SUBMODULO 1

PROCESAR CULTIVOS BACTERIOLGICOS

MANUAL DE PRCTICAS

Villahermosa, Tab., Enero del 2013

MANUAL DE PRCTICAS

ASIGNATURA Procesar cultivos bacteriolgicos.

SEMESTRE: CUARTO PERODO ESCOLAR: FEBRERO 2013 JULIO 2013

INDICE
P AG. I. II. III. IV. V.

INTRODUCCIN...................................................... 4 OBJETIVO GENERAL.............................................. NDICE DE PRCTICAS.......................................... 5 6

CREDITOS DE ELABORACIN............................... 61 VALIDACIN........................................................... 61

I.

INTRODUCCIN

El presente cuadernillo de trabajo pretende que el estudiante reafirme sus conocimientos y domine la metodologa para realizar cultivos bacteriolgicos a partir de muestras clnicas aislando e identificando el agente patgeno.

II.

OBJETIVO GENERAL

Aplicar las tcnicas de laboratorio para reafirmar los conocimientos tericos sobre el cultivo de bacterias a partir de muestras biolgicas en apoyo al diagnstico clnico.

III.

INDICE DE PRACTICAS

Nombre de la prctica Cultivo e identificacin de Enterobacterias Cultivo e identificacin de Bacterias Gram Negativas no Fermentadoras ( BGNnF ) Diagnstico de Micobacteriosis ( Baciloscopia ) Coprocultivo Urocultivo Cultivo de exudado farngeo

Prctica Nmero 1 2 3 4 5 6

Pagina 7 17 26 34 44 53

Prctica No. 1

Titulo de la Prctica: Cultivo e identificacin de Enterobacterias

Fecha de realizacin: Enero 2013

Submdulo 1 Procesar cultivos bacteriolgicos

Competencia profesional: Asla e identifica Enterobacterias

RESULTADO DE APRENDIZAJE: Realiza un cultivo de muestra biolgica para aislar e identificar las Enterobacterias ms relevantes de importancia mdica con el uso de pruebas bioqumicas. INTRODUCCIN: Enterobacteriaceae es una familia de bacterias Gram negativas que contiene ms de 30 gneros y ms de 100 especies que pueden vivir en tierra, en plantas o en animales acuticos. Sucumben con relativa facilidad a desinfectantes comunes, incluido el cloro. No son exigentes, son de fcil cultivo, son oxidasa negativo, es decir, carecen de la enzima citocromo oxidasa. Son capaces de reducir nitrato en nitrito. Son Anaerbicos facultativos. Son fermentadores de carbohidratos en condiciones Anaerbicas con o sin la produccin de gas (en especial glucosa y lactosa). Los miembros de esta familia causan principalmente infecciones en los aparatos gastrointestinal y urinario; sin embargo a partir de la era de los antibiticos la quimioterapia moderna y las medidas inmunosupresoras, se ha observado que estos microorganismos pueden aislarse de infecciones de cualquier sitio anatmico causando las infecciones nosocomiales.

ESTRATEGIA ENSEANZA- APRENDIZAJE: Actividad 1: Obtener una muestra biolgica. Actividad 2: Seleccionar los medios adecuados para la siembra de la muestra biolgica..

Actividad 3: Realizar las siembras con la tcnica de aislamiento de la estra cruzada.. Actividad 4: Seleccionar la colonia sospechosa de enterobacteria y sembrar con un asa recta las pruebas bioqumicas para su identificacin. Actividad 5: Interpretar los cambios en las pruebas bioqumicas para identificar la enterobacteria aislada. Anota sus observaciones y reporta resultados.

1.- OBJETIVO DE LA PRCTICA: Conocer las caractersticas morfolgicas de cultivo y bioqumicas ms relevantes de las enterobacterias de mayor importancia clnica.

2.- INTRODUCCIN: Las Enterobacterias constituyen uno de los grupos ms importantes en la Microbiologa Mdica Diagnstica, ya que en l se incluyen una variedad de gneros, algunos de los cuales forman parte de la biota normal, mientras que otros tienen un papel patgeno ampliamente reconocido como: Escherichia, Shigella, Salmonella y Yersinia. Para el diagnstico de estas infecciones se requiere conocer el manejo adecuado de los productos, seleccionar los medios para el primo aislamiento, as como el criterio para interpretar el resultado y decidir cul es el agente causal. La clasificacin se basa inicialmente en la determinacin de la presencia o ausencia de diferentes enzimas codificadas que estn involucradas en el metabolismo bacteriano que pueden ser evidenciadas en medios especiales in vitro en las que el sustrato se incorpora junto con un sistema indicador que pone de manifiesto su degradacin a la presencia de un metabolito especifico, conociendo estas como pruebas bioqumicas.

3.- FUNDAMENTO La clasificacin se basa inicialmente en la determinacin de la presencia o ausencia de diferentes enzimas codificadas que estn involucradas en el metabolismo, ponindose de manifiesto con cambios de color por los indicadores de pH que contiene cada uno de los medios en base al pH que presentan cada uno de los productos formados.

4.- MATERIALES A UTILIZAR: (Equipo de 6 a 7 integrantes) CANTIDAD DESCRIPCIN Cajas Petri desechables sin divisin Portaobjetos Cubreobjetos Aplicadores de madera. Asa bacteriolgica estndar Asa bacteriolgica recta Algodn Gasas Matraz Erlenmeyer de 250 y 500 ml Tubos de 13X100 Papel estraza Pipetas graduadas de 10 ml.

5.- EQUIPO A UTILIZAR: CANTIDAD 1 1 1 2 4 4 4 Microscopio Autoclave ( Olla de presin Presto de 21 lt. ) Estufa bacteriolgica Mecheros Fisher Mecheros bunsen Rejillas con centro de asbesto Tripies 9 DESCRIPCIN

6.- MATERIAL BIOLGICO: DESCRIPCIN Muestra clnica ( Cepas de Enterobacterias ) 7.- REACTIVOS: CANTIDAD DESCRIPCION Reactivo de Erlich Agua destilada Reactivo de ortoparafenilen diamina Agua oxigenada Agar de Eosina Azul de Metileno ( Agar de EMB ) Agar de Mac Conkey ( Agar de MC) Agar de Xilosa Lisina Desoxicolato ( Agar de XLD ) Agar de Salmonella y Shigella ( Agar de SS ) Agar de Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa ( Agar de TCBS ) Agar de Hierro de Kligler ( Agar KIA ) Agar de Hierro y Lisina ( Agar LIA ) Agar Citrato de Simmons ( Agar CIT ) Medio de Movilidad Indol y Ornitina ( Medio MIO ) Caldo Urea ( Caldo UR ) Caldo Malonato ( Caldo MAL ) Kit para tincin de Gram

8.- DESCRIPCIN DE LA PRCTICA: a) Sembrar la muestra biolgica en Agar de EMB, MC, SS y XLD por medio de la estra cruzada e incubar las placas a 36 +/- 1 C. durante 24 hrs. b) Seleccionar por la morfologa colonial sospechosas de Enterobacterias. c) Sembrar la colonia sospechosa con un asa recta en las siguientes pruebas bioqumicas: 10

Tomar el inoculo con el asa recta de una sola colonia y sembrar de la siguiente manera. KIA: Picadura y estra en la superficie. LIA: Picadura y estra en la superficie. CIT: Estra en la superficie. MIO: Picadura en el centro. UR: Introducir el asa dos veces sin agitar. MAL: Introducir el asa dos veces sin agitar. d) Incubar a 36 +/- 1 C durante 24 hrs. e) Llevar a cabo las lecturas en base a los cambios de color. f) En base a las lecturas y utilizando la tabla de Gneros y especies identifique la bacteria de acuerdo a la siguiente tabla

TABLA DE IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS FRECUENTES IND H2S MOV CIT MAL UR LAC LIS ORN

11

Escherichia coli Salmonella sp Shigella sp Klebsiella K. oxytoca K. ozanae K. pneumoniae K. rhinoscleromatis K. planticola Proteus mirabilis Proteus penneri Proteus vulgaris Citrobacter C. amalonaticus C. diversus C. freundii Enterobacter E. aerogenes E. agglomerans E. cloacae Providencia P. alcalifaciens P. rettgeri P. stuarti Serratia S. licuefaciens S. marcescens S.odorifera S. rubidea

+ + V + + + + + + V -

+ + V + + -

+ + + V + + + + + V + + + V + + + V

+ + V + + V V V + + + V + + + + + + + +

+ + + + + V V V V +

+ V + + + + + V V V V V + V V -

+ + V + + V V V + V + V V +

+ + + V + + + + + + V

+ + + + V + + + + V -

9.- REPORTE DE RESULTADOS:

Reportar lo observado durante la prctica. 1.-Color inicial de los Medios de cultivo 2.- Color de los medios despus del crecimiento 3.-Morfologia colonial 4.-Color inicial de las pruebas bioqumicas 5.-Cambios de color despus de la incubacin 6.- Las lecturas de cada una de las pruebas bioqumicas 7.- Bacteria aislada e identificada. 12

10.- RECOMENDACIONES:

Al trabajar en el Laboratorio: Debe tenerse cuidado en mantener toda el rea de trabajo en condiciones limpias. Todos los materiales contaminados deben colocarse en de inmediato en un desinfectante o en el recipiente de RPBI. Deben utilizarse cubre boca, bata de laboratorio blanca, manga larga, debidamente abotonada. No colocarse ni llevarse nada a la boca.

