Aula 3:MICROSCOPIAConceito a arte de empregar o microscpio. O que um microscpio?

A palavra tem origemgrega

mikrs , pequeno, e skoppoo, observar, ver atravs de

e significa um instrumentoatravs do qual se observa coisas pequenas. Partes do microscpio a)

Parte mecnica: p (base); brao (estativa ou coluna); platina (mesa); canho (tubo);parafusos: macromtrico e micromtrico; revlver (tambor); charriot. Compem osistema de suporte e ajuste.b)

Parte ptica: lente ocular; lente objetiva; condensador com diafragma; espelho oufonte de luz acoplada. Compem o sistema de aumento e de iluminao. a) Parte Mecnica P: o local de apoio, d estabilidade ao aparelho e serve de suporte para as demais peas.Brao: Suporte pesado que sustenta os tubos, a mesa, o condensador, os parafusos macro emicromtrico.Platina: Redonda ou quadrangular, pode ser fixa, mvel ou giratria no plano horizontal.Sobre ela fica a lmina com o material a ser observado. Apresenta uma abertura no seucentro permitindo a passagem dos raios luminosos, coletados pelo espelho ou oriundos defonte luminosa prpria e convergindo sobre o material da lmina pelo condensador ediafragma. Os raios chegam atravs da lente objetiva do tubo e da ocular at o globo ocular(retina) do observador. A preparao sobre a lmina afixada platina atravs de duaspresilhas mveis.Canho: Nos microscpios monoculares (que possuem uma s ocular), o canho representaum cilindro metlico, que pode ser reto ou oblquo. Os microscpios binoculares (quepossuem duas oculares) podem ser inclinados, com ajuste para as distncias entre os olhosde cada observador.Parafuso macromtrico: o parafuso maior, de avano rpido. Possui botes bilaterais,localizados acima ou abaixo da platina. Utiliza-se primeiro para atingir a aproximao dafocalizao grosseira do material. Possui um percurso vertical, com

cerca de 7 cm.Parafuso micromtrico: o parafuso menor, de avano lento. Comandado, tambm portambores laterais. Permiti o deslocamento do tubo a apenas dois milsimos de milmetro ou menos, portanto seu emprego s utilizado para acertar a focalizao do material j visvel.Emprega-lo antes no indicado, pois perde-se muito tempo tentando obter deslocamentosmaiores. utilizado para obter um enfoque perfeito da preparao. Entretanto, quando apreparao j parecer estar perfeitamente focalizada, devemos ter sempre a mo sobre oparafuso e proceder a pequenas oscilaes, que permitam precisar certos detalhes, ouperceber novos elementos, ainda no vistos.Revlver: Fica acima da platina. As objetivas se encaixam numa pea rotatria e giramsempre no sentido do menor para o maior aumento.Charriot: Pea reguladora localizada na platina e que serve para movimentar a lmina nocampo. Um parafuso desloca a lmina para frente e para trs e outro parafuso a deslocapara a esquerda ou para a direita. b) Parte ptica Lente ocular: Encaixada na extremidade superior do tubo, pode ser retirada e substitudafacilmente. Juntamente com a objetiva fornece a imagem do objeto. As oculares fornecem,geralmente, ampliaes iguais s obtidas por lentes ou lupas manuais. Com a ocular demaior aumento a parte visvel da preparao mais restrita.Ex. Se examinarmos uma preparao de glbulos de sangue com a ocular de menorampliao, os elementos sero menores, porm mais numerosos em cada campo domicroscpio. Por outro lado, com a ocular de maior ampliao, os elementos sero maiores,mas em cada campo ver-se- um nmero muito mais reduzido de elementos. Se omicroscpio for monocular conveniente fazer a observao com ambos olhos abertos,olhando-se com qualquer um dos dois. Quanto menos iluminada estiver a mesa mais fcilser consegui-lo.Caracterstica tcnica da ocular:Aumento: O poder de aumento se encontra gravado na ocular.-

a ocular X 4 aumenta 4 vezes a imagem produzida pela objetiva.-

a ocular X 6 aumenta a imagem 6 vezes-

a ocular X 10 aumenta a imagem 10 vezes.Se a imagem do objeto aumentou 40 vezes mediante a objetiva de X 40 e aps 6 vezesmediante a ocular de X 6, o aumento total ser de 6 x 40 = 240 X.Para calcular o aumento total da imagem do objeto que se observa, multiplicamos o poderde aumento da objetiva pelo da ocular.Lente objetiva: Fornece a imagem ampliada do objeto. H objetivas a seco e de imerso. Asobjetivas de maior ampliao tm as lentes terminais menores.a) Objetivas a seco So as mais correntemente empregadas. Entre a lente frontal e alamnula s existe ar. As objetivas, sem indicao especfica, so destinadas aos exames aseco, isto , nenhum lquido

