GUIA DE LABORATORIO Unidad de Formacin Versin: Cdigo: 001 UC-BAC-BCLGL002

2 ANTIBIOGRAMA

Fecha:

2010

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Laboratorio No Tema:

Objetivos
Afianzar los conocimientos sobre mecanismos de accin de los antibiticos. Realizar los mtodos aplicados en Bacteriologa, para conocer sensibilidad. Aplicar los trminos CMI y CMB, valorando un antibitico conocido. Conocer cuando un microorganismo es resistente, intermedio o sensible.

Fundamento
Introduccin El antibiograma es un procedimiento in vitro, utilizado para conocer la sensibilidad bacteriana frente a un conjunto de medicamentos seleccionados. El tratamiento adecuado de un proceso infeccioso, est relacionado con 3 premisas esenciales: El foco o sitio de localizacin de la infeccin. El conocimiento adecuado del agente etiolgico. La susceptibilidad de tal agente, a los microbianos que pueden alcanzar niveles teraputicos en el sitio infeccioso. Por su actividad dentro de la bacteria los antimicrobianos pueden ser: Bacteriostticos: bloquean el desarrollo y multiplicacin de las bacterias Bactericidas: provocan la muerte o lisis del germen, siendo este proceso. Por su origen pueden clasificarse en: Antibiticos biolgicos: producidos por microorganismo, cuando se derivan de bacterias, hongos o sustancias naturales. Sintticos o quimioteraputicos: cuando se obtienen por sntesis qumica, no produciendo toxicidad en los tejidos ninguno de los dos. Los antimicrobianos tienen cuatro formas de ejercer sus efectos sobre el metabolismo y crecimiento de bacterias (mecanismo de accin).
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1. Inhibicin de la sntesis de la pared celular: Betalactmicos como las Penicilinas y Cefalosporinas; Macrolidas y Vancomicina. 2. Alteracin sobre la membrana citoplasmtica: son las Polimixinas y los Polienicos como la Nistatina y Anfotericina B. 3. Inhibicin de la sntesis proteica, entre ellos los aminoglucsidos (como Gentamicina, Kanamicina, Amikacina, Espectiomicina), el Cloramfenicol, Tetraciclinas y Macrolidos. 4. Bloqueo de la sntesis de los cidos nuclicos: las sulfonacidas, PAS (acido paraaminosalicilico). Mtodos de eleccin para determinar la sensibilidad bacteriana 1. Mtodo por difusin en Agar o Kirby Bauer 2. Mtodo por dilucin en tubo de ensayo MTODO POR DIFUSIN EN AGAR O KIRBY BAUER Es el mtodo ms utilizado en el laboratorio de microbiologa y se le conoce tambin como el antibiograma de discos. Recomendaciones para la realizacin del antibiograma Medios de cultivo: se emplea el Agar Mueller Hinton pH 7.2 - 7.4 y la capa debe tener un grosor de 4 mm. Sensidiscos: los antimicrobianos para esta tcnica vienen impregnados sobre papel filtro a una determinada concentracin que puede correlacionarse a la concentracin que alcanza este antibitico en los lquidos orgnicos. Deben mantenerse refrigerados en recipientes libres de humedad. Antes de ser utilizados deben dejarse a temperatura ambiente por una hora. Para una caja de Petri de 100 mm de dimetro deben colocarse 5 sensidiscos. Uno en el centro y 4 en la periferia, teniendo en cuenta que queden a 1 cm del borde de la caja y sus centros estn a no menos de 3 cm de distancia para limitar las probabilidades de superposicin de las zonas de inhibicin entre uno y otros discos. Condiciones del cultivo: el antibiograma debe realizarse a partir de cultivos axnicos. Debe recordarse que este mtodo aplica a microorganismos Gramnegativos
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como Enterobacterias, Pseudomona, Staphylococcus y Streptococcus del grupo D. no debe utilizarse para determinar la sensibilidad in vitro frente a bacterias como Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorrhoeae, bacterias anaerobias entre otras. Procedimiento Primer da: Preparacin del inculo Transferir con asa de 3 a 5 colonias del microorganismo en estudio a un tubo con 3 5 ml de caldo Mueller Hinton o caldo tripticasa de soya, hasta ajustar a una turbidez equivalente al tubo 0.5 de la escala de Mac Farland. Si no se obtiene esa turbidez, se ajusta utilizando una solucin salina estril y se incuban los tubos inoculados a 37 C de 2 a 6 horas hasta lograr la turbidez requerida. Inoculacin de placas Sumergir un escobilln estril a la solucin anterior, rotarlo varias veces y presionarlo luego sobre las paredes del tubo, presionar luego sobre las paredes del tubo por encima del nivel del caldo, para remover el exceso del inoculo. Sembrar sobre la superficie del Agar en forma masiva para cubrir todo el medio de cultivo, pasando luego el escobilln por la periferia del agar. Se deja secar las placas durante 5 a 10 minutos, nunca ms de 15 minutos. Colocacin de los sensidiscos Seleccione los sensidiscos apropiados. Aplique los discos con una pinza dispensadora de discos, previamente flameada y empleando precauciones aspticas. Deposite los discos sobre la superficie del agar, presionndolos para asegurar un mejor contacto entre el disco y el medio de cultivo. Incubacin En un plazo no mayor de 15 minutos, coloque las placas con el agar hacia arriba, en una incubadora a 37 C por 16 a 18 horas. (Para Haemophilus influenza, N. gonorrhoeae, S. pneumoniae y otros estreptococos en una atmosfera de CO2 al 5% a 37 C por 24 horas). Segundo da Lectura Se mide en milmetros (mm) el dimetro del halo de inhibicin de crecimiento
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bacteriano de cada antibitico. Esta medida se compara con las tablas estandarizadas de sensibilidad microbiana. El resultado de cada organismo especfico puede describirse como S (sensible), R (resistente) o I (intermedio). En el informe se debe anotar el nombre genrico del antibitico y no el comercial. Los factores que intervienen en el antibiograma por difusin pueden ser de tipo tcnico que comprometen la seguridad y confiabilidad invalidando el procedimiento. Causas de error Medios de cultivo: utilizacin de un medio diferente al Mueller Hinton, preparacin incorrecta del medio, mala concentracin de cationes divalentes Ca y Mg, volumen muy o poco denso, medio horizontal, mala conservacin. Inoculo: no estandarizar en un nefelmetro, cepa no pura, colonias tomadas sobre un medio inhibitorio. Discos: mala conservacin en ausencia de desecante, falta de presin al colocarlos sobre el agar, fecha de caducidad sobrepasada, nmero de discos demasiado elevado (causa interferencia de las zonas de inhibicin). Procedimiento: tiempo de incubacin (demasiado corto o muy largo), temperatura de incubacin, atmosfera de incubacin, errores de lectura, errores de transcripcin. MTODO POR DILUCIN Se utiliza para cuantificar la sensibilidad de la bacteria frente a concentraciones decrecientes del antibitico, determinando la concentracin mnima que es capaz de inhibir el germen: CMI (Concentracin Mnima Inhibitoria). Este mtodo se utiliza en casos especiales como: Procesos infecciosos que requieren de un esquema de dosificacin y los niveles de droga en suero estn controlados. Cuando los resultados del antibiograma por difusin son de dudosa interpretacin. Para evidenciar sinergismo o antagonismo entre agentes antimicrobianos contra determinado germen. Para determinar sensibilidad en anaerobiosis o en bacterias de lento crecimiento.
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Procedimiento 1. A partir de la ampolla de antibitico de concentracin especfica, preparar una serie de diluciones dobles progresivas. Ejemplo: una ampolla comercial de 80 mg de antibitico corresponde a 80000 ucg y se desea preparar 10 ml de una concentracin de 400 ucg. Vc x Cc = Vd x Cd Vc x 80000 = 10 ml x 400 ucg Vc = 0.05 ml de ampolla + 9.95 de caldo 2. Adicione al primer tubo 2 ml de la concentracin preparada y adicione 2 ml al tubo N 2, mezcle fuertemente. Con una pipeta estril, pase 2 ml al tubo N 3, mezcle y pase nuevamente al tubo N 4. As sucesivamente, hasta llegar al tubo N10. El tubo N11 es el tubo testigo bacteriano (no lleva antimicrobiano pero presenta turbidez positiva). El tubo N12 solo lleva 2 ml del antimicrobiano como control negativo de crecimiento (suspensin transparente). 3. De la misma suspensin bacteriana con concentracin 1.5 x 10 microorganismos viables por ml, tomar 10 ul para depositarlos en cada tubo de dilucin del antibitico (tubos del 1 al 10) y al tubo N 11. 4. Incubar de 12 a 18 horas a 37C y realizar la lectura por presencia. Interpretacin El primer tubo que se observe sin turbidez, corresponde a la CMI. Anotar frente al germen que proceso, la CMI con respecto al antibitico usado. A partir de los tubos donde no se observa crecimiento, se puede determinar la concentracin mnima bactericida CMB, que corresponde a la concentracin que adems de inhibir la bacteria le causa la muerte. Para hallar la CMB se extiende sobre Agar Mueller Hinton una gota de cada uno de los tubos de la prueba CMI en los que se detecta turbidez. Se incuban 18 24 horas. La CMB viene determinada por la concentracin ms baja de antibitico (Tubo)
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con la que no crecen las bacterias en las placas de extensin (agar).

