PRCTICA 5

AISLAMIENTO Y CONTEO DE MICROORGANISMOS.

ANTECEDENTES
Los microorganismos estn presentes en todos los hbitats incluyendo el suelo. Podemos encontrar tanto bacterias como hongos y levaduras. Se ha definido que solamente el 10 % de estos microorganismos se pueden cultivar en el laboratorio. Para realizar el conteo de microorganismo se pueden utilizar diferentes mtodos de conteo de clulas totales o recuento de clulas viables, entre los que se incluye el mtodo de recuento en placa. Con este mtodo se cuentan las Unidades Formadoras de Colonias cada una de las cuales proviene de un nico microorganismo presente en la muestra original. Si se desconoce la concentracin aproximada de UFC presentes en la muestra se aconseja realizar diluciones seriadas para obtener un conteo estadsticamente confiable.

METODOLOGA
Para la realizacin de la presente prctica se requieren los siguientes materiales, equipos, reactivos y medios de cultivo: Material 5 Tubos estriles con tapa de rosca 5 Cajas Petri de vidrio 2 Pipetas graduadas de 10 ml 10 Pipetas graduadas de 1 ml 10 Puntas de 1 ml 1 Matraz Erlenmeyer de 250 ml 1 Matraz Aforado de 50 ml 1 Propipeta 1 Gradilla para tubos 1 Asa de vidrio 3 Vasos de precipitados de 50 ml 1 Mechero 1 Potencimetro 1 Piceta para agua destilada 1 Piceta para alcohol etlico 1 Matraz Erlenmeyer de 250 ml 1 Probeta de 100 ml 1 Esptula Algodn Industrial Manta de cielo Papel estraza Equipo Olla de presin. Autoclave Incubadora Vortex Balanza Analtica Micropipeta Reactivos y medios de cultivo Peptona Cloruro de Sodio Agar Cuenta Estndar Agar Papa Dextrosa Agua Destilada Alcohol etlico al 70% Soluciones reguladoras pH 4 y pH 7 Material Biolgico. 1 g de suelo de la UPP

PROCEDIMIENTO
1. Preparar 50 ml Agua Peptonada (Peptona 1 g/l, NaCl 8.5 g/l, pH 7). 2. Agregar 9 ml de Agua Peptonada en cada uno de los 5 tubos con tapa de rosca. 3. Preparar 100 ml de Agar Cuenta Estndar, y de PDA tal y como indica el proveedor. 4. Esterilizar en olla de presin o autoclave, a 1 atm, durante 15 minutos, los tubos con Agua Peptonada, el Agar Cuenta Estndar, las pipetas de 1 ml, las puntas y las cajas Petri. 5. Una vez esterilizados los medios de cultivo colocar un antibitico y un antimictico segn sea el caso y as inhibir el crecimiento de microorganismos no deseados. 6. Vaciar el Agar Cuenta Estndar as como el PDA, en las cajas esterilizadas. 7. Realizar las diluciones seriadas: tomar 1 g de suelo y aadirlo a 1 de los tubos con
-1

Agua Peptonada, sta ser la dilucin 10 ; homogeneizar bien la solucin, tomar 1 ml y

-2

adicionarlo a otro tubo con Agua Peptonada, sta ser la dilucin 10 . Y as

-5

sucesivamente, hasta obtener la dilucin 10 (ver Figura 1). Utilizar en todo momento, pipetas estriles y trabajar cerca del mechero en condiciones aspticas. 8. Pasar 500 l de cada una de las diluciones perfectamente homogneas a una caja Petri con Agar Cuenta Estndar. 9. Sumergir el asa de vidrio en etanol, flamear en el mechero, enfriar el asa y esparcir homogneamente los 500 l aadidos en toda la placa. Es importante realizar correctamente este paso para esparcir los microorganismo y que puedan ser contados (Figura 2). 10. Esperar a que la solucin aadida sea totalmente adsorbida en el medio de cultivo. Incubar las cajas volteadas a 30 durante 24 horas . C 11.Contar el nmero Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en cada una de las cajas. 12. Realizar los clculos de aquella caja donde el nmero de UFC est entre 20 y 200: UFC/volumen aadido a la placa (en ml): UFC/ml (UFC/ml) (1/dilucin)= UFC/g suelo 1 g suelo

Figura 1. Diluciones seriadas.

Figura 2. Mtodo de siembra por extensin

CUESTIONARIO
1. Con esta metodologa, se cuentan todos los microorganismos que estn presentes en el suelo? Justifique su respuesta. 2. Qu otras metodologas se pueden realizar para contar el nmero de microorganismos existentes en una muestra? 3. Cules son las ventajas y desventajas de realizar el mtodo de recuento en placa? 4. Por qu se utiliza Agua Peptonada y no Agua Destilada para hacer las diluciones?

OBSERVACIONES CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA