I.

INTRODUCCIN.

La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las investigaciones qumicas y biolgicas. El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo. La absorcin de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica. Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la energa radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas. La base de la espectrofotometra se centra en dos leyes principalmente: LEY DE BEER La Ley de Beer declara que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentracin en la solucin. Por ejemplo, en un vaso de vidrio tenemos agua con azcar diluida y en otro tenemos un vaso con la misma cantidad de agua pero con ms azcar diluida. El vaso es una celda fotoelctrica, y la solucin de azcar es la que se mide su concentracin. Segn la ley de Beer, si hiciramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldra del otro lado seria mayor que si repitiramos esto en el segundo; ya que en el segundo, las ondas

electromagnticas chocan contra un mayor nmero de tomos y/o molculas y son absorbidos por estos. LEY DE LAMBERT En la Ley de Lambert se dice que la cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida por la luz. Por ejemplo, retomando el ejemplo de los vasos, pero ahora, pensemos que ambos tiene la misma cantidad de agua y la misma concentracin de azcar, pero, el segundo tiene un dimetro mayor que el otro.

Segn la ley de Lambert, si hiciramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldra del otro lado seria mayor que si repitiramos esto en el segundo; ya que en el segundo, las ondas electromagnticas chocan contra un mayor nmero de tomos y/o molculas y son absorbidos por estos; de la misma forma que se explic en la ley de Beer. Un espectrmetro tpico posee cuatro componentes bsicos: una fuente de radiacin que tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda que cubre (usualmente es lmpara de tungsteno para luz visible, y deuterio para ultravioleta), un compartimiento para la muestra, un monocromador que separa la banda de longitud de onda deseada del resto del espectro y la dispersa al compartimiento de la muestra, y un fotodetector, que mide cuantitativamente la radiacin que pasa por la muestra.

II.

OBJETIVOS: 1 . Identificar los instrumentos y equipos que se utilizan en un laboratorio de Bio qumica. 2. Conocer el manejo de la Espectro fo to metra.

III. 3.1

MATERIAL Y PROCEDIMIENTO: Materiales y equipo s 3.1.1. Materiales: A. y y B. y C. y y y De vidrio : 10 tubos de ensayo 10x75 02 Pipetas 10 ml De po lipro pileno : 20 tips para m icro pipeta s Reactivo s: Azul de Metileno 0,1 mg/mL Safranina 0,1 m g/mL Agua destilada 500 mL

3.1.2. Equipos e instrumento s: y y 01 Espectro fo t metro Genesys 10 UV 02 Micropipetas: 100-1000 L / 10 - 100 L.

3.2

Pro cedimiento : 3.2.1. Espectro fo to metra: DETERMINACIN DE LOS ESPECTROS DE ABSORCIN: Segn la ta bla, determ inar los espectros de absorcin de cada una de las soluciones de colorantes (azul de metileno y safranina), leyendo las absorbancias en ca da una de las longitudes de onda del espectro fot metro , llevando el equipo a cero con agua destilada (ca librarlo ). Nuestro grupo trabajo con el reactivo: Safranina, el cual nos dio los siguientes datos:

Safranina 410 nm 460 nm 510 nm 560 nm 610 nm 660 nm 0,143 A 0,754 A 2,082 A 0,447 A 0,027 A 0,010 A

Con estos datos construir una grfica para cada espectro de abso rci n, colocando en las ordenadas las absorbancias y en las abscisas las longitudes de onda. Debe indicar cul es la longitud de onda de mxima absorbancia para cada una de las solucio nes.

PREPARACIN DE UNA CURVA DE CALIBRACIN: Preparar 5 diluciones de la solucin de safranina 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 y 1:32, utilizando agua destilada co mo diluyente. Leer cada dilucin a la longitud de onda seleccionada en la experiencia anterior. Graficar absorbancia vs. co ncentraci n.

IV.

RESULTADOS:

EXPERIENCIA 1: Al tubo de ensayo se le coloca safranina (solucin patrn)

Y este es colocado en la cubeta

Luego es llevada al espectrofotmetro para la medicin respectiva

EXPERIENCIA 2:

Solucin Patrn (SAFRANINA)

FUNDAMENTACIN:

V. 1.

CUESTIONARIO: Qu es transmitancia y absorbancia?