11.- ACTIVIDADES:

Anota tus resultados. Reporta los resultados del estudio. Comenta conclusiones con tus compaeros. Contesta el siguiente cuestionario. Completa el glosario.

12.- CUESTIONARIO

1.- Diga cuales son los principales indicadores de pH que contienen los medios de cultivo y bioqumicas que se utilizan para el aislamiento e identificacin de las Enterobacterias. 2.- Investigar que son las infecciones nosocomiales o intrahospitalarias. 3.- Gneros y especies ms frecuentes causantes de infecciones 13

nosocomiales? 4.5.6.7.8.9.pH que presentan los productos que se forman a partir del metabolismo fermentativo de los carbohidratos. pH que presentan los productos que se forman a partir del metabolismo de peptonas y aminocidos. Mencione que gneros de las Enterobacterias se caracterizan por ser inmviles. Gneros de Enterobacterias considerados como patgenos? Carbohidrato que todas las Enterobacterias fermentan. Que menciona la NOM- 166 , la NOM 005 y la NOM-087?

13. GLOSARIO DE TERMINOS: Desaminacin Descarboxilacin Aminocido Medio selectivo Medio diferencial Indicador de pH

14.- EVALUACIN:
GUA DE OBSERVACIN

14

Instrucciones: a) Lee y analiza el fundamento de la prctica b) Selecciona adecuadamente los materiales y reactivos c) Desarrolla el procedimiento de la prctica d) Lee e interpreta los resultados e) Observaciones con base a la norma 166 y 087 Aspecto a observar
SI a) Ley y analiz el fundamento de la prctica. 1p b) Seleccion y prepar adecuadamente el material y reactivo. 1p c) Desarrollo correctamente el procedimiento. 2p d) Interaccin grupal e individual. 1p e) Manipul con destreza el equipo. 2p f) Ley, interpret y contrast eficazmente sus resultados con los valores referenciales.1p g) Cumpli con los aspectos de las NOM 005 y 087. 2p

Cumple
NO N/A

Observaciones

Puntos

15.- BIBLIOGRAFA : AUTOR Koneman Elmer Mac Fadin TTULO Diagnstico Microbiolgico EDITORIAL Panamericana, 2008 Pruebas bioqumicas para Panamericana, la identificacin de de 2003 bacterias mdica, Prats Forbes. Sahm. Microbiologa clnica Weissfeld. Diagnstico microbiolgico Microbiologa mdica Panamericana, 2006 Panamericana, 2004 Manual moderno, 2005 15 Bayled Scout Brooks. Geo F importancia

Levinson Conant E. Prescott,Harley, Klein

Microbiologa inmunologa mdica. Micologa Mdica, Microbiologa.

e Interamericana, 2006 Interamericana, 1999. Interamericana

Prctica No. 2

Titulo de la Prctica: Aislamiento e identificacin de Bacterias Gram Negativas no Fermentadoras(BGNnF)

Fecha de realizacin: Enero 2013

Submdulo 1 Procesar cultivos bacteriolgicos

Competencia profesional: Asla e identifica BGNnF

16

RESULTADO DE APRENDIZAJE: Identificar algunos bacilos no fermentadores de la glucosa y distinguir los grupos de King-Weaver de bacilos Gram negativos fermentadores, no fermentadores, oxidativos y no oxidativos. INTRODUCCIN: Los bacilos Gram Negativos no Fermentadores (BGNnF) constituyen un grupo heterogneo de microorganismos que se consideran generalmente patgenos oportunistas y que en la actualidad han cobrado relevancia por su incidencia en las infecciones hospitalarias. Son bacterias no esporuladas, aerobias estrictas que, o bien no utilizan los carbohidratos como fuente de energa, o los degradan a travs de vas metablicas diferentes a la fermentacin. Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y dado su ubicuidad, pueden sobrevivir en el ambiente hospitalario en: agua destilada, soluciones salinas, tubuladuras, superficies hmedas, humidificadores, incubadoras, nebulizadores, catteres, soluciones desinfectantes y en superficies inertes, constituyendo reservorios de potenciales infecciones. Algunas especies psicrfilas pueden contaminar sangre de banco y hemoderivados. ESTRATEGIA ENSEANZA- APRENDIZAJE: Actividad 1: Obtener una muestra biolgica. Actividad 2: Seleccionar los medios adecuados para la siembra de la muestra biolgica.. Actividad 3: Realizar las siembras con la tcnica de aislamiento de la estra cruzada.. Actividad 4: Seleccionar la colonia sospechosa de BGNnF y sembrar las pruebas bioqumicas para su identificacin. Actividad 5: Interpretar los cambios en las pruebas bioqumicas para identificar la BGNnF aislada. Anota sus observaciones y reporta resultados.

1.- OBJETIVO DE LA PRCTICA: Conocer las caractersticas morfolgicas de cultivo y bioqumicas de los gneros de las BGNnF de mayor importancia clnica.

2.- INTRODUCCIN: La identificacin de estas bacterias se hace aplicando las caractersticas morfolgicas y bioqumicas recomendadas por King Weaver; los no fermentadores se reconocen por su inactividad en el medio de TSI o KIA y a la 17

vez este criterio permite llegar al gnero en la identificacin, basndose en la utilizacin de cuatro pruebas preliminares para diferenciarlos como son : La utilizacin del medio de Hugh y Leifson ( Medio de O/F), Capacidad de crecer en el agar de Mac Conkey, Capacidad de produccin de la enzima citocromo oxidasa y la determinacin de la movilidad. 3.- FUNDAMENTO Las BGNnF son de gran importancia ya que son microorganismos involucrados como causantes de infecciones intrahospitalarias, debido a esto es necesario conocer las caractersticas morfolgicas, agares a utilizar para su aislamiento as como las pruebas bioqumicas para su identificacin.

4.- MATERIALES A UTILIZAR: (Equipo de 6 a 7 integrantes) CANTIDAD DESCRIPCIN Cajas de Petri desechables sin divisin Portaobjetos Cubreobjetos Aplicadores de madera. Asa bacteriolgica estndar Asa bacteriolgica recta Algodn Gasas Matraz Erlenmeyer de 250 y 500 ml Tubos de 13X100 Papel estraza

5.- EQUIPO A UTILIZAR: CANTIDAD 1 1 Microscopio Autoclave ( Olla de presin Presto de 21 lt. ) 18 DESCRIPCIN

1 2 4 4 4

Estufa bacteriolgica Mecheros Fisher Mecheros bunsen Rejillas con centro de asbesto Tripies

6.- MATERIAL BIOLGICO: DESCRIPCIN Muestra clnica ( Cepas de BGNnF)

7.- REACTIVOS: CANTIDAD DESCRIPCION Reactivo de Erlich Agua destilada Reactivo de ortoparafenilen diamina Agua oxigenada Agar de Eosina Azul de Metileno ( Agar de EMB ) Agar de Mac Conkey ( Agar de MC) Agar de Xilosa Lisina Desoxicolato ( Agar de XLD ) Agar de Salmonella y Shigella ( Agar de SS ) Agar de Tiosulfato Citrato Biis Sacarosa ( Agar de TCBS ) Agar de Hierro de Kligler ( Agar KIA ) Agar de Hierro y Lisina ( Agar LIA ) 19

Agar Citrato de Simmons ( Agar CIT ) Medio de Movilidad Indol y Ornitina ( Medio MIO ) Caldo Urea ( Caldo UR ) Caldo Malonato ( Caldo MAL ) Medio de Hugh Leifson ( Medio de O/F ) Kit para tincin de Gram

8.- DESCRIPCIN DE LA PRCTICA: a) Sembrar la muestra biolgica en Agar de EMB, MC, SS y XLD por medio de la estra cruzada e incubar las placas a 36 +/- 1 C. durante 24 hrs. b) Seleccionar por la morfologa colonial sospechosas de una BGNnF . c) Sembrar la colonia sospechosa con un asa recta en las siguientes pruebas bioqumicas: Tomar el inoculo con el asa recta de una sola colonia y sembrar de la siguiente manera. O/F: Sembrar por picadura en el centro dos tubos y a uno agregarle 0.5 ml de aceite mineral. MIO: Sembrar por picadura en el centro. MC: Sembrar una estra en la superficie. BAB o MH: Sembrar una estra en la superficie. KIA: Sembrar por picadura y estra en la superficie d) Incubar a 36 +/- 1 C durante 24 hrs. e) Llevar a cabo las lecturas en base a los cambios de color en los medios de O/F, determinar la movilidad, crecimiento en agar de MC y a partir del la estra en BAB o MH agregar un pequeo inoculo en la tira reactiva con reactivo de ortoparafenilen diamina para determinar produccin de oxidasa. f) En base a las lecturas y utilizando la tabla de Gneros de King Weaver identifique la bacteria de acuerdo a la siguiente tabla.

