CROMATOGRAFIA EN CAPA

FINA
Análisis Instrumental II
MECANISMOS DE SEPARACIÓN
  Adsorción

  Reparto

  Intercambio iónico
BASES TEÓRICAS DE CCF
  Principios de equilibrios de adsorción y partición:
OPERACIÓN DE CCF
  El adsorbente se mezcla con un aglutinante, a
menudo yeso; esta mezcla se suspende en agua y
se deposita sobre una placa de vidrio o sobre una
superficie plana rígida, metálica o de un material
plástico por medio de un dispositivo
embadurnador apropiado. Al secarse, la
suspensión queda adherida a la placa de vidrio,
bien directamente o por efecto de un aglutinante,
como una capa delgada y rugosa de adsorbente de
un espesor de 0.1 a 2 mm. Esta capa puede
utilizarse en cromatografía en forma similar a
una hoja de papel. Pero, ahora la separación
depende de las propiedades adsorbentes de la
capa, tal como si el adsorbente estuviera
rellenando una columna.
ADSORBENTES Y OTROS
SEPARADORES
CROMATOGRÁFICOS
  Los mismos/similares a los usados en CC
  < tamaño de partícula que en CC

  Algunos adsorbentes tienen un indicador fluorescente

(Silicato Zn / 254 a 360 nm)
  Adsorbente más utilizado en CCF, gel de sílice
ADSORBENTES Y OTROS
SEPARADORES
CROMATOGRÁFICOS
  Óxidode Aluminio (Alúmina)
Adsorbente alcalino, preparado también
como alúmina neutra y ácida.
Utilidad: Separación de compuestos neutros
y alcalinos, hidrocarburos policíclicos,
alcaloides, aminas, vitaminas liposolubles
y algunas cetonas. La alúmina puede
catalizar la descomposición de muchos
compuestos organicos, en particular
cetonas insaturadas
ADSORBENTES Y OTROS
SEPARADORES
CROMATOGRÁFICOS
  Gel
de sílice:
Para separar: aldehídos, cetonas, alcaloides,
azúcares, fenoles, esteroides, terpenoides,
acidos grasos y aminoácidos.
Cuando la gel de sílice no se activa por calor,
contiene agua suficiente para que las
separaciones ocurran por un mecanismo de
reparto.
ADSORBENTES Y OTROS
SEPARADORES
CROMATOGRÁFICOS
  Celulosa
y resinas cambiadoras de iones se
emplean en la cromatografía de capa delgada por
intercambio iónico y las resinas se usan también
para separación de compuestos orgánicos por
mecanismo de reparto.
ADSORBENTES Y OTROS
SEPARADORES
CROMATOGRÁFICOS
  Polvo de poliamidas: Formación de enlaces de
hidrógeno entre cadenas de polímero y solutos.
Preparadas a partir de nylon 66, nylon 11 y nylon 6
Tipos de compuestos separados: flavonoides,
fenoles, nitroanilinas, benzofenonas, derivados de
aminoácidos, etc.
ADSORBENTES Y OTROS
SEPARADORES
CROMATOGRÁFICOS
  Aglutinantes: Su objeto es retener la capa del
adsorbente sobre la placa; el más común es el
yeso (sulfato de calcio monohidratado), que se
añade a los adsorbentes en un 10 a 15%. Otro es
el almidón que se añade en cantidades de 1 a 3%.
PREPARACIÓN DE PLACAS
  Aplicador Kensaco
Espesores múltiples y compuertas intercambiables: capas de 250,
275, 500, 1500 y 2000 µm de espesor.
Compuerta para capas de espesores de 50 a 3000 µm en etapas de
50 µm.
Valores de Rf constantes dentro de un intervalo de espesor
razonablemente amplio (10 a 20 µm)
Compuertas con gradiente de espesor.
Aplicadores con separadores de adsorbente, para dos a cinco
secciones paralelas de diferentes capas de adsorbentes sobre la
misma placa.
  Aplicador Camag:
  Estacionario, la placa se desplaza por debajo del aplicador. Se
producen placas de 300 a 500 µm de espesor y durante el secado
se encoge la capa de 200 a 250 µm.
Preparación de portaobjetos por sumergimiento en suspensión
de adsorbente.
OPERACIÓN DE CCF
PREPARACIÓN DE PLACAS
Secado:
Gel de sílice o alúmina, secada durante 15
minutos manteniendo el soorte en posición
vertical. Después se seca en posición
vertical en un horno durante 1 a 2 h a
10-120°C.
Actividad determinada efectuando la
cromatografía de una mezcla patrón de
colorantes (azobenceno, p-
metoxiazobenceno, p-aminoazobenceno,
sudán III y sudán IV) o mediante sustancias
del tipo de las que se desean separar.
PREPARACIÓN Y APLICACIÓN
DE MUESTRAS
  Procedimientos similares a CP y CC.
Aplicación de resinas intercambiadoras de iones en
punto de origen
Muestras en disoluciones de 0.1 a 1% se aplican con
micropipetas o microjeringas de 10 a 100 µl de
capacidad o con tubos capilares que terminen en
un orificio de 0.5 a 0.1 mm de diámetro.
Manchas deben tener de 1 a 3 mm de diámetro y
estar separadas por 1 a 2 cm (uso de plantillas es
recomendable)
Separaciones analíticas: aplicaciones de 5 a 100 µg.
SELECCIÓN DE SISTEMAS DE
DISOLVENTES
  Tiposde disolventes utilizados en CCF
dependiendo del adsorbente, su actividad y los
solutos:
  Disolventes puros de las series elutrópicas
  Mezclas de disolventes
  Disolventes totalmente acuosos, totalmente
orgánicos, acuoso-orgánicos e iónicos.

Pequeñas variaciones en la composición de las mezclas de

disolventes pueden variar Rf.
SELECCIÓN DE SISTEMAS DE
DISOLVENTES
  Mezclas equielutrópicas: Mezclas diversas de
disolventes que pueden originar iguales
desplazamientos de una misma mancha.
  En el estudio de productos naturales o de
productos farmacéuticos es conveniente correr
cromatografías del material usando mezclas en
diferente proporción de los mismos disolventes.
Sugerencias para el proceso de activación:
  El equilibrio de adsorción en la cromatoplaca depende de
la presión, temperatura y humedad.
  El vapor del aliento puede disminuir localmente la
actividad.
  En paises tropicales es indispensable activar las
cromatoplacas para lograr reproducibilidad.
  El tiempo en que se alcanza el equilibrio (actividad cte.),
depende del espesor de la capa y aumenta con éste.
  Algunos eluyentes pueden desproporcionar o condensar
al estar en contacto con superficies activas (p.ej.: la
acetona).
  Las sustancias patrón deben correrse sobre la misma
placa que la muestra.
  Es preferible correr las placas en áreas climatizadas.
Sugerencias para el almacenamiento de
cromatoplacas:
  Si se guardan en desecadores de vidrio, debe evitarse el
uso de grasa en el cierre.
  No suele ser necesario almacenar sobre desecantes.
Preparación de las muestras:
  Si se efectúa un análisis de trazas o muestras de
matrices complejas es necesaria una etapa previa de
purificación y/o enriquecimiento (clean-up).
  El clean-up separa en la medida de lo posible separar las
sustancias por grupos o tipos de sustancias antes de su
separación definitiva por cromatografía.
  Dependiendo del tipo de matriz puede efectuarse
extracción, destilación, sublimación o precipitación.
Sugerencias para efectuar un adecuado clean-up:

  Optimizar empíricamente el proceso.

  Cualquier error cometido en la preparación se arrastra
hasta la evaluación final del cromatograma.
  Utilizar cristalería absolutamente limpia y disolventes
adecuados para el tipo de análisis.
  Preparar suficiente extracto para efectuar medidas de
control (duplicados, triplicados, blanco).
  Al trabajar con muestras lábiles, cromatografiar lo antes
posible. Para almacenar una noche almacenar en
refrigerador. Para almacenar más tiempo, utilizar un
congelador.
Sugerencias para efectuar una adecuada
dosificación en cromatoplaca:
  Aplicar en banda elimina sobrecargas que producen
“colas”, se separan mejor y se evalúan con mayor
exactitud, pero pueden aplicarse menos bandas por
cromatoplaca.
Sugerencias para efectuar una adecuada
dosificación en cromatoplaca:
  Evitar disoventes que eluyan en forma circular sobre el
punto de partida.
  La muestra y el patrón deben ser solubles en el mismo
disolvente.
  Evaporar uniformemente para evitar asimetrías de
concentración debidas al ventilador.