sueros monoespecficos anti-A, anti-M anti-R), cuya realizacin se lleva a cabo en laboratorios de referencia con experiencia en estos mtodos. La utilizacin simultnea de varios fagos, es decir, el Tbilissi (Tb), Weybridge (Wb), Izatnagar (Iz) y RC, representa un sistema de tipificacin fgica que, con suficiente experiencia, permite identificar las especies lisas y las rugosas de Brucella. No obstante, algunas propiedades, como el requerimiento de CO2 para crecer, la produccin de H2S (detectada mediante papeles con acetato de plomo) y el crecimiento en presencia de fucsina bsica y tionina a concentraciones finales de 20 g/ml, se detectan mediante pruebas rutinarias que pueden realizarse en laboratorios no especializados moderadamente equipados (vanse los cuadros 1 y 2). Cuando se envan cepas de Brucella a un laboratorio de referencia para su tipificacin, es esencial seleccionar las cepas lisas. Los cultivos se liofilizan y se cierran en ampollas dentro de tubos con tampn de rosca o se subcultivan en agar inclinado contenido en tubos con tapn de rosca. Tambin deben enviarse cepas suspendidas en medio lquido (por ejemplo, en el medio de transporte de Ames) pero esto puede dar lugar a la aparicin de mutantes rugosas. i) Brucella est considerada entre las bacterias ms peligrosas con las que se trabaja, por el riesgo a las infecciones adquiridas en el laboratorio. Para transportar cultivos de Brucella, las tapas de los recipientes deben estar bien cerradas y selladas con tapones de PVC. Deben envolverse con papel adsorbente o con algodn, sellarse en bolsas de polietileno y empaquetarse en un contenedor rgido de acuerdo con las exigencias de la Asociacin para el Transporte Areo (IATA) para el envo de muestras peligrosas (39). Estas regulaciones se resumen en el captulo 1.1.1. Recogida y envo de muestras de diagnstico. Como los cultivos de Brucella son infecciosos, se designan UN2814 y se debe realizar una Declaracin de Muestras Peligrosas. Tambin existen restricciones para enviar muestras sospechosas de brucelosis y se deben tener en cuenta las regulaciones de la IATA antes de su envo (39). Tambin deben seguirse otras directrices nacionales e internacionales (96). Antes de enviar cultivos o muestras de diagnstico para cultivo, se debe de contactar con el laboratorio receptor para determinar si se necesita algn permiso especial y si el laboratorio tiene la capacidad de realizar las pruebas solicitadas. Si las muestras traspasan fronteras nacionales, probablemente se necesitar un permiso de importacin que debe obtenerse antes de despachar la

ii)

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muestra (captulo 5.8. Transporte internacional y contencin de agentes patgenos de los animales en los laboratorios, del Cdigo sanitario para los animales terrestres).

d)

Mtodos de reconocimiento de cidos nucleicos


La PCR desarrollada recientemente supone un mtodo adicional de deteccin e identificacin de especies de Brucella (11, 14, 16, 69). Pese al alto grado de homologa del ADN dentro del gnero Brucella, se han desarrollado varios mtodos que permiten, hasta cierto punto, la diferenciacin entre especies y algunos de sus biovariedades, como la PCR, el anlisis del polimorfismo de fragmentos de restriccin (RFLP) y la hibridacin tipo Southern (para una revisin, ver las referencias 11 y 53). Se ha desarrollado tambin una electroforesis en campo pulsante que permite la diferenciacin entre varias especies de Brucella (40, 51). Mediante el empleo de la PCR puede biotipificarse Brucella y pueden diferenciarse las cepas vacunales, pero la PCR solo ha tenido una validacin limitada para el diagnstico primario. La primera prueba PCR mltiple especfica de especie para la diferenciacin de Brucella fue descrita por Bricker & Halling (15). La prueba, denominada PCR AMOS, se basaba en el polimorfismo resultante de la localizacin, especfica de especie, de la secuencia de insercin IS711 en el cromosoma de Brucella e inclua cinco cebadores oligonucletidos que podan identificar y diferenciar las biovariedades 1, 2 y 4 de B. abortus, pero no podan diferencias las biovariedades 3, 5, 6 y 9 de ese microorganismo. Con el tiempo, se han introducido modificaciones en la prueba denominadas PCR BaSS para mejorar su rendimiento, y se incorporaron ms cebadores especficos de cepa para la identificacin de las cepas vacunales S19 y RB51 de B. abortus, (14, 16, 26, 27). La PCR AMOS y la PCR BaSS son pruebas PCR mltiple en un solo tubo. La PCR AMOS diferencia B. abortus, B. melitensis, B. ovis, y B. suis (solo la biovariedad 1, aunque el resto de las biovariedades sern detectadas por los cebadores eri) hasta el nivel de especie. La PCR BaSS permite la diferenciacin de cepas adicionales, en concreto las vacunales S10 y RB51. Los procedimientos de las dos pruebas son idnticos, y la nica diferencia es la relativa a los cebadores de la mezcla base. Sin embargo, otras especies y biovariedades (tales como las biovariedades 3, 5, 6 y 9 de B. abortus, las biovariedades 2, 3, 4, y 5 de B. suis, B. canis, B. neotomae, B. ceti y B. pinnipedialis) no pueden detectarse mediante las pruebas PCR AMOS o PCR BaSS. Se ha publicado recientemente que estos procedimientos de la PCR se han sometido a modificaciones adicionales para poder identificar tambin las serovariedades 3, 5, 6 y 9 de B. abortus (69). i) Se ofrece el ejemplo de la PCR BaSS como muestra de un procedimiento molecular (vanse las instrucciones detalladas en las referencias 16 y 27). Preparacin bacteriana Cualquier mtodo aceptado de purificacin de ADN sera adecuado. Un mtodo simple y eficaz consiste en seleccionar una sola colonia y, utilizando un asa de siembra estril, transferir las bacterias a 100 l de agua grado-PCR. Se debe hervir la suspensin bacteriana durante un mnimo de 5 minutos para matar las bacterias y facilitar la lisis de la mayor parte de las mismas como molde para la reaccin. Se ajusta la concentracin bacteriana a una densidad de entre 1,5 y 2 unidades de absorbancia a 600 nm con solucin salina. Inmediatamente antes de su utilizacin, se vuelve a mezclar la suspensin de cultivo y se diluye en alcuota de 1/10 en agua grado-PCR (p.ej. 5 l de suspensin en 45 l de agua). Se mezcla con suavidad pero a fondo. Una vez utilizado, el material diluido debe descartarse de forma adecuada. Secuencias de cebadores para PCR y concentraciones stock
Cebador Especfico para IS711 Especfico para Abortus Directo universal para 16S Inverso universal para 16S Directo eri Inverso eri RB51-3 Secuencia de nucletidos 5 a 3 TGC-CGA-TCA-CTT-AAG-GGC-CTT-CAT-TGC-CAG GAC-GAA-CGG-AAT-TTT-TCC-AAT-CCC GTG-CCA-GCA-GCC-GCC-GTA-ATA-C TGG-TGT-GAC-GGG-CGG-TGT-GTA-CAA-G GCG-CCG-CGA-AGA-ACT-TAT-CAA CGC-CAT-GTT-AGC-GGC-GGT-GA GCC-AAC-CAA-CCC-AAA-TGC-TCA-CAA Concentracin de 100 stock 1,90 g/l 1,55 g/l 1,40 g/l 1,60 g/l 1,35 g/l 1,30 g/l 1,55 g/l

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i)

Amplificacin mediante la PCR Preparacin de la mezcla base (100 pruebas) Deben disolverse los oligonucletidos sintticos en tampn TE a una concentracin de 100 (vase el cuadro anterior). El 100 stock permanece estable a 4C durante al menos dos aos siempre que se tome la precaucin de no contaminar la solucin. Se prepara el primer cctel colocando los siguiente concentrados 100 en un tubo de microcentrfuga de 1,5 ml: 233 l 2,5 l 2,5 l 2,5 l 2,5 l 2,5 l 2,5 l 2,5 l agua grado-PCR cebador especfico para IS711 cebador especfico para B. abortus cebador directo universal para 16S (control opcional para los inhibidores) cebador inverso universal para 16SR (control opcional para los inhibidores) cebador directo para eri cebador inverso para eri cebador para RB51 agua grado-PCR 10 tampn de reaccin sin MgCl2 (vase la Nota 6) 25 mM MgCl2 10 mM mezcla dNTP cctel de cebadores del paso 2 GC potenciador. Si no se usa un potenciador, debe sustituirse por 500 l de agua gradoPCR. TAQ ADN polimerasa FastStart

ii)

iii)

Se prepara la mezcla base colocando en un tubo desechable de 3 o 5 ml los siguientes ingredientes: 1130 l 250 l 150 l 200 l 250 l 500 l 20 l

iv) v)

Se mezcla completamente y con suavidad la solucin pipeteando arriba y abajo. Se hacen alcuotas de la mezcla base de 25 l en tubos PCR con una pared de 0,2 l (o alternativamente una placa de 96 pocillos certificada para PCR). Se guardan los tubos de ensayo a 20C 2C. Antes de su utilizacin, se descongela una cantidad suficiente de tubos con la mezcla base para los desconocidos y los controles, y se mezcla a fondo pero con suavidad golpeando ligeramente con el dedo. Amplificacin de productos mediante la PCR Se aade entre 1,0 y 2,5 l de la muestra desconocida o del control a cada tubo de ensayo. Debe rmezclarse por completo cada muestra inmediatamente antes de retirar la alcuota, puesto que Brucella tiende a depositarse rpidamente. Se amplifican los productos PCR utilizando los siguientes parmetros: 95C 5,0 minutos 1 ciclo

vi)

i)

iii)

95C 15 segundos 52C 30 segundos 72C 90 segundos 4C indefinidamente 40 ciclos

La determinacin del tiempo de puesta en marcha no parece ser importante iii) Despus de la amplificacin, pueden guardarse indefinidamente las muestras sin abrir a 4C hasta el momento de la deteccin. Deteccin de los productos amplificados Se prepara un gel de agarosa al 2%, de 5 mm de espesor (en 0,5 TBE) con un nmero adecuado de pocillos. Se combina 1 l de 6 tincin de carga con 8 l de muestra amplificada y se mezcla bien antes de cargarlo en el pocillo de gel.

i) ii)

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iii) Se hace cor rrer el gel en 0,5 TBE hast que el marc 0 ta cador azul de bromofenol es al menos a 5 cm del st pocillo para conseguir un buena sepa na aracin de las bandas. Par el equipo a s ra aqu descrito, utilizamos 8085 V dur rante 2,5 hora para maxim as mizar la resolu ucin sin que haya una difu usin significat tiva de las bandas, pero puede que se necesiten a o s ajustes para otro equipo. o Se tie el g durante 45 minutos en solucin de bromuro de etidio (250 g gel 5 e g/500 ml de 0,5 TBE). 0 Como altern nativa, puede teirse el ge antes de la electrofores o durante la misma mediante la el a sis adicin de b bromuro de eti idio al tampn que se est corriendo. PR n RECAUCIN: el bromuro de etidio es e mutagnico y un carcing geno potenciall. Interpretaci de los datos n

iv)

dentificacin s basa en el nmero y los tamaos de los productos amplificados por la PCR (v se l vanse las La id figur ras A & B). T Todas las mu uestras, exce epto los contro oles negativos, deberan a amplificar al menos un m prod ducto, la secu uencia del 16 de 800 pb Si esta ban 6S b. nda no est presente, es p p posible que la muestra a cont tenga inhibido ores de la PC el ADN no se degrad, o no se disp CR, o pens la mues stra en la mez zcla base. Pue ser necesa diluir la muestra origina para disminu los niveles de inhibidore en la reaccin, repetir ede ario m al uir es la pr rueba con una nueva mues o simplem a stra mente repetir la prueba con la muestra orig a ginal. Todos los aislam mientos de B. abortus (biov variedades 1, 2, y 4), incl luidas las cep pas vacunales tambin plificarn un producto de 50 pb a partir del locus alkB del IS711. Ni otras espec 00 B N cies de Brucel ni otras lla amp bact terias amplific carn este pro oducto. Solo la cepa vacunal RB51 de B. abortus amp a B plificar un pr roducto de 300 pb a partir de locus wboA del IS711. To el odas las espe ecies y cepas de Brucella, e excepto la cep vacunal pa S19 de B. abortus amplificar el producto de 180 pb a pa del gen ervA, pero no as otras bacte 9 s, e artir s erias. En la secc cin B de la fig gura siguiente se muestran algunos resultados. e

Leye endas de la Fig gura Figu A. loci (fila amplificado predichos p ura as) os para varias cate egoras de desconocidos (co olumnas). A: Se muestran e los c cuatro loci para cada catego con sus c ora cebadores hibr ridantes; B: los productos pr s redichos deriv vados de la amp plificacin efic (fs se refier a la cepa na tural de B. abo caz re ortus). Figu B. Patrone tpicos amplificados a pa rtir de aislami ura es ientos bacteria anos en bovin detectados mediante nos s elec ctroforesis en g de agarosa. Carril 1: cepa natural de B. abortus; Carr 2: s19 de B . abortus; Carr 3: RB51 gel . a ril ril

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de B. abortus; Carril 4: Brucella spp. (no B. abortus); Carril 5: bacterias distintas de Brucella. Se carg un gel de agarosa al 2% con 8 l de producto amplificado y 1 l de tinte de carga por cada pocillo, se someti a electroforesis durante 2,5 horas a 70 V, se ti con bromuro de etidio, y se visualiz con luz UV. Otra nueva prueba es HOOF-Prints. Esta prueba de identificacin se ha elaborado recientemente y se ha comprobado que tiene un gran potencial como herramienta epidemiolgica (12, 13). Conocida tambin como anlisis de repeticiones en tndem de un nmero variable de locus mltiples (MLVA), esta prueba puede ser un complemento de los mtodos clsicos de biotipificacin de acuerdo con la taxonoma establecida (45). Se ha incrementado la utilizacin de procedimientos moleculares para la identificacin de las especies de Brucella y los procedimientos de la prueba han mejorado desde los aos noventa. Actualmente se dispone de otras pruebas, tales como omp 25, 2a y 2b PCR/RFLP para B. abortus, que pueden utilizarse para la identificacin de las especies de Brucella (17, 18).

e)

Identificacin de cepas vacunales


La identificacin de las cepas vacunales B. abortus S19, B. abortus RB51 y B. melitensis cepa Rev.1, depende de pruebas adicionales. La cepa S19 de B. abortus presenta las propiedades normales de una biovariedad 1 pero no requiere CO2 para crecer, ni crece en presencia de bencilpenicilina (3 g/ml = 5 UI/ml), azul tionina (2 g/ml) o i-eritritol (1mg/ml) (concentraciones finales), y presenta una elevada utilizacin de L-glutamato (2). En algunos casos la cepa 19 crecer en presencia de i-eritritol pero sin usarlo. La cepa Rev. 1 de Brucella melitensis tiene las propiedades normales de una biovariedad 1 de dicha especie, pero crece mucho ms lentamente en medios ordinarios, no crece en presencia de fucsina bsica, ni con tionina (2 g/ml) o bencilpenicilina (3 g/ml) (concentraciones finales), pero crece en presencia de de estreptomicina a 2,5 o 5 g/ml (5 UI/ml) (2, 20, 21, 24). La cepa RB51 de B. abortus se identifica por varias propiedades: morfologa rugosa, crecimiento en presencia de rifampicina (250 g por ml de medio), e incapacidad para producir el polisacrido O (OPS) (81). La incapacidad para producir OPS se puede demostrar haciendo reaccionar colonias de RB51 con anticuerpos monoclonales (MAb) especficos contra OPS, en ensayos puntuales o por inmunotransferencia (77, 81). Un modo indirecto de demostrar la ausencia de OPS es inyectar 4 108 microorganismos RB51 viables en ratones BALB/c y determinar la induccin de anticuerpos anti-OPS; la serologa ser negativa (81). Las cepas vacunales S19, Rev.1 y RB51 se pueden identificar utilizando las PCR especficas (16, 80, 89, 91).