pode ser interposto entre a preparao e a objetiva. claro queisto no quer dizer que com elas no se possa examinar um lquido, mas sim que, neste caso preciso que o lquido esteja coberto por uma lamnula e no em contato direto com aobjetiva.b) Objetiva de imerso - A objetiva de imerso promove a maior ampliao do objeto emestudo, entretanto menor a quantidade de raios luminosos que atravessam o tubo domicroscpio, para corrigir essa situao e aproveitar a maior quantidade de luz possvel,coloca-se entre a objetiva de imerso e a preparao uma gota de leo de imerso, evitandoassim a interposio do ar. O uso da objetiva de imerso requer grande luminosidade e oemprego do condensador. Nunca usar a seco uma objetiva de imerso. Caractersticas tcnicas das objetivas:1. Aumentos: O poder de aumento de cada objetiva se indica por um nmero gravado nosuporte da lente: a objetiva X 10 aumenta 10 vezesa objetiva X 40 aumenta 40 vezesa objetiva X 100 aumenta 100 vezes(A objetiva X 100 geralmente se encontra marcada com um anel para indicar que se deveus-la com leo de imerso).2. Abertura numrica (NA): A AN tambm se acha gravada no suporte da lente, junto aindicao do poder de aumento. Ex. X 100 / 1.30-

0,30 na objetiva X 10-

0,65 na objetiva X 40-

1,30 na objetiva X 100A medida que aumenta a AN maior o poder de resoluo (capacidade de perceberdetalhes adjacentes muito prximos, separando-os som nitidez). Ainda, a medida queaumenta a AN diminui a dimenso da lente frontal. A lente frontal da objetiva X 100 tem otamanho de uma cabea de alfinete, por isso deve-se manejar com cuidado.3. No suporte da objetiva pode ter outros nmeros:Ex. X 40 / 0.65160 / 0,17A altura recomendada em mm para o tubo do microscpio (entre a objetiva e a ocular), geralmente de 160 mm.A espessura recomendada em mm para a lamnula utilizada sobre a lmina, 0,17mm.4. Distncia de operao da objetiva: a distncia entre a lente frontal da objetiva e almina quando a imagem se encontra focada. A medida que o poder de aumento do objeto maior diminui a distncia de operao.-

objetiva X 10: a distncia de operao de 5 6 mm-

objetiva X 40: a distncia de operao de 0,5

 1,5 mm-

objetiva X 100: a distncia de operao de 0,15 0,20 mm5. Poder de resoluo: a capacidade de distinguir dois pontos muito prximos. Acapacidade de resoluo do olho humano 0,25 mm. Quanto maior for o poder deresoluo da objetiva, mais clara ser a imagem e maior a capacidade de por em evidnciadetalhes adjacentes muito prximos, separando-os com nitidez.Condensador com diafragma: Localizado abaixo da platina, sua funo principal fornecerbastante luz, tornando mais clara a preparao, indispensvel nas grandes ampliaes(objetivas de grande aumento) do material a ser observado. Ao se elevar o condensador,atravs do parafuso de ajuste, a iluminao mxima. Ao baix-lo obtemos umailuminao mnima. Alguns microscpios tm filtros coloridos, principalmente azuis debaixo do condensador. Se pode deixar ou tirar segundo o tipo de preparao que se vobservar. Pode haver trs parafusos colocados ao redor do condensador: um na frente, um aesquerda e outro a direita. Usam-se para centrar o condensador exatamente em relao aoobjeto em observao.O diafragma est dentro do condensador. Utiliza-se para reduzir ou ampliar um ngulo,portanto, tambm a quantidade de luz que entra no condensador. Fecha-se o diafragmaquando se usam objetivas de pouco aumento, para eliminar os raios laterais. Abre-se odiafragma na medida em que se aumentam as ampliaes, em conseqncia aumenta a NAe se pode observar detalhes menores do objeto. Espelho: encaixado por baixo do condensador. redondo e possui duas faces: uma planae outra cncava. A face plana usada nos pequenos aumentos, quando quisermos obter umcampo uniformemente iluminado e tambm para quando usamos a objetiva de imerso. Aface cncava usada em grandes aumentos. Entretanto estas regras no so absolutas. sugerido proceder por tentativas, quando a preparao est sob o microscpio, eexperimentar sucessivamente uma e outra face assim como as diferentes posies doespelho, at conseguir a visibilidade desejada. Preparao do microscpio para uso Procedimentos para centrar corretamente o condensador:1.

