AVANCES Y PERSPECTIVAS DEL CDIGO DE BARRAS DE HONGOS

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Niver Ivan Tarqui-Callejas, Jos Alberto Narvez-Zapata, Claudia Patricia Larralde-Corona* Centro de Biotecnologa Genmica - Instituto Politcnico Nacional. Blvd del Maestro s/n esq. Elas Pia, Col. Narciso Mendoza, C.P. 88710, Reynosa, Tamaulipas, Mxico. Tel: (55)57296000 ext. 87726 *Correo electrnico: plarralde@ipn.mx

RESUMEN El estudio de la taxonoma y filogenia de hongos, se ha basado en diversas tcnicas desde la morfolgica hasta las moleculares. Debido a la propagacin sexual y asexual de los hongos se gener un sistema dual en su nomenclatura bajo el enfoque morfolgico, el cual tiene grandes limitaciones, sin embargo con el desarrollo de tcnicas de biologa molecular, y particularmente con la estandarizacin para su aplicacin prctica y rpida, se ha podido superar en parte esta limitacin, as mismo la aplicacin de estas metodologas permiten un sistema de clasificacin que toma en cuenta la historia evolutiva de los hongos. Las metodologas basadas en PCR han empleado diversas tcnicas tales como el RFLP, RAPD, AFLP y DAF para la identificacin de hongos, y recientemente un enfoque integral (polifsico) ha revolucionado la sistemtica de hongos, incluso se ha propuesto de manera formal una nueva clasificacin en los taxa superiores del reino Fungi. La iniciativa del cdigo de barras del ADN de la vida, propone una alternativa novedosa para la exploracin de la diversidad biolgica, adems permite utilizar secuencias de ADN estandarizados para su aplicacin en la identificacin a nivel de especies de los hongos de manera rpida, precisa y universal, con el potencial de ser automatizada. 1. INTRODUCCIN La posibilidad de una rpida identificacin de la diversidad biolgica o de un organismo a nivel de especie, ha sido siempre deseable pero rara vez ha sido posible debido a la falta de especialistas as como de las herramientas adecuadas para su correcta aplicacin (Chase y Fay, 2009). Con el fin de desarrollar nuevas alternativas de identificacin se han propuesto diversos mtodos moleculares que permiten no solo identificar a nivel de especie sino tambin trazar la historia evolutiva de los individuos (Guarro y col.,1999). La estandarizacin de estas herramientas para su aplicacin rpida y precisa en la identificacin de especies se conoce como el cdigo de barras de la vida (Stockinger y col., 2010). Para la implementacin del conjunto de tcnicas que constituyen el cdigo de barras en los diferentes taxa de la vida se ha propuesto el uso de diversas regiones del ADN genmico, principalmente secuencias ribosomales y del ADN mitocondrial (Raab y col., 2005; Stockinger y col., 2010). No obstante, la aplicacin de estas herramientas moleculares sobre el material biolgico provenientes de diferentes grupos de especies se enfrenta a diferentes retos tecnolgicos para la correcta identificacin de grupos genticamente muy relacionados (Chase y Fay, 2009). Por ejemplo, la determinacin a nivel especie en hongos (en el marco del concepto de especie molecular), se basa principalmente en secuencias del ADN ribosomal, como son la subunidad pequea (SSU), los espaciadores internos transcritos (ITS) y la subunidad grande (LSU) (Stockinger y col., 2010). Sin embargo se ha observado que en algunos gneros como Fusarium, la consistencia y resolucin de la identificacin basada en estos genes marcadores es relativamente baja (ODonnell y col., 2007). Lo anterior, probablemente debido a la gran variabilidad intragenmica presente en los diferentes alelos ribosomales (Nilsson y col., 2006). Para estos casos, diversos investigadores han propuesto el anlisis de cdigo de barras basados en dos o ms genes marcadores (Balajee y col., 2007; Stockinger y col., 2010). De esta forma el presente estudio describe las aportaciones para el anlisis del cdigo de barras en hongos, haciendo nfasis en regiones de ADN ribosomal y mitocondrial. 2. Taxonoma y filogenia de hongos 2.1. Taxonoma de hongos A partir de la dcada de los 90 (S. XX) la clasificacin e identificacin de los organismos se baso en la combinacin de diversas tcnicas como: morfologa, bioqumica, inmunologa, estudios fisiolgicos y biologa

molecular (Martnez y col., 2004). Los hongos debido a su variedad de caractersticas y a su diversidad, presentaron problemas, en algunos casos, para definirlos de manera precisa, por lo cual se prefiere referirse a ellos describiendo tambin algunas de sus principales caractersticas (organelos citoplasmticos, tipo de nutricin y composicin qumica de la membrana celular). Recientemente, los anlisis a nivel de biologa molecular, han permitido ubicar a la mayora de los organismos con caractersticas de hongos en el reino Fungi con algunas excepciones, por ejemplo Phytium insidiosum y Rhinosporidium seeberi ubicados en el reino Chromista y Pnemocystis carinii en el reinoProtozoa (Erikson, 1994; Kendrick, 2000). El concepto clsico de especie en hongos se basa entonces en las caractersticas morfolgicas de las esporas sexuales y en los cuerpos fructificantes presentes en los estadios sexuales de su ciclo biolgico, siendo sta la lnea base para la taxonoma y nomenclatura de los hongos (Pelczar y col., 1998; Guarro y col., 1999). Sin embargo la identificacin de especies basado en la morfologa de esporas no de fcil aplicacin e incluso algunos especialistas no se ponen de acuerdo en las caractersticas generales de las esporas (Guarro y col., 1999). 2.1.2. Concepto de especie en hongos La especie es el nivel bsico en la clasificacin taxonmica, por lo tanto su conceptualizacin es importante para definir a los individuos. Los miclogos han utilizado diversos enfoques para delimitar las especies fngicas, de esta forma, han realizado varios esfuerzos para llegar a universalizar el concepto de especie sin resultados concretos, en consecuencia se utilizan diferentes conceptos para definir a una especie desde el morfolgico hasta el gentico (Guarro y col., 1999). Davis (1995), puntualiza algunas caractersticas de los conceptos de especie utilizados para delimitar a los hongos: a) Morfolgico(fenotpico) se basa en determinar las caractersticas morfolgicas de cada individuo, para establecer diferencias particulares que existen entre ellos, es el concepto clsico utilizado para la identificacin de hongos. b) Polittico, este concepto se basa en la combinacin de caracteres, sin embargo cada cepa no necesariamente puede tener una misma combinacin. c) Ecolgico, se toma en cuenta principalmente la adaptacin de los individuos a los hbitats, y no el aislamiento reproductivo. Se utiliza por lo general para los hongos patgenos de plantas. d) Biolgico, este concepto hace nfasis en el intercambio de genes dentro de la especie (reproduccin sexual y parasexual) as mismo en la existencia de barreras que no permiten el cruzamiento entre especies. Los estudios filogenticos y el desarrollo de modernas tcnicas moleculares en particular el anlisis de secuencias del ADN, han permitido cambios significativos en la concepcin tradicional de la sistemtica. Dado que stos desarrollos proporcionan nueva informacin, ha provocado que el concepto especiesbiolgica haya sido objeto de crticas en favor del concepto especie-filogentica. El concepto especiefilogentica, se basa en el anlisis cladstico de las caractersticas moleculares del individuo y por lo general los resultados son coherentes en la delimitacin de especies (Kurtzman y Robnett, 1997; Seifert y col., 1995). 2.1.3. Filogenia y evolucin de hongos Se han realizado diversos estudios moleculares para la comprensin de la evolucin de los hongos pero, sin embargo, estos estudios se han enfrentado a diversas dificultades como la falta de registros fsiles, la enorme diversidad de los mismos y a las discrepancias obtenidas con los anlisis de evolucin basados en los estudios previos de morfologa simple (Berbee y Taylor, 1992). Por lo tanto, los estudios evolutivos de hongos han incorporado, adems del anlisis molecular, el anlisis basando en la comparacin morfolgica, composicin de pared celular, metabolismo celular, pruebas citolgicas, elementos ultraestrurales y registro fsil, aun cuando este ltimo sigue siendo escaso (Guarro y col., 1999).

Figura 1. rbol filogentico de eucariotas, basado en secuencia de ADN 18S. (Tomado y modificado de Guarro y col., 1999) Los estudios filogenticos aplicados a los diversos reinos taxonmicos dependen de las regiones moleculares y del algoritmo o mtodo estadstico empleado para establecer las relaciones evolutivas. Por ejemplo, en el anlisis filogentico con secuencias 18S ADN, el reino de los Hongos tuvo una relacin ms cercana con el reino animalia (Fig. 1) aun cuando por mucho tiempo este taxa fue clasificado como parte del reino de las plantas (Nikoh y col., 1994; Taylor y col., 1994). Ahora sabemos, que el anlisis de secuencias de aminocidos (enzimas) indica que estos diferentes taxa (plantas, animales y hongos) tuvieron un ancestro comn hace aproximadamente mil millones aos y las plantas fueron las que se separaron primero (Doolittle y col., 1996). Tomando en consideracin este tipo de anlisis y aunados a los registros fsiles, se estimaron la aparicin de los principales phyladel reino Fungi, Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycotahace 500 millones de aos, y la divisin de Basidiomycota y Ascomycota se dio hace 400 millones de aos (Berbee y Taylor, 1993). 2.2. Nomenclatura de hongos En la sistemtica de organismos, por lo general cuando es descubierto un nuevo individuo debe ser descrito bajo los lineamientos aceptados a nivel internacional, el nombre se le asignar bajo el sistema binomial latinizado, propuesto por Carl von Linneo (S. XVII). Dicha sistematizacin en la clasificacin de especies tiene el objetivo de establecer lineamientos con reglas claras y concretas, para evitar y rechazar nombres que causen confusin (Guarro y col., 1999). La nomenclatura de los grupos biolgicos est normada por diversos cdigos, la cual depende del tipo de organismo (plantas, bacterias, virus y animales) para el caso de la taxonoma de hongos incluyendo las levaduras, se basa en los lineamientos de la ICBN (International Code of Botanical Nomenclature) (Greuter y col., 1994). Los hongos se propagan de forma sexual (teleomorfos) y asexual (anamorfos) debido a esto se ha formado una nomenclatura dual para su identificacin, la cual est aceptado por la ICBN. Holomorfo es un termin reservado para aquellos hongos que presentan esporulacin teleomrfica y anamrfica al mismo tiempo, un ejemplo de ellos son los zigomicetos. As mismo es importante sealar que la descripcin de los hongos se

dio bajo circunstancias desconocidas hasta entonces de la existencia de sus fases sexuales (Gams, 1995; Guarro y col., 1999). Los hongos en fase asexual fueron agrupados en un inicio en el gnero anamorfo, posteriormente fueron clasificados en el phylum deuteromicetes, sin embargo con el desarrollo de tcnicas moleculares, basados en el anlisis de ADN los miclogos han propuesto unificar el sistema dual en la taxonoma de hongos, no obstante para propsitos solo de identificacin, se acord mantener el trmino deuteromicetes pero sin ser reconocido formalmente en un rango dentro de la sistemtica de los hongos (Blackwell, 1993; Reynolds,1993). El cambio de los trminos teleomorfo y anamorfo por meiosprico y mitosprico respectivamente, ha creado polmica entre los especialistas, debido a que algunos consideran que las fases (anamorfo y teleomorfo) del hongo no solo es determinado por el tipo de proceso celular, sino tambin por las caractersticas morfolgicas, as mismo se argumenta que los procesos citolgicos no han sido estudiados en profundidad, para establecer una correlacin con la morfologa teleomrfica y la recombinacin sexual (Hawksworth y col., 1995; Gams, 1993; Korf, 1993). 3. METODOLOGAS DE IDENTIFICACIN EN HONGOS Los hongos estn asociados a diversas causas de enfermedad, as como en interacciones biolgicas y procesos bioqumicos, por lo cual su identificacin es importante no solo en el campo de la salud, sino tambin en patologas de plantas, biodeterioro, aplicaciones biotecnolgicas y en investigaciones ambientales. La mayor parte de las especies de hongos, fueron identificados y clasificados tomando en cuenta solo el enfoque morfolgico (caractersticas fenotpicas), no obstante otros grupos fueron examinados desde diversos aspectos (fisiolgicos, bioqumicos, composicin de la pared celular y de protenas, y tcnicas moleculares) debido a su importancia econmica y/o mdica (Guarro y col., 1999; Balajee y col., 2009). 3.1. Identificacin morfolgica La identificacin y clasificacin de los hongos a diferencia de otros microorganismos (bacterias y virus) se ha basado principalmente sobre criterios morfolgicos. La microscopia de luz ha sido la herramienta ms utilizada, con algunas mejoras como la fluorescencia, citoqumica y el desarrollo de nuevas tcnicas de teido para las estructuras apicales de las ascas (Guarro y col., 1999). Por lo general los hongos cultivados en condiciones de laboratorio solo desarrollan las caractersticas de la fase asexual y en muy raras ocasiones las de la fase teleomorfa. Por lo cual la identificacin de anamorfos se basa principalmente en el tipo de conidio y procesos de conidiognesis (Hennebert y Sutton, 1994). Sin embargo varias caractersticas asociados a la fase teleomorfa son tiles para su identificacin y clasificacin, por ejemplo el tipo de cuerpo fructificante (basidiomas, ascomas) y el tipo de ascas (microscpicas y globosas) (Guarro y col., 1999). Estudios en la pared celular de los hongos por microscopia electrnica de transmisin, han permitido diferenciar los ascomicetos de basidiomicetos. A menudo los detalles en la superficie de las ascosporas ha facilitado la identificacin a nivel de especie en algunos ascomicetos (De Hoog y Guarro, 1995; Kurtzman y Fell, 1998). La identificacin de hongos, basado en el enfoque fenotpico siempre ha sido criticada por la falta de una terminologa universal y objetiva, as mismo las caractersticas morfolgicas estn sujetas a la variacin de las condiciones ambientales (Guarro y col., 1999). Adems el sistema dual de clasificacin (teleomorfos y anamorfos) basado en el enfoque fenotpico, no establece una coherente correlacin entre las taxonomas de los ascomicetos y deuteromicetos (Hennebert y Sutton, 1994). 3.2. Tcnicas bioqumicas de identificacin de hongos 3.2.1. Metabolitos secundarios Los metabolitos secundarios son compuestos no esenciales, ni intermediarios clave en el metabolismo del individuo, sin embargo es posible que desempee otro rol en el desarrollo de los hongos. Por lo general se

encuentran como una mezcla de molculas de estructura qumica rara, los ms comunes pueden ser esteroides, terpenos, alcaloides, ciclopptidos y cumarinas, algunos de stos compuestos son micotoxinas (Hawksworth y col.,1995). Las mejoras en la cromatografa de capa fina ha permitido identificar de manera ms rpida los metabolitos secundarios, que con las tcnicas convencionales (extraccin, purificacin y concentracin). El perfil de metabolitos secundarios, ha sido til para la identificacin y clasificacin de lquenes, pero el mtodo se ha empleado de forma reservada en la taxonoma de los Ascomycetes yBasidiomycetes, debido a que la produccin de tales compuestos pueden estar influidos por las condiciones ambientales, as como por las dificultades que se presentan en la tcnica (Carlile y Watkinson, 1994). Sin embargo, su potencial se ha demostrado en estudios realizados en los rdenes Eurotiales y Xylariales (phylum Ascomycota), las especies pueden ser identificadas sobre la base de sus perfiles de metabolitos (Frisvad, 1994; Whalley y Edwards, 1995). 3.2.2. Ubiquinonas Adems de los metabolitos secundarios, en taxonoma de hongos tambin se han utilizado otros compuestos que desempean un rol esencial en el metabolismo, como es el caso de las ubiquinonas (coenzima Q), stos compuestos desempean un papel importante en la cadena del transporte de electrones del sistema respiratorio (Carlile y Watkinson, 1994). Se sabe que el nmero de isoprenos adheridas al ncleo de la quinona es variable, y tales diferencias se emplean para la clasificacin (gnero y subgnero) en levaduras; sin embargo para las levaduras negras y hongos filamentosos el mtodo se ha utilizado de forma limitada (Yaguchi y col., 1996) debido a que las conclusiones basadas solo en el sistema de ubiquinona son debatibles, as mismo dependiendo del mtodo utilizado es posible obtener diferente conjuntos de datos (Samson, 1991). 3.2.3. Composicin de cidos grasos La composicin de cidos grasos celulares, se emplea rutinariamente en la taxonoma bacteriana. El tipo de cido graso y su concentracin relativa son las caractersticas que se utilizan para la separacin de taxones, stas tcnicas raramente se empleaban en hongos, sin embargo algunos cidos grasos son producidos por hongos y no por las bacterias (Veys y col., 1989). Estos anlisis se utilizan cada vez ms en la taxonoma de hongos (Stahl y Klug, 1996). La cromatografa de gases, en combinacin con los mtodos de anlisis multivariado, se ha empleado con xito en estudios de cidos grasos en hongos filamentosos, incluyendo Oomycetes, Zygomycetes, Basidiomycetes, adems de mycelia sterilia. Sin embargo, los aspectos tcnicos del procedimiento deben ser estandarizados y controlados para minimizar las fuentes de variacin debido a que pueden influir en los resultados; entre los factores ms importantes a ser normalizados son las condiciones de cultivo y la temperatura (Stahl y Klug, 1996). 3.2.4. Composicin de la pared celular Estudios en la pared celular de los hongos, han demostrado diferencias en su estructura y composicin, lo cual se ha utilizado para definir taxa superiores. La celulosa es un componente particular de la fraccin alcalino-soluble en Oomycetes, por el contrario enAscomycetesy Basidiomycetes contienen quitina y glucano en estas fracciones, y en Zygomycetes se presentan el quitosano y el cido poliglucornico. As mismo variaciones significativas en la composicin de azcares de la pared celular se han observado en gneros de dermatofitos (Guarro y col., 1993). La presencia o ausencia y la diferencia en cantidad de algunos polisacridos como la glucosa, manosa, fucosa, galactosa, ramnosa y xilosa son caracterstica que se han empleado en la clasificacin de hongos (Carlile y Watkinson, 1994). 3.2.5. Composicin proteica Los patrones de isoenzimas (zimogramas) han permitido diferenciar especies y establecer relaciones generales (Murphy y col., 1990). La secuenciacin de protenas y los mtodos inmunolgicos tambin se utilizan para la caracterizacin interespecfica debido a su adecuada resolucin (Kohn, 1992). El empleo de los zimogramas se considera una tcnica econmica y prctica para la deteccin de especies en grandes poblaciones; las aloenzimas (isoenzima allica) son generalmente utilizadas en estudios filogenticos (Kohn,

1992). 3.3. Tcnicas moleculares-tcnicas basadas en PCR La reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction) es una tecnologa que consiste en amplificar in vitrofragmentos especficos de ADN, con la finalidad de detectar una secuencia o gen de inters en el genoma de un organismo. En 1985 Kary B. Mullis patent y pblico su invencin (PCR), desde la fecha se ha empleado con xito en diferentes campos del conocimiento como en la medicina, biologa, agronoma, reas forense y taxonoma (Dale y von-Schantz, 2007). La PCR consiste en tres pasos esenciales: a) desnaturalizacin del ADN, sirve para separar por temperatura (94C) el ADN de doble cadena a molculas de cadena sencilla, que servirn de molde para la sntesis de los fragmentos; b) alineamiento, la temperatura se reduce para permitir el reconocimiento de los oligonucletidos a las cadenas moldes, la temperatura optima de alineamiento pude variar desde los 40 a 65 C, y depender de las caractersticas de los oligonucletidos (su longitud, composicin de bases nitrogenadas y especificidad); c) extensin, el ADN polimerasa producir la cadena de ADN complementaria a partir de los oligonucletidos unidos a las cadenas moldes, la temperatura de extensin optima es aproximadamente a 72C; la enzima ADN Taqpolimerasa agrega aproximadamente 1000 bases por minuto. Estos pasos (ciclo) se repiten las veces que sea necesario, para obtener de manera exponencial el fragmento de inters (en 30 a 40 ciclos se acumula alrededor de 106 a 108 molculas) a partir de la muestra de ADN (Dale y von-Schantz, 2007; Valdez y Kahl, 2005). Los procesos de replicacin de ADN tienen alta fidelidad, sin embargo el genoma de los hongos es dinmico, en la cual pueden ocurrir eventos de sustitucin, insercin, delecin, transposicin, rearreglos en regiones gnicas o en cromosomas, movimiento de genes desde los orgnulos hacia el ncleo, as como la adquisicin de elementos gnicos de otros organismos. Por lo tanto el genoma de los hongos presenta varias regiones de ADN cuyas caractersticas pueden ser analizadas en cualquier especie fngica, para lo cual se han desarrollado diversas tcnicas (a menudo con desconcertante siglas) para estudiar la variacin gentica de los organismos incluyendo los hongos (Piercey-Normore y Egger, 2001). 3.3.1. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin del ADN (PCR-RFLP) La tcnica de RFLP (Fig. 2) se basa en la accin de las enzimas de restriccin, que cortan en secuencias objetivo especficas, el producto de PCR digerido con stas enzimas produce un patrn de bandas de diferentes tamaos y stas son separadas de acuerdo a su longitud en un gel de electroforesis para su visualizacin (Piercey-Normore y Egger, 2001). Se ha aplicado esta tcnica para la identificacin de hongos (Saccharomyces, Aspergillus, Fusarium, Candida y Cryptococcus, entre otros) con importancia industrial y mdica (Hierro y col., 2004; Mirhendi y col.,2001).

Figura 2. Demostracin del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) 3.3.2. Amplificacin inespecfica del polimorfismo del ADN (RADP)

La RADP (Ramdomly Amplified Polymorfism DNA) ha sido la metodologa ms ampliamente utilizada en la PCR para diferentes propsitos, la tcnica se basa en el uso de pequeos oligonucletidos (9-10 nucletidos) para amplificar fragmentos de ADN de funcin y localizacin desconocida en todo el genoma (Fig. 3). Los fragmentos se amplificarn si los iniciadores se alinean de manera opuesta a las cadenas de ADN molde, produciendo un patrn de bandas polimrficas, y la cual pude ser visualizado en un gel de electroforesis (Valdez y Kahl, 2005). Se ha aplicado para identificacin y clasificacin a nivel de especie del hongo patgeno Fusarium oxysporum (Manulis y col.,1994).

Figura 3. Amplificacin inespecfica del polimorfismo del ADN (RADP). 3.3.3. Amplificacin de huellas del ADN (DAF) La tcnica DAF (DNA Amplification Fingerprinting) es similar a la RADP para identificar polimorfismos genmicos, se caracteriza porque en la PCR se utilizan oligonucletidos pequeos (5-6 nucletidos) para producir patrones de bandas que pueden ser visualizado en geles de agarosa o poliacrilamida; esta tcnica no necesita el conocimiento previo de la variacin del genoma, as mismo es en un mtodo simple, rpido y sensible que puede ser aplicado en una amplia variedad de organismos incluyendo los hongos (PierceyNormore y Egger, 2001). 3.3.4. Amplificacin de fragmentos de longitud polimrfica (AFLP) Esta tcnica AFLP (Amplification Fragment Length Polymorphism) hace uso de las enzimas de restriccin en combinacin con la PCR para producir fragmentos polimrficos. Bsicamente consiste en digerir el ADN con dos endonucleasas distintas (una de corte frecuente y otra de baja frecuencia), entonces los fragmentos son ligados con adaptadores (oligonucletidos de extremos compatibles con las enzimas utilizadas). Para la amplificacin de los fragmentos por PCR se utilizan diferentes combinaciones de complementariedad de los oligonucletidos (con una, dos o tres bases extra en el extremo 3), esto permite disminuir o aumentar el nmero de bandas amplificadas y comparar su polimorfismo generado. Esta tcnica es capaz de producir numerosos marcadores moleculares, no obstante stos pueden ser susceptibles a la agrupacin de pequeas regiones del genoma (Piercey-Normore y Egger, 2001; Valdez y Kahl, 2005). Esta tcnica fue usada para comparar las levaduras del gnero Saccharomyces (Flores-Berrios y col., 2005). 3.3.5. Identificacin molecular polifsica de hongos Los avances en las tecnologas de secuenciacin de ADN as como en los mtodos analticos, han revolucionado la sistemtica de hongos (Shenoy, 2007). Los hongos son reconocidos como un reino distinto del Plantae y son clasificados en un rango independiente, el reino Fungi (Whittaker, 1969; Cavalier-Smith, 2001; Hibbett y col., 2007). Este reino acepta cuatro phyla: Ascomycota, Basidiomycota,

Chytridiomycota y Zygomycota (Kirk y col., 2008), as mismo las phyla Myxomycota (mohos del limo plasmodiales), Dictyosteliomycota(mohos del limo celulares), y Oomycota (mohos acuticos) se excluyeron del reino (Barr, 1992; Bruns y col., 1992; Berbee y Taylor, 1994). Recientemente, se ha propuesto una clasificacin filogentica completa de los hongos, Ascomycotay Basidiomycotason clasificados en un subreino, el Dikarya (Hibbett y col., 2007). Chytridiomycota y Zygomycota son considerados clados polifilticos (Lutzoni y col., 2004) y han sufrido los cambios ms importantes en su clasificacin, Chytridiomycota se conserva en un sentido estricto junto conBlastocladiomycota y Neocallimastigomycota que representan phyla de hongos flagelados; los taxones tradicionalmente clasificados dentro de Zygomycotase distribuyen entre Glomeromycota y varios subphyla incertae sedis (Hibbett y col., 2007). 4. CONCEPTOS BSICOS DEL CDIGO DE BARRAS (BARCODING) Los datos moleculares permitieron elucidar el fenmeno de evolucin y se ha vuelto particularmente evidente con la ejecucin de proyectos de genomas. La secuenciacin de genomas completos est creciendo, sin embargo hay pocas posibilidades de que tal cobertura sea alcanzada para la mayora de las especies, as mismo solo se tiene la capacidad de analizar unas pocas docenas de ellas (Costa y Carvalho, 2010). La iniciativa del Cdigo de Barras de la Vida, propone una alternativa para la exploracin de la diversidad biolgica, el anlisis de una o varios segmentos (secuencias) de exactamente la misma seccin en cada genoma que pueda ser leda y anotada. Los segmentos estandarizados pueden ser utilizado como un identificador nico, un cdigo de barras, que funcionara como etiquetas para cada especie el cual permita hacer un inventario de la vida (Hebert y col., 2003). En un principio la idea del cdigo de barras de ADN fue aplicada en especies del reino Metazoa, usando marcadores mitocondriales (COI), sin embargo su aplicacin tambin fue extendida para otros reinos como las plantas y los hongos (Casiraghi y col., 2010b). 4.1. Breve historia sobre el cdigo de barras de ADN El sistema de clasificacin Lineana se adopt hace 250 aos y desde entonces se han descrito alrededor de 1.7 millones de especies por los taxnomos, no obstante ste valor es una pequea fraccin de la verdadera biodiversidad a nivel global, que se estima un aproximado de 10 millones de especies (Vernooy y col., 2010). La primera conferencia internacional (2000) sobre el cdigo de barras de vida se realiz en el Museo de Historia Natural en Londres, los tpicos que se discutieron fueron: las nuevas tecnologas y su utilidad en la biologa, el cdigo de barras de ADN como una herramienta revolucionaria (Marshall, 2005). En el 2002 se celebr el Deutsche Staatssammlung (Munich, Alemania) el Taller sobre Taxonoma de ADN, fue una de las primeras conferencias en el que se discuti la construccin de una base de datos de ADN, con potencial para la identificacin y clasificacin de organismos, as como para el apoyo a los programas de investigacin en ecologa y biodiversidad (Tautz y col., 2002). En esta primera etapa, el objetivo se centr en formar un sistema de clasificacin de organismos basados en ADN (taxonoma de ADN) sin embargo se observaron dificultades con respecto a la nomenclatura (Minelli, 2003). En el 2003 un grupo de trabajo liderado por Paul Hebert (Universidad de Guelph, Canad) desarrollaron y propusieron el uso de un gen mitocondrial como un marcador universal (citocromo oxidasa subunidad 1, COI) para especies animales (Hebert y col., 2003). La idea fue construir un marcador universal, haciendo analoga con el cdigo de barras que se utiliza para identificar a los productos en el comercio (Brown, 1997). En el 2004, la Fundacin Sloan promovi el establecimiento de una secretara para el "Cdigo de Barras de la Vida", inspirado en el Museo Nacional de Historia Natural Smithsoniana (Washington, EEUU), fue creado el Consorcio para el Cdigo de Barras de la Vida (CBOL) la cual se uni a otros museos de historia naturales, herbarios, y organizaciones de investigacin, cuyo objetivo es coordinar los esfuerzos que se realizan para el desarrollo del cdigo de barras de ADN (Savolainen y col., 2005; Casiraghi y col., 2010a). 4.2. Base de datos para el cdigo de barras de ADN En la base de datos (GenBank) de la NCBI (National Center for Biotechnology Information) se encuentra disponible el registro de secuencias de ADN estandarizados, cuya finalidad es proporcionar la informacin de

forma amplia y prctica. Para alcanzar este objetivo se estableci la creacin del Registro de Repositorio Biolgico (http://www.biorepositories.org/), una base de datos donde se tienen la informacin de los organismos ligado a sus secuencias de ADN, esto permite la simplificacin en la bsqueda y consulta de la informacin (Casiraghi y col., 2010b). Las secuencias de cdigo de barras de ADN, tambin pueden ser depositados como proyectos en la base de datos del Sistema de Datos del Cdigo de Barras de la Vida (BOLD; http://www.barcodinglife.org/) se caracteriza por el envo automtico de las secuencias para su posterior publicacin en el GenBank. En el 2009, en la base de datos de la BOLD se registraron 760,000 secuencias de ADN, que corresponde a ms de 65,300 especies descritas; sta gran cantidad de datos gestionados adems de la secuencias, se tiene informacin sobre la morfologa, distribucin geogrfica, punto de muestreo y fotografas entre otros datos (Ratnasingham y Hebert, 2007; Casiraghi y col., 2010b) 4.3. Cdigo de barras de ADN y la identificacin de especie en hongos El cdigo de barras de ADN se define, como el anlisis estandarizado de fragmentos de ADN (correspondientes al mismo locus) cortos y de fcil amplificacin por PCR, para la identificacin de organismos a nivel de especie (Hebert y col., 2003; Stockinger y col., 2010). As mismo debe ser precisa, rpida, econmica, independiente del cultivo, universal y til para ser aplicado por personal no especialista en el rea (Frzal y Leblois, 2008). Un cdigo de barras de ADN facilita la identificacin de especies (en diferentes reinos de vida eucariota), diferenciacin de especies crpticas, as como identificacin de fragmentos de organismos o bien en cualquier etapa de su ciclo de vida (anamorfo y teleomorfo) lo cual no es posible por mtodos basados en morfologa (Gilmore y col., 2009). Basado en el enfoque fenotpico para la delimitacin de especies no es fcil su conceptualizacin como entidad biolgica (por ejemplo en microorganismos y nematodos) (Markmann y Tautz 2005). Debido a esta limitacin se ha desarrollado el concepto de unidad taxonmica operativa molecular que se refiere a grupos de individuos que son reconocidos sobre la base del anlisis de similitud de secuencias (Blaxter y col., 2005). Estas entidades identificadas por mtodos moleculares han sido nombrados de varias formas: genoespecie, filo-especies, unidades taxonmicas reconocibles (RTU), filotipos y unidades taxonmicas operacionales moleculares (M-OTU). Considerar las entidades moleculares y especies como sinnimos, no necesariamente es correcto, al menos es una limitacin para el cdigo de barras de ADN en el sentido estricto, debido a que el significado biolgico de los rangos no pueden ser derivados directamente, a menos de que se tenga una clara e inequvoca asociacin de la especie a su patrn de variabilidad del marcador de cdigo de barras de ADN (Casiraghi y col., 2010a).Por lo tanto la identificacin e interpretacin de las entidades moleculares como uno de los objetivos del cdigo de barras del ADN, se podr realizar de manera correcta en base a un slido conocimiento de la base terica de las tcnicas empleadas (Casiraghi y col., 2010b). 4.3.1. Regiones de ADN para definir el cdigo de barras fngico Los anlisis de agrupamiento basados en secuencias de ADN, revelan la agrupacin de especies y la asignacin de individuos desconocidos a una especie. Una de las regiones de ADN, que se propuso como un buen candidato de cdigo de barras para especies animales, fue el gen mitocondrial citocromo oxidasa subunidad 1 (conocido como COI) fue el primer cdigo de barras de ADN aceptado por el CBOL, con una longitud aproximada 640 pb (Hebert y col., 2003; Savolainen y col., 2005). El xito inicial de la COI, promovi la creacin de programas de secuenciacin para peces y aves. Sin embargo, aunque sta regin se sigue utilizando, otros marcadores han sido propuestos como regiones de cdigo de barras, debido a potenciales problemas que se tiene con los genes mitocondriales en la delimitacin de especies en algunos grupos, regiones de rADN nucleares se han utilizado con consistencia en especies animales (Moritz y Cicero, 2004; Monaghan y col., 2005). En plantas debido a la baja variacin en ADN mitocondriales, el COI se ha utilizado solo en algunas algas, por lo cual se han propuesto loci plastdicos, como los espaciadores intergnicos trnH-psbA (cloroplastos) as como los marcadores rbcL y trnL-F (Kress y Erickson 2007; Chase y col., 2005).

La CBOL propuso como posible cdigo de barras para las plantas basados en dos genes matKyrbcL, porque se ha observado que la capacidad de discriminacin de especies es aproximadamente del 72% basados en ambos locus y no hay un incremento significativo cuando se toma en cuenta a siete marcadores (matK, rbcL, rpoC1, rpoB, psbKPSBI, trnH-psbA, psbK-PSBI) en la resolucin (Hollingsworthy col., 2009; Stockinger y col., 2010). Cuadro 1. Regiones de ADN utilizadas en la clasificacin filogentica propuesta por Hibbett y col., (2007) para el Reino Fungi.

(Tomado y modificado de Hibbett y col., 2007) * Subphyla incertae sedis (no asignadas a ningn phylum). A Phylum en mayscula, subphylum en minscula. B LSU, SSU y 5.8S hacen referencia genes rARN nuclear, en tanto mt-LSU y mt-SSU se refieren a genes mitocondriales del rRNA, los otros genes estn dados bajo abreviaturas estndar. As mismo se ha propuesto a las regiones de ADN ribosomal (ITS en orqudeas) podra ser utilizada como complemento de los genes plastdicos y se ha previsto que podra utilizarse para proporcionar un cdigo de barras mltiples ms completo para la delimitacin y diagnstico de las especies, el estndar de oro de acuerdo a varios botnicos (Chase y col., 2005). El enfoque de cdigo de barras, se ha convertido de gran inters para los miclogos. La determinacin a nivel especie en hongos (en el marco del concepto de especie molecular), se basa principalmente en secuencias de ADN ribosomal (Cuadro 1), como la subunidad pequea (SSU), subunidad grande (LSU), espaciadores internos transcritos (ITS) (Stockinger y col., 2010). As mismo se han utilizado otros marcadores como la SSU-LSU mitocondrial (Raaby col., 2005) y genes de tubulina (Corradi y col., 2004; Msiska y Morton,

2009). 4.4. Identificacin molecular de hongos con otras regiones: ITS, SSU, LSU y COI La regin ribosomal de ADN conocido como espaciador interno transcrito (ITS) ha sido utilizado para la identificacin de hongos, sin embargo no es un cdigo de barras oficialmente reconocido, a pesar de esto ha desempeado un papel importante durante varios aos (Seifert, 2009). La regin ITS (ITS1-5.8S-ITS2) es el marcador gentico ms frecuentemente secuenciado en hongos y es utilizado en general para sistemtica, filogenia e identificacin de cepas a nivel de especie incluso por debajo de ste (Begerow y col., 2010). Sin embargo su uso no significa que no presente limitaciones potenciales como un cdigo de barras de ADN universal para hongos; se ha observado que puede presentar variabilidad intraespecfica as como intraindividual, lo cual dificulta la automatizacin en la identificacin de especies (Smith y col., 2007) as mismo las copias de ITS entre especies de diferentes grupos taxonmicos parecen no ser uniformes (Nilsson y col., 2008). La regin ITS as como otros marcadores, los oligonucletidos que se utilizan discriminan determinados taxones, varios grupos de hongos solo pueden ser amplificado con oligonucletidos ITS adaptados (Taylor y McCormick, 2008) por lo cual se pierde valiosa informacin de grupos de hongos de los cuales se saben poco o nada, debido a la inespecificidad de los oligonucletidos (Begerow y col., 2010). Las regiones del ARN ribosomal nuclear han sido propuestos como potenciales candidatos para el cdigo de barras en hongos, debido a que fueron utilizados con frecuencia en estudios filogenticos aproximadamente desde hace dos dcadas (Begerow y col., 2010) No obstante las regiones ADN ribosomales (subunidad pequea SSU y subunidad grande LSU) se han empleado de forma general en taxonoma de hongos. En filogenia de hongos filamentosos, se han utilizado las secuencias SSU, la regin completa o parcial de ms de 600 pb (Wilmotte y col., 1993). En Glomeromycetes se ha empleado para identificacin a nivel de especie, siendo una regin conservada para otros grupos de hongos; pero se ha observado que su utilidad se limita a determinado nmero de especies (Beck y col., 2007; Poll y col., 2009). En las levaduras, las regiones D1 y D2 de la LSU se utilizan de manera casi exclusiva (Kurtzman y Fell, 1998) esta manera de identificacin se ha extendido para otros grupos como los Heterobasidiomycetes y ascomicetos filamentosos (Guarro y col., 1999). Se ha comprobado que la regin COI es til para la identificacin en animales, no obstante se han encontrado algunas limitaciones cuando es aplicado a hongos (Stockinger y col., 2010). A pesar de que esta regin (COI) mostr ser un potencial cdigo de barras paraPenicillium spp., su longitud en hongos es muy variable (1.6 a 22 kb), y la regin que tiene posibilidades de ser utilizada, vara de 642 pb, hasta ms de 12 kb (Seifert y col., 2007; Seifert, 2009). Por otro lado la identificacin de hongos a nivel de especies con genes COI puede ser inexacta, por ejemplo en Fusarium y en Aspergillus niger se ha observado mltiples copias parlogas que obstaculizan la resolucin a nivel de especies (Chase y Fay, 2009; Geiser y col., 2007.; Gilmore y col., 2009), as mismo en Glomus sp. (hongo micorrzico arbuscular) esta regin se extiende por 2200 pb y adems contiene varios intrones (Lee y Young, 2009). De la misma manera el ADN mitocondrial de Glomus diaphanum el COI tiene un intrn que presenta una alta similitud con su correspondiente intrn (COI) en plantas y en Rhizopus oryzae; dicho intrn en la planta se cree que se origin por transferencia horizontal de genes a partir de los hongos (Vaughn y col., 1995; Lang y Hijri, 2009). conclusiones El cdigo de barras del ADN como una propuesta novedosa para la identificacin a nivel de especie de hongos, utiliza secuencias de ADN estandarizados para su aplicacin rpida, precisa, universal y econmica, as mismo con el potencial de ser automatizado. Se han propuesto varias regiones de ADN nuclear y mitocondrial para establecer un cdigo de barras para hongos, sin embargo actualmente an no se ha definido una regin en particular como se hicieron para los animales y plantas. Las regiones de ADN ribosomal ms utilizadas para la identificacin a nivel de especie de hongos son los LSU, SSU, ITS, tambin se han realizado estudios con COI con potencial para ser utilizada como cdigo de barras, sin embargo se han observado limitaciones para algunos grupos de hogos en su aplicacin, por lo que la creacin de un cdigo

de

barras

universal

para

hongos

se

encuentra

en

desarrollo.

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