2.

Pruebas serolgicas

Ninguna prueba serolgica aislada es adecuada en cualquiera de las situaciones epidemiolgicas, presentando limitaciones en el diagnstico de animales individuales (36, 68). Se deben considerar todos los factores que influyen en la relevancia del mtodo de prueba y de sus resultados para una aplicacin o interpretacin diagnstica especfica. Los mtodos serolgicos que se describen en este captulo son mtodos estandarizados y validados, con caractersticas de realizacin adecuadas para ser consideradas pruebas obligadas o alternativas en el comercio internacional. Esto no impide el uso de pruebas modificadas o similares o la utilizacin de reactivos diferentes. Sin embargo, los mtodos y reactivos descritos en este captulo suponen un estndar de comparacin respecto a la realizacin esperada del diagnstico. Debe resaltarse que la prueba de la seroaglutinacin lenta en tubo (SAT) se considera inadecuada a efectos del comercio internacional. La prueba de la fijacin del complemento (FC) es ms especfica que la SAT para el diagnstico y adems posee un sistema estandarizado de unidades. Las caractersticas diagnsticas de algunos enzimoinmunoensayos (ELISA) y la prueba de la polarizacin de fluorescencia (FPA) son similares o superiores a la FC y, como son ms fciles de realizar tcnicamente y ms consistentes, es preferible su utilizacin (64, 98). Se ha comparado el rendimiento de algunas de estas pruebas. Para el control de la brucelosis en un pas o regin, son adecuadas para el anlisis las pruebas con antgeno tamponado de Brucella, es decir, la prueba con rosa de bengala (RBT) y la prueba de aglutinacin tamponada en placa (BPAT), as como ELISA y FPA. Las reacciones positivas deben volverse a comprobar utilizando una estrategia confirmativa adecuada.

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En otras especies, como por ejemplo en bfalos (Bubalus bubalus), bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), yak (Bos grunniens), elk/wapiti (Cervus elaphus), camellos (Camelus dromedarius, C. bactrianus) y camlidos sudamericanos, la infeccin por Brucella sigue un curso similar al del ganado vacuno. Para estos animales pueden utilizarse los mismos procedimientos serolgicos (59), pero cada uno debe ser validado para la especie de animal estudiada (33, 34).

Sueros de Referencia
Los estndares primarios de referencia bovina son aquellos frente a los que se comparan y calibran todos los dems estndares. Estos estndares de referencia estn a disposicin de los laboratorios nacionales de referencia y deben utilizarse para establecer estndares secundarios o nacionales frente a los que pueden prepararse otros de trabajo para utilizacin en el diagnstico diario rutinario de laboratorio. Estos sueros se han desarrollado y designado por la OIE como Sueros Internacionales Estndar1. Su empleo favorece la armonizacin internacional de las pruebas de diagnstico y la estandarizacin de antgenos (98): Para la RBT y la FC se emplea el suero estndar internacional de la OIE (OIEISS, antes designado Segundo suero anti-B. abortus de la OMS) que contiene 1000 UI y UIFC (unidades internacionales para la prueba de fijacin del complemento). Adems, se dispone de tres sueros estndar de la OIE para ELISA. Son tambin de origen bovino y comprenden un estndar fuertemente positivo (OIEELISASPSS), otro dbilmente positivo (OIEELISAWPSS) y otro negativo (OIEELISANSS).

Produccin de clulas
En la produccin de antgenos para diagnstico debe utilizarse siempre la cepa 99 de B. abortus (Weybridge) (S99) (ver direccin en la nota 1 a pie de pgina) o la cepa 1119-3 (USDA) (S-1119-3)2. Debe destacarse que el antgeno preparado de una de estas cepas tambin se utiliza en las pruebas para infeccin por B. melitensis o B. suis. Las cepas deben ser lisas y no autoaglutinables en solucin salina con 0,1% (p/v) de acriflavina. Tienen que ser cultivos puros y cumplir las propiedades de las cepas de B. abortus biovariedad 1 que son independientes de CO2. Los cultivos originales de siembra se cultivan para producir un lote de inculo que debe tener las propiedades de estas cepas, y se conservan por liofilizacin o por congelacin en nitrgeno lquido. Para la produccin de antgeno, el inculo de siembra se utiliza para sembrar varios tubos de agar inclinado con medio de infusin de patata que se incuban a 37C durante 48 horas. Los medios slidos SDA y TSA, con adicin de un 5% de suero equino o suero de ternero neonato y un 0,1% de extracto de levadura, son satisfactorios con tal de que se utilice un inculo adecuado como se recomienda arriba. La pureza del crecimiento se comprueba suspendiendo a la cepa en PBS estril, pH 6,4, y se utiliza para sembrar frascos Roux con medio slido de infusin de patata o con glicerol-dextrosa. Estos se incuban luego a 37C durante 72 horas con la superficie inoculada hacia abajo. La pureza del crecimiento se comprueba en cada frasco mediante la tincin de Gram, y los microorganismos se recogen aadiendo a cada frasco 5060 ml de solucin salina con fenol (con un 0,5% de fenol en una solucin de cloruro sdico al 0,85%). Los frascos se agitan, se decanta la suspensin, y los microorganismos se inactivan por calentamiento a 80C durante 90 minutos. Despus de una prueba de viabilidad, el antgeno se conserva a 4C. Alternativamente, las clulas se pueden producir en medio lquido o por cultivo continuo en un fermentador (38), en un medio que contenga (por litro de agua destilada) D-glucosa (30 g), peptona de grado elevado (30 g), extracto de levadura (Difco) (10 g), fosfato sdico (9 g) y fosfato bisdico (3,3 g). El pH inicial es 6,6 pero tiende a subir a 7,27,4 durante el crecimiento. Debe comprobarse la capacidad de los lotes de peptona y de extracto de levadura para producir un buen crecimiento sin formacin de clulas anormales o disociadas. Durante el crecimiento se puede necesitar una aireacin y agitacin vigorosas y el ajuste del pH a 7,27,4 por adicin de HCl 0,1 M. El inculo de siembra se prepara como se describi anteriormente. El cultivo se incuba a 37C durante 48 horas. El cultivo continuo puede mantenerse ms tiempo, pero se necesita ms experiencia. Para confirmar su pureza deben realizarse controles del proceso del crecimiento tanto en medio slido como lquido, del nivel de microorganismos viables para que sea el adecuado y la ausencia de formas rugosas disociadas. En la fase de recogida las clulas para utilizacin como antgeno deben comprobarse de nuevo su pureza y ausencia de disociacin.

1 2

Disponibles en el Laboratorio de Referencia de la OIE para la Brucelosis en la Veterinary Laboratories Agency (VLA) Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, Inglaterra. Disponible en el Departamento de Agricultura de los EE.UU. (USDA), National Veterinary Services Laboratories (NVSL), 1800 Dayton Road, Ames, Iowa 50010, EE. UU.

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El cultivo se recoge mediante centrifugacin para precipitar los microorganismos, que se resuspenden en solucin salina con fenol. Los microorganismos se inactivan por calentamiento a 80C durante 90 minutos y se guardan a 4C. Deben formar suspensiones estables en solucin salina fisiolgica sin evidencia alguna de autoaglutinacin. Con las suspensiones se debe realizar una prueba de viabilidad sin que se evidencie crecimiento alguno despus de una incubacin de 10 das a 37C. El volumen de clulas empaquetadas (PCV) presentes en las suspensiones inactivadas puede determinarse centrifugando volmenes de 1 ml en tubos Wintrobe a 3.000 g durante 75 minutos.

a)

Pruebas de antgeno tamponado de Brucella (Prueba prescrita para el comercio internacional) Prueba del rosa de bengala
Esta prueba es una prueba sencilla de aglutinacin puntual que utiliza antgeno coloreado con rosa de bengala y tamponado a pH bajo, normalmente 3,65 + 0,05 (54). Produccin de antgeno

El antgeno para la RBT se prepara depositando clulas muertas de las cepas de B. abortus S99 o S11193, recogidas por centrifugacin a 23.000 g durante 10 minutos a 4C, y resuspendindolas uniformemente en una solucin salina fenicada estril (0,5%) a razn de 1 g por cada 22,5 ml.(Nota: si se utiliza carboximetil celulosa sdica como agente sedimentador durante la preparacin del concentrado celular, los residuos insolubles deben eliminarse antes de la tincin filtrando la suspensin por un prefiltro AMF-CUNO Zeta-plus [Tipo CPR 01A]). A cada 35 ml de esta suspensin se aade 1 ml de rosa de bengala (CI No. 45440) al 1% (p/v) en agua destilada estril, y la mezcla se agita durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla se filtra a travs de una gasa estril y se centrifuga a 10.000 g para depositar las clulas teidas, que a continuacin se resuspenden uniformemente a razn de 1 g de clulas por 7 ml de diluyente (21,1 g de hidrxido sdico disueltos en 353 ml de solucin salina estril con fenol ms 95 ml de cido lctico, que se ajusta a 1.056 ml con solucin salina fenicada estril). El color de esta suspensin debe ser rojo intenso y el sobrenadante de una muestra centrifugada debe carecer de colorante; el pH debe ser 3,65 + 0,05. Despus de la filtracin a travs de una gasa, la suspensin se filtra dos veces a travs de un prefiltro de fibra de vidrio Sartorius No. 13430, se ajusta a un PCV de aproximadamente 8%, dependiendo de la estandarizacin final frente a un suero calibrado contra el OIEISS, y se guarda a 4C en la oscuridad. El antgeno debe almacenarse siguiendo las recomendaciones de los fabricantes, pero normalmente no debe congelarse. Cuando se utiliza en la prueba estndar, el antgeno RBT debe dar una reaccin positiva clara con dilucin 1/45 del OIEISS diluido en 0,5% de solucin salina con fenol, pero no a una dilucin de 1/55. Tambin es conveniente comparar la reaccin de antgeno nuevo y de lotes previamente estandarizados utilizando un conjunto de sueros definidos. i) ii) iii) iv) Procedimiento de la pruebas Poner las muestras de suero y de antgeno a temperatura ambiente (22 4C); solo debe sacarse del refrigerador el antgeno suficiente para las pruebas del da. Colocar 2530 l de cada muestra de suero en una baldosa blanca, placa esmaltada o de plstico, o en una placa para hemaglutinacin de la OMS. Agitar bien el frasco de antgeno, pero suavemente, y colocar el mismo volumen de antgeno prximo a la gota de suero. Inmediatamente despus de aadir la ltima gota de antgeno en la placa, mezclar cuidadosamente el suero y el antgeno (usando un porta limpio o una varilla de plstico para cada prueba) hasta producir una zona circular u oval de aproximadamente 2 cm de dimetro. La mezcla se agita suavemente durante 4 minutos a temperatura ambiente en un agitador circular o tridimensional (si la zona de reaccin es oval o circular, respectivamente) Comprobar la aglutinacin, justo a los 4 minutos. Cualquier reaccin visible se considera positiva. Antes de las pruebas de cada da se debe comprobar que un suero control origine una reaccin positiva mnima para verificar la sensibilidad de las condiciones de la prueba.

v) vi)

La RBT es muy sensible. Sin embargo, como toda prueba serolgica, a veces origina una reaccin positiva debido a vacunacin con S19 o a reacciones serolgicas positivas falsas (FPSR). Por tanto, las reacciones positivas deben confirmarse con estrategias confirmativas (que incluyan tanto la realizacin de otras pruebas como la investigacin epidemiolgica). Las reacciones negativas falsas se producen muy raramente, sobre todo debido a los fenmenos de prozona y en ocasiones se pueden detectar diluyendo la muestra de suero o volviendo a probarla despus de 46 semanas. Sin embargo, la RBT parece adecuada como una prueba para detectar rebaos infectados o para garantizar la ausencia de infeccin en rebaos libres de brucelosis.