Materiales y Equipos
Item 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Tipo MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT MAT EQU Descripcin Escobillones estriles Tubo patrn 0.5 de la escala de Mac Farland Agar Mueller Hinton Caldo BHI Pinza metlica dispensadora de discos Asa bacteriolgicas rectas y de argolla Sensidiscos Cepas en agar nutritivo de grmenes Gramnegativos y Grampositivos Cinta de enmascarar Fsforos Gradillas Lpiz marcador Mecheros Reglilla de lectura de halos Solucin salina 0.9% estril Pipeta de 2 ml estril Puntas estril Antibitico 80 mg Pipetas automticas Incubadora

Consulta
1. Qu es antagonismo y sinergismo antimicrobiano? 2. Investigue como se prepara la escala de Mac Farland y a cuantos microorganismos viables equivale cada tubo. 3. Control de calidad al tubo patrn 0.5 de la escala de Mac Farland. 4. Elabore una tabla que clasifique los diferentes antibiticos por su mecanismo de accin. Inhibidores de la sntesis de la pared celular Inhibidores de los cidos miclicos
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Inhibidores de la sntesis de las protenas Inhibidores de cidos nucleicos Inhibidores de la membrana citoplasmtica.

Bibliografa
Koneman, Elmer, et, Diagnostico Microbiolgico. Medica Panamericana Keith J. et al. Bacteriologa Clnica. Masson.

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