Transmitancia: La transmitancia o transmitencia es una magnitud que expresa la cantidad de energa que atraviesa un cuerpo en la unidad de tiempo (potencia). Transmitancia ptica La transmitancia ptica que se define como la fraccin de luz incidente, a una longitud de onda especificada, que pasa a travs de una muestra. Transmitancia trmica Es la cantidad de energa que atraviesa, en la unidad de tiempo, una unidad de superficie de un elemento constructivo de caras plano paralelas cuando entre dichas caras hay un gradiente trmico unidad. Es el inverso a la resistencia trmica. Absorbancia: La absorbancia, , es la cantidad de intensidad de luz que absorbe una muestra. Est definida como:

Siendo la intensidad despus de haber habido la absorcin e intensidad de la luz que se hace incidir en la muestra.

la

Se suele emplear en la qumica analtica ya que se cumple, la llamada, Ley de Beer-Lambert:

Siendo el coeficiente de extincin molar, longitud atravesada por el haz de luz.

la concentracin y

la

La ley de Beer es una ley aditiva, y por tanto si se tienen diferentes sustancias en una muestra la ley de beer se tiene como: }

2.

Qu utilidad tiene la espectrofotom etra en la bioqumica clnica?

El espectrofotmetro constituye una herramienta fundamental en el laboratorio clnico. Ms del 90% de las determinaciones que se realizan en Qumica Clnica tienen como paso final la lectura de una absorbancia o una transmitancia. El correcto desempeo de los espectrofotmetros es entonces determinante, en ltima instancia, de la calidad analtica de los resultados que emite el laboratorio. Tiene aplicacin en bioqumica clnica para realizar anlisis de parmetros bioqumicos. Como principal ventaja, es la gran versatilidad de parmetros bioqumicos que pueden ser realizados, pudiendo analizar marcadores bioqumicos que otros equipos automatizados no pueden. Como inconveniente, es que es un mtodo menos exacto y preciso que los mtodos automatizados; y adems, requiere una cantidad de tiempo considerable para realizar cada determinacin.

QUMICA CLNICA Test

Bilirrubina total Bilirrubina Directa Fosfatasa Alcalina Amilasa Transaminasa glutmico oxalactica (AST) Transaminasa glutmico pirvica (ALT) Gamaglutamil-transpeptidasa (GGT) Lacticodeshidrogenasa (LDH)

Mtodos
Espectrofotometra visible. Espectrofotometra directa 540 y 454 nm Espectrofotometra visible Espectrofotometra cintica 405 nm Cintico espectrofotomtrico a 405 nm Espectrofotometra Cintica UV 340/360 nm Espectrofotometra Cintica UV 340/360 nm Espectrofotometra cintica a 405 nm Espectrofotometra-UV 340 nm.

3.

En qu se basa el funcionamiento del espectrofotmetro?

Los espectrofotmetros de reflectancia miden la cantidad proporcional de luz reflejada por una superficie como una funcin de las longitudes de onda para producir un espectro de reflectancia. El espectro de reflectancia de una muestra se puede usar, junto con la funcin del observador estndar CIE y la distribucin relativa de energa espectral de un iluminante para calcular los valores triestmulos CIE XYZ para esa muestra bajo ese iluminante.

El funcionamiento de un espectrofotmetro consiste bsicamente en iluminar la muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una serie de intervalos de longitudes de onda. Lo ms usual es que los datos se recojan en 31 intervalos de longitudes de onda (los cortes van de 400 nm, 410 nm, 420 nm 700 nm). Esto se consigue haciendo pasar la luz a travs de un dispositivo

monocromtico que fracciona la luz en distintos intervalos de longitudes de onda. El instrumento se calibra con una muestra o loseta blanca cuya reflectancia en cada segmento de longitudes de onda se conoce en comparacin con una superficie de reflexin difusa perfecta. La reflectancia de una muestra se expresa como una fraccin entre 0 y 1, o como un porcentaje entre 0 y 100. Es importante darse cuenta de que los valores de reflectancia obtenidos son valores relativos y, para muestras no fluorescentes, son independientes de la calidad y cantidad de la luz usada para iluminar la muestra. As, aunque los factores de

reflectancia se midan usando una fuente de luz concreta, es perfectamente correcto calcular los valores colorimtricos para

cualquier iluminante conocido.

VI.

CONCLUSIONES y y La espectrofotometra nos ayudo a medir la concentracin que el azul de metileno. Pudimos observar a travs del espectrofotmetro como es que varan las absorbancias con diferentes longitudes de onda. Hemos concluido que a mayor concentracin de soluto mayor va ser la absorcin de dicha solucin.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.