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Prueba de aglutinacin tamponada en placa


Produccin de antgeno El antgeno para la BPAT se prepara a partir de la cepa S1119-3 de B. abortus siguiendo el procedimiento descrito por Angus & Barton (3). Se requieren dos soluciones de colorante: verde brillante (2 g/100 ml) y cristal violeta (1 g/100 ml) de calidad garantizada disueltos en agua destilada. Una vez preparadas, las dos soluciones se almacenan por separado durante 24 horas, y luego se mezclan en volmenes iguales en una botella opaca y se guardan en un refrigerador durante ms de 6 meses antes de uso. La mezcla de colorantes solo puede utilizarse entre 6 y 12 meses despus de su preparacin inicial. El diluyente tamponado se prepara disolviendo lentamente hidrxido sdico (150 g) en 34 litros de solucin salina estril con fenol. A esta solucin se aade cido lctico (675 ml) y el volumen final se ajusta a 6 litros aadiendo solucin salina estril con fenol. El pH de la solucin debe estar comprendido entre 3,63 y 3,67. Las clulas empaquetadas de B. abortus S1119-3 se diluyen a una concentracin de 250 g/litro en solucin salina fenolada; se aaden 6 ml de colorante por litro de suspensin celular, y la mezcla se agita antes de filtrar por algodn absorbente estril. Las clulas se centrifugan a 10.000 g a 4C y las clulas precipitadas se resuspenden a continuacin a una concentracin de 50 g/100 ml en diluyente tamponado (como se describi anteriormente). La mezcla se agita vigorosamente durante 2 horas y despus se diluye aadiendo 300 ml de diluyente tamponado por cada 100 ml de clulas resuspendidas (es decir, a una concentracin final de 50 g de clulas empaquetadas/400 ml de diluyente tamponado). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 2024 horas antes de que la concentracin celular se ajuste al 11% (p/v) con diluyente tamponado. Esta suspensin se agita durante toda la noche antes de uso. Pendientes de pruebas de control final de calidad, el antgeno se guarda a 4C hasta su utilizacin. El antgeno tiene una caducidad de 1 ao y no se debe congelar. El pH del antgeno tamponado en placa debe ser de 3,70 0,03 y el pH de una mezcla suero-antgeno a una proporcin 8:3 debe ser de 4,02 0,04. La suspensin al 11% de clulas teidas debe ser azulverdosa. Cada lote de antgeno tamponado en placa debe comprobarse con al menos 10 sueros de reactividad dbil y comparar los resultados con uno o ms lotes previos de antgeno. Si es posible, los lotes de antgeno deben compararse con el antgeno estndar preparado por el NVSL, USDA (ver nota 2 a pie de pgina para direccin). No hay sin embargo establecido un procedimiento de estandarizacin internacional para uso con el OIEISS. i) ii) iii) iv) Procedimiento de la prueba Se colocan las muestras de suero y el antgeno a temperatura ambiente (22 4C). Se sacar de la nevera solo el antgeno necesario para las pruebas del da. Se agita bien la muestra. Se colocan 80 l de cada muestra de suero en una placa de vidrio marcada con cuadros de 4 4 cm. Se agita bien la botella de antgeno, pero con suavidad, y se colocan 30 l de antgeno cerca de cada gota de suero. Inmediatamente despus de aadir la ltima gota de antgeno a la placa, se mezclan completamente el suero y el antgeno (utilizando un vaso limpio o una varilla de plstico para cada prueba) hasta producir una zona circular de aprox. 3 cm de dimetro. Despus de la mezcla inicial, la placa se mueve tres veces para asegurar la dispersin homognea de los reactivos y se incuba 4 minutos a temperatura ambiente en una cmara hmeda. Se extrae la placa y se mueve como antes, incubando otros 4 minutos. Lase de inmediato la aglutinacin una vez transcurridos 8 minutos. Cualquier reaccin visible se considera positiva. Debe probarse un suero control que d una reaccin positiva mnima antes de comenzar las pruebas de cada da para comprobar la sensibilidad de las condiciones de la prueba.

v) vi) vii)

Como la RBT, esta prueba es muy sensible, especialmente para la deteccin de anticuerpos inducidos por la vacuna, y las muestras positivas deben volverse a verificar con pruebas confirmativas. Pueden producirse reacciones negativas falsas, debidas por lo general a fenmenos de prozona, la cual puede eliminarse diluyendo el suero o volviendo a probar despus de cierto tiempo.

b)

Prueba de la fijacin del complemento (prueba prescrita para el comercio internacional)


La FC es una prueba confirmativa ampliamente aplicada y aceptada pese a la complejidad de su realizacin y a la necesidad de unas buenas instalaciones y de personal entrenado para titular y mantener los reactivos

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adecuadamente. Existen muchas variaciones de la FC, pero la prueba ms adecuada se realiza en formato de microtitulacin. Para la incubacin de suero, antgeno y complemento, se puede utilizar la fijacin en caliente o en fro: 37C durante 30 minutos o 4C durante 1418 horas. Varios factores influyen en la eleccin del mtodo: la actividad anticomplementaria de muestras de suero de baja calidad es ms evidente con la fijacin en fro, mientras que a 37C aumenta la frecuencia e intensidad de las prozonas, y se deben probar varias diluciones para cada muestra. Se han propuesto varios mtodos para la FC que utilizan diferentes concentraciones de eritrocitos de oveja (SRBC) frescos o conservados (normalmente se recomienda una suspensin al 2,5% o al 3%). Los SRBC estn sensibilizados con un volumen igual de suero anti-SRBC de conejo diluido hasta contener varias veces (en general de dos a cinco veces) la concentracin mnima necesaria para producir un 100% de lisis de SRBC en presencia de una solucin titulada de complemento de cobaya. El ltimo se titula independientemente (en presencia o ausencia de antgeno, segn el mtodo) para determinar la cantidad de complemento necesaria para producir el 50% o el 100% de lisis de los SRBC sensibilizados por unidad de volumen de una suspensin estndar; estas se definen como la unidad hemoltica de complemento al 50% o al 100%/ dosis hemoltica mnima (CH MHD50 CH MHD100), respectivamente. Se suele recomendar titular el complemento antes de cada serie de pruebas, siendo preferible un micromtodo para la determinacin ptima de CH50. Normalmente se utilizan en la prueba 1,252 CH100 o 56 CH50. El diluyente estndar para la FC es una solucin salina tamponada con barbital (veronal). Se prepara con tabletas comerciales; alternativamente puede prepararse a partir de una solucin stock de cloruro sdico (42,5 g), cido barbitrico (2,875 g), dietil barbiturato sdico (1,875 g), sulfato magnsico (1,018 g) y cloruro clcico (0,147 g) en 1 litro de agua destilada y se diluye antes de uso aadiendo cuatro volmenes de una solucin de gelatina al 0.04%. Produccin de antgeno

Existen numerosas variaciones de la prueba pero, cualquiera que sea el procedimiento, debe emplearse un antgeno preparado de una cepa lisa aprobada de B. abortus, como la S99 o la S1119-3, y que est estandarizado frente al OIEISS. El antgeno para la FC puede preparase por mtodos especiales (2, 38) o utilizar clulas enteras diluyendo la suspensin stock de modo que la PCV de la suspensin de antgeno concentrado para la FC sea aproximadamente del 2% antes de la estandarizacin frente al OIEISS. El antgeno debe estandarizarse para dar una fijacin del 50% a una dilucin 1/200 del OIEISS y debe mostrar tambin una fijacin completa a diluciones ms bajas de suero, porque una concentracin demasiado baja (o demasiado alta) de antgeno puede no producir un 100% de fijacin a diluciones ms bajas de suero. Cuando son adecuadas dos diluciones de antgeno, debe escogerse la suspensin de antgeno ms concentrada para evitar el fenmeno de prozona. La apariencia del antgeno a una dilucin 1/100 debe ser la de una suspensin blanca, uniforme y densa, sin agregacin visible ni formacin de depsito despus de incubar a 37C durante 18 horas. No debe producir efectos anticomplementarios en las condiciones de la prueba. El antgeno se guarda a 4C y no debe congelarse. Procedimiento de la prueba (ejemplo)

Los sueros problema sin diluir y los estndar de trabajo adecuados se inactivan durante 30 minutos en una bao de agua a 60C 2C. Si previamente se han diluido a la mitad con una solucin salina tamponada con veronal, se pueden inactivar a 58C 2C durante 50 minutos. En general solo se prueba rutinariamente una dilucin del suero (1/4 o 1/5, dependiendo del procedimiento escogido de la FC), pero se recomiendan diluciones seriadas a efectos de detectar la existencia de prozona. Con el empleo de placas de microtitulacin estndar de 96 pocillos de fondo redondeado (en U), la tcnica se realiza normalmente del modo siguiente: i) En el pocillo de la primera, segunda y tercera filas, se colocan 25 l de suero problema inactivado diluido. La primera fila es un control anticomplementario para cada suero. Se aade a los pocillos de la primera fila 25 l de tampn de FC (controles anticomplementario) para compensar la falta de antgeno. A todos los otros pocillos se aade 25 l de tampn de FC excepto a los de la segunda fila. A continuacin se hacen diluciones dobles seriadas transfiriendo volmenes de 25 l de suero de la tercera fila en adelante. Se descartan 25 l de la mezcla resultante en la ltima fila. A cada pocillo, excepto en la primera fila, se aaden 25 l de antgeno, diluido a la concentracin de trabajo, y 25 l de complemento, diluido al nmero de unidades requerido. Se aaden a cada pocillo volmenes de 25 l de complemento diluido hasta el nmero de unidades requerido.

ii) iii)

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Captulo 2.4.3. Brucelosis bovina


iv) Se establecen controles con diluyente solo, complemento + diluyente, antgeno + complemento + diluyente, que contengan en cada caso 75 l de volumen total. En cada serie de pruebas debe probarse un suero control que d una reaccin positiva mnima para comprobar la sensibilidad en las condiciones de la prueba. Las placas se incuban a 37C durante 30 minutos o durante toda la noche a 4C y se aade a cada pocillo un volumen de SRBC sensibilizados (25 o 50 l dependiendo de la tcnica). Las placas se reincuban a 37C durante 30 minutos. Los resultados se leen despus de centrifugar las placas a 1.000 g durante 10 minutos a 4C y despus dejarlas en reposo a 4C durante 23 horas para permitir que sedimenten las clulas no lisadas. El grado de hemolisis se compara con los estndares que correspondan a una lisis del 0, 25, 50, 75 y 100% de lisis. La ausencia de actividad anticomplementaria se comprueba en la primera fila para cada suero. Estandarizacin de los resultados de la FC: Existe un sistema de unidades basado en el OIEISS. Este suero contiene 1000 UIFC (unidades internacionales de la prueba de fijacin de complemento) por ml. Si este suero se prueba por un mtodo determinado y origina un ttulo de, por ejemplo, 200 (50% de hemolisis), entonces el factor de un suero problema probado por el mismo mtodo se deduce de la frmula: 1000 1/200 ttulo del suero problema = nmero de UIFC de anticuerpo en el suero problema por ml. El OIEISS contiene IgG especfica; los sueros estndar nacionales tambin deben depender de este isotipo para su actividad especfica de fijacin de complemento. Surgen dificultades en la estandarizacin porque diferentes tcnicas favorecen selectivamente la FC por los diferentes isotipos de las inmunoglobulinas. Se recomienda que cualquier pas que use la FC a escala nacional acuerde entre los diversos laboratorios que realizan la prueba el mismo mtodo para obtener el mismo nivel de sensibilidad. Para facilitar la comparacin entre pases, los resultados deben expresarse siempre en UIFC, calculadas en relacin con las obtenidas en una titulacin paralela con un suero estndar, que a su vez se calibra frente al OIEISS. viii) Interpretacin de los resultados: Los sueros con un ttulo equivalente a 20 UIFC/ml o ms, se consideran positivos. Este procedimiento es un ejemplo y se pueden escoger otros volmenes y cantidades de reactivos con tal de que la prueba se calibre frente al OIEISS como se describe antes y que los resultados se expresen en UIFC/ml. La prueba la FC es muy especfica. Sin embargo, como todas las pruebas serolgicas, a veces da resultados positivos debido a vacunacin con S19 o a consecuencia de la FPSR. En consecuencia, las reacciones positivas deben investigarse mediante estrategias confirmativas. Las hembras que se han vacunado con B. abortus S19 entre los 3 y 6 meses se consideran generalmente positivas si los sueros dan una fijacin positiva con un ttulo de 30 o ms UIFC/ml cuando los animales se diagnostican con una edad de 18 meses o superior.

v)

vi)

vii)

c)

Enzimoinmunoensayos (pruebas prescritas para el comercio internacional)


ELISA indirecto Se han descrito muchas variaciones de ELISA indirecto (I-ELISA) utilizando diferentes preparaciones antignicas, diversos conjugados de antiglobulinas con enzimas, y varios substratos/cromgenos. Algunos I-ELISA validados en ensayos amplios de campo se han comercializado y son muy utilizados. Para una homologacin internacional se deben usar los tres Sueros Estndar para ELISA de la OIE en los laboratorios nacionales de referencia para comprobar o calibrar el mtodo de la prueba en particular. La prueba debe calibrarse de modo que la densidad ptica (OD) del Suero Estndar de la OIE fuertemente positivo represente un punto de la porcin lineal de una curva tpica de dosis-respuesta, justo por debajo de la meseta. El Suero Estndar dbilmente positivo de la OIE para ELISA debe dar siempre una reaccin positiva que est situado en la porcin lineal de la misma curva dosis-respuesta, justo por encima del umbral positivo/negativo. El suero negativo y el control de tampn deben originar reacciones que estn por debajo del umbral positivo/negativo (97). El umbral debe establecerse en la prueba con tcnicas adecuadas de validacin (ver Captulo 1.1.4. Principios de validacin para las pruebas de diagnstico de enfermedades infecciosas). La prueba I-ELISA es muy sensible, pero a veces no es capaz de distinguir entre los anticuerpos debidos a vacunacin por S19 u otros problemas de FPSR y los inducidos por las cepas patgenas de Brucella (60). Por consiguiente, la prueba I-ELISA debe considerarse como una prueba de diagnstico ms que como una prueba confirmativa con ganado vacunado o en rebaos afectados con problemas de FPSR.

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Captulo 2.4.3. Brucelosis bovina


El problema de las FPSR se puede solucionar parcialmente mediante la realizacin de un I-ELISA utilizando rLPS como antgeno, antgenos del citosol o sustancias qumicas caotrpicas como el tiocianato potsico. La mayor parte de las FPSR son resultado de la reaccin cruzada con la porcin del polisacrido O de la molcula sLPS; sin embargo, son menos frecuente las reacciones cruzadas entre las regiones centrales del PLS (57). Para el I-ELISA de deteccin se deben utilizar como antgeno las preparaciones ricas en lipopolisacridos lisos (sLPS). En funcin de la disponibilidad y de las necesidades concretas se pueden emplear antiglobulinas mono o policlonales o protena A/G conjugadas con enzimas. Un MAb especfico para la cadena pesada de la IgG1 bovina puede mejorar la especificidad an a costa de perder sensibilidad, mientras que una protena A/G conjugada con enzimas puede proporcionar un reactivo til para las pruebas con diferentes especies de mamferos (57, 67). El mtodo de la prueba que se describe a continuacin es un ejemplo que ha sido validado internacionalmente y utilizado por todo el mundo en proyectos de cooperacin tcnica e investigacin cientfica con financiacin internacional. El tampn para antigenar es el carbonato/bicarbonato 0,05 M, pH 9,6, que contiene carbonato monosdico (2,93 g) y carbonato bisdico (1,59 g) en 1 litro de agua (la azida sdica [0,20 g/litro] es opcional). El tampn de dilucin del conjugado y de los sueros problema es PBS 0,01 M, pH 7,2, que contiene ortofosfato bisdico (1,4 g), fosfato monopotsico (0,20 g), cloruro sdico (8,50 g) y Tween 20 al 0,05% disuelto en 1 litro de agua destilada (PBST). Este tampn tambin se usa como tampn de lavado. El conjugado utilizado en este ejemplo es un MAb especfico para la cadena pesada de la IgG1 conjugado con peroxidasa de rbano (HRPO). La solucin base de substrato es perxido de hidrgeno al 3%. La solucin base de cromgeno es 0,16 M de 2,2-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS) en agua destilada. El tampn del substrato es tampn citrato, pH 4,5, compuesto por citrato trisdico hidratado (7.6 g) y cido ctrico (4,6 g) disueltos en 1 litro de agua destilada. La solucin para detener la reaccin enzimtica es 4% de dodecil sulfato sdico (SDS). Produccin de antgeno (ejemplo)

