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Manual de laboratorio de microbiologa para el diagnostico de infecciones respiratorias
Manual cl nico y tecnico de ayuda al diagno stico microbiolo gico de las infecciones del trato respiratorio alto y bajo
M Jos Lpez Garca, Marta Crdenas Povedano, Aurora Urbano Felices Revisado por: Jos Miguel Aguilar Bentez
1 edicin 2012 OmniaScience (Omnia Publisher SL) www.omniascience.com
DOI: http://dx.doi.org/10.3926/oss.4 ISBN versin on-line: 978-84-695-0921-0 ISBN versin impresa: 978-84-940234-6-0 DL: B-18941-2012 Diseo portada y contraportada: OmniaScience Fotografa portada: Kts | Dreamstime.com
ndice
PRESENTACIN CAPTULO 1 FLORA RESPIRATORIA NORMAL 1.1 Fosas nasales 1.2 Faringe CAPTULO 2 INFECCIONES RESPIRATORIAS Y AGENTES ETIOLGICOS 2.1 Infecciones de vas respiratorias altas
2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.1.5 2.1.6 2.1.7 2.1.8 2.1.9 2.1.10 Faringitis Sndromes larngeos Otitis Sinusitis Sndrome de Lemierre Angina de Vincent Abscesos periamigdalino y faringeo Difteria Candidiasis Zigomicosis Bronquitis Bronquiolitis Neumona aguda Neumona nosocomial Colonizacin-infeccin respiratoria crnica Absceso pulmonar Derrame pleural y empiema
2.2
2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.6 2.2.7
Infecciones de vas respiratorias bajas
CAPTULO 3 TOMA DE MUESTRAS 3.1 Muestras del tracto respiratorio superior 3.2 Muestras del tracto respiratorio inferior (mtodos no invasivos) 3.3 Muestras del tracto respiratorio inferior (mtodos invasivos)
3.3.1 3.3.2 Fibrobroncoscopia Otras tcnicas no fibrobroncoscpicas
CAPTULO 4 DIAGNSTICO MICROBIOLGICO DIRECTO 4.1 Visualizacin directa

4.1.1 Fresco
4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5
Tincin argntica rpida (Gomori-Grocott modificada) Tincin de Gram Tincin Ziehl-Neelsen Tinciones con fluorocromos
4.2
4.2.1 4.2.2
Cultivos bacteriolgicos y fngicos

Siembra Evaluacin del crecimiento
4.3
Pruebas complementarias
Tcnica del scotch o papel de celofn Tincin de Gram Oxidasa Catalasa Prueba de la coagulasa Aglutinacin de estreptococos Sensibilidad a Optoquina Sensibilidad a Bacitracina Solubilidad en bilis Requerimientos de factores X, V, XV Test de filamentacin Sistemas comerciales multipruebas Aglutinacin de legionella: Legionella Latex Test Kit Test del iodo-nitro-trifenil-tetrazolio (INT) Antibiograma de muestras primarias Antibiograma de anaerobios Antibiograma de Streptococcus Antibiograma de gonococos Antibiograma de Haemophilus Panel de Gramnegativos Panel de Grampositivos
4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.3.6 4.3.7 4.3.8 4.3.9 4.3.10 4.3.11 4.3.12 4.3.13 4.3.14
4.4
4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.4.4 4.4.5 4.4.6 4.4.7
Antibiogramas
4.5
4.5.1 4.5.2
Cultivos vricos
Virus de la Gripe Otros virus
4.6
Pruebas de deteccin rpida de antgeno
4.6.1 Frasco de boca ancha y tapn de rosca, con orina 4.6.2 Torunda en tubo con cido casamino o Amies-Stuart con Charcoal, con exudados nasofarngeos 4.6.3 Torunda en Amies-Stuart o tubo, con muestras respiratorias de vas altas 4.6.4 Torunda o tubo en medio para virus, con muestras respiratorias
4.7
4.7.1 4.7.2 4.7.3 4.7.4
Tcnicas de biologa molecular

Frascos de hemocultivo para anaerobios y aerobios con lquido pleural o sangre Torunda en Amies-Stuart o tubo, con muestras respiratorias de vas altas Torunda en M4 o frasco, con muestras respiratorias de vas bajas Torunda o tubo en medio para virus, con muestras respiratorias
CAPTULO 5 DIAGNSTICO MICROBIOLGICO INDIRECTO: SEROLOGA 5.1 Serologa Mycoplasma pneumoniae 5.2 Serologa de Chlamydophila pneumoniae 5.3 Serologa de Legionella pneumophila 5.4 Serologa de Coxiella burnetii
5.5 5.6 5.7
Serologa de Rickettsia coronii Serologa de Francisella tularensis Serologa del virus sincicial respiratorio
CAPTULO 6 INFORME DE LOS RESULTADOS 6.1 Visualizacin directa 6.2 Cultivos 6.3 Deteccin rpida de antgenos 6.4 Serologa CAPTULO 7 BIBLIOGRAFA SOBRE LOS AUTORES DEL LIBRO SOBRE EL REVISOR DEL LIBRO
ndice de tablas
Tabla 1. Caractersticas diferenciales de los sndromes larngeos ms comunes Tabla 2. Resumen de los procedimientos microbiolgicos de toma de muestras y transporte para infecciones respiratorias Tabla 3. Distintos medios de cultivo para Mycobacterium sp Tabla 4. Caractersticas macroscpicas de los principales hongos filamentosos respiratorios Tabla 5. Caractersticas microscpicas de los principales hongos filamentosos respiratorios Tabla 6. Morfologa y afinidad por los colorantes de Gram de las mayora de las bacterias causantes de infecciones respiratorias Tabla 7. Indentificaciones rpidas de enzimas bacterianos Tabla 8. Api NH Tabla 9. Api Coryne Tabla 10. Api 20 A Tabla 11. Distintos mtodos de estudio de la sensibilidad bacteriana a los antibiticos Tabla 12. Interpretacin de sensibilidades para S. pneumoniae Tabla 13. Interpretacin de sensibilidades para Streptococcus beta hemolticos Tabla 14. Interpretacin de sensibilidades para N. gonorrehae Tabla 15. Interpretacin de sensibilidades para Haemophilus Tabla 16. Virus respiratorios, lneas celulares y tiempo de observacin de efectos citopticos Tabla 17. Caractersticas de los mtodos moleculares disponibles para la deteccin de virus grupales Tabla 18. Resumen de los procedimientos especficos del laboratorio de microbiologa para las muestras recepcionadas de infecciones respiratorias Tabla 19. Tipo de tincin, aumento ptico y n de BAAR observados Tabla 20. Informe de las serologas infecciosas
ndice de ilustraciones
Ilustracin 1. Frecuencia estacional de los virus respiratorios Ilustracin 2. Toma de muestra de un exudado farngeo con torunda Ilustracin 3. Siembra para aislamiento en placa Ilustracin 4. Esquema de la estructura de los principales hongos filamentosos respiratorios Ilustracin 5. Distintos mtodos de estudio de la sensibilidad bacteriana a los antibiticos Ilustracin 6. Fundamento de la tcnica Inmunocromatografa directa Ilustracin 7. Fundamento de la tcnica de Enzimoinmmunoanlisis directo Ilustracin 8. Proceso esquemtico de la inmunofluorescencia directa Ilustracin 9. Proceso esquemtico de la inmunofluorescencia indirecta
Presentacin
Presentacin
Las infecciones respiratorias son las enfermedades de mayor incidencia adems de presentar algunas de ellas, como la enfermedad pulmonar obstructiva crnica, una prevalencia creciente en el mundo desarrollado. Los procesos infecciosos de las vas respiratorias altas son las que ms ausencia escolar y laboral producen, mientras que las infecciones del tracto respiratorio inferior son las que requieren ms hospitalizacin y presentan mayores tasas de morbilidad y mortalidad. Todo esto, adems de los costes econmicos derivados de las bajas laborales y de los prolongados tratamientos farmacuticos y hospitalarios, apremian en la necesidad de conseguir diagnsticos certeros y rpidos. En cuanto al Laboratorio de Microbiologa, el hecho de que la gran mayora de los procedimientos sean manuales hace que se requiera personal entrenado con ciertas habilidades tcnicas y que el informe de resultados dependa de la interpretacin subjetiva del facultativo. Por otra parte, los mtodos de diagnstico directo en microbiologa estn experimentando un gran avance, mejorando los tiempos de respuesta y la eficiencia del proceso. El objetivo de este manual es actualizar los conocimientos clnicos, analticos y tcnicos, y adiestrar en los procedimientos de diagnstico microbiolgico de las infecciones del tracto respiratorio alto y bajo, con el fin ltimo de disminuir la morbilidad y mortalidad asociadas y los costes derivados de ellas. Va dirigido al personal en formacin y a profesionales del mbito sanitario, principalmente del laboratorio (tcnicos y facultativos) pero tambin a los clnicos (mdicos y enfermeros). Recorre por tanto las reas asistenciales de atencin primaria (medicina comunitaria y pediatra) y especializada (otorrinonaringologa, neumologa, medicina interna e intensiva), toma de muestras, y las distintas reas del laboratorio de microbiologa. Para la elaboracin del manual nuestro grupo de trabajo ha realizado una revisin completa y actualizada de las infecciones respiratorias sobre la que ha desarrollado unos Procedimientos de Laboratorio de Microbiologa de forma detallada y esquematizada, de cada uno de los pasos del proceso analtico: toma de muestras y recepcin, procesamiento e informe de laboratorio. Abril 2012
Manual de laboratorio de microbiologa para el diagnstico de infecciones respiratorias
Captulo 1
Flora respiratoria normal

El aparato respiratorio se divide en dos sectores anatmicos: alto y bajo. En el individuo normal nicamente las vas respiratorias altas (fosas nasales y faringe) estn colonizadas por flora normal. Los senos paranasales, el odo medio, la trquea, los bronquios pulmonares y la pleura son estriles. Ilustraciones recomendadas: http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/ssvv/respi0.htm http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/ssvv/respi1.htm http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/ssvv/respi2.htm http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/ssvv/respi3.htm http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/ssvv/respi4.htm http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/ssvv/respi5.htm http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/ssvv/respi6.htm http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/ssvv/respi7.htm http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/ssvv/respi8.htm En las fosas nasales la estructura anatmica tortuosa genera una corriente de aire turbulenta. Cuando el aire choca contra las mucosas, se calienta y las partculas grandes que ste contiene son retenidas por el mucus y los pelos de las narinas. En sectores ms bajos los microorganismos que ingresan por esta va llegan al tejido linfoide del anillo de Waldeyer.
Flora respiratoria normal
El sistema mucociliar, la capa de moco y los reflejos como la tos, el estornudo y la broncoconstriccin son otros mecanismos de defensa importantes. La mucosa respiratoria tambin es rica en IgA. En el tejido pulmonar existen macrfagos alveolares que contribuyen a la defensa del husped, fagocitando las bacterias y otras partculas.
1.1 Fosas nasales

En las fosas nasales se encuentran microorganismos caractersticos de la piel: Staphyloccus epidermidis y especies de Corynebacterium. Alrededor de 20 a 30% de los individuos son portadores nasales sanos de S. aureus, porcentaje que aumenta en personas diabticas sometidas a hemodilisis y en el personal de salud. En preescolares es habitual la colonizacin nasal por Streptococcus pneumoniane y especies de Haemophilus.
1.2 Faringe
En la faringe la flora normal est compuesta principalmente por Streptococcus -hemolticos, del grupo viridans. Se encuentran adems diferentes especies de Lactobacillus, Propionibacterium, Corynebacterium, Moraxella, etc. Los anaerobios superan en diez veces a los aerobios y se aslan Peptoestreptococcus spp, Bifidobacterium spp, y Actinomyces spp. Los bacilos gramnegativos que se encuentran, generalmente son Fusobacterium, spp y Bacteroides spp. En las criptas amigdalinas se produce acumulacin de materia orgnica que disminuye el potencial de xido reduccin, por lo tanto el nmero de anaerobios puede ser muy elevado. Algunos individuos albergan S. pneumoniae y Haemophillus influenzae, sin que ello signifique enfermedad. Tambin pueden encontrarse especies no patgenas de Neisseria y Streptococcus -hemolticos no pertenecientes al grupo A. En condiciones normales no existen bacterias ms all de la glotis. La flora orofarngea est implicada en infecciones pulmonares, causadas por la aspiracin de estos microorganismos. Generalmente esto ocurre en pacientes que tienen alterados los reflejos de defensa debido a alteraciones de la conciencia, etc. En las infecciones bronquiales o pulmonares, el estudio de la expectoracin puede resultar til si el paciente logra obtener una buena muestra mediante el esfuerzo de tos. Hay que ser cauteloso en la lectura de esta muestra, porque la misma se contaminar en diferentes grados por la flora oral.
Captulo 2
Infecciones respiratorias y agentes etiolgicos

2.1 Infecciones de vas respiratorias altas
Ilustraciones recomendadas: http://www.zonamedica.com.ar/categorias/medicinailustrada/gargantanarizy/index.html Los procesos infecciosos de las vas respiratorias altas (IRA) constituyen seguramente la causa ms frecuente de consulta en la prctica clnica diaria y las enfermedades que ms ausencia escolar y laboral producen. Slo en Estados Unidos se calcula que se producen al ao algo ms de tres episodios de resfriado comn por habitante y ao. En Espaa se ha comprobado que casi el 30% de las consultas mdicas relacionadas con la infeccin respiratoria son debidas a resfriados y el 20% a faringitis. Las IRA son las infecciones que afectan la nasofaringe, orofaringe, laringe, trquea, odo y senos paranales. Debe recordarse que la mucosa del tracto respiratorio superior es continua por lo que una infeccin en cualquiera de sus sectores puede propagarse hacia sus sectores inferiores. 2.1.1 Faringitis Se define la faringitis como la inflamacin y/o la infeccin de la faringe y/o rea periamigdalar. Puede estar afectada tanto la orofaringe como la nasofaringe, adenoides y amgdalas. El trmino
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amigdalitis se refiere a la inflamacin de las amgdalas y puede utilizarse indistintamente junto con el de faringitis. En ocasiones la faringitis es parte de un sndrome, como el resfriado comn o la gripe. La faringitis aguda es uno de los motivos ms frecuentes de consulta y prescripcin de antibiticos en las consultas de atencin primaria. En Espaa se estima que suponen un 20% de las consultas por infecciones respiratorias y el 75% aproximadamente de las mismas generan prescripcin de antibiticos. o La epidemiologa de la faringitis viral es igual a la de la rinitis. Cada virus tiene su propia incidencia estacional. (Ilustracin 1). En cuanto al rol del clima y la temperatura, se cree que por un lado las bajas temperaturas aumentan el hacinamiento de personas en espacios cerrados favoreciendo la diseminacin; por otro lado, los cambios en la humedad ambiental relativa alteran la viabilidad viral, por ejemplo Rinovirus tiene mayor viabilidad cuando la humedad es de 40% a 50%, mientras que Influenza y Parainfluenza virus persisten viables en aerosoles habiendo baja humedad ambiental relativa. La va de ingreso es respiratoria, por contacto directo con secreciones infectadas, mano a mano a travs de fmites, y posteriormente son inoculados en la mucosa nasal o conjuntival.
Ilustracin 1. Frecuencia estacional de los virus respiratorios o Las faringitis bacterianas ocurren durante todo el ao pero tienen su pico de incidencia en otoo y primavera. El grupo etario ms afectado y el de mayor riesgo de complicaciones es el de 5 a 15 aos. La trasmisin se produce por va respiratoria por contacto estrecho persona a persona.
Los signos y sntomas de la faringitis causada por virus o por bacterias son inespecficos. o La faringitis bacteriana suele tener un perodo de incubacin de dos a cuatro das. El cuadro ms caracterstico de S. pyogenes est dado por la instalacin abrupta de dolor de garganta, odinofagia acompaada de fiebre, cefalea y malestar general. En nios son frecuentes las nuseas, vmitos y dolor abdominal. Los signos ms destacados son edema, enrojecimiento e hiperplasia linfoide a nivel de la faringe posterior, hiperplasia amigdalina, exudado amigdalino blanco grisceo, adenomegalias cervicales dolorosas. Si bien esta signosintomatologa es sugestiva de faringitis bacteriana, tambin puede deberse a causas virales, y por este motivo nunca puede realizarse el diagnstico etiolgico nicamente sobre la base del cuadro clnico. Por otra parte, un cuadro
respiratorio alto que carezca de estas manifestaciones raramente corresponder a una faringitis bacteriana. o La aparicin concomitante de conjuntivitis, coriza, tos, exantema, estomatitis, pequeas lesiones ulceradas y diarrea se asocia ms frecuentemente con la etiologa vrica.
Virus Son la causa ms frecuente de faringitis infecciosa aguda. o Los virus respiratorios (rinovirus, adenovirus, respiratorio sincicial, influenza, parainfluenza, coronavirus) frecuentemente causan faringitis. o Fiebre faringoconjuntival: la presentacin clnica de la faringitis producida por Adenovirus generalmente es ms severa que la asociada al resfriado comn. Se acompaa de malestar general, mialgias, cefaleas, chuchos de fro, mareos, fiebre alta, odinofagia y exudado farngeo purulento indistinguible del observado en las faringitis bacterianas. Una caracterstica distintiva, si est presente, es la conjuntivitis que afecta a un tercio de los casos. Es de tipo folicular y bilateral.