Coloque na platina uma preparao em lmina, sem lamnula. Desa o condensador.Abra o diafragma. Examine com a objetiva de menor aumento. Observe a preparaoatravs da ocular e focalize.2.

Feche o diafragma. No campo microscpico aparecer um crculo borrado de luzrodeado por um anel escuro.3.

Elevar o condensador lentamente at que as bordas do crculo luminoso estejamclaramente focalizadas.4.

Ajuste, se necessrio, a posio do espelho de maneira que o crculo luminoso fiquecentrado exatamente ou sobreposto rea clara que est rodeada pela zona escura.5.

Atravs dos parafusos para centrar o condensador faa os ajustes necessrios at queo crculo luminoso se encontre exatamente no centro do campo microscpico. Repita aoperao quando usar as outras objetivas. Ajuste do diafragma Abra o diafragma completamente, Retire a ocular e observe diretamente atravs do tubo domicroscpio; a lente superior da objetiva aparecer cheia por um crculo luminoso. Feche odiafragma lentamente at que este crculo luminoso ocupe somente 2/3 da superfcie.Repita esta operao at usar cada objetiva. Ajuste da ocular 1. Escolha da ocular: As oculares X 5 ou X 6 proporcionam resultados satisfatrios nolaboratrio clnico. Se utilizarmos oculares de maior poder se intensificar o aumento, mas provvel que no se observe melhor os detalhes.2. Ajuste da distncia interpupilar (distncia entre as pupilas dos olhos): Segurar as basesdas oculares com as duas mos e regular a distncia interpupilar at obter uma perfeitaviso binocular.3. Focalizao dos olhos direito e esquerdo: Um dos suportes das oculares, quase sempre oesquerdo, est provido de um anel para focagem. Se este anel se encontra no suporte daocular esquerda, feche o olho esquerdo e, empregando a objetiva X 40, focalize a imagempara o olho direito pela ocular direita. A seguir feche o olho direito e observe com o olhoesquerdo atravs da ocular esquerda. Se a imagem se encontra focalizada no necessrioajuste. Se a imagem no clara, faa girar o anel de focagem at obter nitidez de imagem.Neste momento o microscpio estar ajustado de acordo com a viso binocular prpria dooperador. Focalizao da objetiva 1. Emprego da objetiva de menor aumento ( X 5 ou X 10 )Na observao de uma preparao, inicie sempre pela objetiva de menor aumento.-

Coloque a lmina sobre a platina, fixe-a com a(s) presilha(s), mova a lmina com ocharriot at que o objeto fique exatamente no centro do campo.-

Desa o condensador completamente-

Desa a objetiva at encontrar -se imediatamente acima da preparao-

Utilizando o parafuso macromtrico de rpido avano eleve a objetiva at observar uma imagem clara atravs da ocular-

Faa ajustes com o parafuso micromtrico-

Se a iluminao insuficiente suba o condensador ligeiramente2. Emprego da objetiva de maior aumento ( X 40 )-

Sem olhar pela ocular, baixe o condensador at a metade da distncia.-

Ainda olhando por fora, desa a objetiva at coloc -la imediatamente por cima dapreparao (a distncia de operao muito pequena, cerca de 0,5mm).-

Atravs do parafuso macromtrico de rpido avano, eleve a objetiva muito lentamente at que aparea uma imagem borrada no campo microscpico.-

Busque o foco por meio do parafuso micromtrico de avano lento.-

Eleve o condensador para obter suficiente iluminao. -

Se o microscpio no tiver condensador utilize o lado cncavo do espelho.3. Emprego da objetiva de imerso em leo-

Utilizar preparaes completamente secas-

Colocar uma pequena gota de leo de imerso sobre a poro que se vai examinar(de preferncia usar leos sintticos)-

Eleve o condensador at onde possa chegar -

Abra completamente o diafragma-

Desa a objetiva X 100 at que entre em contat o com o leo-

Aproxime a objetiva da preparao at onde seja possvel, mas evite a presso nalmina (as objetivas modernas tem amortizador).-

Observe atravs da ocular e gire para cima, muito cuidadosamente, o parafusomicromtrico, de avano lento at que a imagem se encontre focalizada. Observao: Nos microscpios modernos a objetiva no sobe nem desce, e sim a platina que se move atravs do comando do parafuso macromtrico de avano rpido edo parafuso micromtrico de avano lento. Neste caso os parafusos devem girar emdireo oposta para a focalizao da imagem.Mudana das objetivasOs microscpios modernos so construdos de tal maneira que quando se muda aobjetiva de menor aumento para a de maior aumento o objeto permanece mais oumenos focalizado sendo necessrio pequeno ajuste com o parafuso micromtrico. Seisso no acontecer, suba o revlver antes de fazer a mudana para a objetiva de maioraumento e aps focalize novamente. Antes de mudar a objetiva certifiquese que oobjeto examinado encontra-se no meio do campo microscpico (crculo luminoso quese observa atravs da ocular), a fim de no perde-lo depois na troca de objetivas. Cuidados no uso apropriado do microscpio1.

 essencial que voc conhea as partes pticas e mecnicas do microscpio, tendo ocuidado de ler e absorver as instrues contidas nos manuais que os acompanham,e/ou seguir as orientaes do professor em classe.2.

Mantenha o microscpio livre de poeira, vapores cidos e do contato com reagentes.Para mant-lo seco, cubra com capa de flanela pois evita o p e a multiplicao defungos(Obs.: as capas devem ser lavadas periodicamente).3.

No manusear o equipamento com as mos sujas ou molhadas.4.

Jamais comer ou beber prximo ao equipamento.5.

Na remoo do equipamento, segure-o firmemente com uma das mos no brao eoutra na base. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de trabalho de superfcie plana,evitando qualquer movimentao brusca. Nunca desloque o microscpio com almpada acesa ou logo aps ter sido apagada.6.

Muita ateno necessria quando se observa a preparao em meio lquido, poish sempre o risco de molhar a lente frontal da objetiva, portanto o conselho retiraro excesso de lquido com papel filtro, antes de colocar a lmina sobre a platina, emcaso de acidente, enxugar imediatamente com leno de papel absorvente macio.7.

Ao trabalhar com o colega no mesmo microscpio, aps a focalizao do objeto,desatarraxar o parafuso para soltar as oculares, e desloc-la para o colega quedever atarraxar suavemente, regulando o ajuste interpupilar.8.

Ao encerrar os trabalhos com o microscpio, desligue a luz, enrole o fio e posicionea objetiva de menor aumento sobre o orifcio da platina. Limpeza: - Parte ptica A nitidez das imagens depende diretamente do estado de limpeza das lentes. Isto pode serevitado pelo hbito de limpeza peridica.1. OcularesCom a objetiva de menor aumento

focalizado em uma preparao, gire as oculares everifique se existem partculas que acompanham o movimento: caso existam elas, podemestar nas duas superfcies e neste caso ambas devem ser limpas com um bulbo de borrachae cotonete.Para retirar eventuais manchas de leo, dedos; umedecer um cotonete com solventeapropriado (lcool a 70% ou ter), tomando cuidado para no inundar as lentes, e secarimediatamente com um leno de papel. Freqentemente basta projetar o hlito na superfciedas lentes e limpa-las.Limpe freqentemente as oculares com leno de papel fino; pois o contato com os clios emesmo poeira podem suj-las. Nunca toque as lentes com os dedos, pois a gordura atraipoeira.Precauo especial requerida no uso de solventes hidrocarbonetos, como o xilol, poispodem penetrar na rea de fixao das lentes no suporte dissolvendo a cola, bem comoproduzir pelcula sobre as lentes. 2. ObjetivasCada objetiva deve ser desatarraxada cuidadosamente do revlver e aps a limpezarecolocada na posio original, para tanto, usar a mesma tcnica descrita para as oculares.No entanto, como as superfcies das lentes so menores que as das oculares, recomenda-seinspeciona-las com uma pequena lupa manual.Para retirar poeira da face posterior da objetiva, usa-se um pincel de plo muito macio.Aps o uso da objetiva de imerso, retirar o excesso de leo com um papel de filtro eterminar a limpeza com um cotonete levemente embebido de ter. Jamais usar lcool nalimpeza do leo de imerso, pois este no dissolvido pelo lcool, mas forma com ele umprecipitado branco. - Parte mecnica Evitar o acmulo de poeira e areia. Antes de proceder a lubrificao, a sujeira deve serretirada.Para lubrificar a cremalheira (pea dentada) do parafuso macro e micromtrico econdensador, coloque uma pequena quantidade de vaselina neutra e aps move-se paracima e para baixo a fim de espalha-la. Nunca force o parafuso macro e micromtrico queesteja emperrado ou duro. Para as partes expostas, suficiente lav-las usando tecidoumedecido com gua e sabo neutro.