El sLPS de B. abortus S1119-3 S99 se prepara calentando 5 g de peso seco (o 50 g de peso hmedo) de clulas suspendidas a 66C en 170 ml de agua destilada y aadiendo 190 ml de fenol al 90% (v/v) a 66C. La mezcla se agita continuamente a 66C durante 15 minutos, se enfra y se centrifuga a 10.000 g durante 15 minutos a 4C. El fenol parduzco de la capa inferior se extrae con una cnula larga y si es necesario los restos celulares se eliminan por filtracin (utilizando un filtro de papel Whatman No.1). El sLPS se precipita aadiendo 500 ml de metanol fro que contenga 5 ml de metanol saturado con acetato sdico. Despus de 2 horas de incubacin a 4C, el precipitado se recoge por centrifugacin a 10.000 g durante 10 minutos. El precipitado se agita con 80 ml de agua destilada durante 18 horas y se centrifuga a 10.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se mantiene a 4C. El precipitado se resuspende en 80 ml de agua destilada y se agita otras 2 horas a 4C. El sobrenadante se recoge mediante centrifugacin como antes y se mezcla con el sobrenadante recogido previamente. A continuacin, se aaden 8 g de cido tricloroactico a los 160 ml del LPS crudo. Despus de agitar durante 10 minutos, el precipitado se elimina por centrifugacin y la solucin traslcida que constituye el sobrenadante se dializa frente a agua destilada (como mnimo, dos cambios de 400 ml cada uno) y luego se liofiliza. El LPS liofilizado se pesa, se reconstituye a una concentracin de 1 mg/ml en tampn carbonato 0,05 M, pH 9,6, y se sonica en un bao de hielo utilizando tres sonicaciones de 6 vatios durante 1 minuto cada vez. A continuacin, el LPS se liofiliza en fracciones de 1 ml y se guarda a temperatura ambiente. i) Procedimiento de la prueba (ejemplo) El sLPS liofilizado se reconstituye con 1 ml de agua destilada y se diluye a 1/1000 con tampn carbonato 0,05 M, pH 9,6 (o a una dilucin predeterminada por titulacin frente al suero estndar de la OIE para ELISA). Para antigenizar las microplacas, se aade a todos los pocillos 100 l de la solucin de sLPS, se cubren las placas y se incuba durante 18 horas a 4C. Despus de la incubacin, las placas se pueden usar o se mantienen selladas y congeladas a 20C hasta un ao. Las placas congeladas se descongelan antes de uso durante 3045 minutos a 37C. El antgeno no unido se elimina lavando todos los pocillos cuatro veces con PBST. A los pocillos especificados se aaden 100 l de suero diluido de 1/50 a 1/200 con PBST, pH 6,3, que contiene

ii)

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Captulo 2.4.3. Brucelosis bovina


7,5 mM de cido etiln diamino tetraactico (EDTA) y 7,5 mM de cido etiln glicol tetraactico (EGTA) (PBST/EDTA) y se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. iii) Se aaden a las placas los sueros problema y se ensayan por separado o en duplicado. Los controles, calibrados con Sueros Estndar de la OIE para ELISA, se disponen en pocillos duplicados e incluyen un suero control fuertemente positivo, otro dbilmente positivo, un suero control negativo y un control del tampn. El suero no unido se elimina lavando cuatro veces con PBST (no debe usarse PBS que contenga EDTA/EGTA con HRPO ya que inactiva el enzima). A cada pocillo se aade 100 l de conjugado (MAb M23) especfico para un eptopo de la cadena pesada de la IgG1 bovina unido a HRPO y diluido en PBST (predeterminado por titulacin) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos. El exceso de conjugado se elimina con cuatro lavados. A cada pocillo se aade 100 l de sustrato/cromgeno (1,0 mM de H2O2 [100 l/20 ml de tampn citrato] y 4,0 mM de ABTS [500 l/ 20 ml de tampn citrato]), las placas se agitan durante 10 minutos y el color desarrollado se determina en un espectrofotmetro a 414 o 405 nm. Si se desea, se puede aadir directamente a todos los pocillos 100 l de SDS al 4% como agente de parada de la reaccin. Los pocillos control que contienen el suero fuertemente positivo se consideran como un 100% de positividad y todos los datos se calculan de estas lecturas de absorbancia (entre 1,000 y 1,800) empleando la ecuacin: Porcentaje de positividad (%P) = absorbancia (muestra problema)/absorbancia (control fuertemente positivo) 100. Con fines de estandarizacin y de investigacin se encuentran disponibles3 el antgeno sLPS, pequeas cantidades del MAb especfico para la cadena pesada del la IgG1 bovina, programas para la generacin de datos empleando espectrofotmetros particulares y un protocolo estandarizado para la prueba I-ELISA. Mediante este protocolo descrito para I-ELISA, u otro similar calibrado frente a los Sueros Estndar de la OIE para ELISA, la sensibilidad diagnstica debe ser igual o mayor que los BBAT en pruebas con ganado infectado, y la especificidad diagnstica debe ser equivalente a la prueba de la FC en diagnsticos con ganado sin vacunar (66, 67). Puede esperarse que la sensibilidad diagnstica en pruebas con ganado vacunado con la cepa S19 o en el caso de FPSR sea notablemente inferior a la prueba de la FC dependiendo de dnde se establezca el umbral de positividad/negatividad en el I-ELISA.

iv)

v)

vi)

ELISA competitivo
El ELISA competitivo (C-ELISA) que emplea un MAb especfico para uno de los eptopos de la Brucella OPS parece tener mayor especificidad que el I-ELISA (49, 64, 83, 92). Se realiza seleccionando un MAb con mayor afinidad que los anticuerpos con reaccin cruzada. No obstante, se ha comprobado que el CELISA elimina algunas, pero no todas, las reacciones (FPSR) debidas a bacterias con reaccin cruzada (61). El C-ELISA es tambin capaz de eliminar la mayora de las reacciones debidas a los anticuerpos residuales que se producen en respuesta a la vacunacin con S19. La eleccin del MAb y su singular especificidad y afinidad influencian las propiedades diagnsticas de la prueba. Como en cualquier prueba basada en el MAb, se debe considerar la disponibilidad general del MAb o del hibridoma para su aceptacin internacional y su utilizacin generalizada. Se han descrito algunas variaciones de C-ELISA. El C-ELISA tambin est disponible comercialmente. Para una homogenizacin internacional, los laboratorios nacionales de referencia deben utilizar los tres Sueros Estndar de la OIE para el ELISA a fin de comprobar o calibrar el mtodo concreto. La prueba debe calibrarse de tal modo que la densidad ptica del Suero Estndar de la OIE fuertemente positivo represente un punto en la zona lineal de una curva tpica de dosis-respuesta justo por encima de la meseta (es decir, prximo a la mxima inhibicin). El Suero Estndar de la OIE dbilmente positivo debe dar una reaccin que caiga en la porcin lineal de la misma curva de dosis-respuesta justo por encima del umbral positivo/negativo (es decir, inhibicin moderada). El suero negativo y el control de tampn/MAb deben dar reacciones siempre menores que el umbral positivo/negativo (es decir, inhibicin mnima). El mtodo que se describe a continuacin es un ejemplo de prueba que se ha validado internacionalmente y utilizado con una difusin mundial a travs de proyectos de cooperacin tcnica y colaboracin cientfica con financiacin internacional. Los sistemas de tampn son los mismos que los descritos para la prueba I-ELISA.

Laboratorio de Referencia de la OIE para la Brucelosis, Animal Diseases Research Institute, 3851 Fallowfield Road, Nepean, Ontario K2H 8P9, Canada.

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Produccin de antgeno (ejemplo)

El sLPS de la cepa S1119-3 de B. abortus se prepara y se utiliza como para el I-ELISA. i) Procedimiento de la prueba El sLPS liofilizado se reconstituye con 1 ml de agua destilada y se diluye a 1/1000 con tampn carbonato 0,05 M y pH 9,6. Para antigenizar las microplacas, se aade a todos los pocillos 100 l de la solucin de LPS, se cubren las placas y se incuban durante 18 horas a 4C. Despus de la incubacin, las placas se pueden usar o mantenerlas selladas y congeladas a 20C hasta un ao. Las placas congeladas se descongelan antes de uso durante 3045 minutos a 37C. El antgeno no unido se elimina lavando todos los pocillos cuatro veces con PBST. A cada pocillo se aaden 50 l de MAb (M84 en este caso) convenientemente diluido en PBST/EDTA e inmediatamente otros 50 l de suero diluido 1/10 en PBST/EDTA. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitacin, por lo menos durante los 3 minutos iniciales. Se aaden a las placas los sueros problema y se ensayan por separado o en duplicado. Los controles, calibrados con Sueros Estndar de la OIE para ELISA, se disponen en pocillos duplicados e incluyen un suero control fuertemente positivo, otro dbilmente positivo, un suero control negativo y un control del tampn. El suero no unido se elimina lavando cuatro veces con PBST. A cada pocillo se aade 100 l de conjugado comercial de IgG anti-ratn de cabra (cadena H y L) unida a HRPO y diluida en PBST (predeterminado por titulacin) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos. El exceso de conjugado se elimina con cuatro lavados. A cada pocillo se aade 100 l de substrato/cromgeno (1,0 mM de H2O2 y 4,0 mM de ABTS), se agitan las placas durante 10 minutos y el color desarrollado se determina con un espectrofotmetro a 414 o 405 nm. Si se desea, se puede aadir directamente a todos los pocillos 100 l de SDS al 4% como agente de parada de la reaccin. Los pocillos control que contienen el suero fuertemente positivo se consideran como una inhibicin del 0% y todos los datos se calculan de estas lecturas de absorbancia (entre 1.000 y 1.800) empleando la ecuacin: Porcentaje de inhibicin (%I) = 100 (absorbancia [muestra problema]/absorbancia [control de tampn] 100). Con fines de estandarizacin y de investigacin se encuentran disponibles el antgeno sLPS, pequeas cantidades del MAb especfico para la cadena pesada del la IgG1 bovina, programas para la generacin de datos empleando espectrofotmetros particulares y un protocolo estandarizado para la prueba C-ELISA (ver direccin en nota 3 a pie de pgina). Mediante este protocolo descrito para C-ELISA, u otro similar calibrado frente a los Sueros Estndar de la OIE para ELISA, la sensibilidad diagnstica debe ser equivalente a los BBAT y el I-ELISA en pruebas con ganado infectado (63, 64, 66). La especificidad diagnstica del C-ELISA debe ser equivalente o superior a la de la FC e I-ELISA en pruebas con ganado sin vacunar o en el caso de FPSR. La especificidad diagnstica de C-ELISA es mayor que la de la FC y el I-ELISA en pruebas con ganado vacunado con S19.

ii)

iii)

iv)

v)

vi)

d)

Prueba de polarizacin de fluorescencia (prueba prescritas para el comercio internacional)


La FPA es una tcnica sencilla para determinar la interaccin antgeno/anticuerpo y puede realizarse en instalaciones de laboratorio o en el campo. Es una prueba homognea que no requiere la separacin de los compuestos analizados y que por tanto es muy rpida. El mecanismo de la prueba se basa en la rotacin aleatoria de las molculas en solucin. El tamao molecular es el principal factor que influencia la velocidad de rotacin, con una relacin de proporcionalidad inversa. As, una molcula pequea gira ms deprisa que una grande. Si una molcula se marca con un fluorocromo, se puede determinar el tiempo de rotacin a travs de un ngulo de 68,5C midiendo la intensidad de la luz polarizada en planos verticales y horizontales. Una molcula grande emite ms luz en un nico plano (ms polarizada) que una pequea que gira ms deprisa y emite luz ms despolarizada. En la mayora de las FPA, se marca con un fluorocromo un antgeno de pequeo peso molecular, inferior a 50 kD, y se aade suero u otro lquido problema para detectar la presencia de los anticuerpos. Si estn presentes anticuerpos, la unin con el antgeno marcado provoca un descenso en su velocidad rotacional que puede medirse. Para el diagnstico de la brucelosis, se emplea como antgeno un fragmento de bajo peso molecular (media de 22 kD) del OPS del sLPS de la cepa 1119-3 de B. abortus y se marca con isotiocianato de fluorescena. Este antgeno se aade a suero diluido o a sangre completa y en 2 minutos (para suero) o 15 segundos

700

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(para sangre), despus de aadir el antgeno, se obtiene una medida del contenido de anticuerpos mediante un analizador de polarizacin de fluorescencia (62 ,66). La FPA se puede realizar en tubos de vidrio o en formato de placa de 96 pocillos. El suero bovino se diluye a 1/10 para la prueba en placa o a 1/100 para la prueba en tubo; si se emplea sangre tratada con EDTA, la dilucin para la prueba en tubo es de 1/50 y 1/5 para la prueba en placa (la sangre tratada con heparina aumenta la variabilidad de la prueba). El diluyente utilizado es Tris 0,01 M (1,21 g) que contiene cloruro sdico 0,15 M (8,5 g), 0,05% de Igepal CA630 (500 l) (antes denominado NP40) y 10 mM de EDTA (3,73 g) por litro de agua destilada, pH 7,2 (tampn Tris). Despus de mezclar, se obtiene una lectura inicial para determinar la dispersin de la luz con un analizador de polarizacin de fluorescencia (FPM). Se aade un antgeno titulado marcado adecuadamente (que por lo general origine una intensidad de 250.000 300.000), se mezcla y se obtiene con el FPM una segunda lectura a los 2 minutos para suero y a los 15 segundos para sangre. Una lectura superior al nivel del umbral establecido (en miliunidades de polarizacin, mP) indica una reaccin positiva. Un nivel umbral tpico es 90100 mP, aunque la prueba debe calibrarse localmente con un Suero Estndar de Referencia Internacional. Deben incluirse controles de suero positivo fuerte, positivo dbil, y negativo, as como un suero de animal vacunado con S19. Produccin de antgeno (ejemplo)