Otros virus asociados son: virus coxsackie, echovirus y virus herpes simple. o Faringitis herptica: la infeccin primaria por Herpes simplex puede presentarse como una faringitis aguda. Los casos leves son indiferenciables de las otras etiologas. En los casos severos la presencia de inflamacin y exudado purulento puede hacer pensar en una faringitis bacteriana. Las vesculas y las lceras planas de paladar son hallazgos caractersticos. Herpangina: es un tipo infrecuente de faringitis causada por el virus Coxsackie y se diferencia por la presencia de pequeas vesculas en paladar blando, la vula y pilares anteriores de faringe. Las lesiones se abren para convertirse en pequeas lceras blancas. Se observa principalmente en nios, en quienes puede manifestarse como una enfermedad febril severa.
Epstein-Barr, citomegalovirus, virus de la rubola, sarampin. o Mononucleosis infecciosa: cuadro clnico producido por Epstein-Barr y Citomegaloviru, cursa con faringitis aguda y suele acompaarse de odinofagia, fiebre alta, linfadenopatas y esplenomegalia. Las infecciones sistmicas por citomegalovirus, virus de la rubola, sarampin y otros, tambin pueden asociarse con faringitis aguda.
o o Bacterias
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tambin puede producirla; no hay que olvidar que la presentacin inicial de esta infeccin puede ser de un cuadro catarral.
Causan el 5-40% de las faringitis agudas. Las faringitis bacterianas, segn la etiologa, se pueden dividir en:
Faringitis estreptoccicas. S. pyogenes es la bacteria ms frecuente (responsable del 20-40% de los episodios de faringitis aguda en la edad peditrica y del 2-26% de los casos en adultos). Otros estreptococos beta-hemolticos, pertenecientes a los grupos C y G y con tamao grande de colonia, tambin se han asociado con brotes de faringitis, pero se desconoce su importancia en los casos espordicos. El papel de S. pyogenes en la faringitis aguda est claramente establecido, aunque tambin existen portadores asintomticos, en particular entre convivientes de un caso ndice de infeccin estreptoccica. En los casos en que la cepa de S. pyogenes, que causa una faringitis u otra infeccin, produce toxinas eritrognicas, puede producirse escarlatina. Se trata de un eritema difuso y puntiforme que se acompaa de enantema caracterstico que afecta el paladar y la lengua. La infeccin farngea aguda es de resolucin espontnea; la fiebre desaparece en tres a cinco das y el resto de los sntomas y signos suele resolverse en el plazo de una semana. El nico motivo por el cual se justifica el tratamiento antibitico es la prevencin de las complicaciones. o Complicaciones supuradas. A nivel local, pueden producirse abscesos o flemones periamigdalinos, abscesos retrofarngeos. Por extensin directa del germen: otitis media, sinusitis, mastoiditis, linfadenitis cervical supurada. Otras complicaciones supuradas, como infecciones del sistema nervioso central, son extremadamente raras. Complicaciones no supuradas (secuelas postestreptoccicas): fiebre reumtica y glomerulonefritis. Fiebre reumtica (FR). Es una enfermedad que se caracteriza por lesiones inflamatorias no supurativas que afectan fundamentalmente al corazn, las articulaciones, el tejido subcutneo y el sistema nervioso central. Su presentacin clnica es muy variable dependiendo del grado de afeccin de cada rgano. Las personas que han sufrido un episodio de FR son especialmente susceptibles tras nuevas infecciones por S. pyogenes. No se ha descrito la fiebre reumtica como complicacin de la faringitis por estreptococos del grupo C o G. Glomerulonefritis (GN). Es una enfermedad inflamatoria del glomrulo renal que sigue a las infecciones farngeas o cutneas causadas por cepas pertenecientes a un limitado nmero de serotipos de S. pyogenes, llamadas cepas nefritognicas. Se manifiesta por edema, hipertensin arterial, hematuria y proteinuria. A diferencia de la FR, S. pyogenes no es el nico agente capaz de causar GN, sino que estreptococos del grupo C, concretamente la especie S. equi subsp. Zooepidemicus tambin pueden originarla.
Faringitis no estreptoccicas o Arcanobacterium haemolyticum. Se ha aislado a partir de la piel y faringe de individuos sanos pero tambin se ha descrito como causa de infeccin, especialmente faringitis en adolescentes y adultos jvenes. La faringitis asociada
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a este patgeno se acompaa generalmente de un rash similar al que se observa en la escarlatina. Se ha implicado tambin en infecciones cutneas e invasivas como sinusitis, celulitis y septicemia, a menudo en combinacin con otros patgenos. o Neisseria gonorrhoeae. Puede producir faringitis de forma ocasional en pacientes que tienen contacto sexual orogenital. A pesar de la baja incidencia, debe incluirse en el diagnstico diferencial de faringitis en adultos sexualmente activos, en grupos de alto riesgo y entre pacientes con gonorrea urogenital. Mycoplasma pneumoniae. Produce principalmente traqueobronquitis neumona, aunque tambin se ha asociado a casos de faringitis recurrentes. y
o o
Chlamydophila pneumoniae y Chlamydophila psittaci. Son causa de neumona y en muchos casos se describe la faringitis como manifestacin inicial de la infeccin. La verdadera incidencia de faringitis por estos microorganismos no se conoce, ya que generalmente el diagnstico se realiza mediante tcnicas serolgicas. Treponema pallidum. La infeccin farngea se puede adquirir tras relaciones sexuales orogenitales. Aparece el chancro farngeo asociado a linfadenopata. En el caso de sospecha de sfilis habra que realizar las pruebas serolgicas correspondientes. Se puede examinar una muestra del chancro mediante tincin con anticuerpos fluorescentes. Corynebacterium diphteriae. Yersinia enterocolitica. Muy poco frecuente. Slo hay descritos dos brotes de faringitis en la literatura. Francisella tularensis. La tularemia orofarngea puede adquirirse a travs del contacto con artrpodos o animales infectados. La recogida y el procesamiento de muestras para el aislamiento de F. tularensis suponen un elevado riesgo pues el microorganismo puede penetrar a travs de la piel intacta y mucosas durante la recogida de la muestra o puede ser inhalado si se producen aerosoles sobre todo durante el procesamiento de las muestras. Se describe con frecuencia la tularemia como una infeccin adquirida en el laboratorio a pesar de que los casos de enfermedad son infrecuentes. Anaerobios
o o o
2.1.2 Sndromes larngeos Laringitis aguda y laringotraquetis o La laringitis es una manifestacin frecuente de las infecciones del tracto respiratorio superior, caracterizada por rinorrea, tos y dolor de garganta, que normalmente afecta a nios mayores, adolescentes y adultos. La laringitis aguda es un sndrome clnico muy frecuente en las consultas de atencin primaria.
La laringotraquetis aguda o sndrome denominado crup es una infeccin vrica de las vas respiratorias superiores e inferiores especfica de la infancia, que produce inflamacin en la zona de la subglotis y un cuadro de disnea acompaada de una inspiracin estridente caracterstica. Enfermedad frecuente de la primera infancia, representa el 15% de todas las IRA en los nios. La incidencia mxima se observa durante el segundo ao de vida y la mayor parte de los casos se produce entre los tres meses y los tres aos de edad. Predomina en el sexo masculino. En muchos nios el crup slo se desarrolla una vez durante la infancia, aunque se produzcan mltiples infecciones por los virus que la causan. En ocasiones, sin embargo, estas infecciones vricas causan episodios repetidos de crup en la primera infancia.
Los patrones epidemiolgicos reflejan principalmente los patrones estacionales. El virus Parainfluenza 1 tiene su mxima incidencia durante el otoo y parecera provocar brotes epidmicos ao por medio. Lo brotes en invierno o principios de la primavera se asocian ms frecuentemente a Influenza A o B. Cuadro clnico o La laringitis comienza como un catarro comn sin fiebre asociada o con febrcula. El paciente se queja de ronquera y el examen de la laringe revela las cuerdas vocales hipermicas y eritematosas debido al edema y a la ingurgitacin vascular de las mucosas. Por lo general, el diagnstico de la laringitis aguda se realiza solo en funcin de los datos clnicos. El debut del crup es gradual, y va seguido de una infeccin del tracto respiratorio superior. El distress respiratorio severo, especialmente en nios pequeos, y la fiebre son manifestaciones comunes. El crup produce estrechamiento de la va area y signos y sntomas similares a los de la epiglotitis, pero los nios con crup tienden a tener un curso de la enfermedad ms largo, empeorando por las noches y con tos perruna. Los nios infectados por Influenza y Parainfluenza suelen tener fiebre de entre 38 y 40; en la infeccin por VRS la fiebre suele ser ms baja. La instalacin del crup puede estar anunciada por la presencia de disfona y una profundizacin de la tos, habitualmente seca con un tono metlico. Aparecen polipnea, tirajes altos, estridor larngeo inspiratorio, roncus y sibilancias. Una caracterstica distintiva es su curso fluctuante. El cuadro puede mejorar o agravarse clnicamente en el curso de una hora. La mayora de las veces dura entre tres y cuatro das, aunque la tos puede persistir. El diagnstico es clnico.
En los nios con edad inferior a 6 meses, la presentacin del crup y de la epiglotitis puede ser indistinguible. Etiologa o Los agentes etiolgicos primarios de ambas enfermedades son los virus respiratorios; de este modo, en pacientes mayores de cinco aos con laringitis se ha aislado parainfluenza, rinovirus, virus de la gripe o adenovirus. Tambin se ha observado que
la ronquera es una manifestacin destacada de la infeccin por coronavirus y por el virus de la parainfluenza, identificndose tanto en nios como en adultos jvenes. o El virus Parainfluenza 1 es la causa ms frecuente del crup, el tipo 3 suele ser el segundo en frecuencia. Solo Parainfleunza tipo1 y el virus Influenza A se asocian con epidemias. En la era prevacunal el sarampin se asociaba con un crup severo y complicado. Las infecciones bacterianas tambin se han asociado en ocasiones a laringitis aguda, como son los casos de la faringitis estreptoccica aguda, de infecciones por Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, y de infecciones por M. catarrhalis o H. influenzae. En muchas circunstancias, la infeccin inicial est ocasionada por varios virus, y las bacterias juegan un papel como agentes sobreinfectantes sobre la mucosa del tracto respiratorio previamente daada. Entre las causas poco frecuentes de laringitis aguda se encuentran los herpesvirus, Candida spp., Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans y Estreptococos beta-hemolticos del grupo G, tanto en pacientes inmunocompetentes como en inmunocomprometidos. Entre los herpesvirus se han visto implicados los virus del herpes simple 1 y 2, el virus varicelazster y el citomegalovirus. La laringitis producida por Mycobacterium tuberculosis o por una blastomicosis est asociada con la infeccin pulmonar. Los hallazgos clnicos varan desde parlisis de los nervios craneales y lesiones ulcerativas de la laringe posterior, a masas similares a tumores en la laringe anterior. Dado que este cuadro clnico es variable, es necesario que exista una gran sospecha clnica para realizar el diagnstico. La histoplasmosis larngea es una complicacin de la infeccin diseminada y se manifiesta como ronquera de aparicin indolente sin tos. La blastomicosis y la histoplasmosis de la laringe pueden confundirse con el carcinoma escamoso. El diagnstico depende de la demostracin del hongo en la submucosa.
Debido a que el diagnstico de laringitis y el crup es fundamentalmente clnico, y de etiologa es vrica en la mayora de los casos, los cultivos para bacterias y hongos son slo necesarios cuando no hay otra causa aparente o cuando se realiza un diagnstico diferencial de infecciones crnicas (por ejemplo, histoplasmosis y tuberculosis) con malignidad larngea. Epiglotitis La epiglotitis es un proceso infeccioso que produce inflamacin y edema de las estructuras supraglticas, lo que incluye la epiglotis, la vula, la base de la lengua, aritenoides, las falsas cuerdas vocales y las paredes farngeas adyacentes. En contraste con la faringitis y el crup, la epiglotitis tiene una etiologa primariamente bacteriana y suele ocurrir en nios mayores de dos aos; tambin puede ocurrir en adultos. La mayora de los casos de epiglotitis en nios menores de cinco aos estn causadas por H. influenzae tipo b. Desde la introduccin de la vacuna frente a H. influenzae tipo b (Hib) ha habido un gran descenso en el nmero de casos de epiglotitis aguda ocasionada por este organismo.
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La epiglotitis aguda se produce tpicamente en nios entre 2 y 6 aos y caractersticamente presenta un inicio agudo con fiebre alta, dolor de garganta y obstruccin respiratoria con estridor, disfagia, y agitacin. Es importante diferenciar esta situacin del crup vrico por las implicaciones teraputicas. Los adultos con epiglotitis a menudo tienen una presentacin menos aguda caracterizada por odinofagia y cambios en la voz. Otras manifestaciones menos comunes en los adultos son disnea, estridor, faringitis, fiebre, adenopatas cervicales, tos y hemoptisis. La epiglotitis afecta aproximadamente a 1 de cada 100.000 adultos por ao.
Sndrome Edad Etiolgia Virus Influenza, Adenovirus, Rinovirus, Virus parainfluenza, VRS, M. catarrhalis, M. pneumoniae, C. pneumonia Virus parainfluenza, VRS, Adenovirus, H. influenzae, M. pneumoniae, S. pyogenes, S. aureus, M. catarrhalis H. influenzae, H. parainfluenzae, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. aureus Clnica
Laringitis
Nios mayores, adolescentes y adultos
Ronquera, dolor de garganta, fiebre, y congestin nasal
LaringotraQueobron-Quitis (Crup)
Bebs y nios pequeos (3 meses-3 aos)
Fiebre, tos perruna, dificultad respiratoria, tiraje, y estridor
Epiglotitis
Nios de 2-6 aos
Aparicin brusca de fiebre, dolor de garganta y agitacin
Tabla 1. Caractersticas diferenciales de los sndromes larngeos ms comunes La vacuna no es 100% eficaz y se han descrito casos espordicos de epiglotitis por H. influenzae tipo b en nios previamente vacunados. En algunos casos se deben tener en cuenta tambin varios virus respiratorios. Otras especies bacterianas que se han asociado con epiglotitis son H. influenzae no tipable, Haemophilus parainfluenzae, S. pneumoniae, S pyogenes y S. aureus. El diagnstico es esencialmente clnico sin necesidad de realizar el aislamiento etiolgico de los organismos desde el lugar de la infeccin, ms an, la manipulacin de la epiglotis puede conducir a obstruccin respiratoria, siendo por tanto una contraindicacin absoluta. 2.1.3 Otitis Aunque el cuadro de otitis no corresponde en sentido estricto al tracto respiratorio superior, s puede acompaar a las IRAs. La otitis es la inflamacin del odo, tanto del canal auditivo externo como del odo medio (Ilustracin 6), cuya causa ms frecuente es la infeccin bacteriana. La otitis media aguda (OMA)
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representa una de las patologas ms frecuentes en el nio y es uno de los principales motivos de prescripcin de antibiticos en atencin primaria, pero su diagnstico puede ser difcil; la OMA no siempre es sintomtica y los mtodos y dispositivos de diagnstico, escasos. Al mismo tiempo, dado el alto ndice de curacin espontnea, puede existir una subestimacin del nmero real de casos. Otitis externa A) Otitis externa La infeccin del conducto auditivo externo es similar a una infeccin de la piel y los tejidos blandos en cualquier otra parte del organismo. Generalmente est causada por humedad excesiva que permite a las bacterias multiplicarse en el canal auditivo, dando lugar a maceracin e inflamacin. El dolor y el prurito resultantes pueden ser importantes debido al escaso espacio disponible para la expansin de los tejidos inflamados. Tambin pueden ser el resultado de un traumatismo (al intentar limpiar el odo), o de distintos cuadros dermatolgicos (eczema, psoriasis). La otitis externa puede aparecer a cualquier edad, y puede dividirse en varias categoras que, exceptuando los casos invasivos, no suelen diferenciarse como tales en la prctica clnica. o Localizada aguda. Puede manifestarse como una lesin pustulosa o un fornculo, causados generalmente por S. aureus. Las erisipelas causadas por S. pyogenes pueden afectar al pabelln auricular y al conducto auditivo externo. Difusa aguda. Es un cuadro comn en adultos, que aparece en condiciones clidas y hmedas, denominado tambin odo del nadador. El principal agente etiolgico es Pseudomonas aeruginosa. Crnica. Aparece como consecuencia de la irritacin provocada por el drenaje del odo medio en pacientes con una otitis media supurativa crnica. Invasiva (maligna). Es una infeccin necrotizante grave que se propaga desde el epitelio escamoso del conducto auditivo externo hacia los tejidos blandos, los vasos sanguneos, el cartlago y el hueso circundantes. Esta enfermedad afecta principalmente a las personas de edad avanzada, a los pacientes diabticos e inmunocomprometidos. La diseminacin de la infeccin hacia el hueso temporal y posteriormente al seno sigmoideo, la base del crneo, las meninges y el cerebro puede ser fatal. El agente causal es casi siempre Pseudomonas aeruginosa. o Fngica. Puede formar parte de una infeccin mictica local o general y en el canal auditivo externo puede presentarse de forma superficial, crnica o subaguda. Las especies de Aspergillus son responsables de la mayora de los casos.
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B) Otitis media La otitis media (OM) o inflamacin del odo medio se asocia a presencia de lquido en el odo medio, o con otorrea (secrecin desde el odo a travs de una perforacin de la membrana timpnica o de un tubo de ventilacin). Puede clasificarse por los sntomas asociados y duracin, frecuencia y complicaciones, as como por los hallazgos otoscpicos. No parece haber consenso en la forma de denominar las distintas formas de presentacin de la OM, aunque los ms comunes se indican a continuacin, as como sus caractersticas clnicas y patogenia. o Otitis media aguda (OMA). Es una otitis de comienzo brusco que se acompaa de signos y sntomas que no siempre son especficos. La OMA se debe a la colonizacin del odo medio por bacterias procedentes de la nasofaringe, que causa una reaccin aguda inflamatoria con produccin de pus. Una vez resuelto el episodio agudo, puede persistir en el odo medio cierta cantidad de lquido por dificultades de drenaje. La presencia de este fluido puede causar dificultades auditivas. Se sabe que la mencionada colonizacin se ve facilitada por el incremento de la adherencia bacteriana al revestimiento de la trompa de Eustaquio, debido a la presencia de virus y enzimas bacterianas, endotoxinas y mediadores inflamatorios. o Ms de dos tercios de los nios de tres aos ya han padecido uno o ms episodios de OMA, y un tercio ha sufrido ya tres o ms episodios; la incidencia mxima se observa entre los 6 y 24 meses de edad. La mayor frecuencia en nios de estas edades se atribuye a factores inmunolgicos, tales como la ausencia de anticuerpos antineumoccicos, a factores anatmicos, incluyendo un menor ngulo de la trompa de Eustaquio en relacin a la nasofaringe, as como a la mayor incidencia de infecciones vricas del tracto respiratorio, que pueden conducir al bloqueo de la trompa de Eustaquio. Otitis media serosa (OMS). Se define como una secrecin asintomtica del odo medio que puede asociarse a sensacin de odo taponado. Se sabe que la eliminacin incompleta de las bacterias del odo medio despus de una OMA puede ser responsable de la inflamacin persistente del odo medio, que conducira a la OMS. Otitis media recurrente. Se define como la aparicin de tres episodios de OMA en seis meses, o cuatro o ms episodios en un ao. Otitis media crnica supurada. Se debe a episodios recurrentes de infeccin aguda y a una duracin prolongada del derrame del odo medio, generalmente producido por un episodio previo de infeccin aguda.
o o
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Consideraciones clnicas de la OMA La secuencia ms probable de eventos en la mayora de los episodios comprende una anomala previa (debido por lo general a una IRA alta viral) que da lugar a la congestin de la mucosa respiratoria y la consecuente obstruccin de la mucosa tubrica que ocasiona la obstruccin de la porcin ms estrecha de la trompa o istmo; la obstruccin provoca una presin negativa en el interior del odo medio, con formacin de derrame. Las secreciones del odo medio se acumulan en consecuencia, si despus de producirse la obstruccin tubrica existen bacterias patgenas en el odo medio que colonizan la nasofaringe, los microorganismos se multiplican y producen una infeccin supurada aguda. La enfermedad se presenta con otalgia, hipoacusia, fiebre, anorexia, vmitos, diarrea. Cuando ocurre perforacin de la membrana timpnica se observa otorrea. Las posibles complicaciones de esta infeccin son otorrea purulenta crnica, mastoiditis aguda, bacteriemia, prdida de audicin. Etiologa o Tres especies bacterianas representan el 80% de las causas de OMA: S. pneumoniae, H. influenzae no tipo b (no capsulado en la mayora de los casos), y M. catarrhalis. En nuestro medio, el neumococo es responsable del 25-50% de los episodios, y H. influenzae del 15-30%; en los pases anglosajones, M. catarrhalis est implicada hasta en el 20% de los casos, sin embargo en el sur de Europa este porcentaje es mucho menor, siendo prcticamente inexistente en nuestro medio. Otras bacterias, como S. pyogenes y S. aureus tambin pueden ser causa de otitis media. Hace aproximadamente 15 aos se estableci la presencia, mediante timpanocentesis, de una nueva bacteria, Alloiococcus otitidis, en una serie de nios con otitis media crnica. Desde entonces, se han realizado nuevos estudios mediante tcnicas de PCR que apoyan que la presencia de esta bacteria en el odo medio es una causa de este tipo de otitis. Otras bacterias del grupo de las corineformes, como Corynebacerium auris y sobre todo, Turicella otitidis, tambin se han relacionado con la otitis media, pero en este caso, no se han desarrollado trabajos suficientes para apoyar esta teora. o La coinfeccin con virus se observa en el 30-40% de los casos, pero menos del 10% de estos estn causadas exclusivamente por virus (VRS, adenovirus, enterovirus, virus influenza y rinovirus). De forma ocasional, se asocian a la otitis media Chlamydophila, Mycoplasma pneumoniae y Chlamydia trachomatis en nios menores de seis meses. Tambin se han aislado especies bacterianas anaerobias del odo de nios con OMA y otitis crnica. Hay otras formas muy infrecuentes de otitis: otitis diftrica, tuberculosa, ttanos otgeno, otitis por Mycobacterium chelonae y la otitis por Ascaris lumbricoides.
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2.1.4 Sinusitis Los senos paranasales comprenden el seno frontal, el maxilar, el etmoidal y el esfenoidal. Cada uno de ellos est recubierto por un epitelio ciliado pseudo-estratificado con orificios de drenaje (ostiums) que se abren a la nariz. Cualquier obstruccin de stos conduce a la alteracin de la fisiologa normal y potencialmente puede producir sinusitis, cuyas causas son una infeccin vrica, bacteriana o mictica. A menudo es difcil distinguir de una simple rinofaringitis vrica o de una inflamacin sinusal de causa alrgica, y estos dos procesos son importantes factores predisponentes para la aparicin de una infeccin bacteriana de los senos paranasales. Los sntomas de la sinusitis aguda pueden ser inespecficos y su diagnstico se fundamenta en una cuidadosa historia clnica y un buen examen fsico. La mayora de los pacientes probablemente sufren una sinusitis de causa vrica. Diferenciar la sinusitis vrica de la sinusitis bacteriana es difcil, debido a que las infecciones vricas preceden a las sinusitis bacterianas. En general se dice que si los sntomas persisten por ms de 7 das, son ms severos que en la infeccin vrica o empeoran, se puede diagnosticar una sinusitis bacteriana. La impresin clnica general es un indicador diagnstico ms seguro de sinusitis aguda bacteriana. El diagnstico, depende de la presencia de al menos dos sntomas mayores, o un sntoma mayor y dos menores. Los sntomas mayores son: dolor o presin facial, obstruccin nasal, rinorrea purulenta, hiposmia o anosmia. Los sntomas menores son: cefalea, halitosis, dolor dental superior, tos (especialmente en nios), otalgia o presin en odos. Varios factores pueden contribuir a la obstruccin de los orificios de drenaje: o o o o Inflamacin de la mucosa que obstruye el ostium Anormalidades en el sistema ciliar. Anormalidades anatmicas y estructurales. Sobreproduccin de moco.
Las infecciones vricas o los daos del epitelio debilitan las defensas y facilitan la penetracin de bacterias a la mucosa sinusal. Las alergias, el decbito prolongado y el uso de sondas o tubos nasales, tambin contribuyen a la inflamacin de la mucosa nasal y pueden obstruir el ostium de drenaje de los senos paranasales. La mayora de las veces la etiologa es vrica o alrgica, pero en un pequeo porcentaje de casos, puede aparecer una infeccin bacteriana secundaria. Esto ocurre especialmente en los nios pequeos en los que las infecciones respiratorias vricas se complican en sinusitis bacteriana. En adultos esta complicacin se produce entre el 5-13% de los casos. La probabilidad de que un paciente con sntomas respiratorios sugerentes de sinusitis tenga realmente esta condicin no supera el 40%. Por convencin se denomina sinusitis aguda a aquel proceso infeccioso que dura hasta 4 semanas y sinusitis crnica a aquel que dura al menos 3 meses, que recurre ms de 3 o 4 veces al ao o en las que el tratamiento mdico fracasa frecuentemente.
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Los agentes etiolgicos involucrados en la sinusitis aguda o crnica son diversos: o o o Los virus, que son la principal causa de sinusitis aguda son rinovirus, virus influenza, virus parainfluenza y adenovirus. Entre las bacterias predominan dos especies: S. pneumoniae y H. influenzae no encapsulado. En menor frecuencia estn las bacterias anaerobias (tales como Bacteroides, Fusobacterium y cocos anaerobios), M. catarrhalis, S. pyogenes, S. aureus y los bacilos gramnegativos. Los bacilos gramnegativos son agentes causantes de sinusitis nosocomial, especialmente en pacientes que estn sometidos a ventilacin mecnica o intubados durante mucho tiempo. o Los hongos son agentes causantes de sinusitis crnica que se produce especialmente en pacientes inmunodeprimidos o con anomalas mecnicas. Los hongos ms frecuentes son Aspergillus spp., Fusarium spp., los hongos dermatofitos (Bipolaris spicifera, Cladosporium spp., Curvularia spp., y Alternaria spp.) y los zigomicetos (Mucor spp., y Rhizopus spp.).
2.1.5 Sndrome de Lemierre El sndrome de Lemierre es una entidad clnica caracterizada por una infeccin orofarngea aguda que origina una tromboflebitis de la vena yugular interna, as como embolismos spticos mltiples que afectan preferentemente al pulmn. Afecta principalmente a adolescentes y adultos jvenes. Es actualmente una enfermedad rara debido al uso generalizado de antibiticos; no obstante es importante tenerla en consideracin y mantener un alto ndice de sospecha diagnstica, ya que un tratamiento precoz es esencial para una evolucin satisfactoria. La presentacin tpica de esta enfermedad es la fiebre, malestar general, disfagia y antecedentes de faringitis en los das previos. Puede haber induracin del borde anterior del esternocleidomastoideo y dolor cervical intenso, que son manifestaciones de tromboflebitis de la vena yugular interna. Los mbolos spticos desde la vena yugular interna facilitan la diseminacin metastsica de la enfermedad y la formacin de abscesos en pulmn, hgado, articulaciones y otros lugares. El agente causal en la mayor parte de los casos es Fusobacterium necrophorum, bacilo gramnegativo, anaerobio estricto, saprofito habitual de la microbiota de la boca. En algunos casos pueden aislarse asociados otros anaerobios como Fusobacterium nucleatum, Bacteroides o Peptostreptococcus, e incluso bacterias aerobias como Arcanobacterium haemolyticum. 2.1.6 Angina de Vincent Es una infeccin de la cavidad oral caracterizada por faringitis, presencia de exudado membranoso, aliento ftido y lceras orales. Es infrecuente en nios, pero s se presenta en adultos que tienen una mala higiene bucal, estrs o una enfermedad sistmica grave. Est
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causada por ciertas especies aerobias como Borrelia spp. y anaerobias como Fusobacterium spp. Para confirmar el diagnstico, adems de la clnica y la exploracin, se debe realizar una tincin de Gram. 2.1.7 Abscesos periamigdalino y faringeo o El absceso periamigdalino es una coleccin purulenta localizada entre la cpsula amigdalar, el msculo constrictor superior de la faringe y el msculo palatofarngeo. Es la complicacin ms frecuente de una infeccin amigdalar. Ilustracin 10. El absceso retrofarngeo afecta fundamentalmente a nios menores de 5 aos, en los que se produce la infeccin de los ganglios linfticos situados entre la pared posterior de la faringe y la fascia prevertebral. . El absceso parafarngeo se sita lateralmente al msculo constrictor superior de la faringe y cerca de la cartida, y suele deberse a la complicacin de un absceso periamigdalino, aunque en ocasiones son de naturaleza idioptica.
Cuadro clnico o El absceso periamigdalino clnicamente se caracteriza porque en el curso de una amigdalitis aguda, aparece odinofagia y disfagia intensa, otalgia refleja, mal estado general y fiebre elevada, trismos, y voz gangosa con sialorrea. A la exploracin se aprecia un abombamiento unilateral de la amgdala hacia la lnea media con el consiguiente desplazamiento de la vula hacia el lado sano. La palpacin de los ganglios linfticos de la regin mandibular suele ser dolorosa. El absceso retrofarngeo se manifiesta con fiebre elevada, odinofagia acentuada que puede comprometer la alimentacin, e incluso estridor y disnea por obstruccin de la va area. A la exploracin se aprecia un abombamiento en la pared farngea posterior. Este signo es difcil de detectar en nios pequeos debido al tamao de la orofaringe y al acmulo de secreciones en la hipofaringe y en la cavidad oral. Los sntomas ms frecuentes del absceso parafarngeo son el dolor y tumefaccin cervical, seguido por la odinofagia y en menor medida por el trismus y tortcolis. Si un paciente con absceso periamigdalino presenta una clnica atpica, como cierta profusin de pared farngea, edema de epiglotis, o los sntomas anteriormente indicados, se debe sospechar una extensin al espacio parafarngeo. Asimismo, la imagen tpica de abombamiento amigdalar y el desplazamiento contralateral de la vula son signos menos evidentes si el absceso periamigdalino se ha convertido en parafarngeo.
Etiologa Suele tratarse de una infeccin polimicrobiana con participacin de la microbiota aerobia (S. pyogenes, S. aureus, H. influenzae) y anaerobia (Prevotella, Porphyromonas, Fusobacterium, y Peptostreptococcus spp.).
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2.1.8 Difteria La difteria es una enfermedad distribuida por todo el mundo, fundamentalmente en zonas urbanas pobres donde el hacinamiento es notorio y el grado de proteccin de la inmunidad inducida por la vacuna es bajo. Debido a los programas de inmunizacin activa la difteria se ha convertido en una enfermedad infrecuente en nuestro medio. La difteria es fundamentalmente una enfermedad peditrica, pero en las zonas donde hay programas de inmunizacin activa para nios, la incidencia ms elevada se observa en los grupos de ms edad. Cuando el microorganismo Corynebacterium diphtheriae llega al sujeto susceptible, inicia su multiplicacin. Su virulencia est relacionada con la capacidad de elaborar y excretar toxina desde el foco local, ya que no produce bacteriemia, lo cual explica las manifestaciones locales y los efectos txicos a distancia (miocardio, sistema nervioso, rin, etc.). Las lesiones se localizan en la mucosa respiratoria del tracto respiratorio superior y tras 2-4 das de periodo de incubacin, las cepas lisgenas elaboran la toxina, que a nivel local dan lugar a fenmenos necrticos, inflamatorios y exudativos que condicionan un ambiente propicio para el crecimiento del microorganismo y para que siga elaborando ms toxinas. Por su parte las clulas epiteliales necrticas, los leucocitos, hemates, material fibrinoide y los propios bacilos diftricos junto a otros microorganismos presentes en la mucosa respiratoria dan lugar a las tpicas membranas diftricas en las que se elabora y libera la exotoxina. Estas membranas en ocasiones producen un autntico molde del rbol respiratorio. Las manifestaciones clnicas txicas, a distancia, aparecen tras un periodo latente variable, de 10-14 das para la miocarditis y de 3-7 semanas para las neuritis perifricas. Hay que resaltar que es necesario instaurar precozmente el tratamiento con antitoxina ya que esta puede neutralizar la toxina circulante o la toxina absorbida por las clulas pero es ineficaz una vez que la toxina ha penetrado la clula. Las complicaciones ms frecuentes son la miocarditis y la neuritis. El agente etiolgico de la difteria es C. diphteriae (del cual se conocen 4 biotipos: gravis, mitis, intermedius y belfanti) as como algunas cepas de C. ulcerans y C. pseudotuberculosis. Todos pueden portar el gen de la toxina diftrica, que se introduce en las cepas de C. diphteriae mediante un fago lisognico. Investigaciones posteriores a esta clasificacin en biotipos demostraron que todos los tipos producen la misma toxina con diferencias ms cuantitativas que cualitativas y que incluso las formas graves y mortales pueden estar condicionadas por el tipo mitis, por lo que esta clasificacin, distinguiendo tipos, no tiene mayor inters prctico. C. diphtheriae resiste bien la desecacin y las bajas temperaturas (hasta 1 ao en los cultivos conservados en la oscuridad), mientras que resiste poco la luz solar directa, por lo que se trata de una enfermedad helifaga y esto explica que los microorganismos virulentos pueden permanecer con capacidad de contagio en juguetes, libros, muebles, etc. durante largo tiempo. En nuestro pas, la difteria es una enfermedad erradicada y su reaparicin sera excepcional. El cribado de especies de Corynebacterium se recomienda nicamente en las siguientes circunstancias:
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Paciente con uno de los siguientes factores de riesgo: o o Faringitis membranosa. Viaje en los 10 das previos o contacto con alguien que haya viajado recientemente a pases de la antigua Unin Sovitica, frica, Amrica del Sur o Sudeste asitico. Consumo de productos lcteos sin pasteurizar o contacto con animales domsticos (C. ulcerans). Trabajo en un laboratorio donde se manipulen cepas de C. diphteriae.
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Paciente con lceras crnicas o lesiones cutneas y uno de los siguientes factores de riesgo: o o o Viaje reciente a regiones tropicales. Contacto con viajeros recientes a zonas tropicales. Trabajo en un laboratorio donde se manipulen cepas de C. diphteriae.
2.1.9 Candidiasis Las micosis de la cavidad oral son frecuentes y habitualmente de carcter leve o moderado. Se observan especialmente en pacientes portadores de prtesis o con inmunodeficiencias. La mayor parte de las candidiasis orales son asintomticas y ms frecuentes en lactantes, ancianos y personas con factores predisponentes generales o locales. La infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un importante factor predisponente y, en personas con SIDA, estas lesiones pueden ser indicadoras de la evolucin de la enfermedad. La candidiasis orofarngea puede ser asintomtica o producir dolor o sensacin de mal sabor de boca. Se describen cuatro formas de candidiasis orofarngea: o Candidiasis pseudomembranosa o muguet: se caracteriza por las tpicas lesiones blanquecinas cremosas, adheridas a la mucosa bucal, que dejan un rea eritematosa cuando se desprenden. Afecta sobre todo a la mucosa bucal, labios y paladar. Candidiasis atrfica: se manifiesta como un eritema brillante con prdida de papilas en la lengua y en toda la cavidad oral. Candidiasis hiperplsica crnica: se caracteriza por reas eritematosas de distribucin simtrica junto a lesiones blanquecinas sobreelevadas que no se desprenden. Es la forma menos frecuente. Queilitis angular: existe eritema y grietas o fisuras en las comisuras labiales.
o o
En cuanto a la etiologa, la mayora estn producidas por Candida albicans y, en menor medida, por otras especies de Candida como C. tropicalis, C. parapsilosis, y C. glabrata.
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2.1.10 Zigomicosis Las zigomicosis son un grupo heterogneo de infecciones causadas por hongos oportunistas miceliares ubicuos y generalmente saprofitos. Los zigomicetos son hongos ubicuos de distribucin mundial que tienen relativamente poco grado de patogenicidad, salvo cuando existen factores predisponentes siendo la acidosis metablica el ms implicado. Otros factores son la inmunosupresin, ruptura de barreras, enfermedades crnicas debilitantes, administracin de corticoesteroides o antibiticos de amplio espectro. El uso de desferroxamina se ha asociado con distintas presentaciones de la zigomicosis pero no con la cutnea. La infeccin se origina al germinar las esporas del hongo y al producirse el crecimiento invasor de las hifas. Cuadro clnico o El cuadro tpico de la mucormicosis es la rinocerebral, que se caracteriza por una sinusitis aguda, rpidamente progresiva, que invade los vasos sanguneos y se extiende a la zona orbital y el cerebro. La especie que causa con mayor frecuencia esta infeccin es Rhizopus oryzae. Se han descrito otros tipos de mucormicosis, como la cutnea, la subcutnea, la gastrointestinal, la pulmonar e infecciones diseminadas. Las entomoftoramicosis son cuadros crnicos que suelen afectar al tejido subcutneo o a la mucosa nasofarngea. Basidiobolus ranarum origina micosis subcutneas en la cara, en el cuello y en el trax y Conidibolus coronatus causa una infeccin caracterizada por plipos nasales. Ambos hongos son endmicos en zonas tropicales de Amrica del Sur, frica, Sudeste asitico y Australia. En los ltimos aos se han descrito infecciones diseminadas mortales en enfermos con SIDA.
Los zigomicetos pertenecen a la divisin Zygomycota, clase Zygomycetes, la cual est formada, segn las ltimas revisiones taxonmicas, por tres rdenes: o o o Las infecciones por Mucorales reciben el nombre de mucormicosis, entre las que existen infecciones localizadas y diseminadas. Los Entomophthorales causan infecciones cutneas y subcutneas crnicas, que reciben el nombre de entomoftoramicosis. Los Mortierellales son patgenos animales, principalmente del ganado bovino, y hasta la fecha no existen casos confirmados de infeccin en humanos.
2.2 Infecciones de vas respiratorias bajas

Las infecciones del tracto respiratorio inferior se encuentran entre las enfermedades infecciosas ms frecuentes y con mayores tasas de morbilidad y mortalidad. Los mecanismos por los cuales los microorganismos alcanzan el tracto respiratorio inferior son los siguientes:
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La aspiracin de microbiota residente en la orofaringe dentro del alvolo pulmonar es el ms frecuente, (neumona por S. pneumoniae, neumona nosocomial por bacilos y cocobacilos gramnegativos). El segundo mecanismo en frecuencia es la inhalacin de microorganismos aerosolizados (como ocurre en las denominadas neumonas atpicas: Legionella spp., Chlamydia spp., M. pneumoniae, Coxiella burnetii, Rickettsia prowazekii, Francisella tularensis, en la neumona por Aspergillus spp. y por hongos dimrficos). El tercer mecanismo, y menos frecuente, se produce por diseminacin sangunea desde un foco infeccioso distante (pacientes en hemodilisis, usuarios de drogas por va parenteral) o por translocacin bacteriana a partir de la microbiota intestinal.
2.2.1 Bronquitis La bronquitis, uno de los diagnsticos clnicos ms frecuentes, consiste en la inflamacin e hiperreactividad del epitelio ciliado que recubre el rbol bronquial, con la consiguiente obstruccin del flujo de aire, que se manifiesta clnicamente por dificultad respiratoria y tos acompaada o no de la produccin de esputo. Con frecuencia se acompaa de fiebre y afecta a todos los grupos de edad. Por la duracin de los sntomas (principalmente la tos) puede clasificarse en bronquitis aguda (varias semanas) y bronquitis crnica (episodios de tres meses de duracin durante dos aos consecutivos). Ilustracin recomendada: http://www.nhlbi.nih.gov/health-spanish/health-topics/temas/brnchi/ En la bronquitis aguda, o La gran mayora de los casos tiene una etiologa vrica (influenza, parainfluenza, rinovirus, coronavirus y respiratorio sincicial) formando parte del cortejo sintomtico del catarro comn, y slo una pequea proporcin tienen etiologa bacteriana, que puede corresponder a una infeccin primaria o, ms frecuentemente, secundaria a una infeccin vrica previa. Entre los agentes bacterianos, M. pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Bordetella pertussis y Bordetella parapertussis son los ms frecuentemente implicados, y el cuadro clnico se caracteriza por tos persistente de curso ms prolongado que en el caso de la infeccin vrica, que en ocasiones puede progresar al inicio de un cuadro asmtico.
En la bronquitis crnica, o Los agentes respiratorios comunes, tales como Haemophilus influenzae, S. pneumoniae y Moraxella catarrhalis, adquieren el principal protagonismo al ser responsables de la mayora de las exacerbaciones clnicas.
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Reagudizaciones de procesos crnicos: o Haemophilus influenzae, S. pneumoniae y Moraxella catarrhalis son tambin los principales agentes etiolgicos de las exacerbaciones agudas que se producen en los pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crnica (EPOC), de las bronquiectasias y en las primeras fases (durante la infancia) de la fibrosis qustica. La importancia de otros microorganismos en las reagudizaciones de la bronquitis es notablemente inferior, aunque pueden predominar Pseudomonas aeruginosa y las enterobacterias en las exacerbaciones de la bronquitis crnica avanzada.
El papel del laboratorio de microbiologa en el diagnstico de la bronquitis crnica es muy limitado, ya que ni el examen microscpico ni el cultivo del esputo permiten diferenciar la colonizacin de la infeccin del tracto respiratorio. No obstante, puede estar indicado el estudio microbiolgico en las exacerbaciones de la bronquitis crnica en caso de fracaso del tratamiento emprico. Bronquitis por Bordetella pertussis (tos ferina) La bronquitis por Bordetella pertussis, diminuto cocobacilo gramnegativo muy lbil y de crecimiento difcil, se caracteriza por episodios de tos intensa, violenta y paroxstica acompaada de jadeo inspiratorio caracterstico, que con frecuencia finalizan en un vmito. La infeccin, endmica con ciclos regulares epidmicos, es fcilmente transmisible y de declaracin obligatoria. Se presenta con ms frecuencia en nios menores de 6 meses, no vacunados o parcialmente vacunados, entre los que se dan los casos ms graves, pero tambin en pacientes adultos y adolescentes, incluso con inmunizacin previa, ya que la inmunidad postvacunal es limitada (menos de 12 aos). La cepa variante no toxignica de B. pertussis, produce un cuadro clnico similar al de B. pertussis, no prevenible por la vacunacin, y requiere un diagnstico microbiolgico diferencial. Bordetella bronchiseptica, endmica en algunos animales, puede producir infecciones respiratorias crnicas de difcil tratamiento en humanos, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. Bronquitis por Mycoplasma pneumoniae M. pneumoniae es un patgeno de comportamiento extra e intracelular implicado en infecciones del tracto respiratorio adquiridas en la comunidad tanto en nios como en adultos. La presentacin clnica primaria es la traqueobronquitis con fiebre y tos no productiva (en ocasiones con un cierto parecido a la de la tos ferina), acompaada por una variedad de manifestaciones del tracto respiratorio superior. Esta infeccin puede progresar a bronquiolitis, especialmente en los nios pequeos, y a neumona en el 10%-15% de los casos, y en raras ocasiones acompaarse o seguirse de manifestaciones extrapulmonares importantes, principalmente neurolgicas y cardacas. El microorganismo, que se caracteriza por la ausencia de pared celular, se adhiere selectivamente mediante adhesinas especficas a las clulas del epitelio ciliado bronquial en las que causa ciliostasis y destruccin celular y, por consiguiente, inflamacin y prdida del
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recubrimiento epitelial de la mucosa del tracto respiratorio, as como hiperreactividad de las vas areas que puede persistir durante semanas o meses, y que es caracterstica de esta bacteria. Merece mencin especial la asociacin de M. pneumoniae con el asma. Estudios controlados apoyan un papel emergente de M. pneumoniae, as como tambin de C. pneumoniae, en el asma crnico estable y en sus exacerbaciones agudas. Es conocida su capacidad para la induccin de secrecin de mediadores proinflamatorios implicados en la patogenia del asma y de las exacerbaciones, incluida la respiracin sibilante. Bronquitis por Chlamydophila Tres especies de clamidias pueden causar infeccin bronquial que, en ocasiones, puede progresar a neumona: o C. pneumoniae es un patgeno muy ubicuo. Aunque su incidencia es menor en los nios pequeos, aumenta significativamente durante la edad escolar. Causa bronquitis aguda en nios y adultos, adems de sntomas del tracto respiratorio superior, como faringitis, laringitis y sinusitis, aunque su mayor inters corresponde a un cuadro grave parecido a la tos ferina. Otra implicacin importante de C. pneumoniae se debe a su asociacin con la exacerbacin aguda en la bronquitis crnica, asma y EPOC. En estos ltimos pacientes, es caracterstica la produccin de tos persistente, acompaada o no de fiebre. La infeccin por C. psittaci, de aparicin espordica, se asocia con la exposicin a secreciones de pjaros infectados C. trachomatis es causa de infeccin bronquial y neumona en lactantes que adquieren la infeccin durante el nacimiento a partir de la madre infectada. Parachlamydia acanthamoebae y Simkania negevensis, recientemente incluidas en el gnero Chlamydophyla, adems de un cuadro respiratorio grave pueden causar manifestaciones extrapulmonares y secuelas neurolgicas.
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2.2.2 Bronquiolitis La bronquiolitis es un sndrome agudo que afecta a los nios durante los dos primeros aos de vida (mayor tasa de ataque entre 1 y 6 meses de edad) que se caracteriza por la inflamacin del epitelio que reviste los pequeos bronquios y los bronquiolos. A medida que la inflamacin progresa, la infiltracin peribronquiolar y el edema de la submucosa y la adventicia conducen a la necrosis y prdida del epitelio bronquiolar y, en consecuencia, al estrechamiento y obstruccin de la luz de las vas areas. La progresin del proceso conduce a la neumonitis intersticial. La etiologa de la bronquiolitis es:
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Principalmente vrica (ms frecuentemente por virus respiratorio sincicial, seguido por virus parainfluenza y metapneumovirus) como resultado de la progresin de una infeccin originada en las vas altas. En ocasiones puede producirse como resultado de una infeccin bronquial descendente, en particular por M. pneumoniae. M. pneumoniae es el causante de hasta el 5% de las bronquiolitis en los nios pequeos.
La presentacin es estacional, con predominio invernal y al inicio de la primavera. Las manifestaciones clnicas incluyen unos prdromos con sntomas de vas altas y un comienzo agudo con respiracin sibilante, distensin torcica, tos, disnea, apnea y sndrome de dificultad respiratoria aguda. La mayora de los nios requieren hospitalizacin. Ilustracin recomendada: http://catalog.nucleusinc.com/enlargeexhibit.php?ID=71247&TC=&A=2 2.2.3 Neumona aguda La neumona es un proceso caracterizado por la inflamacin y consolidacin de los pulmones, causado por infeccin o por irritantes. La neumona aguda puede estar causada por una amplia gama de agentes microbianos. Neumona adquirida en la comunidad La neumona aguda adquirida en la comunidad (NAC) es una entidad clnica muy frecuente (en nuestro pas 2-10 casos/1000 habitantes adultos/ao) que conlleva una morbilidad (aproximadamente un 35% requieren hospitalizacin) y mortalidad importantes (menos del 5% a ms del 30%). Las caractersticas del sndrome de neumona aguda adquirida en la comunidad han cambiado con el curso de los aos, presentando una mayor diversidad de la poblacin afectada, con aumento de la edad de los afectados y del nmero de pacientes con enfermedades de base (diabetes, EPOC, bronquiectasias) o inmunodepresin (infeccin por el VIH, trasplantados). Adems, ha cambiado tambin el espectro de los microorganismos potencialmente implicados. A continuacin se detallan los principales sndromes clnicos y los agentes etiolgicos bacterianos ms frecuentes. Sin embargo, se ha de tener presente que aproximadamente en el 10% de los casos la etiologa de la NAC puede ser mixta y que casi en el 40% de los pacientes se desconoce el agente causal. Neumona por Streptococcus pneumoniae S. pneumoniae es el agente causal ms frecuente de la NAC, con una prevalencia del 20%-65% y responsable de hasta el 35% de los casos de NAC que requieren hospitalizacin. Afecta a todos los grupos de edad, pero con mayor frecuencia a nios pequeos y ancianos. Es la primera causa de neumona bacteriana en el paciente infectado por el VIH y su incidencia es mayor en los adultos con enfermedad broncopulmonar o inmunodeficiencia subyacentes.
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La colonizacin de la orofaringe y tracto respiratorio superior por S. pneumoniae es frecuente en los adultos y muy frecuente en los nios, sobre todo durante los dos primeros aos de vida. Su transmisin se realiza de persona a persona y la infeccin pulmonar se adquiere por microaspiracin desde la orofaringe. Cuando a la colonizacin por neumococo se suman ciertos factores de riesgo como la alteracin de los mecanismos defensivos del tracto respiratorio (alcoholismo, tabaquismo, infecciones vricas), ciertas inmunodeficiencias (linfoma, mieloma, infeccin por el VIH) y una enfermedad crnica subyacente (pulmonar, heptica, renal o diabetes) se favorece el desarrollo de la neumona. Merece mencionarse la especial gravedad que adquiere la neumona neumoccica en los pacientes esplenectomizados, con asplenia funcional o con respuesta anormal de inmunoglobulinas (mieloma, linfoma, infeccin por el VIH). El cuadro clnico-radiolgico de la neumona por S. pneumoniae (se observa en 50% de los casos) representa el sndrome clsico de neumona bacteriana: fiebre, tos productiva con esputos purulentos o herrumbrosos, dolor pleural, leucocitosis y a la exploracin presencia de estertores crepitantes y, a veces, soplo tubrico. En la radiografa se observa la presencia de imgenes tpicas de condensacin lobar o segmentaria con broncograma areo. Neumona por Haemophilus influenzae H. influenzae coloniza con frecuencia la orofaringe de las personas sanas, que adquieren y eliminan espontneamente nuevas cepas y las transmiten a otras personas por las secreciones. La infeccin afecta preferentemente a pacientes adultos y ancianos con EPOC, as como a pacientes con SIDA, por lo que se incluye en las series de NAC categorizadas como graves, con una prevalencia del 3%-10%. Sin embargo, se desconoce su verdadera incidencia en los pacientes no hospitalizados, debido a que en la mayora de stos no se obtienen muestras de esputo, y a la dificultad de establecer la distincin entre colonizacin e infeccin. En los nios, la neumona por H. influenzae se acompaa con frecuencia de otitis, epiglotitis y, en ocasiones, meningitis. El cuadro clnico es similar al de la neumona neumoccica. Neumona por Legionella pneumophila La neumona por L. pneumophila se incluye dentro de las denominadas neumonas por patgenos bacteriano atpicos, junto con M. pneumoniae y C. pneumoniae. De las ms de 40 especies de Legionella, L. pneumophila (principalmente los serogrupos 1, 4 y 6) es responsable de ms del 90% de las infecciones causadas por este grupo de organismos. L. pneumophila, de amplia distribucin en la naturaleza, tiene su hbitat natural en las aguas ambientales, industriales y domsticas (grifos, duchas, acondicionadores de aire), en las que, normalmente, se encuentra en nmero reducido. Resistente a la accin de la cloracin puede sobrevivir y multiplicarse hasta nmeros elevados. La transmisin al hombre se produce por inhalacin directa, aspiracin o instilacin en el tracto respiratorio de lquidos contaminados. La neumona puede aparecer en casos espordicos o en brotes epidmicos y su prevalencia vara mucho segn las reas geogrficas (en general del 2%-10%). Afecta a los principalmente a adultos varones y, como patgeno intracelular, son factores predisponentes todas las situaciones de dficit de la inmunidad celular (tabaquismo, alcoholismo, bronquitis crnica, tratamiento con corticosteroides), as como la inmunodepresin del transplantado.