METABOLISMO MOVILIDAD Pseudomonas Acinetobacter Flavobacterium Bordetella Moraxella Stenotrophomonas O O o I O O O o I O + V V +

OXIDASA + + + + - / Dbil

CREC.

EN

AGAR MC + + Pobre o Pobre o Pobre o 20

Alcaligenes

O o I

9.- REPORTE DE RESULTADOS:

Reportar lo observado durante la prctica. 1.-Color inicial de los Medios de cultivo. 2.- Color de los medios despus del crecimiento. 3.-Morfologia colonial. 4.- Realizar un frotis y teir con la tincin de Gram. 4.-Color inicial de 21las pruebas bioqumicas. 5.-Cambios de color despus de 21la incubacin. 6.- Las lecturas de cada una de 21las pruebas bioqumicas. 7.- Bacteria aislada e identificada. 10.- RECOMENDACIONES:

Al trabajar en el Laboratorio: Debe tenerse cuidado en mantener toda el rea de trabajo en condiciones limpias. Todos los materiales contaminados deben colocarse en de inmediato en un desinfectante. Deben utilizarse, cubreboca, bata de laboratorio blanca, larga y manga larga, debidamente abotonada. No colocarse ni llevarse nada a la boca. 11.- ACTIVIDADES:

Anota tus resultados. Reporta los resultados del estudio. Comenta conclusiones con tus compaeros. Contesta el siguiente cuestionario. Completa el glosario.

12.- CUESTIONARIO

21

1. - Diga que es el metabolismo fermentativo. 2. - Defina el significado de metabolismo oxidativo. 3. - Gnero y especie de BGNnF comnmente aislada de pacientes hospitalizados. 4. - Diga por qu se le agrega aceite mineral a uno de los tubos de O/F. 5. - Mencione las tres pruebas claves para sospechar de una BGNnF. 6. - Explique el significado de K/N en el agar de KIA.

13. GLOSARIO DE TERMINOS: O/F Inerte No sacaroltica Oxidacin Fermentacin

14.- EVALUACIN:
GUA DE OBSERVACIN Instrucciones: a) Lee y analiza el fundamento de la prctica b) Selecciona adecuadamente los materiales y reactivos c) Desarrolla el procedimiento de la prctica d) Lee e interpreta los resultados e) Observaciones con base a la norma 166 y 087 Aspecto a observar
SI a) Ley y analiz el fundamento de la prctica. 1p b) Seleccion y prepar adecuadamente el material y reactivo 1p

Cumple
NO N/A

Observaciones

Puntos

22

c) Desarrollo correctamente el procedimiento. 2p d) Interaccin grupal e individual. 1p e) Manipul con destreza el equipo. 2p f) Ley, interpret y contrast eficazmente sus resultados con los valores referenciales 1p g) Cumpli con los aspectos de las NOM 005 y 087. 2p

15.- BIBLIOGRAFA : AUTOR Koneman Elmer Mac Fadin TTULO Diagnstico Microbiolgico EDITORIAL Panamericana, 2008 Pruebas bioqumicas para Panamericana, la identificacin de de 2003 bacterias mdica, Prats Forbes. Sahm. Microbiologa clnica Weissfeld. Diagnstico microbiolgico Microbiologa mdica Microbiologa inmunologa mdica. Conant E. Prescott,Harley, Klein Micologa Mdica, Microbiologa. Panamericana, 2006 Panamericana, 2004 Manual moderno, 2005 Levinson e Interamericana, 2006 Interamericana, 1999. Interamericana Bayled Scout Brooks. Geo F importancia

23

Prctica No. 3

Titulo de la Prctica: Diagnstico de las micobacteriosis ( Baciloscopia )

Fecha de realizacin: Enero 2013

Submdulo 1 Procesar cultivos bacteriolgicos

Competencia profesional: Realizar una baciloscopia

RESULTADO DE APRENDIZAJE: Aprender a realizar la baciloscopia como apoyo en el diagnstico de la tuberculosis pulmonar. 24

INTRODUCCIN: La tuberculosis humana es una de las enfermedades ms viejas que todava se encuentra ampliamente distribuida en el mundo, se sabe que el 95 % de los enfermos se ubica en los pases subdesarrollados, su asociacin con la pobreza y las condiciones caractersticas de las misma, como la desnutricin, parasitosis, drogadiccin, SIDA y alcoholismo hacen que el problema aumente, en Mxico en el programa de control de la tuberculosis se tiene establecido que el diagnstico de esta enfermedad se realice preferentemente por tcnicas bacteriolgicas ( La baciloscopia ) solicitando tres muestras de esputo cuando se sospecha de esta enfermedad. ESTRATEGIA ENSEANZA- APRENDIZAJE: Actividad 1: Obtiene la muestra del paciente en un recipiente de boca ancha de acuerdo a las indicaciones para la obtencin adecuada. Actividad 2: Realizar un frotis de acuerdo a las indicaciones de seguridad. Actividad 3: Realizar la Tincin de Ziehl Neelsen. Actividad 4: Llevar a cabo el recuento de BAAR. Actividad 5: Anota sus observaciones y reporta resultados.

1.- OBJETIVO DE LA PRCTICA: Determinar el diagnstico de laboratorio de la tuberculosis pulmonar, teniendo en cuenta la toma de la muestra y la baciloscopia directa para la bsqueda de los BAAR. 2.- INTRODUCCIN: La baciloscopia, es la tcnica fundamental en toda investigacin bacteriolgica de la tuberculosis, en la deteccin de casos y control de tratamiento. Con un costo bajo y de rpida ejecucin, la baciloscopia es una tcnica que permite identificar al 70-80% de los casos pulmonares positivos. Si bien la complejidad del cultivo y su costo resultan ser mayores que la baciloscopia, es mejor alternativa en comparacin a otras tcnicas sofisticadas. Por lo tanto, la baciloscopia no puede ser utilizada como nica opcin en el diagnostico de la tuberculosis extrapulmonar y se debe utilizar el cultivo en todos los especmenes no pulmonares. 3.- FUNDAMENTO La tcnica de tincin utilizada fue la de Ziehl-Neelsen tradicional. Cuando se 25

examina muestras de esputo u otras lesiones en donde estas bacterias se encuentran, al microscopio, previa coloracin de los extendidos, su caracterstica principal es bacilos cido-alcohol resistencia (BAAR) ya que son difciles de teir con fucsina pero una vez teidos resisten a la decoloracin con alcohol-cido. 4.- MATERIALES A UTILIZAR: (Equipo de 6 a 7 integrantes) CANTIDAD DESCRIPCIN Portaobjetos Aplicadores de madera. Algodn Gasas Papel estraza Recipiente con cloro al 10 % Lmpara de alcohol Puente de tincin 5.- EQUIPO A UTILIZAR: CANTIDAD 1 Microscopio

DESCRIPCIN

6.- MATERIAL BIOLGICO CANTIDAD DESCRIPCIN Muestra de esputo 7.- REACTIVOS: CANTIDAD DESCRIPCION Agua destilada Kit para tincin Ziehl - Neelsen Alcohol etlico Cloro al 10 %

8.- RECOLECCIN DE LA MUESTRA: Se obtiene una muestra de esputo por la maana en un rea abierta en un frasco de plstico de boca ancha evitando la contaminacin externa del 26

recipiente. .