El OPS se prepara a partir de 5 g de peso seco (o 50 g de peso hmedo) de B. abortus S1119-3 aadiendo 400 ml de cido actico al 2% (v/v), autoclavando la suspensin durante 15 minutos a 121C y eliminando los restos celulares mediante centrifugacin a 10.000 g durante 10 minutos a 4C. A continuacin, el sobrenadante se trata con 20 g de cido tricloroactico para precipitar las protenas y los cidos nucleicos. El precipitado se elimina de nuevo mediante centrifugacin a 10.000 g durante 10 minutos a 4C. El sobrenadante se dializa frente, al menos, 100 volmenes de agua destilada y se liofiliza. Se disuelven 3 mg de OPS en 0,6 ml de hidrxido sdico 0,1 M (4 g NaOH/litro) y se incuba a 37C durante 1 hora. Despus se aade 0,3 ml de ismero 1 de FICT a una concentracin de 100 mg/ml en dimetil sulfxido y se incuba otra vez durante 1 hora a 37C. El OPS conjugado se aplica a una columna de 1 10 cm de DEAE (dietilaminoetil) Sephadex A 25 equilibrada con tampn fosfato 0,01 M, pH 7,4. La primera fraccin (despus de 1015 ml de elucin con tampn) es verde fuerte, y despus se cambia el tampn a fosfato 0,1 M, pH 7,4. Se eluyen 1015 ml de tampn seguidos luego de 2040 ml donde se obtiene el material verde fluorescente. Este ltimo material es el antgeno utilizado en FPA. La preparacin de antgeno se puede aumentar proporcionalmente. La cantidad de antgeno utilizada por prueba se determina diluyendo el material antes obtenido hasta lograr una intensidad de fluorescencia de 250.000300.000 en el FPM. El antgeno se guarda como un lquido durante varios aos a 4C en un frasco opaco o se puede liofilizar en frascos opacos. Se puede disponer de pequeas cantidades de antgeno marcado para la investigacin y estandarizacin de procedimientos operativos relacionados con la obtencin de antgeno y la realizacin de FPA (para direccin, ver nota 3 a pie de pgina). i) Procedimiento de la pruebas Se aade 1 ml de tampn Tris a tubos de vidrio de borosilicato de 10 75 mm y despus 10 l de suero o 20 l de sangre tratada con EDTA. Para el formato de 96 pocillos, se aaden 20 l de suero a 180 l de tampn. Es importante mezclar bien. Se obtiene una lectura en el FPM para determinar la dispersin de la luz. Se aade al tubo un volumen de antgeno que corresponda a una intensidad total de fluorescencia de 250300 103 y se mezcla bien. Este volumen puede variar de un lote a otro, pero en general es de unos 10 l. Se obtiene una segunda lectura en el FPM despus de una incubacin a temperatura ambiente de 2 minutos para suero y de 15 segundos para sangre tratada con EDTA. Una lectura superior al umbral predeterminado indica una reaccin positiva. En cada serie de pruebas se incluye un suero estndar de trabajo fuertemente positivo, otro dbilmente positivo y un suero negativo (calibrados frente a los Sueros Estndar de la OIE).

ii)

iii) iv)

La sensibilidad y la especificidad diagnstica de la FPA en la brucelosis bovina son casi idnticas a las de C-ELISA. La especificidad diagnstica en ganado recientemente vacunado con la cepa S19 supera el 99% (62). Sin embargo se desconoce en la actualidad la especificidad de la FPA en condiciones de FPSR. La FPA debe estandarizarse de modo que los sueros positivos fuertes y dbiles de la OIE suministren resultados positivos repetitivos.

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Captulo 2.4.3. Brucelosis bovina

3.
a)

Otras pruebas
Prueba cutnea de la brucelina
Una prueba inmunolgica alternativa es la prueba cutnea de la brucelina, que puede utilizarse para el diagnstico en rebaos no vacunados siempre que se utilice una preparacin antignica purificada (libre de LPS) y estandarizada (por ejemplo, brucelina INRA). La prueba cutnea de la brucelina tiene una especificidad muy elevada, de modo que los animales sin vacunar que son serolgicamente negativos y reaccionan positivamente en la prueba de la brucelina deben considerarse animales infectados (78). Adems, los resultados de esta prueba pueden ayudar a interpretar reacciones serolgicas que se consideran como FPSR debidas a una infeccin por bacterias que tienen una reaccin cruzada, especialmente en reas libres de brucelosis (23, 74, 78). No todos los animales infectados reaccionan, por lo que esta prueba sola no es recomendable como prueba nica a efectos del comercio internacional. Es esencial utilizar una preparacin estandarizada y definida de brucelina que no contenga antgenos sLPS, ya que este puede producir reacciones inflamatorias inespecficas o interferir con pruebas serolgicas posteriores. Una preparacin de ese tipo es la brucelina INRA preparada de una cepa rugosa de B. melitensis que est comercializada4. i) ii) iii) iv) Procedimiento de la prueba Se inyecta intradrmicamente 0,1 ml de brucelina en el repliegue caudal, en la piel del costado lateral, o de un lado del cuello. La prueba se lee despus de 4872 horas. El grosor de la piel en el sitio de la inyeccin se mide con un calibrador Vernier antes y despus de la inyeccin. Una reaccin positiva fuerte se reconoce fcilmente como una inflamacin local e induracin. No obstante, las reacciones dudosas requieren una interpretacin cuidadosa. Un engrosamiento de la piel de 1,52 mm debe considerarse como una reaccin positiva.

Aunque la prueba intradrmica de la brucelina es una de las ms especficas de la brucelosis (en animales no vacunados) el diagnstico no puede hacerse basndose solamente en reacciones intradrmicas positivas en unos cuantos animales del rebao, y debe apoyarse en una prueba serolgica fiable. La inoculacin intradrmica de la brucelina puede originar una anergia temporal de la respuesta inmune celular. Por tanto, en general se recomienda un intervalo de 6 semanas entre dos pruebas realizadas sobre el mismo animal. La prueba cutnea, realizada con brucelina de la RB51 homloga tras la vacunacin de los terneros con RB51, produce una respuesta humoral anamnsica. De esta forma, la asociacin de la prueba cutnea y la prueba de FC con RB51 puede aportar un sistema de diagnstico para identificar los animales individuales vacunados con RB51 (23).

b)

Prueba de aglutinacin del suero


Aunque no se considera una prueba obligada o alternativa, la SAT se ha utilizado con eficacia durante muchos aos en programas de vigilancia y control de la brucelosis bovina. Su especificidad mejora notablemente si se aade EDTA al antgeno (35, 48, 65). El antgeno es una suspensin bacteriana en solucin salina fenolada (NaCl al 0,85% [p/v] y fenol al 0,5% [v/v]). No debe usarse formaldehdo. Los antgenos pueden presentarse en forma concentrada siempre que el factor de dilucin para uso se indique en la etiqueta del frasco. Para reducir el nivel de resultados positivos falsos se puede aadir EDTA a la suspensin antignica a una concentracin final en la prueba de 5 mM. En consecuencia, el pH de 7,2 debe reajustarse en la suspensin de antgeno. El OIEISS contiene 1000 UI de aglutinacin. El antgeno debe prepararse sin referencia a la concentracin celular, pero su sensibilidad debe estandarizarse con relacin al OIEISS de modo que el antgeno produzca el 50% de aglutinacin con una dilucin srica final de 1/600 a 1/1.000, o el 75% con una dilucin srica final de 1/500 a 1/750. Tambin se aconseja comparar la reactividad de los lotes de los antgenos nuevos con los estandarizados previamente utilizando un juego de sueros definidos.

Brucellergne OCB, Synbiotics Europe, 2 rue Alexander Fleming, 69007 Lyon, Francia.

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Captulo 2.4.3. Brucelosis bovina


La prueba se realiza en tubo o en microplaca. La mezcla de antgeno con las diluciones de suero debe incubarse 1624 horas a 37C. Si la prueba se realiza en microplaca, el tiempo de incubacin puede acortarse a 6 horas. Para cada suero debe prepararse un mnimo de tres diluciones para evitar respuestas negativas debidas a los fenmenos de prozona. La dilucin de sueros sospechosos debe llevarse a cabo de modo que la lectura de la reaccin al lmite de la positividad se haga en un tubo medio (o pocillo en el mtodo de microplaca). Interpretacin de los resultados: El grado de aglutinacin de Brucella por un suero debe expresarse en UI por ml. Un suero con 30 UI o ms, se considera positivo.

c)

Pruebas de hapteno nativo y poliB


Las pruebas de hapteno nativo y poliB son pruebas confirmativas5 utilizadas con xito en programas de erradicacin en combinacin con RBT como prueba de diagnstico (4). La sensibilidad ptima se obtiene por un sistema de inmunodifusin radial inversa donde el suero difunde en un gel hipertnico que contiene el polisacrido (24, 43). No obstante, el procedimiento de la doble difusin en gel tambin resulta til (46, 47). Los terneros vacunados subcutneamente con la dosis estndar de la cepa S19 a los 35 meses de edad son negativos a los 2 meses de la vacunacin, y el ganado adulto vacunado subcutneamente 4 5 meses antes con dosis reducida de la cepa S19 no da reacciones positivas a menos que resulten infectados y excreten la vacuna en la leche (43). La vacunacin conjuntival (tanto en jvenes como en adultos) reduce el tiempo de obtencin de una respuesta negativa en las pruebas con hapteno nativo y poliB. Una caracterstica notable de la prueba RID es que un resultado positivo se correlaciona con la excrecin de Brucella, como se ha demostrado en ganado infectado experimentalmente y en ganado con infeccin natural sometido a tratamiento antibitico (42). Se ha demostrado que las pruebas de precipitacin en las que se utiliza como antgeno el hapteno nativo o protenas de citosol eliminan la mayora de las reacciones FPSR causadas por Yersinia enterocoltica O:9 y las FPSR de origen desconocido (57).

d)

Pruebas en la leche
Un medio eficaz de examinar a las vacas lecheras es recurrir a la leche de los tanques de recogida. De estos tanques se puede obtener leche de forma ms barata y frecuente que las muestras de sangre, y habitualmente estn disponibles en las centrales lecheras. Cuando se obtiene un resultado positivo, todas las vacas que aportan leche deben comprobarse individualmente analizando sus muestras de sangre. La prueba I-ELISA en leche es sensible y especfica, y resulta particularmente til para llevarla a cabo en grandes poblaciones de animales. La prueba del anillo de leche (MRT) es una alternativa adecuada cuando no se dispone de ELISA. I-ELISA en leche

Como con el I-ELISA para suero, se utilizan numerosas variaciones del I-ELISA para leche. Se han comercializado varios I-ELISA que se han validado en ensayos de campo y son de uso amplio. A efectos de una armonizacin internacional, los laboratorios nacionales de referencia deben utilizar los tres Sueros Estndar de la OIE para ELISA con el fin de comprobar o calibrar el mtodo particular de la prueba en cuestin. El I-ELISA debe estandarizarse de modo que el estndar positivo fuerte positivo de la OIE para ELISA diluido a 1/125 en suero negativo y diluido despus a 1/10 en leche negativa se comporte repetidamente como positivo. Las muestras de leche completa se comprueban generalmente con diluciones mucho ms bajas que el suero, es decir, de 1/2 a 1/10 en tampn de dilucin, y el resto de la prueba es similar a lo descrito para suero. La prueba C-ELISA no debe utilizarse con leche completa pero puede usarse con muestras de suero. Prueba del anillo de leche

En los animales lactantes, la prueba del anillo de leche o MRT (sigla inglesa para milk ring test) puede utilizarse para el diagnstico de la brucelosis en rebaos. En poblaciones grandes (>100 terneros lactantes) la sensibilidad de la prueba tiene menos fiabilidad. La MRT puede ajustarse para compensar el factor de dilucin de las muestras de leche entera procedente de rebaos grandes. Las muestras se ajustan de acuerdo con la siguiente frmula: tamao del rebao <150 animales usan 1 ml de leche. 150450 usan una muestra de leche entera de 2 ml. 451700 usan una muestra de leche de 3 ml. Pueden presentarse reacciones positivas falsas en animales vacunados 4 meses antes de la prueba, en muestras de leche anormal (como el calostro) o en casos de mamitis. Por tanto, no se recomienda la utilizacin de esta prueba en granjas muy pequeas, donde estos problemas presentan un mayor impacto en los resultados de la prueba.

El procedimiento detallado puede obtenerse del Departamento de Sanidad Animal, Servicio de Investigacin Agraria/DGA, Apartado 727, 50080 Zaragoza, Espaa.

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Produccin de antgeno

El antgeno para MRT se prepara a partir de suspensiones concentradas de bacterias muertas de B. abortus S99 o S1119-3, cultivadas como se ha descrito con anterioridad. Se centrifugan a 23.000 g durante 10 minutos a 4C y se resuspenden en solucin de colorante hematoxilina. Se emplean varios mtodos satisfactorios; un ejemplo es el siguiente: se aaden 100 ml de hematoxilina al 4% (p/v) (Cl No. 75290), disuelta en 95% de etanol, a una solucin de sulfato amnico alumnico (5 g) en 100 ml de agua destilada y 48 ml de glicerol. A la solucin se aaden 2 ml de iodato sdico al 10% (p/v) recin preparado. Despus de 30 minutos a temperatura ambiente, la solucin de color prpura oscuro se aade a 940 ml de sulfato amnico alumnico al 10% (p/v) en agua destilada. El pH de la mezcla se ajusta a 3,1 y la solucin se deja envejecer mantenindola a temperatura ambiente durante 4590 das en la oscuridad. La solucin de colorante se agita antes de utilizarlas y se filtra a travs de una gasa. Las clulas empaquetadas se suspenden en la solucin de colorante a razn de 1 g por cada 30 ml de colorante y se mantienen a temperatura ambiente durante 48 horas (en vez de esto, algunos laboratorios prefieren calentar 80C durante 10 minutos). Las clulas teidas se concentran por centrifugacin y se lavan tres veces con una solucin de cloruro sdico (6,4 g), cido lctico al 85% (1,5 ml) e hidrxido sdico al 10% (4,4 ml) en 1,6 litros de agua destilada, a pH final de 3,0. Las clulas lavadas se resuspenden a razn de 1 g en 27 ml de un diluyente que consiste en solucin salina con fenol al 0,5%, ajustada a pH 4,0 por adicin de cido ctrico 0,1 M (aproximadamente 2, 5 ml) y fosfato bisdico 0,5 M (aproximadamente 1 ml), y se mantiene a 4C durante 24 horas. La mezcla se filtra a travs de una gasa, se comprueba el pH, y se determina el PCV ajustndolo aproximadamente al 4%. La sensibilidad del lote nuevo debe compararse con la de un lote previamente estandarizado utilizando un juego de muestras de varios grados de reaccin preparado diluyendo un suero positivo en leche. El antgeno debe estandarizarse frente al OIEISS de modo que una dilucin 1/500 sea positiva y una dilucin 1/1.000 sea negativa. El antgeno debe almacenarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero generalmente debe guardarse a 4C. El pH del antgeno debe estar entre 3,3 y 3,7 y su color debe ser azul oscuro. Se permite la existencia de un poco de colorante libre en el sobrenadante de una muestra centrifugada. Cuando se diluye en leche de un animal sin brucelosis, el antgeno debe producir una coloracin uniforme de la capa de leche sin formar depsitos ni coloracin en la capa cremosa. Procedimiento de la prueba

La prueba se lleva a cabo sobre las muestras del tanque de leche entera. Si es necesario, las muestras se pueden pretratar con un conservante (formalina al 0,1% o bronopol al 0,02%) durante 23 das a 4C antes de su utilizacin. i) ii) iii) Se debe procurar que las muestras de leche y el antgeno se mantengan a temperatura ambiente (20 3C). Debe retirarse de la nevera solo el antgeno necesario para las pruebas del da. Se agita suavemente la botella de antgeno. La prueba se lleva a cabo aadiendo 3050 l de antgeno a 12 ml de leche completa (el volumen de leche puede aumentarse para muestras de poblaciones grandes. Vase ms arriba la prueba del anillo de leche). La altura de la columna de leche en el tubo debe ser como mnimo de 25 mm. Las muestras de leche no deben haber sido congeladas, calentadas, sometidas a agitacin violenta o guardadas durante ms de 72 horas. Normalmente, las mezclas de leche y antgeno se incuban a 37C durante 1 hora junto con los estndares de trabajo positivos y negativos. Sin embargo, la incubacin durante la noche a 4C aumenta la sensibilidad de la prueba y permite una interpretacin ms fcil. Una reaccin fuertemente positiva se indica por la formacin de un anillo azul oscuro por encima de la columna blanca de leche. Cualquier anillo azul en la interfase de leche y de crema debe considerarse como positivo y podra ser significativo, especialmente en el caso de grandes poblaciones. La prueba es negativa si el color de la leche supera al de la capa cremosa.

iv)

v)

vi)

vii)

viii) Cuando se ajusta la MRT para aplicarla en rebaos de gran tamao (utilizndose 2 o 3 ml de leche), se aade 0,1 ml de una mezcla de nata negativa al tubo de ensayo y a continuacin 3050 l del antgeno de la prueba del anillo. Despus de mezclar, se incuba y se lee de la misma forma que para la MRT no ajustada. La mezcla de nata negativa se recoge mediante la separacin de la leche entera y sin pasteurizar procedente de un rebao de 25 o ms vacas que sean negativas a la brucelosis.