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Las manifestaciones clnicas de la neumona por L. pneumophila son indistinguibles de las de las neumonas de otra etiologa. Con frecuencia, se presenta de forma parecida a la neumona neumoccica grave, requiriendo hospitalizacin. En otras ocasiones, la presentacin corresponde a un cuadro ms leve que recuerda a la neumona atpica. El diagnstico diferencial puede presentar dificultades. Aparte de la existencia de un brote conocido, pueden ser de utilidad la presencia de datos tales como cefalea intensa, anomalas gastrointestinales y neurolgicas, necesidad de atencin en unidad de cuidados intensivos, elevacin de la creatinina y de las enzimas hepticas, hiponatremia y falta de respuesta al tratamiento con antibiticos betalactmicos. Neumona por Mycoplasma pneumoniae M. pneumoniae es un agente etiolgico importante de la NAC. Su incidencia (globalmente ms del 20% de los pacientes con NAC y el segundo agente etiolgico despus de S. pneumoniae) presenta amplias variaciones segn las reas geogrficas, los perodos en que se producen brotes epidmicos y las poblaciones que residen en instituciones cerradas. De forma clsica, se ha descrito una mayor preferencia de presentacin en los nios en edad escolar (5-15 aos) y en los adultos jvenes, siendo muy infrecuente en nios menores de 5 aos. Sin embargo, estudios de los ltimos aos han puesto de manifiesto que la neumona por M. pneumoniae tiene una presentacin endmica y epidmica significativa en los nios menores de 5 aos y en los ancianos, aunque el sndrome ms tpico en los nios pequeos siga siendo la traqueobronquitis. Generalmente, el curso clnico de la neumona por M. pneumoniae suele ser benigno (neumona ambulatoria) e incluso asintomtico. No obstante, cerca de un 3-4% de los pacientes requieren hospitalizacin, especialmente los ancianos, y en raras ocasiones se presenta como NAC de carcter grave, dndose casos, aunque muy infrecuentes, en los que cursa con sndrome de insuficiencia respiratoria aguda. El cuadro clnico corresponde al sndrome de neumona atpica en el que adems de M. pneumoniae se incluyen las neumonas causadas por C. pneumoniae, en ocasiones L. pneumophila, y las relacionadas con zoonosis producidas por C. psittaci y C. burnetii, as como algunos virus respiratorios y caracterizado por inicio subagudo, tos seca, predominio de manifestaciones extrapulmonares (artromialgias) sobre las respiratorias, imgenes radiolgicas de infiltrados nodulares con distribucin peribronquial y tpica disociacin clnico-radiolgica. De especial relevancia son las manifestaciones extrapulmonares que se producen en la infeccin por M. pneumoniae, tanto por su variedad (neurolgica, cardaca, cutnea, hematolgica), como por su gravedad, que en ocasiones sobrepasan en importancia al cuadro respiratorio. Neumona por Chlamydophila pneumoniae y otras clamidias Las dos especies del nuevo gnero Chlamydophila compuesto por C. pneumoniae y C. psittaci, as como la especie Chlamydia trachomatis, son agentes etiolgicos de la NAC, aunque, como ha quedado expuesto en el apartado correspondiente a la bronquitis, dentro de contextos epidemiolgicos distintos: C. trachomatis, en lactantes que adquieren la infeccin durante el nacimiento y C. psittaci, por exposicin a secreciones de pjaros infectados.
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Las especies de la familia Chlamydiaceae son microorganismos intracelulares obligados. Presentan preferencia por las clulas epiteliales, los macrfagos y las clulas mononucleares. Su efecto citoptico consiste en disfuncin ciliar y dao en el epitelio bronquial. Merecen mencin aparte las dos especies del grupo nuevas clamidias, Parachlamydia acanthamoebae y Simkania negevensis, recientemente reconocidas como patgenos respiratorios emergentes, y se engloban bajo el trmino clamidias resistentes a amebas por su capacidad de infectar y sobrevivir dentro de las amebas, que utilizan como reservorio ambiental. P. acanthamoebae coloniza las mucosas nasal y farngea de los individuos sanos y ha sido implicada como agente causal de casos de bronquitis, neumona adquirida en la comunidad y neumona por aspiracin en pacientes inmunocomprometidos, por lo que se comporta como un patgeno oportunista. S. negevensis, se encuentra ampliamente distribuida, como lo demuestra la elevada seroprevalencia y su deteccin por PCR, pero adems se ha asociado con bronquiolitis en lactantes, infeccin crnica del tracto respiratorio inferior en adultos, exacerbaciones del EPOC y neumona, adems de haberse detectado por PCR en biopsias arteriales. Neumona por Moraxella catarrhalis M. catarrhalis es un colonizador frecuente del tracto respiratorio superior de nios y adultos sanos y de forma especial en los adultos con EPOC. Se le asocia con cuadros de sinusitis y otitis media en los nios. Como agente etiolgico de la NAC, M. catarrhalis da cuenta del 10% de los casos en las personas ancianas, sobre todo en las que sufren enfermedades subyacentes, en especial la EPOC, insuficiencia cardiaca congestiva, diabetes mellitus y otras enfermedades crnicas. Neumona por Enterobacteriaceae Las enterobacterias forman parte de la microbiota normal gastrointestinal. Cuando en las clulas del husped ocurre una alteracin de los puntos de unin para los bacilos gramnegativos, se produce un aumento en la colonizacin orofarngea por estas bacterias que, fundamentalmente, por aspiracin alcanzan el parnquima pulmonar y dan lugar a la neumona. Aunque el aumento de la colonizacin por bacilos gramnegativos es ms frecuente en los pacientes hospitalizados y la neumona por enterobacterias es, en general, nosocomial, las enterobacterias tambin son causa de NAC en un grupo restringido de pacientes no hospitalizados, si bien en una proporcin mucho ms reducida (<5%). Los pacientes con inmunodepresin, enfermedades debilitantes crnicas, como la diabetes, y EPOC, hospitalizacin previa o tratamiento antimicrobiano tienen un riesgo mayor de padecer neumona por enterobacterias. Las neumonas causadas por Escherichia coli y K. pneumoniae tienden a la formacin de empiema, abscesos y adherencias pleurales y se acompaan de una elevada tasa de mortalidad. Otras especies de enterobacterias asociadas a neumona en estos pacientes incluyen Enterobacter spp., Hafnia spp., y Citrobacter spp.
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Neumona por Pseudomonas y otros bacilos gramnegativos no fermentadores P. aeruginosa, es una bacteria muy ubicua y forma parte de la microbiota normal de las personas sanas. Los pacientes con inmunodepresin, alteracin de los mecanismos respiratorios (enfermedad pulmonar crnica, insuficiencia cardaca congestiva, bronquiectasias, fibrosis qustica) y hospitalizacin previa son especialmente susceptibles a la neumona por P. aeruginosa. La va de adquisicin se produce por la aspiracin del microorganismo que coloniza en altas tasas la faringe y el tracto respiratorio superior. P. aeruginosa, tiene resistencia intrnseca a muchos agentes antimicrobianos y es el principal agente etiolgico bacteriano multirresistente de la neumona nosocomial. Acinetobacter spp. se encuentra distribuido de forma ubicua en multitud de fuentes ambientales y tambin coloniza heces, piel y esputos de las personas sanas fuera del medio hospitalario. Sin embargo, Acinetobacter spp. es causa de neumona comunitaria en pacientes con inmunosupresin. Neumona por aspiracin Se denomina neumona aspirativa a la producida por la aspiracin de secreciones orofarngeas o de material contaminado procedente del tracto digestivo. La aspiracin de secreciones contaminadas es frecuente durante el sueo, pero en condiciones normales estas secreciones son eficazmente eliminadas por los mecanismos defensivos del husped (tos, la accin del epitelio ciliar y los macrfagos alveolares). Cuando estos mecanismos estn alterados (alteracin de la consciencia, de la deglucin y boca sptica), la aspiracin es de gran volumen o contiene un alto inculo bacteriano, se desarrolla la infeccin pulmonar. Ilustracin recomendada: http://catalog.nucleusinc.com/enlargeexhibit.php?ID=12758&TC=&A=2 La neumona por aspiracin puede representar hasta el 10-15% de los casos de NAC. Presenta dificultades para el diagnstico clnico, cuyas nicas claves son la presencia de infiltrado pulmonar en una zona declive en un paciente con factores de riesgo de aspiracin o boca sptica, y rara vez se confirma bacteriolgicamente. En ocasiones, evoluciona de forma grave hacia la necrosis y el absceso pulmonar. La etiologa suele ser polimicrobiana. Cuando en un paciente no hospitalizado se produce una aspiracin, las bacterias anaerobias (Fusobacterium spp., Bacteroides spp., Prevotella spp., Peptostreptococcus spp., etc) y los estreptococos microaeroflicos de la orofaringe son los microorganismos predominantes. En los pacientes hospitalizados, adems de los microorganismos anteriores se incluyen tambin patgenos nosocomiales, como S. aureus (2-33%) y bacilos gramnegativos. Una higiene oral deficiente es un factor de riesgo, en el que la placa dental acta como un reservorio.
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Neumonas en situaciones especiales Se incluyen aqu las neumonas producidas por microorganismos poco frecuentes adquiridas por inhalacin, muy infecciosas, y que son responsables de numerosas infecciones adquiridas en el laboratorio. En el curso de los cuadros clnicos causados por Rickettsia prowazekii (tifus epidmico) y C. burnetii (fiebre Q) en ocasiones se produce infeccin pulmonar. Los microorganismos del orden Rickettsiales presentan una especial peligrosidad en su manejo y son una importante causa de infecciones adquiridas en el laboratorio. C. burnetii, resiste la desecacin y la inactivacin qumica, por lo que no puede ser inactivada por los desinfectantes habituales. La infeccin pulmonar por F. tularensis es la forma clnica ms aguda de la tularemia. Se produce por inhalacin de un aerosol infeccioso (lo ms frecuente) o por diseminacin del microorganismo desde las formas ulceroganglionar, glandular u orofarngea de la enfermedad. La inhalacin de F. tularensis se produce principalmente durante las actividades en granjas en las que residen roedores infectados. Aunque la tularemia tiene una distribucin preferente en el hemisferio norte (Escandinavia, Amrica del Norte, Japn y Rusia), tambin se han descrito casos en Suiza, Turqua, Yugoslavia y Espaa. F. tularensis es un agente extremadamente infeccioso y el tercer agente causal ms frecuente de las infecciones adquiridas en el laboratorio. Neumona en el paciente inmunodeprimido En los pacientes inmunodeprimidos la infeccin pulmonar tiene, adems de una elevada frecuencia, una morbilidad y mortalidad importantes, por lo que el diagnstico microbiolgico adquiere una gran relevancia en estos sndromes por la necesidad de la instauracin precoz del tratamiento antimicrobiano adecuado. Las diferentes alteraciones de los mecanismos de defensa inmunitaria permiten clasificar a los pacientes inmunodeprimidos en tres grandes grupos, cada uno de los cuales tiene una etiologa bacteriana ms probable: o Pacientes en los que predomina un deterioro en el nmero y funcin de los granulocitos (pacientes en tratamiento con citotxicos, pacientes en las 3-4 semanas postrasplante de mdula sea) expuestos con mayor probabilidad a infecciones bacterianas pigenas como P. aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, enterobacterias, Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia, S. pneumoniae, S. aureus, as como tambin Candida spp. y hongos filamentosos. Pacientes con deterioro inmunocelular (trasplante de rganos slidos y mdula sea, infeccin por el VIH, tratamiento con corticoides y frmacos inmunosupresores, enfermedades hematolgicas, radioterapia, enfermedad injerto contra husped), sujetos a infecciones por bacterias como Legionella spp., Nocardia spp., Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Rhodococcus equi, micobacterias y hongos productores de micosis invasoras como Pneumocystis jiroveci (distribucin mundial) e Histoplasma capsulatum (en Amrica y frica, y casos importados).
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Pacientes con deterioro de la inmunidad humoral (pacientes con mieloma, asplenia, hipogammaglobulinemia, corticoides, quimioterapia, trasplante de mdula sea, leucemia linftica, linfoma no Hodgkin) especialmente predispuestos a infecciones por bacterias encapsuladas, como S. pneumoniae, H. influenzae y Neisseria meningitidis. S. maltophilia coloniza frecuentemente el tracto respiratorio de estos pacientes y su transmisin puede realizarse desde fuentes ambientales, soluciones farmacolgicas, agua de las instalaciones hospitalarias o a travs de las manos del personal sanitario. La neumona por S. maltophilia se asocia con una elevada tasa de mortalidad.
La incidencia de la neumona, adquirida tanto en el medio hospitalario como en la comunidad, depende del dficit inmunolgico subyacente. Igualmente, la mortalidad por neumona en los pacientes inmunodeprimidos es muy elevada (superior al 50%) y de forma especial en los pacientes infectados por el VIH (85%). 2.2.4 Neumona nosocomial Se define como neumona nosocomial a aquella que se presenta despus de las 48 horas del ingreso hospitalario. Es la segunda causa ms frecuente de infeccin adquirida en el hospital y la principal causa de mortalidad por infeccin nosocomial. Su incidencia depende de varios factores, pero globalmente se estiman tasas del 10-20% en los pacientes sin ventilacin mecnica y tasas 20 veces ms altas en los pacientes con tubo endotraqueal. La neumona nosocomial se produce generalmente por microaspiracin de las secreciones orofarngeas o gstricas contaminadas con microbiota colonizante (generalmente modificada por sobrecrecimiento o tratamiento antibitico previo prolongado), por aspiracin de un gran inculo de microorganismos y por alteracin o abolicin de los mecanismos de defensa del tracto respiratorio de tipo mecnico (epitelio ciliado y moco), humoral (anticuerpos) y celular (polimorfonucleares, macrfagos y linfocitos y sus respectivas citocinas). Neumona en el paciente sin ventilacin mecnica El paso previo a la infeccin es la colonizacin de la orofaringe (por va exgena o por va retrgrada gstrica) por una gran concentracin de bacilos gramnegativos. Este proceso se produce durante la hospitalizacin prolongada y afecta hasta un 60% de los pacientes. La orofaringe est normalmente recubierta de fibronectina, que proporciona a las bacterias grampositivas una superficie de adhesin a la mucosa. Los enfermos crticos presentan un aumento de los valores de proteasa que, a su vez, produce una disminucin de la inmunoglobulina A de la mucosa y de la fibronectina. Se impide as, la adherencia de las bacterias grampositivas a la mucosa y se favorece la adherencia de bacterias gramnegativas, a lo que se aade el efecto de seleccin bacteriana producido por el tratamiento antibitico. As, P. aeruginosa, que coloniza en tasas bajas la piel y las mucosas nasal y farngea de las personas sanas, en los pacientes hospitalizados adquiere una tasa de colonizacin superior al 50%, especialmente tras la administracin de tratamiento antimicrobiano prolongado. Otro tanto ocurre con Acinetobacter spp., que adems tambin coloniza con frecuencia y persistencia al personal hospitalario.