9.- DESCRIPCIN DE LA PRCTICA 1.-Antes de comenzar a trabajar, disponga en la mesada todo lo necesario para realizar el extendido en el espacio despejado de la misma o en la bandeja: mechero, aplicadores o asas, frasco con arena y fenol o alcohol, soporte para los extendidos, lpiz para marcar los portaobjetos, portaobjetos marcados con la numeracin de las muestras a procesar. 2.- Es conveniente extender una hoja de papel absorbente en el rea de trabajo donde realizar los extendidos, la que descartar con el material a esterilizar, al finalizar el trabajo. 3.- Si marca los portaobjetos con lpiz graso hgalo en la parte posterior de los mismos para evitar que se pierda la identificacin durante la coloracin. 4.-Disponga a su izquierda o derecha (siempre en la misma posicin) las muestras de acuerdo a numeracin creciente y los portaobjetos marcados delante de cada una de ellas. El portaobjetos se divide virtualmente en tres tercios, uno de ellos se utiliza para marcar el nmero correlativo de identificacin y los dos restantes se dejan para realizar el extendido. 5.- Tome la primera muestra y el portaobjetos correspondiente y colquelo entre usted y el mechero, tome el frasco con material y llvelo detrs de la llama de manera que sta quede entre usted y el frasco y bralo con cuidado. Esta posicin lo proteger de posibles formaciones de aerosoles al abrir el frasco. 6.-Si usa palillo para realizar el extendido, parta el palillo en dos tratando de que las puntas queden speras y con las puntas de ambas mitades trate de levantar la partcula ms purulenta de la muestra y enrllela en una de ellas. 7.-Si la muestra contiene varias porciones mucopurulentas trate de mezclarlas con movimientos suaves del palillo y luego tome una porcin de la mezcla, enrollndola en la punta de una de las mitades del palillo. 8.-Si usa asa no descartable, qumela primero desde el mango hacia el aro, djela enfriar y luego seleccione la partcula ms purulenta. 9.-Coloque la partcula seleccionada sobre el portaobjetos cerca de la lnea divisoria y extindala con el palillo o el asa con movimientos circulares, tratando de dispersarla por toda la superficie central, sin llegar a los bordes, en forma homognea. 10.-Coloque slo un extendido en cada portaobjetos el extendido debe quedar de grosor homogneo, cubriendo la mayor parte de los dos tercios del portaobjetos. Si es demasiado fino, es posible producir un resultado falso negativo, si es muy grueso, el material puede desprenderse durante la coloracin. El grosor adecuado es el que permite leer un texto impreso a travs del preparado .Este procedimiento debe realizarse teniendo el mechero entre usted y el portaobjetos. 11.- Deje el extendido en un soporte para que se seque a temperatura ambiente; el extendido no debe calentarse a la llama mientras ste permanezca hmedo pues el calor fuerte deteriora los bacilos y no se colorean y puede generar aerosoles. 12.-Si utiliz palillos deschelos en un frasco que contenga fenol al 5% o una solucin de hipoclorito de sodio concentrado comercial al 10%; si us asa introdzcala en el frasco que contiene arena y fenol, psela con movimientos circulares por la arena y 27

luego qumela con cuidado comenzando desde el mango avanzando lentamente hacia el aro. 13.- Cierre el envase y djelo en el lado opuesto a los que an no ha procesado, para evitar confusiones. 14.- Espere a que las lminas se hayan secado al aire y luego pselas rpidamente sobre la llama dos o tres veces para fijar el extendido; no lo queme ni lo sobrecaliente. 15.- Conserve las muestras hasta que haya realizado las coloraciones y lecturas y est seguro de que no necesitar realizar nuevos extendidos o enviarlas para cultivo. 16.- Cuando haya terminado, puede descartar las muestras colocndolas, junto con los palillos, en un recipiente para incineracin o autoclavado o bien colocndoles fenol al 5% o hipoclorito de sodio al 10% y dejndolas hasta el da siguiente, momento en que puede eliminarlas con los desechos habituales del laboratorio. Tincin de Ziehl Neelsen 15.- Colocar el frotis en un puente de tincin y cubrir con el colorante de Fucsina fenicada bsica. 16.- Calentar a emisin de vapores durante cinco minutos sin que hierva y sin que se seque el colorante. 17.- Lavar con agua de la llave a presin baja. 18.- Decolorar con alcohol cido al 3 % enjuagando con agua de la llave a presin baja hasta que ya no salgan restos de colorante. 19.- Cubrir el frotis con el azul de metileno durante un minuto. 20.- Lavar con agua de la llave a presin baja. 21.- Dejar secar el frotis a temperatura ambiente. 22.- Observar al microscopio al objetivo de 100 X revisando cien campos. 23.- Realizar el reporte de a cuerdo al siguiente a la siguiente tabla. 10.- REPORTE DE RESULTADOS

Resultado del examen microscpico No se encuentran BAAR en los 100 campos revisados Se observan de 1 a 9 BAAR en 100 campos revisados Se observaron de 10 a 99 BAAR en 100 campos revisados Se observan de 1 a 10 BAAR por campo en 50 campos revisados Se observan ms de 10 BAAR por campo en 20 campos revisados

Informe No se observaron BAAR Nmero exacto de BAAR en 100 campos Positivo ( + ) Positivo ( ++ ) Positivo ( +++ )

28

11.- OBSERVACIONES

Los bacilos acidorresistentes tienen entre 1 y l0 m de largo. Con la coloracin de Ziehl Neelsen se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacndose claramente contra el fondo azul. A veces se observan con grnulos o cuentas intensamente coloreados en el interior.

12.- NOTAS IMPORTANTES

La seleccin de la partcula ms purulenta de la muestra es uno de los pasos ms importantes para aumentar la probabilidad de identificar los casos de tuberculosis mediante la baciloscopia directa de esputo. Los extendidos deben ser teidos de inmediato, ya que algunos bacilos pueden permanecer vivos despus de fijados con calor hasta que se le agrega la fucsina.
13.- ACTIVIDADES Anota tus resultados. Informa tus resultados Comenta conclusiones con tus compaeros. Contesta el siguiente cuestionario. Completa el glosario de trminos.

14.- CUESTIONARIO 1. -Explica el fundamento de la tcnica de la Tincin de Ziehl Neelsen.

2.- Mencione el gnero de otra bacteria que se tia como BAAR.

3.- Nombre de los compuestos caractersticos de la pared celular de las bacterias del gnero Mycobacterium que le dan la propiedad de ser Acido Alcohol Resistentes? 4.- Medio que se utiliza comnmente para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis?

29

5.- Mencione otra tcnica de tincin que se utiliza para la baciloscopia. 6.- Mencione en que otras muestras se pueden encontrar los BAAR para el diagnstico de tuberculosis 7. Nombre del mtodo de concentracin que se utiliza para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis? 8.- Diga porqu se utiliza la baciloscopia como diagnstico de la tuberculosis y no el cultivo?

15- GLOSARIO DE TERMINOS

BAAR Auramina Extrapulmonar Renal Menngea

16.- EVALUACIN:
GUA DE OBSERVACIN Instrucciones: a) Lee y analiza el fundamento de la prctica b) Selecciona adecuadamente los materiales y reactivos c) Desarrolla el procedimiento de la prctica d) Lee e interpreta los resultados e) Observaciones con base a la norma 166 y 087 Aspecto a observar
SI a) Ley y analiz el fundamento de la prctica. 1p

Cumple
NO N/A

Observaciones

Puntos

30

b) Seleccion y prepar adecuadamente el material y reactivo. 1p c) Desarrollo correctamente el procedimiento. 2p d) Interaccin grupal e individual. 1p e) Manipul con destreza el equipo. 2p f) Ley, interpret y contrast eficazmente sus resultados con los valores referenciales.1p g) Cumpli con los aspectos de las NOM 005 y 087. 2p

17.- BIBLIOGRAFA : AUTOR Koneman Elmer Mac Fadin TTULO Diagnstico Microbiolgico EDITORIAL Panamericana, 2008 Pruebas bioqumicas para Panamericana, la identificacin de de 2003 bacterias mdica, Prats Forbes. Sahm. Microbiologa clnica Weissfeld. Diagnstico microbiolgico Microbiologa mdica Microbiologa inmunologa mdica. Conant E. Prescott,Harley, Klein Micologa Mdica, Microbiologa. Panamericana, 2006 Panamericana, 2004 Manual moderno, 2005 Levinson e Interamerica, 2006 Interamericana, 1999. Interamericana Bayled Scout Brooks. Geo F importancia

31

Prctica No. 4 Submdulo 1 Procesar cultivos bacteriolgicos

Titulo de la Prctica: Coprocultivo

Fecha de realizacin: Enero 2013

Competencia profesional: Aislar e identificar enteropatgenos

RESULTADO DE APRENDIZAJE: Realizar un coprocultivo para el aislamiento e identificacin de bacterias enteropatgenas en el diagnstico de las enfermedades bacterianas del aparato gastrointestinal. INTRODUCCIN: Las enfermedades infecciosas del aparato gastrointestinal representan una de las principales causas de mortalidad y morbilidad infantil por la diarrea aguda de nios menores de cinco aos. En el tercer mundo es un serio problema y est relacionado con la desnutricin donde se crea un circulo vicioso para el nio enfermo aumentando las cifras a nivel mundial. ESTRATEGIA ENSEANZA- APRENDIZAJE: Actividad 1: Obtener una muestra de material fecal utilizando el medio de transporte de Cary-Blair.. Actividad 2: Realiza el primoaislamiento en los agares de EMB o MC, XLD o SS y sembrar un hisopo en el caldo de tetrationato.