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Captulo 2.4.3. Brucelosis bovina

e)

Prueba del interfern gamma


A medida que disminuye la prevalencia de la brucelosis, aumenta la importancia de la precisin de las pruebas serolgicas. Las reacciones positivas falsas conllevan rastreos retroactivos e investigaciones epidemiolgicas que son caras y requieren mucho tiempo para su aplicacin. De ah que las pruebas que eliminen la FPSR sern cada vez ms tiles. En general, la prueba del interfern gamma implica la estimulacin de los linfocitos en sangre completa con un antgeno adecuado; en este caso, se ha demostrado que la brucelina da buenos resultados y luego se mide la produccin de interfern gamma resultante mediante un ELISA de captura (44, 93, 94). Se ha comprobado que el protocolo de la prueba tambin es til para la deteccin de FPSR en ovejas (25) y cerdos (76).

f)

Deteccin de anticuerpos frente a Brucella rugosa


La utilizacin de Brucella rugosa (RB51) como vacuna y en algunos casos de infeccin atpica por Brucella ha hecho necesaria la utilizacin de pruebas serolgicas para la deteccin de anticuerpos contra el ncleo del sLPS. Aunque se ha demostrado que el sLPS de la cepa RB51 de B. abortus contiene pequeas cantidades de OPS (19), generalmente la respuesta de los anticuerpos frente a OPS es insignificante, y el rLPS es un antgeno ms adecuado. El rLPS se extrae con facilidad de la cepa RB51 de B. abortus mediante el mtodo de Galanos et al. (32). Entonces ese antgeno puede utilizarse en el IELISA (66, 67). Tambin se ha comprobado que, mediante la prueba de fijacin del complemento, se detectan anticuerpos contra el rLPS utilizando un antgeno de clula entera (1).

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO


La brucelosis es una de las infecciones de laboratorio ms fciles de contraer y deben tomarse estrictas medidas de seguridad. La manipulacin en los laboratorios de cultivos vivos de Brucella, que incluye cepas de vacunas, es peligroso y debe realizarse bajo un nivel 3 de contencin o mayor, tal como se seala en el captulo 1.1.6, a fin de minimizar la exposicin durante el trabajo.

C1. Brucelina
La brucelina INRA es un extracto libre de LPS de la cepa B115 de B. melitensis en fase rugosa. Esta preparacin no provoca la formacin de anticuerpos reactivos en la BBAT, la FC o el ELISA.

1.
a)

Control de inculos
Caractersticas del inculo
La produccin de brucelina INRA se basa en un sistema de lotes de siembra como el descrito para los antgenos y las vacunas. El inculo original de la cepa B115 de B. melitensis para produccin de brucelina6 debe cultivarse para producir un lote de siembra que debe conservarse mediante liofilizacin o congelacin en nitrgeno lquido. Debe presentar las propiedades de un cultivo puro de una cepa rugosa de B. melitensis y no producir LPS liso de Brucella. Debe producir cantidades razonables de una mezcla de antgenos proteicos reactivos frente a antisueros contra cepas rugosas y lisas de Brucella.

b)

Mtodo de cultivo (2)


La cepa B115 de Brucella melitensis crece mejor en el medio de cultivo descrito con anterioridad para el cultivo en fermentador. Puede crecer en fermentador por el mtodo continuo o discontinuo o en matraces colocados en un agitador. Debe comprobarse su pureza en cada recogida aislada y el organismo debe encontrase en la fase rugosa.

c)

Validacin como un reactivo para el diagnstico in vivo


Estudios de laboratorio y de campo realizados en Francia, han confirmado que la brucelina INRA es segura, no txica y de accin especfica. La preparacin contiene un 5075% de protenas, principalmente de bajo peso molecular, y un 1530% de carbohidratos. No contiene antgenos LPS. La brucelina INRA no provoca repuestas inflamatorias en animales no sensibilizados, y no es por s misma un agente sensibilizante. No provoca anticuerpos reactivos en las pruebas serolgicas estndar para brucelosis. Ms del 90% de los pequeos rumiantes infectados por B. melitensis manifiestan una hipersensibilidad retardada a la brucelina INRA en alguna fase. La preparacin no es recomendable como un agente de diagnstico para animales individuales, pero puede ser til para el anlisis de poblaciones. Se suministra a los pequeos rumiantes en

Se puede obtener del Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Laboratoire de Pathologie Infectieuse et Immunologie, 37380 Nouzilly, Francia.

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dosis de 100 g por va intradrmica e induce una reaccin local de hipersensibilidad retardada que es visible a las 4872 horas en animales sensibilizados. Tanto los animales vacunados como los infectados dan reacciones positivas (78).

2.

Mtodo de produccin (2)

Las clulas de la cepa B115 de Brucella melitensis se inactivan despus del cultivo elevando la temperatura a 70C durante 90 minutos, se enfran a 4C, y se recogen por centrifugacin a 9.000 g durante 15 minutos a 4C. Las clulas se lavan con agua destilada estril y fra y se deshidratan precipitndolas con tres volmenes de acetona a 20C, y luego se deja reposar a 20C durante 2448 horas. Despus de lavados repetidos con acetona fra y de un lavado final con dietil ter, las clulas se secan sobre cloruro clcico y se mantienen a 4C. Las clulas secas se someten a una prueba de viabilidad. Se resuspenden en cloruro sdico estril al 2,5% hasta una concentracin final del 5% (p/v) y se agitan durante 3 das a 4C. Las clulas bacterianas se eliminan mediante centrifugacin como se ha descrito con anterioridad y el sobrenadante se concentra a un cuarto de su volumen mediante ultrafiltracin con una membrana Diaflo PM10 (Amicon) y se precipita aadiendo tres volmenes de etanol fro. La mezcla se mantiene a 4C durante 24 horas y el precipitado se centrifuga y el concentrado se redisuelve en agua destilada y se dializa para eliminar el etanol. Despus de centrifugar a 105.000 g durante 6 horas a 4C, el sobrenadante, que es la brucelina sin estandarizar, se determinan mediante anlisis sus protenas y carbohidratos. Puede liofilizarse en su totalidad o despus de distribuirla en sus envases.

3.

Control del proceso

Debe comprobarse la esterilidad del extracto crudo de brucelina despus de su extraccin con acetona para comprobar la inactivacin de las clulas de Brucella, y una vez ms al final del proceso, a fin de comprobar una posible contaminacin. Deben determinarse el pH y la concentracin de protena y realizarse pruebas de identidad en la totalidad del material obtenido antes de proceder al llenado de los envases.

4.
a)

Control de lotes
Esterilidad
La esterilidad de las preparaciones de alrgenos debe comprobarse como se describe en el captulo 1.1.9.

b)

Inocuidad
Las muestras de brucelina en sus recipientes finales deben someterse a la prueba estndar de esterilidad y tambin deben comprobarse la toxicidad anormal de las preparaciones. Se inyectan intraperitonealmente dosis equivalentes a 20 dosis de ganado (2 ml) en un par de cobayas normales que no se hayan expuesto con anterioridad a Brucella o a sus antgenos. Tambin se inyectan subcutneamente cinco ratones normales con 0, 5 ml de brucelina examinada. Los animales se observan durante 7 das y no debe haber reaccin local o generalizada a la inyeccin. La capacidad dermonecrtica se examina mediante la inoculacin intradrmica de 0,1 ml del producto examinado en el costado previamente afeitado y desinfectado de tres cobayas albinos normales que no se hayan expuesto con anterioridad a Brucella o a sus antgenos. No debe observarse reaccin cutnea alguna. La ausencia de sensibilizacin alrgica o serolgica se comprueba mediante la inoculacin intradrmica de tres cobayas albinos normales, tres veces cada 5 das, con 0,1 ml de una dilucin al 1/10 de la preparacin examinada. Se suministra una inyeccin similar 15 das despus a los mismos tres animales y a un lote control de tres cobayas del mismo peso que no se hayan inyectado previamente. Los animales no deben convertirse en seropositivos cuando se examinan 24 horas despus de la ltima inoculacin por las pruebas estndar de brucelosis (RBT, FC) ni deben desarrollar respuestas de hipersensibilidad retardada.

c)

Potencia
La potencia de las preparaciones de brucelina se determina mediante la inyeccin intradrmica de dosis graduales de brucelina en cobayas que se han sensibilizado con inoculacin subcutnea con 0,5 ml de brucelina de referencia7 con adyuvante completo de Freund de 1 a 6 meses antes. Se determina y mide la reaccin eritematosa a las 24 horas y se calcula el ttulo por comparacin con una brucelina de referencia8. Este mtodo solo es vlido para comparar preparaciones de brucelina obtenidas por el mismo protocolo que

7 8

Se ha producido por el INRA-PII (F-37380 Nouzilly, Francia) una brucelina de referencia nacional que puede obtenerse del Laboratorio de Referencia de la OIE para la Brucelosis, AFSSA, 23 avenue du Gnral-de-Gaulle, 94706 MaisonsAlfort Cedex, France. El procedimiento estadstico puede obtenerse del Laboratorio de Referencia de la OIE para Brucelosis, AFSSA, BP67, 94706 Maisons-Alfort Cedex, France.

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Captulo 2.4.3. Brucelosis bovina


el alrgeno sensibilizante. Se ha descrito la estandarizacin inicial de un lote de alrgeno y la sensibilizacin y titulacin en rumiantes (2).

d)

Duracin de la sensibilidad
La duracin de la sensibilidad es dudosa. El grado de hipesensibilidad a la brucelina de los animales vara individualmente de forma considerable. Los animales en la fase inicial de la infeccin, o con infecciones crnicas, pueden no manifestar hipersensibilidad a la inyeccin intradrmica.

e)

Estabilidad
La preparacin liofilizada mantiene ntegramente su actividad durante varios aos. La preparacin comercial lquida debe mantener su potencia hasta la caducidad recomendada.

f)

Conservantes
No se recomienda el uso de conservantes en las preparaciones liofilizadas. En la forma lquida, se puede utilizar mertiolato sdico como conservante (mximo 0,1 mg/ml). Si la preparacin est liofilizada no debe reconstituirse hasta inmediatamente antes de su uso.

g)

Precauciones (riesgos)
La brucelina no es txica. Sin embargo, puede provocar reacciones graves de hipersensibilidad en individuos sensibilizados que se exponen accidentalmente a ella. Debe tenerse cuidado en evitar la inyeccin accidental o la contaminacin de las mucosas. El equipo de inyeccin utilizado y los recipientes deben descontaminarse cuidadosamente o eliminarse por incineracin en contenedores adecuados de desecho.

5.
a)

Pruebas sobre el producto final


Inocuidad
La prueba de la esterilidad se debe llevar a cabo por el mtodo recomendado. Las pruebas de seguridad in vivo son las descritas para el control de los lotes (vase la seccin C1.4.b.). Estas pruebas pueden omitirse en el lote si se realiza la prueba completa en los lotes finales de llenado.

b)

Potencia
Se realiza por inyeccin de una nica dosis en cobayas segn el procedimiento descrito en la seccin C1.4.c.

C2. Vacunas Vacuna con la cepa 19 de Brucella abortus


La vacuna ms ampliamente utilizada para prevenir la brucelosis en el ganado vacuno es la vacuna con la cepa S19 de B. abortus, que contina siendo la vacuna de referencia con la que se compara el resto de las vacunas. Se utiliza como una vacuna viva que por lo general se suministra a terneras entre 3 y 6 meses como una dosis nica subcutnea de 58 1010 microorganismos viables. Se puede administrar al ganado adulto una dosis reducida de 3 108 a 3 109 microorganismos, pero algunos animales desarrollan ttulos duraderos de anticuerpos y pueden abortar y excretar la cepa vacunal por la leche (84). Alternativamente, se puede administrar a ganado de cualquier edad en dos dosis de 510 109 microorganismos viables por va conjuntival; esto produce proteccin sin una respuesta duradera de anticuerpos y reduce los riesgos de aborto y de la excrecin en la leche. La vacuna con B. abortus S19 induce una buena inmunidad frente a desafos moderados por microorganismos virulentos. La vacuna debe prepararse a partir de inculos derivados del USDA (para direccin, ver nota 2 a pie de pgina) y cada lote ha de probarse para pureza (ausencia de microorganismos extraos), viabilidad (bacterias vivas por dosis) y homogeneidad (determinacin de la fase de disociacin). La virulencia residual y la inmunogenicidad de los lotes de inculo para la produccin de vacuna S19 deben comprobarse regularmente en ratones. Los procedimientos de control para esta vacuna se indican ms adelante.