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En el desarrollo de la neumona nosocomial, adems del papel crtico que supone la modificacin iatrognica de la microbiota orofarngea por el empleo prolongado de antibiticos, se produce una inmunosupresin temporal o parlisis inmunitaria de mecanismo no bien conocido. Son factores de riesgo para la adquisicin de neumona nosocomial la inmunosupresin, enfermedades subyacentes, enfermedad cardiopulmonar, diabetes, EPOC, ciruga previa, tratamiento antibitico previo, prdida de consciencia, sedacin y empleo de todos los agentes que conlleven una disminucin de la eficacia de la tos, como sedantes, analgsicos y anticolinrgicos. El curso puede ser fulminante o indolente y tiene una mortalidad aproximada del 18%. En relacin con el momento de presentacin, o En la neumona nosocomial de aparicin precoz (menos de 5 das), el espectro de los microorganismos corresponde a patgenos prevalentes en la comunidad e integrantes de la propia microbiota del paciente, como S. pneumoniae, H. influenzae, E. coli y otros bacilos gramnegativos entricos sensibles o poco resistentes a los antibiticos y S. aureus sensible a meticilina. La neumona nosocomial de aparicin tarda tienen ms probabilidad de estar causadas por microorganismos multirresistentes (P. aeruginosa, Acinetobacter spp., enterobacterias resistentes y S. aureus resistente a la meticilina. As, los pacientes con coma, traumatismo, diabetes e insuficiencia renal estn predispuestos a padecer neumona nosocomial por S. aureus (2-33% de los casos) que tiende a progresar a cavitacin y a la formacin de abscesos pulmonares y empiema pleural. Los pacientes con larga estancia en UCI, tratamiento antimicrobiano prolongado o enfermedad pulmonar de base presentan mayor riesgo de padecer neumona por Pseudomonas. Los pacientes inmunodeprimidos tienen predisposicin a padecer neumona por Candida spp. y L. pneumophila. Este ltimo agente puede aparecer en brotes hospitalarios a partir de instalaciones de agua contaminadas.
Neumona en el paciente con ventilacin mecnica Video recomendado: http://catalog.nucleusinc.com/generateexhibit.php?ID=70896&ExhibitKeywordsRaw=&TL=&A=2 La neumona constituye la primera causa de infeccin en el paciente con ventilacin mecnica y lleva asociada unas tasas de morbilidad y mortalidad muy elevadas, por lo que la informacin microbiolgica es esencial para instaurar a la mayor brevedad un tratamiento antibitico apropiado. En los pacientes intubados el riesgo de desarrollar neumona es entre 6 y 21 veces mayor que en los no intubados y aumenta en 1-3% por cada da de ventilacin mecnica. Segn los datos recogidos en nuestro pas por el Estudio Nacional de Vigilancia de la Infeccin Nosocomial en UCI (ENVIN-UCI) durante el ao 2010, la neumona asociada a ventilacin mecnica (NAV)
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represent el 41.8% de las infecciones adquiridas en la UCI. Los datos arrojan una tasa de densidad de incidencia de 11,5 episodios de NAV por 1.000 das de ventilacin mecnica y de 10,9 episodios por cada 100 pacientes con ventilacin mecnica. Los criterios clnicos de sospecha de NAV se basan en la presencia (48-72 horas despus de iniciar la ventilacin mecnica) de infiltrados pulmonares asociados con fiebre o hipotermia, leucocitosis o leucopenia y secreciones traqueobronquiales purulentas. Otros signos que se incluyen son hipoxemia, aumento de leucocitos inmaduros (ms de 10% de cayados), persistencia y/o extensin del infiltrado pulmonar y/o evolucin rpida del infiltrado hacia la cavitacin. En estos pacientes el tubo endotraqueal favorece la abolicin de las barreras mecnicas de las vas areas del tracto respiratorio superior (la glotis, el reflejo de la tos y el lavado mucociliar), mantiene abierta la glotis facilitando el paso directo de las secreciones orofarngeas hacia la va area distal y, adems, debido al biofilm que le recubre, se comporta como un reservorio bacteriano. o La principal va de infeccin se produce a partir de la superficie externa del tubo endotraqueal que, por una presin inadecuada del baln de aislamiento de la va area, permite que se produzcan aspiraciones repetidas de las secreciones orofarngeas, con su correspondiente microbiota bacteriana endgena. La segunda va es la inhalatoria o exgena, en la que la infeccin pulmonar se produce por inhalacin directa por la luz del tubo endotraqueal a partir de reservorios externos (respiradores, aerosoles, humidificadores), por manipulaciones (aspiracin de secreciones) y por tcnicas invasivas (la propia intubacin, fibrobroncoscopia). Otra posible va de infeccin, ms rara (en pacientes inmunolgicos, oncolgicos y grandes quemados), se realizara por translocacin bacteriana mediante el paso de los microorganismos a travs de la mucosa intestinal (facilitado por la isquemia, malnutricin y los traumatismos) y la formacin de bacteriemias que dan lugar a la colonizacin bacteriana del pulmn. En ocasiones, la contaminacin bacteriana del aire y agua de las instalaciones hospitalarias puede llevar a originar casos espordicos o brotes epidmicos de neumona por Aspergillus y Legionella spp., respectivamente. Curiosamente la NAV por Legionella spp. es muy infrecuente, quizs debido a que los pacientes con ventilacin mecnica estn protegidos a la exposicin al agua contaminada.
Entre los factores de riesgo para adquirir la NAV, adems de todas las situaciones que disminuyan las defensas del tracto respiratorio y favorezcan la aspiracin de secreciones, destacan la duracin prolongada de la ventilacin, la edad, enfermedad pulmonar crnica, situacin de gravedad, traumatismo craneal, profilaxis con anticidos o anti-H2, sondaje nasogstrico y la reintubacin. En cuanto a los agentes etiolgicos, o En las NAV de presentacin precoz (primeros 5-7 das de estancia hospitalaria) que se producen en pacientes sin tratamiento antibitico previo ni enfermedad crnica de
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base (pacientes con traumatismos, neurolgicos, ciruga programada) los agentes etiolgicos pertenecen a bacterias de la microbiota endgena primaria, del propio paciente, con predominio de S. aureus (meticilina sensible), S. pneumoniae, H. influenzae y enterobacterias. o En cambio, en las NAV tardas (despus de 5-7 das de ventilacin) y en los pacientes con ingreso anterior, enfermedades crnicas, tratamiento antibitico previo, los agentes causantes forman parte de la microbiota endgena secundaria del paciente, en este caso, las bacterias adquiridas en el medio hospitalario y prevalentes en la unidad donde est ingresado, con predominio de P. aeruginosa, Acinetobacter baumannii, S. maltophilia, enterobacterias con frecuencia multirresistentes y S. aureus (frecuentemente resistente a meticilina). En las unidades de cuidados intensivos la transmisin de Acinetobacter spp. puede estar particularmente asociada al equipo de ventilacin, a los guantes y al personal de enfermera colonizado. En aproximadamente el 25% de los casos la etiologa puede ser polimicrobiana. Adems, el 15-30% de las NAV son recurrentes, como en el caso concreto de la NAV por P. aeruginosa cuya recurrencia puede ser hasta del 50%. M. pneumoniae y C. pneumoniae tambin han sido implicados como causa de NAV pero, al no ser estudiados sistemticamente, su papel es desconocido.
2.2.5 Colonizacin-infeccin respiratoria crnica En el contexto fisiopatolgico determinado por ciertas enfermedades respiratorias crnicas de base, entre ellas el EPOC, las bronquiectasias crnicas y, particularmente, la fibrosis qustica, surge una entidad infecciosa con caractersticas clnicas y microbiolgicas claramente distintivas definida como colonizacin-infeccin respiratoria crnica. Se trata de una colonizacin con efectos patognicos. Estos efectos patognicos se deben originar por: o o La reduccin fsica que la enorme masa bacteriana (ms de 1010 clulas por gramo de tejido) produce en el acceso del oxgeno a los alvolos pulmonares; La reduccin a nivel de la mucosa bronquial del agua, oxgeno y nutrientes orgnicos e inorgnicos que se requieren competitivamente por los procesos metablicos y de crecimiento bacteriano; La liberacin durante los procesos catablicos y de autolisis de la masa bacteriana, de molculas con potenciales efectos bioactivos sobre el husped e inductoras de procesos proinflamatorios locales. Las altas densidades de colonizacin bacteriana facilitan la aparicin de variantes bacterianas con alta resistencia a los antimicrobianos y quizs, tambin, de variantes con hiperexpresin de mecanismos de virulencia capaces de producir efectos patognicos activos.
En trminos generales, el deterioro progresivo de la funcin pulmonar y, por tanto, de la calidad de vida de los pacientes afectados es frecuentemente consecuencia de una colonizacin broncopulmonar persistente basal acompaada de frecuentes exacerbaciones agudas
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provocadas, generalmente, por el sobrecrecimiento por encima de un cierto umbral del propio microorganismo colonizante. La erradicacin del microorganismo una vez establecida la colonizacin-infeccin crnica es muchas veces inalcanzable y por tanto los objetivos teraputicos estn destinados a mantener una carga microbiana basal lo ms baja posible y a reducir rpidamente el inculo bacteriano en las exacerbaciones. Por ello, desde el punto de vista del seguimiento microbiolgico de estos pacientes adquieren especial relevancia los parmetros cuantitativos (carga bacteriana) adems de los puramente cualitativos (diagnstico etiolgico). Neumona crnica La neumona crnica es un proceso inflamatorio del parnquima pulmonar que persiste durante semanas o meses acompaado de imgenes radiogrficas anormales y sntomas pulmonares crnicos o progresivos. La causa puede ser infecciosa o no infecciosa. La neumona crnica afecta a personas dbiles de edad avanzada y de forma especial a personas con inmunodepresin, SIDA, pacientes hospitalizados y personas con enfermedades debilitantes (alcoholismo, diabetes, EPOC). La neumona crnica puede deberse a patgenos que tpicamente causan neumona aguda pero que puede persistir ms all del cuadro agudo (microorganismos anaerobios, S. aureus, H. influenzae, enterobacterias y P. aeruginosa) y a agentes infecciosos que tpicamente causan neumona crnica entre los que se incluyen bacterias oportunistas, como Nocardia spp., Rhodococcus equi, Burkholderia pseudomallei, Actinomyces spp., P. aeruginosa, Enterobacteriaceae, as como otras bacterias aerobias y anaerobias. Neumona por Nocardia spp Las bacterias del gnero Nocardia, perteneciente a los actinomicetos aerobios, se encuentran ubicuamente distribuidas en la naturaleza, suelo y materia orgnica y en el hombre causan una amplia variedad de enfermedades conocidas como nocardiosis, que afectan tanto a individuos inmunocompetentes como inmunocoprometidos. Dada su ubicuidad, Nocardia puede colonizar de forma saprofita la piel y el tracto respiratorio superior, por lo que su aislamiento en esputo no siempre indica infeccin. Estudios experimentales han demostrado que los aislados clnicos de N. asteroides son ms patgenos que los aislados ambientales. Esta diferencia se ha atribuido a la mayor presencia de cidos miclicos de cadena larga en la pared celular de las cepas clnicas. El principal determinante de patogenicidad de Nocardia spp. es su resistencia a la fagocitosis por inhibicin de la induccin fagosoma-lisosoma y por la inhibicin de la acidificacin del fagosoma. La infeccin pulmonar es la forma clnica ms frecuente de la nocardiosis y se produce por inhalacin de las esporas o micelios. Afecta de forma predominante a los pacientes con inmunosupresin sistmica (linfoma, receptores de transplantes renales, cardacos y de hgado), enfermedad pulmonar crnica (EPOC, enfisema, bronquitis crnica, bronquiectasias), lupus eritematoso y a los individuos con SIDA. Son factores de riesgo importantes para el desarrollo de la infeccin los tratamientos previos prolongados con corticosteroides o citotxicos. No obstante, la neumona por Nocardia spp. puede presentarse tambin en pacientes sin enfermedad concurrente ni tratamiento inmunosupresor.
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N. asteroides complex es la especie que se asla con ms frecuencia (80%) e incluye 6 tipos diferentes de patrones de sensibilidad a los antibiticos. Las manifestaciones clnicas son indistinguibles de las que presentan neumonas de otras etiologas. En cambio, los hallazgos radiogrficos pueden ser muy variables. El curso de la infeccin, crnico e indolente en los pacientes inmunocompetentes, es con frecuencia progresivo, rpido, diseminado y grave en los inmunodepremidos. El proceso patolgico de la infeccin por Nocardia se caracteriza por su tendencia a la formacin de abscesos pulmonares necrosantes poco localizados y cavitados, as como por su tendencia a la diseminacin por tejidos adyacentes (pleura, mediastino) o a distancia (piel, cerebro). Tambin es caracterstica la formacin de granulomas. Las complicaciones, que incluyen empiema, pleuritis, mediastinitis, pericarditis y sndrome de la vena cava superior, requieren a veces la intervencin quirrgica para su resolucin. Neumona por Rhodococcus equi Las especies del gnero Rhodococcus se encuentran ampliamente distribuidas en el medio ambiente (principalmente estircol de las caballerizas). Dentro del gnero Rhodococcus, R. equi es un patgeno importante para el ganado y es la especie con mayor significacin clnica en el hombre. Las infecciones por R. equi se producen predominantemente en pacientes con inmunosupresin importante (hematolgicos, neoplasias, transplantados) en tratamiento con quimioterapia o corticosteroides y, en particular, en los pacientes infectados por el VIH. Tambin se han descrito casos en pacientes inmunocompetentes. La infeccin pulmonar primaria por R. equi tiene carcter invasivo y corresponde a cuadros de neumona, absceso pulmonar con tendencia a la cavitacin (ms del 50% de los casos) y derrame pleural (20%). La neumona es la forma clnica ms frecuente (ms del 70%). La adquisicin se produce por inhalacin del microorganismo. El cuadro clnico es poco especfico, por lo que el diagnstico de la infeccin puede llevar tiempo y necesitar de procedimientos invasivos como la broncoscopia o la biopsia pulmonar, y tiende a ser crnico y progresivo. En algunos casos se acompaa de bacteriemia. Neumona por Burkholderia pseudomallei B. pseudomallei es una de las tres especies del gnero Burkholderia patgenas para el hombre. Est presente en el suelo y en aguas superficiales de las regiones donde es endmico. Las regiones endmicas se localizan en el sureste asitico (Tailandia, Malasia, China, Taiwan y Vietnam), India y norte de Australia. Infecta a animales y humanos principalmente mediante inoculacin por va percutnea, aunque tambin por inhalacin o ingestin. B. pseudomallei es el agente causal de la denominada melioidosis, enfermedad de gran diversidad clnica que abarca un espectro de cuadros clnicos que va desde la infeccin asintomtica (la mayora de los casos) hasta el shock sptico fulminante e incluye formas clnicas tan diversas como lceras cutneas, abscesos con tendencia a la cavitacin, de localizacin pulmonar o en otros rganos. La melioidosis puede permanecer como infeccin latente durante dcadas desde la infeccin inicial y despus reactivarse a enfermedad sintomtica. La neumona, que es la presentacin clnica ms frecuente (50% de los casos), puede presentar un cuadro agudo fulminante o un cuadro crnico (ms de dos aos) de fiebre, tos productiva, hemoptisis, prdida de peso, consolidacin pulmonar discreta pero progresiva, infiltrados con o sin
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cavitacin y escasa mortalidad, que se parece a la tuberculosis incluso en la tendencia a la reactivacin. El inters por la neumona crnica por B. pseudomallei en nuestro medio radica en la posibilidad de adquisicin de la enfermedad en los viajes a zonas endmicas de melioidosis. Los factores de riesgo ms importantes para adquirir la melioidosis son la diabetes, alcoholismo y enfermedad renal crnica. Otros factores incluyen enfermedad pulmonar crnica, fibrosis qustica, neoplasias, tratamiento con corticosteroides y tuberculosis. Neumona por Propionibacterium propionicum P. propionicum forma parte de la microbiota endgena de la boca. Morfolgicamente es indistinguible de Actinomyces israelii. El microorganismo alcanza el pulmn por medio de la aspiracin de secreciones orofarngeas y produce un proceso infeccioso de curso indolente que afecta al parnquima pulmonar y al espacio pleural. P. propionicum se ha asociado con casos de actinomicosis con formacin de abscesos pulmonares con o sin empiema torcico. Enfermedad pulmonar obstructiva crnica (EPOC) La EPOC es sin duda una de las enfermedades ms prevalentes en los pases desarrollados, mostrando adems una clara tendencia ascendente que la situar como la tercera causa de muerte en el mundo en 2020. En Espaa la prevalencia de esta enfermedad se sita en torno al 9% en adultos con edades comprendidas entre los 40 y los 70 aos. Esta patologa se define por la presencia de una limitacin del flujo areo irreversible que es frecuentemente progresiva y est asociada con una respuesta inflamatoria anormal de los pulmones a partculas y gases nocivos. Los pacientes con EPOC frecuentemente presentan colonizacin bacteriana en las vas respiratorias bajas, hecho que se asocia con una elevacin significativa de los marcadores inflamatorios. El curso de esta enfermedad se caracteriza por presentar exacerbaciones agudas intermitentes de los sntomas, responsables de gran parte de la morbilidad y mortalidad asociada a esta patologa. Aproximadamente la mitad de estas exacerbaciones se producen por infeccin bacteriana, siendo H. influenzae el principal patgeno implicado, seguido de lejos por M. catarrhalis y S. pneumoniae. No obstante, en los ltimos aos la infeccin por P. aeruginosa empieza a ocupar un papel relevante como marcador de gravedad, asocindose con una intensa inflamacin de las vas respiratorias. Ilustraciones recomendadas: http://www.nhlbi.nih.gov/health-spanish/health-topics/temas/copd/ http://sp.depositphotos.com/7905114/stock-illustration-Chronic-obstructive-pulmonarydisease.html?sqc=12&sqm=15&sq=query%3Dalveoli Bronquiectasias Las bronquiectasias se definen como una dilatacin anormal e irreversible de uno o ms bronquios. La causa desencadenante es frecuentemente desconocida aunque muchas veces se puede atribuir a infecciones respiratorias graves en la infancia, a la inhalacin de sustancias txicas, deficiencia humoral de anticuerpos, disfuncin mucociliar, fibrosis qustica o enfermedad broncopulmonar alrgica. Al contrario que en la EPOC, esta patologa respiratoria