32

Actividad 3: Realiza el cultivo de la resiembra en los agares de XLD o SS y VB o SB, seleccionar colonias sospechosas de los agares de primoaislamiento y sembrar pruebas bioqumicas. Actividad 4: Seleccionar colonias sospechosas de los agares de resiembra y sembrar pruebas bioqumicas, interpretar las pruebas bioqumicas sembradas a partir de los agares de primoaislamiento e identificar la bacteria. Actividad 5: Interpretar las pruebas bioqumicas sembradas a partir de los agares de resiembra e identificar la bacteria . Actividad 6: Anota las observaciones y reporta resultados.

1.- OBJETIVO DE LA PRCTICA: Aislar e identificar Enterobacterias a partir de materia fecal procedente de pacientes con diarrea.

2.- INTRODUCCIN: El estudio de la materia fecal para el aislamiento e identificacin de bacterias productoras de diarrea se denomina coprocultivo y apoya el diagnstico clnico. Hasta hace algunos aos la proporcin de anlisis positivos eran de un 10 a 20 % an en las mejores condiciones de laboratorio, este porcentaje ha aumentado si se incluye en la bsqueda agentes como Escherichia coli, Salmonella, Shigella y Yersinia, lo que involucra usar varios medios de cultivo selectivos y diferenciales para el aislamiento primario y la identificacin; de esta manera es posible ofrecer apoyo para que puedan ayudar a los enfermos a combatir estas enfermedades. 3.- FUNDAMENTO La porcin inferior del intestino tiene una flora bacteriana normal muy excesivamente amplia, los microorganismos con mayor prevalencia son los anaerobios ( Bacteroides, bacilos Gram positivos, Streptococcus, bacterias entricas Gram negativas; cualquier intento por aislar bacterias patgenas de las heces implica la separacin de los gneros patgenos, usualmente a travs del empleo de medios selectivos, diferenciales y de caldos de enriquecimiento.

4.- MATERIALES A UTILIZAR: (Equipo de 6 a 7 integrantes) CANTIDAD DESCRIPCIN 33

Cajas Petri desechables sin divisin Hisopos estriles. Asa bacteriolgica estndar Asa bacteriolgica recta Algodn Gasas Matraz Erlenmeyer de 250 y 500 ml Tubos de 13X100 Papel estraza Pipetas graduadas de 10 ml.

5.- EQUIPO A UTILIZAR: CANTIDAD 1 1 2 4 4 4 Estufa bacteriolgica Mecheros Fisher Mecheros bunsen

DESCRIPCIN

Autoclave ( Olla de presin Presto de 21 lt. )

Rejillas con centro de asbesto Tripies

6.- MATERIAL BIOLGICO CANTIDAD

DESCRIPCIN

Muestra de material fecal en medio de transporte de Cary - Blair

7.- REACTIVOS: CANTIDAD DESCRIPCION Reactivo de Erlich 34

Agua destilada Reactivo de ortoparafenilen diamina Agua oxigenada Agar de Eosina Azul de Metileno ( Agar de EMB ) Agar de Mac Conkey ( Agar de MC) Agar de Xilosa Lisina Desoxicolato ( Agar de XLD ) Agar de Salmonella y Shigella ( Agar de SS ) Agar de Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa ( Agar de TCBS ) Agar de Hierro de Kligler ( Agar KIA ) Agar de Hierro y Lisina ( Agar LIA ) Agar Citrato de Simmons ( Agar CIT ) Medio de Movilidad Indol y Ornitina ( Medio MIO ) Caldo Urea ( Caldo UR ) Caldo Malonato ( Caldo MAL ) Caldo de tetrationato Kit para tincin de Gram

8.- RECOLECCIN DE LA MUESTRA: La materia fecal se obtiene con el uso de un hisopo del medio de transporte de Cary Blair o bien una muestra recin evacuada

9.- DESCRIPCIN DE LA PRCTICA a) Una muestra recin evacuada o un hisopado rectal en Cary Blair sembrarla como primoaislamiento en agar EMB o MC, XLD o SS estriando por estra cruzada e introducir un hisopo con muestra en un tubo de caldo tetrationato con dos gotas de lugol e incubar a 36 +/- 1 C durante 24 hrs. b) Realizar una resiembra a partir del caldo de tetrationato en agar SS o XLD y VB o SB estriando por estra cruzada. Seleccionar colonias sospechosas de Salmonella o Shigella a partir de los medios de primoaislamiento ( Colonias lactosa negativa y/o productoras de cido sulfhdrico ) y tomar el inoculo de una sola colonia con el asa recta y sembrar de la siguiente manera los tubos de las bioqumicas :

35

KIA: Picadura y estra en la superficie. LIA: Picadura y estra en la superficie. CIT: Estra en la superficie. MIO: Picadura en el centro. UR: Introducir el asa dos veces sin agitar. MAL: Introducir el asa dos veces sin agitar. Incubar los agares de la resiembra y pruebas bioqumicas a 36 +/- 1 C durante 24 hrs. c) Seleccionar colonias sospechosas de Salmonella ( Colonias lactosa negativa y/o con acido sulfhdrico ) y sembrar los tubos de las pruebas bioqumicas de la misma manera e incubar a 36 +/- 1 C durante 24 hrs. Adems llevar a cabo la interpretacin de las pruebas bioqumicas en base a los cambios de color, anotar las lecturas para identificar la bacteria utilizando la tabla de gneros y especies. d) Llevar a cabo la interpretacin de las pruebas bioqumicas en base a los cambios de color, anotar las lecturas para identificar la bacteria utilizando la siguiente .tabla

CARACTERISTICAS DE LA MORFOLOGIA COLONIAL DE Salmonella y Shigella EN LOS MEDIOS UTILIZADOS PARA AISLAR ENTEROPATGENOS

EMB
Salmonella Lac ( - )

MC
Lac ( - )

XLD
Negras Lac ( - ) Ojo de pescado

SS
Negras Lac ( - ) Ojo de pescado

VB
Transparentes Medio rojo

SB
Negras con Brillo metlico Ojo de pescado

Transparentes Transparentes

Shigella

Transparentes Transparentes Trabnsparente Transparentes Lac ( - ) Lac ( - ) s Lac ( - ) Lac ( - )

36

Medio rojo

TABLA DE IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS FRECUENTES IND H2S MOV CIT MAL UR LAC LIS ORN

37

Escherichia coli Salmonella sp Shigella sp Klebsiella K. oxytoca K. ozanae K. pneumoniae K. rhinoscleromatis K. planticola Proteus mirabilis Proteus penneri Proteus vulgaris Citrobacter C. amalonaticus C. diversus C. freundii Enterobacter E. aerogenes E. agglomerans E. cloacae Providencia P. alcalifaciens P. rettgeri P. stuarti Serratia S. licuefaciens S. marcescens S.odorifera S. rubidea

+ + V + + + + + + V -

+ + V + + -

+ + + V + + + + + V + + + V + + + V

+ + V + + V V V + + + V + + + + + + + +

+ + + + + V V V V +

+ V + + + + + V V V V V + V V -

+ + V + + V V V + V + V V +

+ + + V + + + + + + V

+ + + + V + + + + V -

10.- REPORTE DE RESULTADOS

Para reportar los hallazgos en el cultivo, primero se escribe el nombre de la bacteria, con su gnero iniciando con mayscula y la especie con minscula, subrayando ambos o escribindolo con letra cursiva y negrita. Reporte: Ejemplo Se aisl Salmonella sp

11.- OBSERVACIONES Leer las placas y pruebas bioqumicas en el tiempo especificado, ya que si se 38

leen antes o despus del tiempo los cambios de color presentados no sern confiables al determinar las lecturas de interpretacin.

12.- NOTAS IMPORTANTES

Las muestras deben de ser sembradas lo ms pronto posible para el primoaislamiento ya que Shigella es muy lbil al pH, no recolectar la materia fecal de la tasa del bao ni de recipientes donde se haya defecado con restos de orina.

13.- ACTIVIDADES Anota tus resultados. Informa tus resultados Comenta conclusiones con tus compaeros. Contesta el siguiente cuestionario. Completa el glosario de trminos.