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Vacuna con la cepa RB51 de Brucella abortus


Desde 1996 la cepa RB51 de B. abortus es la vacuna oficial en muchos pases para la prevencin de la brucelosis en el ganado vacuno (82). Sin embargo, la eficacia de la cepa RB51 en comparacin con la proteccin inducida por la S19 en el ganado vacuno, es motivo de controversia (55, 56, 84, 85, 87). Cada pas utiliza mtodos ligeramente diferentes de administrar la vacuna. En EE.UU. los terneros se vacunan subcutneamente entre los 4 y 12 meses con 13,4 1010 microorganismos viables de la cepa RB51. La vacunacin del ganado con mayor edad solo se hace bajo autorizacin de organizaciones estatales o federales de Sanidad animal y la dosis recomendada es de 13 109 microorganismos viables de la cepa RB51 (70, 86). En otros pases se recomienda la vacunacin de terneros (412 meses) con dosis de 13,4 1010, y la revacunacin de 12 meses en adelante con una dosis similar para inducir un efecto de recuerdo y aumentar la inmunidad (79, 82). Pueden ocurrir abortos cuando se utiliza la S19 en animales preados (52, 58). Tal como se ha demostrado en estudios realizados en EE.UU, la vacunacin de los adultos con 109 UFC (unidades formadoras de colonias) de RB51 no se ha asociado con notificaciones de incrementos significativos de abortos en las condiciones de campo (71). Tanto la RB51 como la S19 se han aislado de la leche de los vacunados despus de la vacunacin de los adultos (58, 72, 73, 79). En amplios estudios de tipo comparativo sobre las vacunas con S19 y RB51, cuando los terneros vacunados con S19 fueron vacunados como adultos con RB51, un mayor porcentaje de los vacunados con S19 eliminaron la cepa vacunal en la leche por un tiempo superior al del ganado vacuno vacunado con RB51 (71, 73, 79). El uso de S19 como vacuna de adultos en los rebaos infectados por Brucella ha facilitado la disminucin de los abortos en los rebaos de ganado vacuno con infeccin aguda aunque no crnica (6), No existen informes sobre datos epidemiolgicos semejantes relativos a la vacunacin de adultos con RB51. En base a estas observaciones, debera aplicarse con prudencia la vacunacin de vacas preadas con S19 o RB51. Debe destacarse que la S19 puede infectar al hombre y causar fiebre ondulante si no se trata (95). Se han realizado estudios parciales con la RB51 en humanos, pero parece que, en comparacin con la S19, el riesgo de padecer fiebre ondulante despus de la exposicin es mnima (5, 86, 91). El diagnstico de la infeccin por RB51 requiere pruebas especiales que no estn disponibles en la mayora de los hospitales. Los Centros para el Control de Enfermedades, del Departamento de Salud y Servicios Humanos, en Atlanta, Georgia, EE.UU. (CDC), establecieron una vigilancia pasiva sobre la inoculacin accidental con la vacuna RB51 en EE.UU. para determinar si la vacuna produce enfermedad en el hombre. Este estudio incluy 26 participantes expuestos a la vacuna durante la vacunacin de animales. El nmero de casos descritos de pacientes en este estudio (veinte y seis) es pequeo comparado con el nmero de vacunaciones (varios millones de terneros vacunados) y con las predicciones estimadas de inoculaciones fortuitas con la cepa RB51 (8 por 11.000). El estudio indicaba que un uso apropiado de antibiticos protega contra la infeccin pero no ha quedado determinado hasta qu punto otros componentes de la vacuna contribuyen a los efectos adversos (60). Esto contrasta con la cepa 19, donde est bien documentado que se desarrolla la fiebre ondulante por exposicin accidental sin tratamiento preventivo. Debera informarse a los facultativos que toman decisiones respecto al tratamiento profilctico por una exposicin accidental a la RB51 que la cepa de esta vacuna es muy resistente a la rifampicina, uno de los antibiticos de eleccin para el tratamiento de la brucelosis en los humanos. Los procedimientos de control para esta vacuna se indican ms adelante.

Vacuna con la cepa Rev.1 de Brucella melitensis


Es frecuente aislar B. melitensis en ganado vacuno en pases con una elevada prevalencia de esta infeccin en pequeos rumiantes (90). Ha habido cierto debate sobre la eficacia protectora de la cepa S19 en infecciones por B. melitensis en el ganado vacuno y se ha supuesto que la Rev.1 debera ser una vacuna ms eficaz en estas condiciones. Sin embargo solo hay un solo trabajo sobre esta materia que demuestra que S19 es capaz de controlar B. melitensis en condiciones de campo (42, 88). En contraste, no se han realizado experimentos sobre la eficacia de Rev.1 en la infeccin del ganado vacuno por B. melitensis. Adems, la seguridad de esta vacuna es prcticamente desconocida en este ganado (8, 90). Hasta que se realicen estudios sobre la seguridad y eficacia de Rev.1 contra B. melitensis en el ganado vacuno a diferentes condiciones fisiolgicas y bajo situaciones estrictamente controladas, esta vacuna no debera recomendarse para esta especie.s

1.
a)

Control de inculos
Caractersticas del inculo
El inculo original de B. abortus S19 para producir vacunas debe obtenerse del USDA (para direccin, ver nota 2 a pie de pgina) y utilizarse para producir un lote de inculos conservado por liofilizacin o por congelacin en nitrgeno lquido. Las propiedades de este lote de inculos deben ser las de un cultivo puro

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de B. abortus biovariedad 1 no dependiente de CO2, que sea sensible a la bencilpenicilina, azul de tionina e i-eritritol a las concentraciones recomendadas, y que tenga una patogenicidad mnima en cobayas. El inculo original de B. abortus RB51 est comercializado9. Estas compaas tienen los derechos legales de la vacuna.

b)

Mtodo de cultivo
Para producir la vacuna de cepa S19 de B. abortus se cultiva en un medio libre de suero o de otros productos animales, bajo condiciones similares a las descritas antes para las cepas S99 S1119-3 de B. abortus (2). La cepa RB51 de B. abortus sigue mtodos similares de cultivo.

c)

Validacin como vacuna


Muchos estudios independientes han confirmado el valor de la cepa S19 como vacuna que protege al ganado vacuno de la brucelosis. El microorganismo se comporta como una cepa atenuada cuando se suministra a ganado sexualmente inmaduro. En casos raros puede producir una infeccin localizada en el tracto genital. Con adultos, es probable que se produzca una respuesta persistente de anticuerpos durante 6 meses o ms en una proporcin notable del ganado vacunado subcutneamente con la dosis estndar. Parte del ganado vacunado como terneros puede desarrollar ms tarde artropata, particularmente en las articulaciones de la tibia y el fmur (10, 22). La vacuna es segura para la mayora de los animales si se administra a terneros entre 3 y 8 meses de edad. Puede utilizarse tambin en animales adultos con dosis reducida. Produce una inmunidad duradera para un desafo moderado con cepas virulentas de B. abortus, pero su duracin exacta es desconocida. La duracin de la proteccin frente a B. melitensis es tambin desconocida. La cepa vacunal es estable y su reversin a la forma virulenta es extremadamente rara. Cuando se administra involuntariamente a animales grvidos se ha asociado con la aparicin de cepas que utilizan i-eritritol. El microorganismo se comporta como una cepa atenuada para ratones, e incluso los grandes inculos desaparecen rpidamente de los tejidos. Estudios sobre desafos experimentales y desafos realizados en condiciones de campo destacan el valor de la cepa RB51 de B. abortus en la proteccin del ganado frente a la brucelosis. El microorganismo es atenuado en terneros y en adultos. Como esta cepa expresa niveles mnimos de sLPS no se produce seroconversin frente a sLPS en animales vacunados. Adems, la cepa RB51 no induce anticuerpos detectables contra el antgeno OPS utilizando los procedimientos actuales de prueba (86). Produce inmunidad a desafos moderados de cepas virulentas, pero se desconoce su duracin exacta. La vacuna es estable y no revierte de fase in vivo ni in vitro. El microorganismo se comporta como una cepa atenuada en varios tipos de animales, como en ratones, y desaparece rpidamente de los tejidos. Las vacunas de capas S19 y RB51 tienen cierta virulencia para el hombre, y pueden producirse infecciones accidentales. Se debe tener cuidado en su preparacin y manejo, as como incluir un aviso de riesgo en la etiqueta de los recipientes finales. En cualquier caso, las inoculaciones accidentales deben tratarse con los antibiticos apropiados (vase la seccin C2.4.g.).

2.

Mtodo de produccin

Para la produccin de la vacuna S19 se pueden utilizar los procedimientos descritos anteriormente, excepto que las clulas se recogen en PBS, pH 6,3, y se depositan por centrifugacin o aadiendo carboximetil celulosa sdica a una concentracin final de 1,5 g/litro. El producto obtenido de un fermentador o las clulas agrupadas de un lote de cultivos en frascos de Roux que se hayan inoculado al mismo tiempo y con el mismo lote de inculo constituye una cosecha individual. Se puede juntar ms de un lote para formar la masa final que se utiliza para llenar los recipientes terminales de un lote de vacuna. Antes de mezclarlas, en cada lote individual se ha de comprueba la pureza, concentracin celular, disociacin e identidad. Deben hacerse las mismas pruebas en el producto final, que debe tener un nmero de microorganismos viables comprendido entre 8 y 24 109 UFC/ml. Los ajustes de concentracin se hacen aadiendo PBS a la vacuna presentada en forma lquida o un estabilizador a la forma liofilizada. Si se emplea un estabilizador debe tenerse en cuenta la prdida de viabilidad en la liofilizacin, y no debe superar el 50%. El producto final desecado no debe someterse a temperaturas superiores a 35C durante el secado y el contenido en humedad residual debe ser el 12%. Los envases deben cerrarse al vaco o en nitrgeno seco inmediatamente despus del secado, y han de mantenerse a 4C. El proceso de produccin para la cepa BR51 de B. abortus es muy similar al utilizado para la S19.
9 Colorado Serum Company, 4950 York Street, P.O. Box 16428, Denver, Colorado 80216-0428, EE.UU.; o Veterinary Technologies Corporation, 1872 Pratt Drive, Suite 1100B, Blacksburg, Virginia 24060, EE.UU.

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3.

Control del proceso

La pureza y la fase lisa de la vacuna con B. abortus S19 debe comprobarse durante la preparacin de cada cosecha individual. Tambin debe comprobarse la concentracin celular, que puede realizarse mediante medidas de opacidad, pero en los lotes finales de llenado debe realizarse una determinacin de microorganismos viables. Tambin debe comprobarse su identidad mediante pruebas de aglutinacin con antisuero contra el antgeno A de Brucella. La concentracin de microorganismos viables en los recipientes finales no debe ser inferior a 50 109 por cada dosis estndar despus de la liofilizacin y al menos el 95% de las clulas deben estar en la fase lisa. La pureza y le fase rugosa de la vacuna con cepa RB51 de B. abortus debe probarse durante la preparacin de cada cosecha individual. Tambin debe comprobarse la concentracin celular. En los lotes finales de llenado debe realizarse una determinacin de microorganismos viables. Su concentracin en los recipientes finales debe ser de 13,4 1010 UFC por dosis (dosis de 2 ml aplicadas subcutneamente) y el 100% de las clulas deben estar en fase rugosa. Todas las colonias deben ser negativas en pruebas puntuales con MAb especficos para el antgeno OPS.

4.
a)

Control de lotes
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin en los materiales biolgicos se encuentran en el captulo 1.1.5.

b)

Inocuidad
La vacuna S19 es per se un producto virulento y debe mantenerse con mnima virulencia para que sea eficaz (vase la seccin C2.4.c.). Sin embargo, no se realiza rutinariamente una prueba de inocuidad. Si se desea, puede realizarse en ganado cuando se inicia un nuevo proceso de fabricacin o cuando se espera alguna modificacin de la seguridad de la vacuna. Este control debe realizarse como sigue: la prueba utiliza 12 terneras de 46 meses. Seis de las hembras se inyectan con una o con tres dosis recomendadas. Cada lote de seis terneras se mantiene por separado y se observan durante 21 das. No deben producirse lesiones locales o sistmicas significativas. Si para una dosis y una va de administracin dadas la prueba da buenos resultados para un lote representativo de vacuna, no tiene que repetirse con lotes de inculo o de vacuna preparados con el mismo inculo original y con el mismo proceso de fabricacin. Tambin debe realizarse una prueba de seguridad de la vacuna S19 en cobayas. A grupos de 10 animales como mnimo se inyectan por va intramuscular dosis de vacuna diluida en PBS, pH 7,2, que contengan 5 109 microorganismos viables. Los animales no deben mostrar signos nocivos ni debe haber mortalidad. Normalmente, no se realizan pruebas de inocuidad con la vacuna de la cepa RB51 de B. abortus. Si se desea, se pueden inyectar intraperitonealmente ratones Balb/c hembras de 810 semanas con 1 108 UFC y se cultivan los bazos a las 6 semanas post-inoculacin. Los bazos deben estar libres de la cepa RB51 y los ratones no deben desarrollar anticuerpos anti-OPS.

c)

Potencia Vacuna S19


Una vacuna S19 es eficaz si posee las caractersticas de la cepa original S19, es decir, si es satisfactoria respecto a su identidad, fase lisa, inmunogenicidad y virulencia residual (9). En los lotes debe comprobarse tambin el nmero de microorganismos viables. Identidad La vacuna de cepa S19 reconstituida no debe contener microorganismos exgenos. La B. abortus presente en la vacuna se identifica por pruebas morfolgicas, serolgicas y bioqumicas adecuadas y por cultivo: B. abortus S19 tiene las propiedades normales de una cepa de B. abortus biovariedad 1 pero no requiere CO2 para crecer, ni crece en presencia de bencilpenicilina (3 g/ml = 5 UI/ml), azul de tionina (2 g/ml) o i-eritritol (1 mg/ml) (concentraciones finales). Fase lisa (determinacin de la fase de disociacin) La vacuna S19 reconstituida en agua destilada se siembra en estra en seis placas con medio slido (agar suero-dextrosa o agar tripticasa-soja (TSA) con 5% [v/v] de suero o 0,1% [p/v] de extracto de levadura) de modo que las colonias estn juntas en algunas zonas mientras que en otras estn semiseparadas y en otras separadas. Las pequeas diferencias son ms obvias en las colonias adyacentes que en las separadas. Las placas se incuban a 37C durante 5 das y se examinan con luz

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reflejada oblicua (mtodo de Henry) antes y despus de teir (tres placas) con cristal violeta (mtodo de tincin de White & Wilson). Adems la S19 es sensible a la rifampicina. Apariencia de las colonias antes de teir: Las colonias de tipo S aparecen redondas, brillantes y de color azul a verde-azulado. Las colonias R tienen un aspecto seco, granular y son de color blanco amarillento. Las colonias mucoides (M) son transparentes y grisceas y pueden distinguirse por su consistencia pegajosa cuando se las toca con un asa de siembra. Las colonias intermedias (I) son las ms difciles de clasificar y tienen una apariencia intermedia entre las formas S y R: son ligeramente opacas y ms granulares que las colonias S. Apariencia de las colonias despus de teir con cristal violeta: Las colonias S no toman el colorante. Las colonias disociadas (I, M o R) se tien en varios tonos de rojizo a prpura y su superficie puede mostrar grietas radiales. A veces se observa un film superficial teido que se despega de una colonia disociada y aparece adyacente a ella. La fase de la colonia puede confirmarse mediante la prueba de aglutinacin con acriflavina (2): Las colonias S permanecen en suspensin mientras que las R aglutinan rpidamente y, si son mucoides, forman tiras. Las colonias intermedias pueden quedar en suspensin o formar una aglutinacin muy fina. Determinacin de bacterias vivas Se siembran al menos cinco placas de agar triptosa, de agar suero-dextrosa o de cualquier otro medio slido adecuado con 0,1 ml de diluciones apropiadas de la vacuna que se extienden con un asa de vidrio, metal o plstico. Se lleva a cabo un recuento de las UFC por unidad de volumen de la vacuna. i) Virulencia residual (tiempo de persistencia al 50% o tiempo de recuperacin al 50%) (9, 24, 37, 75) Preparar suspensiones adecuadas del lote de siembra o de vacuna de cepa S19 de B. abortus que se vaya a probar (vacuna problema) y del cultivo original de inculo de S19 (como cepa de referencia). Para esto, se recoge un cultivo de 2448 horas de cada cepa en solucin salina estril tamponada (BSS: NaCl 8,5 g; KH2PO4 1,0 g; K2HPO4 2,0 g; agua destilada 1000 ml; pH 6,8) y se ajusta la suspensin con BSS a 109 UFC/ml con un espectrofotmetro (OD = 0,170 cuando se lee a 600 nm). El nmero exacto de UFC/ml se determina despus mediante la siembra en placa de las diluciones decimales sobre un medio adecuado (se recomienda agar sangre o TSA). ii) Inyectar subcutneamente 0,1 ml (108 UFC/ratn) de la suspensin de la vacuna problema en cada una de 32 hembras de ratn CD1 de 56 semanas. En paralelo se realiza una inoculacin similar en otros 32 ratones con la suspensin que contiene la cepa de referencia S19. La cepa S19 original de siembra, cuya inmunogenicidad y virulencia residual sea satisfactoria, se puede obtener del USDA (para direccin ver nota 2 a pie de pgina). A las 3, 6, 9 y 12 semanas, sacrificar los ratones por dislocacin cervical, en grupos de ocho elegidos al azar. Extraer los bazos y homogenizarlos asptica e individualmente en 1 ml de BSS estril con un desintegrador de vidrio (o con un Stomacher en bolsas estriles adecuadas). Extender en cada caso toda la suspensin completa de bazo sobre varias placas con un medio apropiado de cultivo e incubar en condiciones estndar para Brucella durante 57 das (lmite inferior de deteccin: 1 bacteria por bazo). Un animal se considera infectado cuando se asla al menos 1 UFC del bazo. Calcular el tiempo de persistencia al 50% o el tiempo de recuperacin al 50% (RT50) por el mtodo estadstico SAS, desarrollado especficamente para calcular RT50 (para obtener el SAS especfico, ver la direccin en la nota 5 a pie de pgina). Para esto se determina el nmero de ratones curados (sin colonias aisladas en el bazo) a cada punto temporal de sacrificio (ocho ratones por punto) y se calcula el porcentaje acumulado de ratones curados con el tiempo por el mtodo de Reed y Muench (descrito en la ref. 7). La funcin de distribucin de este porcentaje describe una curva sigmoidal que debe linearizarse para calcular los valores RT50, mediante el procedimiento computarizado PROBIT en el sistema estadstico SAS. vii) Comparar estadsticamente el paralelismo (corte y pendiente) existente entre las lneas de distribucin obtenidas para la cepa problema y para la cepa S19 de referencia, utilizando el SAS diseado para este propsito. Se pueden comparar estadsticamente dos valores RT50 solo cuando derivan de lneas de distribucin paralelas. Si no existe paralelismo, la virulencia residual de la cepa problema se considera inadecuada y se rechaza.

iii) iv) v)

vi)

viii) Si se confirma el paralelismo, comparar estadsticamente los valores RT50 obtenidos para la cepa problema y de referencia utilizando el SAS diseado para este propsito. Para ser aceptable para la produccin de vacunas, el RT50 obtenido con la cepa problema no debe diferir significativamente del

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obtenido con la cepa de referencia S19 (RT50 y los lmites de confidencia son normalmente 7,0 1,3 semanas). Las bases del procedimiento estadstico para el clculo anterior de la virulencia residual se han descrito recientemente con detalle (7, 9). Alternativamente, los clculos estadsticos descritos en los pasos vi) a viii) se pueden evitar con un programa especfico de fcil empleo HTML-JAVA (Rev2) recientemente desarrollado y disponible sin coste alguno en la direccin: http://www.afssa.fr/interne/Rev2.html. Si la prueba se realiza con buenos resultados en un lote representativo de inculo o de vacuna problema, no tiene que repetirse rutinariamente con otros lotes de vacuna preparados del mismo lote de inculo y utilizando el mismo proceso de produccin. Inmunogenicidad en ratn (7, 8)

Esta prueba utiliza tres grupos de seis ratones CD1 hembras, de 57 semanas, que se eligen al azar. i) ii) iii) Preparar y ajustar espectrofotomtricamente las suspensiones de vacuna como se indic anteriormente. Inyectar subcutneamente una suspensin de la vacuna examinada (vacuna problema) que contenga 105 UFC (en un volumen de 0,1 ml/ratn) a cada uno de los seis ratones del primer grupo. Inyectar subcutneamente una suspensin de la vacuna de referencia S19 que contenga 105 UFC de bacterias vivas en cada uno de los seis ratones del segundo grupo. El tercer grupo sirve como grupo control sin vacunar y se inocula subcutneamente con 0,1 ml de BSS. El nmero exacto de UFC inoculado se comprueba despus por siembra en placa de diluciones decimales sobre un medio adecuado (se recomienda agar sangre o TSA). 30 das despus de la vacunacin (e inmediatamente despus de 16 horas de ayuno) todos los ratones se someten a una inoculacin intraperitoneal de desafo con una suspensin (0,1 ml/ratn) que contenga 2 105 UFC de la cepa 544 de B. abortus (dependiente de CO2), preparada, ajustada y comprobada como antes. Sacrificar los ratones 15 das ms tarde por dislocacin cervical. Cada bazo se corta aspticamente, se elimina la grasa, y se pesa y homogeniza. Alternativamente, los bazos pueden congelarse y mantenerse a 20C de 24 horas a 7 semanas.

iv) v)

vi) vii)

viii) Cada bazo se homogeniza aspticamente con un desintegrador de vidrio (o con un Stomacher en sacos estriles adecuados) en nueve veces su peso con BSS, pH 6,8, y de cada homogenizado se hacen tres diluciones decimales seriadas (1/10, 1/100 y 1/1.000) en el mismo diluyente. Por cuadruplicado, se extienden 0,2 ml en placas con medio slido y se incuban dos placas a 37C durante 5 das en atmsfera con un 10% de CO2 (permite el crecimiento de la cepa vacunal y la desafo) y otras dos placas en atmsfera normal (se inhibe el crecimiento de la cepa de desafo B. abortus 544 que es dependiente de CO2). ix) Se cuentan las colonias de Brucella en las placas que contengan menos de 300 UFC. Cuando no se cuentan colonias en la placa de la dilucin 1/10, se considera que el bazo est infectado con cinco bacterias. Este nmero de Brucella por bazo se anota como X y se expresa como Y, despus de hacer la siguiente transformacin: Y = log (X/log X). Se calcula la respuesta de cada grupo de seis ratones como media y desviacin estndar. Las condiciones del experimento son adecuadas cuando: i) la respuesta de los ratones no vacunados (media de Y) es por lo menos 4,5; ii) la respuesta de los ratones vacunados con la vacuna S19 de referencia es menor de 2,5; y iii) la desviacin estndar calculada en cada lote de seis ratones es inferior a 0,8. Se realizan comparaciones estadsticas (se recomienda la prueba de diferencias menos significativas [LSD]) de los valores de inmunogenicidad obtenidos en los ratones vacunados con la cepa S19 que se prueba respecto a los obtenidos en los ratones vacunados con la vacuna de referencia y el grupo control no vacunado. La vacuna problema es apta si el valor de inmunogenicidad obtenido en ratones vacunados es notablemente inferior al obtenido en los controles sin vacunar y si, adems, no difiere significativamente del obtenido en ratones vacunados con la vacuna de referencia. (Para una informacin detallada de este procedimiento, ver la nota 5 a pie de pgina con la direccin de contacto).

x)

xi)

Si esta prueba se realiza con buenos resultados en un lote representativo de vacuna problema, no tiene que repetirse rutinariamente con otros lotes de vacuna preparados del mismo lote de inculo y utilizando el mismo proceso de produccin.

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Vacuna RB51
Como la dosificacin (UFC) del inculo primario se correlacion con la proteccin como parte de la autorizacin de la RB51 para el ganado vacuno en EE.UU., las pruebas de potencia in vivo no se aplican de forma rutinaria para las series de vacunas con RB51. En EE.UU. se han aprobado y utilizado los recuentos de placas de microorganismos viables para medir la potencia (este enfoque es idntico al utilizado en las pruebas de potencia para la vacuna con S19 en EE.UU). Se ha propuesto una prueba con ratones Balb/c hembras utilizando 1 104 microorganismos de la cepa 2308 de B. abortus como cepa de desafo, pero la correlacin de la prueba con la proteccin de la vacuna en el ganado vacuno no est completamente determinada. En EE.UU. se ha aprobado y utilizado la determinacin en placa de microorganismos viables (85). Se ha discutido con bastante detalle sobre las vacunas rugosas para la brucelosis (55).

d)

Duracin de la inmunidad
Se considera que la vacunacin de los terneros con una dosis completa de vacuna S19 confiere inmunidad duradera, y no se recomiendan dosis posteriores. Sin embargo no existe evidencia probada de esto y en reas endmicas puede ser aconsejable la revacunacin.

e)

Estabilidad
La vacuna S19 de B. abortus preparada a partir de inculos de orgenes apropiados muestra unas caractersticas estables siempre que se cumplan los requisitos descritos anteriormente sobre el control del proceso y de los lotes, y no tiene tendencia a revertir a la virulenta. La vacuna liofilizada muestra una prdida gradual de microorganismos viables pero debe conservar su potencia hasta el el final del perodo de caducidad recomendado. En funcin de este fenmeno se establece un cierto margen de seguridad, de tal forma que el nmero de viables antes de la liofilizacin sea superior al mnimo exigido. El mantenimiento de la cadena de fro durante la distribucin de la vacuna asegura su viabilidad. La cepa RB51 de B. abortus no muestra tendencia a revertir a la fase lisa de Brucella virulenta despus de muchos pases in vivo o in vitro. Esto se debe probablemente a la naturaleza y localizacin de las mutaciones en esta cepa. La cepa RB51 de B. abortus tiene una disrupcin en el gen wboA debida a un elemento IS711 que impide la sntesis de OPS. Datos no publicados indican que tambin contiene una segunda mutacin que afecta al transporte de OPS a la superficie externa bacteriana o al acoplamiento de OPS con el ncleo del LPS, o a ambos procesos.

f)

Conservantes
En las vacunas vivas S19 o con la cepa RB51 de B. abortus no deben utilizarse conservantes antimicrobianos. Para la preparacin de la vacuna liofilizada se recomienda un estabilizador que contenga 2,5% de hidrolizado de casena, por ejemplo Triptona (Oxoid), un 5% de sacarosa y un 1% de glutamato sdico, disuelto en agua y esterilizado por filtracin.

g)

Precauciones (riesgos)
Aunque son cepas atenuadas, B. abortus S19 y RB51 son an capaces de causar enfermedad en el hombre. los cultivos celulares y las suspensiones deben manejarse bajo condiciones apropiadas de contencin para bioseguridad. La reconstitucin y el posterior manejo de las vacunas deben hacerse con cuidado para evitar una inyeccin accidental o la contaminacin de los ojos o la piel. Los residuos de vacuna y el equipo de inoculacin deben descontaminarse con un desinfectante adecuado (de tipo fenlico, iodforo o aldehdo) a la concentracin adecuada. En caso de exposicin accidental debe requerirse atencin mdica. No se ha establecido adecuadamente la eficacia del tratamiento antibitico de las infecciones causadas por las cepas S19 y RB51 en el hombre; sin embargo, el CDC suministra recomendaciones para el tratamiento. Si se produce contaminacin por la cepa S19, se recomienda un tratamiento combinado con doxiciclina y rifampicina. En caso de contaminacin con la RB51 (que es resistente a rifampicina) debe evitarse el tratamiento con rifampicina y debe utilizarse un rgimen de doxiciclina y estreptomicina o gentamicina, excepto en las mujeres embarazadas, que deben tratarse con trimetoprim sulfametoxazol. Sin embargo, existen estudios parciales sobre el tratamiento de los humanos expuestos a la RB51 (5) y ha habido al menos un informe de infeccin en humanos con RB-51. La cepa RB51 es muy susceptible a la tetraciclina y el tratamiento solo con doxiciclina puede ser satisfactorio (5).

5.
a)

Pruebas sobre el producto final


Inocuidad
Vase la seccin C2.4.b.

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b)

Potencia
Para la vacuna liofilizada, la potencia debe determinarse en el producto final. El procedimiento es como el descrito en la seccin C2.4.c.

REFERENCIAS
1. ADONE R. & CIUGHINI F. (1999). Complement fixation test to assess humoral immunity in cattle and sheep vaccinated with Brucella abortus RB51. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 56, 787790. ALTON G.G., JONES L.M., ANGUS R.D. & VERGER J.M. (1988). Techniques for the Brucellosis Laboratory. Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, France. ANGUS R.D. & BARTON C.E. (1984). The production and e valuation of a buffered plate antigen for use in a presumptive test for brucellosis. Dev. Biol. Stand., 56, 349356. ASARTA A. (1989). Erradicacin de la brucelosis en el ganado vacuno de Navarra. En: Actas del XII Congreso Nacional de Microbiologa.Sociedad Espaola de Microbiologa (Ed.), SEM, Pamplona, 371371. Ashford D.A., Di Pietra J., Lingappa J., Woods C., Noll H., Neville B., Weyant R., Bragg S.L., Spiegel R.A., Tapperrro J. & Perkins B.A. (2004). Adverse events in humans associated with accidental exposure to the livestock brucellosis vaccine RB51. Vaccine, 22, 34353439. BARTON C.E. & LOMME J.R. (1980). Reduced-dose whole herd vaccination against brucellosis: A review of recent experience. J. Am. Vet. Med. Assoc., 177, 12181220. BONET-MAURY P., JUDE A. & SERVANT P. (1954). La mesure statistique de la virulence et limmunit. Application letude de la virulence du bacille typhique et la mesure du pouvoir immunisant des vaccins antityphoidiques. Rev. d'Immun. Th. Antimic., 18, 2149. BOSSERAY N. (1992). Le vaccin Rev.1: drive des caractres dimmunognicit et de virulence indpendante des marqueurs classiques. In: Prevention of Brucellosis in the Mediterranean Countries, Plommet M., ed. Pudoc Scientific, Wageningen, The Netherlands, 182186. BOSSERAY N. (1993). Control methods and thresholds of acceptability for anti-Brucella vaccines. Dev. Biol. Stand., 79, 121128.

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