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crnica no est generalmente ligada al consumo de tabaco y ocurre ms frecuentemente en mujeres. Como ocurre en los pacientes con fibrosis qustica, las alteraciones anatmicas y fisiolgicas de las vas respiratorias predisponen a los pacientes con bronquiectasias a la colonizacin-infeccin crnica por diversos microorganismos, y es sta una de las principales causas de morbilidad y mortalidad de estos pacientes. Ilustracin recomendada: http://www.nhlbi.nih.gov/health/health-topics/topics/brn/ La produccin crnica de secreciones respiratorias purulentas, fiebre recurrente y hemoptisis son manifestaciones tpicas de la colonizacin-infeccin crnica en los pacientes con bronquiectasias. P. aeruginosa es uno de los microorganismos ms frecuentemente implicados, asocindose adems con una mayor gravedad y un deterioro ms rpido de la funcin pulmonar. H. influenzae y S. pneumoniae se aslan tambin con relativa frecuencia de las secreciones respiratorias de los pacientes con bronquiectasias, mientras que la colonizacin-infeccin por S. aureus es rara salvo en las bronquiectasias ligadas a la fibrosis qustica. Una caracterstica comn a todas las infecciones respiratorias crnicas por P. aeruginosa, al contrario de lo que ocurre en las infecciones agudas, es la alta prevalencia de cepas hipermutadoras. Estas cepas presentan una frecuencia de mutacin espontnea hasta 1000 veces ms de lo normal y se documenta una firme asociacin entre la presencia de estas cepas y la resistencia a mltiples antibiticos. 2.2.6 Absceso pulmonar El absceso pulmonar se produce como consecuencia de la necrosis del parnquima pulmonar causada por una infeccin microbiana. La necrosis pulmonar, a su vez, evoluciona a una o ms cavidades que con frecuencia se comunican con el bronquio, produciendo imgenes caractersticas con nivel hidroareo, as como tos y expectoracin purulenta. Cuando el proceso cursa con mltiples cavidades de pequeo tamao en reas contiguas del pulmn se denomina neumona necrosante. La mayora de los abscesos pulmonares se producen como complicacin de una neumona por aspiracin y son infecciones polimicrobianas causadas por bacterias anaerobias de la boca. Son factores predisponentes para la produccin del absceso pulmonar los estados de alteracin de la consciencia, disfagia neurolgica, sondas nasogstricas e intubacin endotraqueal y enfermedad periodontal. Los microorganismos ms frecuentes (90%) son las bacterias anaerobias de la orofaringe Peptostreptococcus spp., Fusobacterium spp., Bacteroides spp. y Prevotella spp.), acompaadas por estreptococos del grupo viridans microaerfilos. Cuando la infeccin es mixta, generalmente incluye bacterias aerobias patgenas, como S. aureus, K. pneumoniae, bacilos gramnegativos entricos o Streptococcus pyogenes. En ocasiones, la infeccin es monomicrobiana por bacterias tales como, S. aureus, Klebsiella spp., P. aeruginosa, B. pseudomallei, Legionella spp., Actinomyces spp. y S. pneumoniae. En los pacientes con alteracin de la inmunidad celular,
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patgenos oportunistas como Nocardia spp., Aspergillus spp. y R. equi son causa importante de lesiones pulmonares cavitadas. 2.2.7 Derrame pleural y empiema El empiema es una entidad que se acompaa de una morbimortalidad importante. La primera causa de infeccin del espacio pleural es una neumona previa (40-60% de los empiemas), seguida por la toracostoma (20%) y los traumatismos (4-10%). Los microorganismos causantes del empiema son bacterias anerobias (35%), aerobias (24%) y, con frecuencia, ambas de modo simultneo (41%). Las bacterias anaerobias (Bacteroides fragilis, Prevotella spp., Fusobacterium spp. y Peptotresptococcus spp.) se encuentran frecuentemente en el empiema, ya como organismos nicos o en combinacin con bacterias aerobias. En los pacientes con NAC el empiema suele deberse a S. pneumoniae, S. pyogenes y H. influenzae, mientras que L. pneumophila y M. pneumoniae slo causan pequeos derrames pleurales que, en general, no progresan a empiema. En los ltimos aos, se ha constatado un aumento en la incidencia de derrame pleural paraneumnico en los nios con NAC, siendo S. pneumoniae (generalmente sensible a la penicilina) el microorganismo ms frecuentemente aislado. En los pacientes hospitalizados, los agentes que se encuentran con ms frecuencia en el empiema son S. aureus y las bacterias anaerobias, sobre todo en los pacientes con aspiracin de secreciones. En aquellos con empiema despus de un traumatismo o ciruga, la infeccin se debe con frecuencia a S. aureus y bacilos gramnegativos aerobios. El empiema por Candida spp. se produce como complicacin de la ciruga, en los enfermos con rotura esofgica y en la infeccin subdiafragmtica. Muchas de estas infecciones son polimicrobianas. Los pacientes inmunocomprometidos y los pacientes con SIDA tienen empiemas causados por bacilos gramnegativos, hongos y Nocardia spp.
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Toma de muestras
Captulo 3
Toma de muestras
En general, las muestras deben obtenerse tan pronto como sea posible tras la aparicin de los sntomas y antes de instaurar la terapia antibitica.
3.1 Muestras del tracto respiratorio superior

o Exudado nasofarngeo. Las muestras nasofarngeas se pueden obtener por aspirado, lavado o con torunda. Las torundas de alginato clcico no son vlidas para la posterior deteccin de virus, s las de algodn o dacrn, y preferiblemente las terminadas en cepillo para recoger el mayor nmero posible de clulas epiteliales, ya que son las que fundamentalmente mantienen la replicacin del virus. Videos recomendados: http://www.copanusa.com/index.php/education/videos/ o Exudado farngeo. Con la ayuda de un depresor se inmoviliza la lengua, y se realiza la toma del rea amigdalar y faringe posterior, as como de cualquier zona inflamada o ulcerada. Si existe presencia de pseudomembrana, se debe obtener desde el borde de la misma, idealmente en profundidad. Es fundamental evitar rozar la torunda con la vula, la mucosa bucal, los labios o con la lengua, tanto antes como despus de la toma.
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La muestra se debe obtener con hisopos de dacrn o alginato clcico para la mayora de las bacterias, sin embargo para C. diphtheriae y Cndida es preferible el algodn. o Muestras representativas de otitis. La toma de la muestra se realiza en funcin de la sospecha diagnstica. Al utilizar torundas, se recomienda usar dos por separado, una para una tincin de Gram y otra para cultivo. La aspiracin es ideal para la bsqueda de anaeobios y se usar en caso de fornculos o cuando se practique una timpanocenteis. Para el estudio de otitis fngica se prefieren las muestras obtenidas por raspado del canal tico. Las muestras representativas de sinusitis se pueden obtener mediante distintos procedimientos: la aspiracin de secreciones nasales no es recomendable por su elevada contaminacin con la flora nasal y slo es vlida para el diagnstico de invasin fngica de los senos; la aspiracin bajo visin endoscpica del meato medio se considera la tcnica de eleccin por alta eficacia y sencillez; por ltimo, la puncin aspirativa sinusal es altamente fiable pero debe restringirse a los casos graves por ser invasiva y no estar totalmente exenta de complicaciones. Pus de abscesos. Se extraer el material purulento tras la puncin con aguja o bien por incisin o drenaje.
3.2 Muestras del tracto respiratorio inferior (mtodos no invasivos)

o Esputo. Para disminuir la contaminacin superficial de la muestra con la microbiota que coloniza el tracto respiratorio superior y la cavidad oral, se han recomendado algunas medidas a tomar, como la extraccin de la dentadura postiza, si se utiliza, y el enjuague de la boca con agua o solucin salina estriles, antes de la recogida de la muestra. El esputo obtenido por expectoracin espontnea debe ser el resultado de un golpe de tos profunda y contener secreciones purulentas representativas del tracto respiratorio inferior. Deben desecharse los esputos compuestos por saliva o secreciones postnasales. Para infecciones crnicas y profundas por micobacterias, actinomyces, nocardia y hongos se recomienda recoger 3 esputos en 3 das consecutivos. o Esputo inducido. Cuando el paciente no expectora de modo espontneo, se puede obtener la muestra por la inhalacin de NaCl al 3% mediante un nebulizador ultrasnico. Tiene su principal indicacin para la deteccin de Pneumocystis jiroveci y M. tuberculosis. Para el resto de los microorganismos su utilidad es dudosa. Aspirado traqueal (AT). La aspiracin traqueal o endotraqueal es el mtodo ms sencillo de obtener secreciones respiratorias en los pacientes intubados y con ventilacin mecnica. Es til para la deteccin de colonizacin por grmenes nosocomiales multirresistentes. La recogida de la muestra se realiza por aspiracin a travs del tubo endotraqueal. En ocasiones puede ser necesario diluir con suero salino las secreciones viscosas y facilitar de este modo la recogida.
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Toma de muestras
No deben cultivarse las secreciones de la traqueostoma, ya que la traqueostoma en las 24 primeras horas de su insercin se coloniza con mltiples bacterias que no corresponden a las causantes de la infeccin pulmonar.
3.3 Muestras del tracto respiratorio inferior (mtodos invasivos)

3.3.1 Fibrobroncoscopia La fibrobroncoscopia tiene por objeto la obtencin de muestras representativas del tracto respiratorio inferior correspondientes a la va area o al segmento pulmonar radiolgicamente afectos, sin contaminacin con microbiota de la orofaringe o, al menos, con la menor contaminacin posible. Ilustracin recomendada: http://columbiadoctors.photobooks.com/Health/images/si_1983.gif La indicacin de la fibrobroncoscopia es el diagnstico de la neumona nososcomial y de modo particular de la NAV, as como de la neumona del paciente inmunocomprometido. Sin embargo, la aplicacin de los procedimientos invasivos para la obtencin de muestras del tracto respiratorio inferior obtuvo su mayor rentabilidad cuando el procesamiento microbiolgico se mejor con la realizacin de cultivos cuantitativos. El tipo de muestra ms adecuado para el diagnstico, vara segn la sospecha diagnstica, la etiologa, nivel pulmonar de la lesin, etc. As, si la patologa se encuentra en los espacios areos distales es necesario obtener una muestra del fluido alveolar, mediante el lavado broncoalveolar o la biopsia transbronquial, mientras que el cepillado bronquial est ms indicado cuando la patologa se localiza en un segmento bronquial o se sospecha infeccin por anaerobios. Si se van a obtener varias muestras, el orden de recogida indicado es obtener en primer lugar el lavado bronquial y el LBA antes que el cepillado bronquial o la biopsia transbronquial, con el fin de evitar el exceso de sangre en los lquidos de lavado, que puede alterar la concentracin de los componentes celulares. Adems, la indicacin de la fibrobroncoscopia est en relacin con el tipo de enfermo. As ocurre en los pacientes inmunodeprimidos, en los que no es infrecuente la infeccin mixta y en las situaciones clnicas en las que los enfermos no responden al tratamiento emprico o en el caso de sospecha de otro diagnstico. o Lavado bronquial. Consiste en la instilacin de suero fisiolgico estril en un bronquio principal, seguida de una aspiracin inmediata para recoger la muestra. La muestra recogida no representa material bronquiolar ni alveolar y es equivalente a un aspirado endotraqueal. Su uso es escaso ya que proporciona informacin confusa al aislarse con frecuencia microbiota orofarngea, sobre todo en enfermos no intubados, por lo que no se considera apropiado para el cultivo bacteriano, excepto en casos en los que se sospechen infecciones por M. tuberculosis, Legionella u hongos. En enfermos intubados no presenta ninguna ventaja sobre el aspirado traqueal.
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Cepillado bronquial. Su nica indicacin es el diagnostico de la neumona bacteriana y su fin obtener muestras del foco de infeccin evitando la contaminacin orofarngea. Para ello se emplea un doble catter telescpico (catter telescopado protegido). El catter interno contiene un cepillo con numerosas cerdas flexibles y el externo est ocluido en su porcin distal por un tapn de material reabsorbible. Al llegar con el fibroscopio hasta el bronquio que conduce al foco infeccioso se empuja el cepillo para desalojar el tapn y obtener la muestra, girndolo suavemente para conseguir que se adhieran las secreciones de los bronquolos distales. Es un procedimiento rpido y las nicas complicaciones son las propias de la fibrobroncoscopia. Extrado el fibroscopio, se corta el cepillo en condiciones estriles y se introduce en un tubo que contiene 1 ml de suero fisiolgico estril. (Ilustracin 2). Lavado broncoalveolar. Para obtener la muestra se enclava el broncoscopio en el bronquio del segmento pulmonar radiogrficamente afecto y se instilan volmenes variables de suero fisiolgico estril en cantidades que oscilan entre 20 y 100 ml. Despus de cada instilacin se hace una aspiracin para recuperar el mximo volumen de lquido posible, formado por una mezcla del suero fisiolgico y secrecin broncoalveolar. El procedimiento no est estandarizado, en el sentido de que no est establecida la cantidad de suero fisiolgico a instilar ni el nmero de alcuotas necesario. El volumen de muestra obtenido depende del volumen instilado y puede variar entre 10 y 100 ml. Se considera que para tener una buena eficacia diagnstica el volumen de lquido recuperado bebe ser superior al 30% del introducido e idealmente no inferior a 60 ml. Se considera que el suero instilado lava y obtiene material de alrededor de un milln de alvolos (el 1% de la superficie pulmonar). La primera porcin de lquido aspirado debe descartarse para el estudio microbiolgico ya que suele contener un exceso de clulas escamosas y ciliadas. El ltimo lquido aspirado es el que mejor representa el contenido alveolar. El LBA es una muestra representativa del fluido alveolar, por lo que est indicada en infecciones que afectan a enfermos inmunodeprimidos sobre todo por microorganismos oportunistas como P. jiroveci, CMV, etc, que producen una afectacin bronquial mnima. Por estos motivos es la muestra ms importante en estos enfermos para el diagnostico de la infeccin pulmonar. Adems, el LBA por su volumen permite un estudio microbiolgico completo para bacterias, virus, hongos y parsitos, mediante tcnicas que permiten obtener resultados pocas horas despus de obtenerla.
Biopsia transbronquial. Se utiliza el broncoscopio para obtener una pequea muestra de tejido peribronquial o alveolar. Es una tcnica til que puede evitar la biopsia pulmonar quirrgica en casos seleccionados de lesiones localizadas o cuando se sospecha alguna etiologa no infecciosa sobreaadida (sarcoidosis, neoplasia) y no se han obtenido resultados con las pruebas broncoscpicas ms comunes. En las etiologas infecciosas su papel es muy limitado. En enfermos con SIDA se han descrito casos de nica muestra diagnstica para P. jiroveci o M. tuberculosis. El riesgo de sta tcnica en enfermos con ventilacin mecnica es alto.
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Toma de muestras
Video recomendado: http://catalog.nucleusinc.com/generateexhibit.php?ID=67892&ExhibitKeywordsRaw= &TL=&A=2 o Aspiracin transbronquial con aguja. No se suele usar en afectaciones infecciosas pero se han descrito buenos resultados en infiltrados pulmonares localizados de fcil acceso. til para estudiar anaerobios.
3.3.2 Otras tcnicas no fibrobroncoscpicas o Tcnicas ciegas. Las tcnicas ciegas son menos invasivas, ms econmicas y de menor riesgo que las broncoscpicas, y no precisan de personal especializado. Adems, pueden emplearse en los pacientes intubados con tubos de pequeo calibre. Estn indicadas en los casos en los que no es posible realizar la broncoscopia (tcnica no disponible o contraindicacin). Su principal limitacin estriba en la imposibilidad de seleccionar el segmento pulmonar afecto radiolgicamente, lo cual es importante cuando los infiltrados se localizan en los lbulos superiores o en el pulmn izquierdo. Pero, en general estas tcnicas ciegas proporcionan resultados similares a las tcnicas broncoscpicas. Existen tres mtodos ciegos: o o o o Aspirado bronquial ciego: consiste en enclavar el catter en un bronquio distal y aspirar 1-2 ml de secreciones bronquiales sin instilar suero. Minilavado broncoalveolar: Consiste en instilar a travs de un catter (telescopado protegido o no) una cantidad no estandarizada (20-150 ml). Catter telescopado no broncoscpico: presenta un baln en su extremo distal para evitar la contaminacin.