14.- CUESTIONARIO 1.- Mencione ejemplos de otras bacterias causantes de diarrea. 2.- Diga por qu en la resiembra a partir del caldo de tetrationato no se aisla la Shigella? 3.- Investigue el nombre de otros ejemplos de caldos que se utilizan como enriquecimiento para el aislamiento de enteropatgenos. 4. - Diga que significa el precipitado negro formado en el agar de TSI o KIA. 5.- Mencione el nombre de los indicadores que contienen los medios de cultivo y pruebas bioqumicas utilizados para el estudio de las Enterobacterias. 6.- Diga cul es el segundo azcar en importancia que se toma como referencia para identificar las Enterobacterias. 7.- Mencione el nombre de otros medios de cultivo utilizados para aislar bacterias Enteropatgenas. 8.- Medio de transporte recomendado en la toma de muestra para realizar el coprocultivo?

39

15.-BIBLIOGRAFIA:

AUTOR Koneman Elmer Mac Fadin

TTULO Diagnstico Microbiolgico

EDITORIAL Panamericana, 2008

Pruebas bioqumicas para Panamericana, la identificacin de de 2003 bacterias mdica, importancia Panamericana, 2006 Panamericana, 2004 Microbiologa mdica Microbiologa inmunologa mdica. Micologa Mdica, Microbiologa. Manual moderno, 2005 e Interamerica, 2006 Interamericana, 1999. Interamericana

Prats Forbes. Sahm.

Microbiologa clnica Weissfeld. Diagnstico microbiolgico

Bayled Scout Brooks. Geo F Levinson Conant E. Prescott,Harley, Klein

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Prctica No. 5 Submodulo:1 Procesar cultivos bacteriolgicos

Titulo de la Prctica: Urocultivo

Fecha de realizacin: Enero 2013

Competencia profesional: Realizar urocultivo aislando e identificando el agente patgeno.

41

RESULTADO DE APRENDIZAJE: Realizar el cultivo de orina para el apoyo en el diagnstico de infeccin en vas urinarias ( Urocultivo ).

INTRODUCCIN: El urocultivo es uno de los mtodos tradicionalmente realizados en el laboratorio de microbiologa clnica que sigue manteniendo su vigencia y utilidad, no slo por ser sencillo y barato, sino porque adems establece un diagnstico de certeza identificando al agente causal de infeccin en vas urinarias, permite conocer la sensibilidad de dichos patgenos a los antimicrobianos. La infeccin de vas urinarias (IVU) es la enfermedad ms frecuente del aparato urinario. En el mbito hospitalario es la infeccin ms usual y en el comunitario sigue a las infecciones respiratorias. La mayora se consideran IVU no complicadas, se define como la presencia y proliferacin de grmenes en el tracto urinario. Habitualmente es bacteriana y excepcionalmente, mictica o vrica. Se pone en evidencia mediante el cultivo de la orina en medios de crecimiento apropiados.

ESTRATEGIA ENSEANZA- APRENDIZAJE: Actividad 1: Obtener la primer muestra de orina de la maana previo aseo de genitales con la tcnica del chorro medio. Actividad 2: Realizar el sembrado de la muestra en los agares apropiados.. Actividad 3: Identificar el uropatgeno aislado. Actividad 4: Anota sus observaciones y reporta resultados.

1.- OBJETIVO DE LA PRCTICA: 42

El alumno conocer la metodologa para el diagnstico de las infecciones en vas urinarias

2.- INTRODUCCIN: La orina de personas aparentemente sanas es estril, sin embargo, se dicen que hay bacteriuria cuando existe una infeccin a nivel de vas urinarias. La bacteriuria puede ser asintomtica o presentarse como una enfermedad crnica o aguda. Las infecciones de las vas urinarias son comunes en todo el mundo, en todas las pocas del ao y se presentan en pacientes de cualquier edad y de ambos sexos, hospitalizados o ambulatorios. Son causadas generalmente por una sola bacteria aunque ocasionalmente pueden encontrarse dos o ms. Las bacterias que se aslan de la orina de pacientes ambulatorios con infeccin en vas urinarias son: Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticus, Proteus sp, Klebsiella sp, Enterococcus faecalis, y Streptococcus pyogenes; en cambio en pacientes hospitalizados se asla Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella sp y Enterobacter sp. 3.- FUNDAMENTO Se pone en evidencia mediante el cultivo de la orina en medios de crecimiento apropiados. Si hay bacterias, crecern formando colonias que pueden ser contadas como unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml). En la mayor parte de los casos, el crecimiento de ms de 100 000 UFC/ml en una muestra de orina adecuadamente recogida puede significar infeccin. En presencia de sntomas o piuria puede haber IVU con recuentos de bacteriuria menores: 100 UFC/ml. Se considera que hay bacteriuria asintomtica cuando, en ausencia de sntomas, hay ms de 100 000 UFC/ml de un microorganismo en cultivo puro en dos muestras diferentes de orina. 4.- MATERIALES A UTILIZAR: (Equipo de 6 a 7 integrantes) CANTIDAD DESCRIPCIN Cajas Petri desechables sin divisin Asa bacteriolgica calibrada de 0.01 ml ( Mango negro ) Asa bacteriolgica recta Algodn Gasas Matraz Erlenmeyer de 250 y 500 ml Tubos de 13X100 Papel estraza 43

Pipetas graduadas de 10 ml. Frasco estril de boca ancha 5.- EQUIPO A UTILIZAR: CANTIDAD 1 1 2 4 4 4 Estufa bacteriolgica Mecheros Fisher Mecheros bunsen Rejillas con centro de asbesto Tripies

DESCRIPCIN

Autoclave (Olla de presin Presto de 21 lt.)

6.- MATERIAL BIOLGICO CANTIDAD Muestra de orina 7.- REACTIVOS: CANTIDAD DESCRIPCION Reactivo de Erlich Agua destilada

DESCRIPCIN

Reactivo de ortoparafenilen diamina Agua oxigenada Placas de gelosa sangre Agar de Eosina Azul de Metileno ( Agar de EMB ) Agar de Mac Conkey ( Agar de MC) Agar de Hierro de Kligler ( Agar KIA ) Agar de Hierro y Lisina ( Agar LIA ) Agar Citrato de Simmons ( Agar CIT ) Medio de Movilidad Indol y Ornitina ( Medio MIO ) Caldo Urea ( Caldo UR ) Caldo Malonato ( Caldo MAL ) Caldo de tetrationato Kit para tincin de Gram 8.- RECOLECCIN DE LA MUESTRA: 44

La recogida de la muestra se har con la primera muestra de orina por la maana mediante lavado previo de genitales, con jabn y bastante agua, descartando la primera porcin y recolectando la miccin media en un envase estril de boca ancha, en menos de dos horas a temperatura ambiente o de 24 horas a 2-8 C En caso de orinas por puncin supra pbica se utilizarn envases para transporte de anaerobios.

9.- DESCRIPCIN DE LA PRCTICA Siembra de la muestra: 1. Homogenizar la muestra y abrir el frasco junto al mechero. 2. Tomar con una asa bacteriolgica calibrada de 0.01ml o 0.001 ml estril de la muestra de orina. 3. Depositarla en la parte central de extremo a extremo en una placa de agar de eosina azul de metileno y realizar la siembra con la tcnica de la estra cerrada. 4. Esterilizar el asa, homogenizar la muestra y volver a tomar una muestra de orina. 5. Depositarla en la parte central de extremo a extremo en una placa de gelosa sangre y sembrar con la tcnica de la estra cerrada. 6. Incubar las placas a 37 C de 24 a 48 hrs. 7.- Revisar si el crecimiento corresponde al mismo tipo de morfologa colonial. 8.- Realizar un frotis de una de las colonias y teir con la tincin de Gram. 9.- De acuerdo a la morfologa microscpica y tincin de Gram identificar la bacteria. 10.- Calcular el nmero de UFC / ml de orina, por medio de la regla de tres.

10.- REPORTE DE RESULTADOS

Para la valoracin del urocultivo se cuantifica el nmero de colonias crecidas por mililitro de orina. Resultados: 1. Menos de 10.000 UFC/ml. Se informar se aslan menos de 10.000 45

UFC/ml. En casos especiales, como nios que precisan un urocultivo de control despus de una infeccin pasada, embarazadas o diabticos, y siempre en caso de cultivo puro, puede informarse del nmero de colonias y una identificacin mnima. 2. De 10.000 a 100.000 UFC/m. Si corresponde a un nico microorganismo patgeno, se indicar el nmero de colonias, identificacin a nivel de especie y antibiograma con la indicacin de valorar clnicamente. Con dos microorganismos aparecer el nmero de colonias, una identificacin de gnero y se solicitar una nueva muestra. Con tres o ms uropatgenos se considera muestra contaminada, pues es difcil saber si alguno de ellos est causando la ITU. 3. Ms de 100.000 UFC/ml. En cultivo puro de uno o dos uropatgenos, en el informe aparecer la identificacin por especie y el antibiograma de cada uno de ellos. 4.-Muestra contaminada si crecen ms de una bacteria diferentes, consideraremos la orina contaminada. El urocultivo puede ser negativo o tener recuentos bajos en caso de: a) tratamiento antibitico previo; b) miccin reciente, a menudo secundaria al sndrome cstico; c) obstruccin uretral; d) pH urinario muy bajo; e) infeccin por microorganismo exigente o de crecimiento lento. Especial atencin merece cualquier cantidad de colonias de Streptococcus agalactiae en gestantes.

Se escribe el nombre de la bacteria, con su gnero iniciando con mayscula y la especie con minscula, subrayando ambos o escribindolo con letra cursiva y negrita.

11.- OBSERVACIONES En pacientes ingresados con imposibilidad de recoger la muestra por s mismos, se realizar sondaje vesical por personal sanitario experto con las medidas aspticas oportunas. - Para la investigacin de anaerobios es necesario que la orina se obtenga por puncin suprapbica. - Para la bsqueda de micobacterias, la orina se recoge de la forma descrita anteriormente durante tres das consecutivos. En este caso el volumen de orina debe ser 100-150ml. y se elegir preferentemente la primera miccin de la maana. Cuando se sospecha la presencia de hongos el volumen ser superior a 20ml. y en el caso de 46

parsitos se recoger la orina de 24 horas. .

12.- NOTAS IMPORTANTES La orina debe llegar al laboratorio en el plazo de una hora. Cuando esto no sea posible debe refrigerarse a 4C durante un tiempo mximo de 24 horas. El laboratorio debe controlar el transporte, garantizndose el que las muestras han sido refrigeradas desde el momento de su toma, siendo admisible, si no puede garantizarse el transporte correcto, la utilizacin de algn conservante (cido brico al 2% o el sistema comercial con bricoformiato). No recolectar la orina desde el inicio de la miccin.

13.- ACTIVIDADES Anota tus resultados. Informa tus resultados Comenta conclusiones con tus compaeros. Contesta el siguiente cuestionario. Completa el glosario de trminos. CUESTIONARIO 1.- Bacterias ms comunes aisladas en los urocultivos positivos? 2.- Diga por qu se descarta la primera porcin de orina al momento de recolectar la muestra? 3.- Diga que se utiliza para recolectar la muestra de orina en nios pequeos? 4. Mencione tres factores que influyen para que una muestra salga contaminada? 5. Escriba los nombres de las bacterias que se aslan con mayor frecuencia en pacientes hospitalizados?
6.- Mencione un factor que influye para que un urocultivo pueda reportarse

como un falso negativo?.

14- GLOSARIO DE TERMINOS 47

Disuria

Suprapbica Uropatgeno Antibiograma 15.- EVALUACIN

GUA DE OBSERVACIN Instrucciones: a) Lee y analiza el fundamento de la prctica b) Selecciona adecuadamente los materiales y reactivos c) Desarrolla el procedimiento de la prctica d) Lee e interpreta los resultados e) Observaciones con base a la norma 166 y 087 Aspecto a observar
SI a) Ley y analiz el fundamento de la prctica. 1p b) Seleccion y prepar adecuadamente el material y reactivo. 1p c) Desarrollo correctamente el procedimiento. 2p d) Interaccin grupal e individual. 1p e) Manipul con destreza el equipo. 2p f) Ley, interpret y contrast eficazmente sus resultados con los valores referenciales.1p g) Cumpli con los aspectos de las NOM 005 y 087. 2p

Cumple
NO N/A

Observaciones

Puntos

16.- BIBLIOGRAFA: AUTOR Koneman Elmer Mac Fadin TTULO Diagnstico Microbiolgico EDITORIAL Panamericana, 2008 Pruebas bioqumicas para Panamericana, la identificacin de de 2003 bacterias mdica, Prats Microbiologa clnica Panamericana, 48 importancia

2006 Forbes. Sahm. Weissfeld. Diagnstico microbiolgico Microbiologa mdica Microbiologa inmunologa mdica. Conant E. Prescott,Harley, Klein Micologa Mdica, Microbiologa. Panamericana, 2004 Manual moderno, 2005 Levinson e Interamerica, 2006 Interamericana, 1999. Interamericana Bayled Scout Brooks. Geo F

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Prctica No. 6

Titulo de la Prctica: Cultivo de exudado farngeo

Fecha de realizacin: Enero 2013

Submodulo:1 Procesar cultivos bacteriolgicos

Competencia profesional: Realizar el cultivo de exudado farngeo

RESULTADO DE APRENDIZAJE: Realizar el cultivo del exudado farngeo para el apoyo en el diagnstico de la faringoamigdalitis de origen bacteriano.

INTRODUCCIN: La biota normal en vas respiratorias con frecuencia est constituida por bacterias raramente patgenas como Streptococcus no hemolticos , especies del gnero Staphylococcus, Neisseria no gonorrhoeae y meningitidis. La bacteria ms comn causante de faringoamigdalitis es el Streptococccus pyogenes ( Streptococcus beta hemoltico gpo A ) aunque tambin como patgenos de este sitio se encuentran Corynebacterium diphtheriae, Haemophilus influenzae, aislados espordicamente. La faringitis estreptocccica es una infeccin bacteriana que afecta la parte posterior de la garganta y las amgdalas, que se inflaman e irritan, lo cual provoca dolor de garganta particularmente molesto al tragar. Es posible que la garganta y las amgdalas presenten manchas o una capa de color amarillo y, quizs, los ganglios linfticos del cuello estn inflamados. ESTRATEGIA ENSEANZA- APRENDIZAJE: Actividad 1: Obtener la muestra del exudado farngeo.. Actividad 2: Realizar el sembrado de la muestra. Actividad 3: Seleccionar e identificar el agente patgeno. 50

Actividad 4: Anota sus observaciones y reporta resultados.

1.- OBJETIVO DE LA PRCTICA: Determinar e interpretar adecuadamente los aislamientos bacteriolgicos obtenidos en el cultivo del exudado farngeo. 2.- INTRODUCCIN: La faringitis estreptocccica se presenta comnmente en nios en edad escolar. La infeccin puede provocar dolor de cabeza, dolor de estmago, nuseas, vmitos y languidez. Las infecciones estreptocciccas de la garganta no suelen ir acompaadas de sntomas de resfro, como tos, estornudos, congestin o mucosidad nasal. Si bien los sntomas de la faringitis estreptoccica suelen desaparecer en unos pocos das sin tratamiento directo, los mdicos recetan antibiticos con el fin de evitar complicaciones relacionadas, como la fiebre reumtica. El cultivo del exudado farngeo puede ayudar a determinar las causas del dolor de garganta. Con frecuencia, el dolor de garganta se debe a un virus, pero el cultivo permite determinar si se debe a una bacteria estreptoccica para que los mdicos puedan brindar el tratamiento adecuado. 3.- FUNDAMENTO El sistema respiratorio se divide en vas altas o superiores, que comprenden las reas anteriores a la laringe, incluyendo la nasofaringe, orofaringe, laringe, epiglotis, odo externo y medio, y los senos paransales, y vas bajas o inferiores que incluyen todas las estructuras posteriores a la laringe. El tracto respiratorio habitual (la faringe) est formado por distintos microorganismos entre los que destacan los siguientes grupos y especies: estreptococos, estafilococos, micrococos, neisserias, Moraxella catarrhalis, corinebacterias, Haemophilus spp, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, Veillonela, Peptostreptococcus, Actinomyces, etc. Sin embargo, cuando encontramos una patologa en la faringe, el agente etiolgico ms frecuentemente aislado es el Streptococcus pyogenes, pero tambin, otros 51

microorganismos patgenos que podemos hallar son: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus alfa-hemoltico grupo viridans, etc. Para poder identificar el agente microbiano de la muestra problema, se proceder a la siembra del mismo en diferentes medios de cultivo, y as observar si hay o no crecimiento en cada uno de ellos. Adems se proceder a realizar diferentes pruebas La faringitis estreptocccica es una infeccin bacteriana que afecta la parte posterior de la garganta y las amgdalas, que se inflaman e irritan, lo cual provoca dolor de garganta particularmente molesto al tragar. Es posible que la garganta y las amgdalas presenten manchas o una capa de color amarillo y, quizs, los ganglios linfticos del cuello estn inflamados. La faringitis estreptocccica se presenta comnmente en nios en edad escolar. La infeccin puede provocar dolor de cabeza, dolor de estmago, nuseas, vmitos y languidez. Las infecciones estreptocciccas de la garganta no suelen ir acompaadas de sntomas de resfro, como tos, estornudos, congestin o mucosidad nasal.

4.- MATERIALES A UTILIZAR: (Equipo de 6 a 7 integrantes) CANTIDAD DESCRIPCIN Cajas Petri desechables sin divisin Asa bacteriolgica estndar Algodn Gasas Matraz Erlenmeyer de 250 y 500 ml Papel estraza 5.- EQUIPO A UTILIZAR: CANTIDAD 1 1 2 4 4 4 Estufa bacteriolgica Mecheros Fisher Mecheros bunsen Rejillas con centro de asbesto Tripies

DESCRIPCIN

Autoclave (Olla de presin Presto de 21 lt.)

6.- MATERIAL BIOLGICO CANTIDAD

DESCRIPCIN

Muestra de exudado farngeo 52

7.- REACTIVOS: CANTIDAD DESCRIPCION Agua destilada Placas de gelosa sangre Agar de Eosina Azul de Metileno ( Agar de EMB ) Agar de Mac Conkey ( Agar de MC) Agar de sal y manitol ( SM ) Kit para tincin de Gram 8.- RECOLECCIN DE LA MUESTRA: 1.- Se cita la paciente en ayunas y sin aseo bucal. 2.- Con un hisopo y abatelengua estril, con el hisopo se tocan las partes edematosas , con pstulas , inflamadas ; evitar tocar paladar , lengua , saliva para no llevar contaminantes y se coloca en un medio de transporte de Stuart.

9.- DESCRIPCIN DE LA PRCTICA 1.- Depositar la muestra en una placa de gelosa sangre, agar de sal y manitol y agar de eosina azul de metileno. 2.- Sembrar con la tcnica de la estra cruzada. 3.- Incubar a 37 C de 24 a 48 hrs. 4.- Buscar colonias pequeas, blancas beta hemolticas sospechosas de Streptococcus beta hemoltico. 5.- Realizar un frotis y colorear con la tincin de Gram (observar cocos en pares o cadenas Gram positivos). 6.- Identificar al Streptococcus pyogenes con la prueba de la bacitracina de la siguiente manera: a) Sembrar la colonia a identificar en la parte central de una placa de gelosa sangre , en forma masiva. b) Con una pinza flameada tomar un disco impregnado con bacitracina y colocarlo en el centro de la siembra masiva e incubar a 37 C 24. 53

c) Observar si se form el halo de inhibicin, si ocurri, esto indica que se trata de un Streptococcus pyogenes o Streptococcus beta hemoltico del grupo A , y si no ocurri lo anterior , se dice que no es un Streptococcus pyogenes sino un Streptococcus beta hemoltico no del grupo A. d) O bien identificar utilizando antisueros especficos de grupo A, B, C, D, F, G. 10.- REPORTE DE RESULTADOS

Un resultado normal o negativo significa que no se encontr ninguna bacteria u otros microorganismos que puedan causar un dolor de garganta. Cuando la colonia beta hemoltica sospechosa de Streptococcus pyogenes resulta positiva la prueba de la bacitracina o aglutina con el antisuero especfico del grupo A, se reporta que se aisl Streptococcus pyogenes. Si la colonia beta hemoltica sospechosa de Streptococcus pyogenes resulta negativa la prueba de la bacitracina o no aglutina con el antisuero especfico del grupo A, se reporta se aisl un Streptococcus beta hemoltico no del grupo A y practica la prueba con el resto de los antisueros para identificar el grupo a que pertenece.

11.- OBSERVACIONES Al momento de la toma de la muestra evitar tocar el paladar, lengua, parte interna de la mejilla o saliva, ya que se encuentra una variedad de bacterias que forman parte de la flora normal y el crecimiento dificultar la observacin del agente patgeno. La faringitis estreptocccica se presenta comnmente en nios en edad escolar. La infeccin puede provocar dolor de cabeza, dolor de estmago, nuseas, vmitos y languidez. Las infecciones estreptocciccas de la garganta no suelen ir acompaadas de sntomas de resfro, como tos, estornudos, congestin o mucosidad nasal.

12.- NOTAS IMPORTANTES El cultivo del exudado farngeo puede ayudar a determinar las causas del 54

dolor de garganta. Con frecuencia, el dolor de garganta se debe a un virus, pero el cultivo permite determinar si se debe a una bacteria estreptoccicca para que los mdicos puedan brindar el tratamiento adecuado. 13.- ACTIVIDADES Anota tus resultados. Informa tus resultados Comenta conclusiones con tus compaeros. Contesta el siguiente cuestionario. Completa el glosario de trminos. CUESTIONARIO 1.- Diga que otro medio de transporte se puede utilizar para la toma del exudado farngeo? 2.- Mencione las complicaciones que puede ocasionar una infeccin por Streptococcus pyogenes? 3.- Investigue el nombre de los virus que tambin pueden ocasionar una faringoamigdalitis? 4.- Mencione que otros grupos de Streptococcus se consideran agentes causantes de faringoamigdalitis? 5.- Investigue de que otra manera a travs del laboratorio se diagnstica la faringoamigdalitis ocasionada por Streptococcus pyogenes?
6.- Mencione tres recomendaciones al paciente antes de tomar la muestra.

14- GLOSARIO DE TERMINOS Exudado Secrecin Escarlatina Erisipela

15.- EVALUACIN
GUA DE OBSERVACIN

55

Instrucciones: a) Lee y analiza el fundamento de la prctica b) Selecciona adecuadamente los materiales y reactivos c) Desarrolla el procedimiento de la prctica d) Lee e interpreta los resultados e) Observaciones con base a la norma 166 y 087 Aspecto a observar
SI a) Ley y analiz el fundamento de la prctica. 1p b) Seleccion y prepar adecuadamente el material y reactivo. 1p c) Desarrollo correctamente el procedimiento. 2p d) Interaccin grupal e individual. 1p e) Manipul con destreza el equipo. 2p f) Ley, interpret y contrast eficazmente sus resultados con los valores referenciales.1p g) Cumpli con los aspectos de las NOM 005 y 087. 2p

Cumple
NO N/A

Observaciones

Puntos

16.- BIBLIOGRAFA ESPECFICA AUTOR Koneman Elmer Mac Fadin TTULO Diagnstico Microbiolgico EDITORIAL Panamericana, 2008 Pruebas bioqumicas para Panamericana, la identificacin de de 2003 bacterias mdica, Prats Forbes. Sahm. Microbiologa clnica Weissfeld. Diagnstico microbiolgico Microbiologa mdica Microbiologa inmunologa mdica. Conant E. Micologa Mdica, Panamericana, 2006 Panamericana, 2004 Manual moderno, 2005 Levinson e Interamerica, 2006 Interamericana, 56 Bayled Scout Brooks. Geo F importancia

1999. Prescott,Harley, Klein Microbiologa. Interamericana

IV.

CREDITOS DE ELABORACIN

Este cuaderno de trabajo fue elaborado por la academia de Laboratorio Clnico del CBTis 32. INTEGRANTES Q.F.B. Mara Esther Snchez Serra Q.F.B. Xchitl del Carmen Ros Ochoa Q.F.B. Miguel ngel Quijano Couoh Q.F.B. Pedro Joaqun Perales Sabido Q.B.P. Edgardo Salvador Acevedo Casarrubias Q.F.B. Andrs Barrientos Acosta Q.F.B. Esly Hernndez Torres Q.F.B. Alejandra Guadalupe Garca Pantoja
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Dr. Mario Alberto Lpez Jess M.V.Z. Ramn Pichardo Hernndez V. VALIDACIN DEL CUADERNO DE PRCTICAS PERODO ESCOLAR:

PLANTEL: C.B.T.i.s. No. 32 Feb 2013 - Jul 2013

ACADEMIA LOCAL DE: Laboratorista Clnico Q.F.B. MIGUEL A. QUIJANO COUOH PRESIDENTE DE LA ACADEMIA
(Nombre y firma)

ACADEMIA ESTATAL DE: Laboratorista Clnico Q.F.B. MARIA ESTHER SNCHEZ SERRA PRESIDENTE DE LA ACADEMIA
(nombre y firma)

Villahermosa, Tabasco a Enero de 2013

CONTROL DE PRCTICAS DE LABORATORIO

Nombre del Alumno:_________________________________________________ Grupo:____________________________________________________________ No de Equipo: _____________________________________________________ Nombre del Profesor: ________________________________________________

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Prctica No. 1 2 3 4 5 6

Fecha de realizacin

Observaciones

Calificacin

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