Puncin transtraqueal. Procedimiento empleado, sobre todo, en el enfermo no ventilado con neumona nosocomial en el que es complicado hacer una broncoscopia y el acceso al foco por la puncin transtraqueal resulta ms fcil. Tcnica con buena sensibilidad, su especificidad est afectada por la colonizacin traqueal del paciente, especialmente en aquellos con patologa bronquial crnica. Es til en la infeccin pulmonar por anaerobios. Ilustracin recomendada: http://catalog.nucleusinc.com/generateexhibit.php?ID=72812&ExhibitKeywordsRaw= &TL=&A=2
Biopsia por puncin transtorcica. La biopsia pulmonar realizada mediante la puncin y aspiracin con aguja fina se realiza de forma percutnea, es poco agresiva y no requiere anestesia general. Se hace guiada por ecografa o por tomografa axial computarizada (TAC), que es el mejor mtodo de gua. Su principal indicacin es la lesin perifrica, como el ndulo pulmonar, no accesible a otras tcnicas diagnsticas como la broncoscopia, por lo que es poco utilizada en el diagnstico de infecciones.
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Video recomendado: http://catalog.nucleusinc.com/generateexhibit.php?ID=70545&ExhibitKeywordsRaw= &TL=&A=2 o Biopsia a pulmn abierto. Su objetivo es la obtencin de tejido del parnquima pulmonar para el estudio histolgico como indicacin principal. Su indicacin microbiolgica es la persistencia de una mala evolucin clnica y la necesidad de obtener un diagnstico etiolgico. La muestra suele obtenerse por minitoracotoma. Puncin pleural. Es una tcnica habitual en el estudio del derrame pleural ya que puede obtener hasta el 75% de los diagnsticos etiolgicos, infecciosos o no. Consiste en la extraccin de lquido pleural con una aguja introducida transparietalmente. El derrame pleural es el resultado de la presencia de lquido en el espacio pleural. En las etiologas infecciosas el mecanismo que causa el aumento de lquido es el aumento de la permeabilidad de la microcirculacin y es frecuente en las neumonas (hasta un 40%), sobre todo en las de etiologa neumoccica. El lquido contiene clulas inflamatorias y suele ser estril a menos que no se trate o fracase el tratamiento antibitico, circunstancias que favoreceran la aparicin de empiema o derrame purulento. El derrame pleural de etiologa vrica tambin es frecuente y suele ser de pequeo volumen. La ventilacin mecnica no es una contraindicacin para su realizacin. Ilustracin recomendada: http://columbiadoctors.photobooks.com/Health/images/si_2006.gif El transporte al laboratorio de microbiologa debe realizarse de forma rpida, y no debe demorarse la llegada de la muestra en ms de 1 hora. En los casos en que no sea posible deben guardarse las muestras a la temperatura que se indica en la tabla 2.
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Toma de muestras
Tipo de muestra patologa Nasofaringe: exudado Laringitis, Laringotraquetis
Mtodo
Recipiente
Temperatura
Aspirado, lavado Tubo con medio de Torunda de algodn o transporte para virus. dacrn Aspirado Tubo estril Tubo con c. Casamino o Amies-Stuart con Charcoal Tubo con Amies-Stuart Tubo estril 2C-8C Torundas de alambre flexible y curvado con punta de dacrn o alginato clcico. Lavado nasofarngeo Aspirado
Bronquitis-tosferina
Portadores difteria Sinusitis Faringe
Con un depresor y torunda sin tocar adyacentes: Pus, lceras: Faringitis bacteriana Pseudomembrana, secreciones: Difteria, Cndida Torundas de dacrn o alginato clcico Torundas de algodn Tubo con Amies-Stuart T ambiente Tubo con Amies-Stuart
Bronquitis y bronquiolitis, Torundas de dacrn, neumona: M. pneumoniae, alginato clcico C. pneumoniae Laringitis, Laringotraquetis vricas Bronquitis y bronquiolitis: M. pneumoniae, C. pneumoniae Lavado por gargarismo
Tubo con M4 2C-8C
Tubo con medio virus Tubo estril
Tabla 2. Resumen de los procedimientos microbiolgicos de toma de muestra y transporte para infecciones respiratorias
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Tipo de muestra patologa Canal del odo externo Exudado Erupcin (fngica)
Mtodo
Recipiente
Temperatura
2 Torundas Raspado o torunda Aspiracin, desbridamiento quirrgico
2 Tubos con AmiesStuart Placa 1 Tubo estril aerobio
T ambiente T ambiente 2C-8C
Fornculo
1 Tubo estril anaerobio T ambiente
Odo medio Timpanocentesis: Aspiracin 1 Tubo estril aerobio 2C-8C
Pus interna
1 Tubo estril anaerobio T ambiente 2 Tubos con Amies-Stuart 1 Tubo con medio transp. anaerobios
Exudado Senos: exudado Sinusitis bacteriana o vrica
3 Torundas
T ambiente
Aspiracin bajo visin endoscpica del meato medio. Puncin aspirativa sinusal
1 Tubo estril aerobio
2C-8C
1 Tubo estril anaerobio T ambiente Tubo estril 2C-8C
Zigomicosis lceras bucales Angina de Vincent
Torunda
Porta
T ambiente
Abscesos Periamigdalar y Farngeo 2C-8C Puncin con aguja o por 1 Tubo estril aerobio incisin o drenaje. 1 Tubo estril anaerobio T ambiente
Tabla 2 continuacin. Resumen de los procedimientos microbiolgicos de toma de muestra y transporte para infecciones respiratorias
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Toma de muestras
Tipo de muestra patologa Esputo Bronquitis y bronquiolitis por M. pneumoniae Neumonia Esputo inducido Pneumocystis jiroveci M. tuberculosis Traquea: exudado Neumonia nosocomial Absceso pulmonar Bronquios: exudado M. tuberculosis, legionella, hongos. NAV, Absceso pulmonar. Alveolos: exudado Neumona Chlamydias, NAV, Absceso pulmonar.
Mtodo
Recipiente
Temperatura
Frasco estril de boca 2C-8C ancha y tapn de rosca.
Aspirado traqueal (AT) Puncin transtraqueal
Lavado bronquial (LB) Cepillado bronquial mediante catter telescopado protegido (CTP)
Frasco estril de boca ancha y tapn de rosca Tubo estril con 1 ml suero
2C-8C
2C-8C
Lavado broncoalveolar (LBA
Frasco estril de boca 2C-8C ancha y tapn de rosca. Tubo estril anaerobio T ambiente
Tejido peribronquial o alveolar Pneumocystis jiroveci M. tuberculosis Biopsia transbronquial Tubo estril con 1 ml suero 2C-8C
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Tipo de muestra patologa Exudado bronquial-alveolar Neumonas nosocomiales Liquido Pleural o Tejido
Mtodo
Recipiente
Temperatura
1 Tubo estril aerobio Tcnicas ciegas 1 Tubo estril anaerobio 1 Tubo estril aerobio (con 1 ml suero, si tejido) 1 Tubo estril anaerobio Frascos de hemocultivos: Aerobio y anaerobio.
2C-8C T ambiente
2C-8C T ambiente T ambiente
Neumonia nosocomial, Absceso pulmonar, Derrame pleural y empiema.
Toracocentesis
Orina Neumonia: S. pneumoniae, L. pneumophila, H. capsulatum. Sangre Laringitis, Laringotraquetis Epiglotitis, Sndrome Lemierre, Neumona. Tosferina, Neumona atpica, Neumona melioidosis.
Chorro de la miccin Frasco estril de boca 2C-8C media ancha y tapn de rosca
Hemocultivos: Aerobio y anaerobio. Extraccin sangre Tubo con gel separador
T ambiente
2C-8C
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Toma de muestras
Ilustracin 2. A) Toma de muestra de un exudado farngeo con torunda. B) Cepillo bronquial con catter telescopado: cepillo sin utilizar; al juntar la anilla blanca y negra se despliega el catter interior; al juntar las tres anillas (cierre total del pistn), se despliega el cepillo
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Captulo 4
Diagnstico microbiolgico directo

4.1 Visualizacin directa
Las muestras se han de procesar lo ms rpidamente posible y seleccionar la parte de la muestra ms purulenta o con sangre. 4.1.1 Fresco A) Torundas en tubo Amies y frascos estriles, con muestras de vas respiratorias Los exudados farngeos y de otitis externas con solicitud de estudio de hongos han de observarse microscpicamente en fresco, para ello se utilizar una de las dos torundas que hayan enviado al laboratorio. Los frascos con lavado broncoalveolar y biopsias que soliciten estudio de hongos, tambin han de observarse en fresco en busca de estructuras fngicas. Tcnica La observacin microscpica en fresco, se realiza habitualmente utilizando un lquido de aclarado (KOH, NaOH), colorantes (tinta china, azul de metileno, fucsina), blanco de calcoflor o similares (blankophor, Univitex). Para su realizacin, en un portaobjetos se hace una impronta con el hisopo de la secrecin o bien se deposita una gota de la muestra, y sin dejar secar se mezcla con una gota del lquido elegido sin formar burbujas, se pone un cubreobjetos y se observa al microscopio a x40.
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Si se emplea el blanco de calcoflor, se ha de observar con un microscopio de fluorescencia. Este microscopio es una variacin del microscopio de luz ultravioleta en el que los objetos son iluminados por una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la energa emitida por las molculas que han absorbido la excitacin primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Para dejar pasar slo la emisin secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Valoracin Las levaduras, hifas y pseudohifas se podrn observar incoloras y transparentes (si se ha empleado KOH o NaOH), incoloras sobre fondo negro (con tinta china), azules (azul de metileno), rosas (fucsina), o con una fluorescencia blanco azulada o amarillo verdosa resaltando ntidamente sobre el fondo ms oscuro (segn el filtro utilizado en el microscopio de fluorescencia, y teidas con el blanco de calcoflor). Ilustraciones recomendadas: http://www.telmeds.org/wp-content/uploads/2009/09/candida200.jpg http://mic.sgmjournals.org/content/150/6/1973/F3.expansion.html Para la deteccin de la cpsula polisacardica extracelular de algunos hongos es especialmente til la tincin con tinta china. As, la presencia de formas redondas rodeadas de un halo grande y transparente sobre un fondo negro son sugestivas de C. neoformans. Ilustracin recomendada: http://www.telmeds.org/wp-content/uploads/2009/09/cry2_l.jpg
4.1.2 Tincin argntica rpida (Gomori-Grocott modificada) A) Frascos estriles de boca ancha y tampn a rosca, con muestras de vas respiratorias bajas Esta tincin est indicada en los esputos inducidos, aspirados bronquiales, lavados broncoalveolares o biopsias pulmonares con sospecha de Pneumocystis jiroveci, aunque tambin pueden detectarse otros hongos. Preparacin de la muestra El adecuado procesamiento de las muestras es un paso crtico en el diagnstico microscpico de la neumocistosis. Esputo o o Aadir a 2-3 ml del esputo el mismo volumen de Ditiotreitol al 0,3% (1,5 g en 500 ml agua destilada). Agitar e incubar 5 min a 37C.
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o o o o
Aadir un volumen igual de PBS y agitar hasta conseguir una buena mezcla. Centrifugar a 1.500xg, 10 min. Retirar el sobrenadante y resuspender el sedimento con 500 L de PBS. Si no se ha eliminado todo el moco de la muestra, se repiten los pasos 1 y 2.
Aspirado bronquial y LBA o o o Centrifugar la muestra a 1.500xg, 10 min. Retirar el sobrenadante. Resuspender el sedimento en un pequeo volumen de PBS hasta que la densidad del material no sea excesiva.
Tras la preparacin y concentracin, se puede depositar directamente una gota del sedimento en el centro de un portaobjetos o utilizar 200 L para la citocentrfuga. Secar al aire y fijar con metanol. Tcnica o Cubrir el portaobjetos con la muestra fijada con una solucin de cido crmico al 10%, dejando actuar durante 10 minutos. (Se puede acortar al utilizar un microondas durante 40 segundos). Lavar el portaobjetos con agua destilada. Cubrir con una solucin de metabisulfito sdico al 1% durante 1 min. Lavar con agua destilada e introducir el portaobjetos en un recipiente donde se ha preparado previamente, justo en el momento de realizar la tincin, la solucin de trabajo de metenamina-nitrato de plata. Tapar el recipiente e introducir en un microondas, al 50% de su potencia, durante aproximadamente 60 segundos (si el microondas no tuviese plato giratorio, debe pararse a los 30 segundos, girar el recipiente 90 y volver calentar otros 30 segundos). Posteriormente, mantener la solucin caliente durante 2 min (deber tomar un color marrn oscuro). En caso de que no se disponga de microondas, se puede utilizar un bao de agua a 80C, donde se coloca el recipiente con la solucin de teido 6 min antes de colocar en el mismo el portaobjetos. Se mantiene en esas condiciones durante otros 5 min, debiendo cambiar el color de la solucin, como en el caso anterior, de marrn a negro. Transcurrido el tiempo correspondiente, sacar el portaobjetos y lavar con agua destilada. Sumergir el portaobjetos en una solucin de cloruro de oro al 1% de 2 a 5 segundos; seguidamente, lavar con agua destilada. Cubrir el portaobjetos con una solucin de tiosulfato sdico al 5% durante 1 min. Lavar de nuevo con agua destilada.
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o o o
o o o
o o o
Cubrir con una solucin al 0,2% de verde brillante en cido actico glacial durante 1 min. Lavar con agua destilada, escurrir el portaobjetos y dejar secar. Montar la preparacin con cubreobjetos y Entelln. Examinar la preparacin a bajo aumento (20X, 40X) y confirmar a 100X.
Valoracin Ilustracin recomendada: http://www.higiene.edu.uy/ciclipa/parasito/Pcarinii.jpg o La pared de los quistes de P. jiroveci se tien irregularmente de color gris-marrn, con aspecto de uva pasa; formas redondeadas de color gris o marrn oscuro con la pared engrosada en forma de doble coma. El interior de los quistes no se tie con esta tincin.
4.1.3 Tincin de Gram Tcnica Primero se ha de hacer una impronta sobre un portaobjetos. Dejar secar. A posteriori se proceder a la tincin, con la siguiente secuencia: o o o o El frotis fijado con calor se tie un minuto con cristal violeta, se lava con agua. Se cubre con solucin yodada durante un minuto y se lava de nuevo con agua. Decolorar con mezcla de alcohol etlico/ acetona. Escurrir. Cubrir con safranina (color de contraste) durante veinte segundos. Lavar y secar.
Examinar con bajo aumento (100X). Valoracin A) Torundas en tubo Amies y tubos estriles, con muestras de vas respiratorias altas o En los exudados farngeos y ticos sospechosos de micosis se podrn observar levaduras y pseudomicelios de Candida o las estructuras de los hongos filamentosos, que se tien de color violeta o azul oscuro intenso. Tambin se puede utilizar una tincin de Giemsa (de utilidad ms limitada) o de PAS que permite apreciar mejor las estructuras fngicas. En los exudados farngeos para descartar difteria se ha de realizar la tincin de Gram para observar la morfologa y caractersticas tintoriales de las bacterias. C. diphteriae se observa como bacilos grampositivos difterimorfos dispuestos en V, letras chinas y/o empalizada.
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Ilustracin recomendada: http://www.microbiologyinpictures.com/bacteria%20photos/corynebacterium%20di phtheriae%20photos/CODI18.html o El diagnstico de la angina de Vincent a partir de las lceras bucales, se basa en la observacin en la tincin de Gram de espiroquetas, bacilos fusiformes y leucocitos polimorfonucleares. Ilustracin recomendada: http://www.lg1.ch/cpg/displayimage.php?album=3&pos=29 o Sinusitis y abscesos periamigdalares y farngeos. La observacin microscpica de la tincin de Gram de las muestras nos permitir seleccionar los medios de cultivo.
B) Frasco estril de boca ancha y tapn de rosca con muestras de vas respiratorias bajas La evaluacin adecuada de la tincin de Gram de la muestra es crtica para asegurar que slo se procesan muestras de calidad, es decir, que sean muestras representativas del tracto respiratorio inferior y no estn contaminadas con secreciones del rbol traqueobronquial ni con flora saprofita orofaringea. Para evitar errores asociados a la subjetividad del observador, deben aplicarse criterios estandarizados de cribado que permitan determinar el grado de contaminacin y la calidad de la muestra antes de la realizacin del cultivo y establecer, de este modo, unos criterios de rechazo. Los criterios mayoritariamente aceptados son los de Murray y Washington (1975). Esputo o aspirado endotraqueal Examinar de 20 a 40 campos de la extensin y realizar una media del nmero de clulas en los campos representativos que contengan clulas. Se aceptarn para cultivo: o o Las muestras con > 25 leucocitos/campo de 100X y < 10 clulas epiteliales escamosas/campo de 100X. Las muestras con > 25 leucocitos/campo de 100X y >10 clulas epiteliales/campo de 100X, cuando el cociente leucocito/clula epitelial sea >10 y exista un predominio franco (3 4 +) de un nico morfotipo bacteriano. Cuando en una muestra con numerosos leucocitos (4+) y detritos celulares no se observan microorganismos, puede ser til inundar la extensin con naranja de acridina y observarla con microscopio de fluorescencia para confirmar la ausencia de microorganismos en los detritos. o o Pseudomonas y Haemophilus pueden no observarse en estas tinciones por la dificultad de diferenciacin entre los detritos celulares. Legionella se puede observar con la tincin de naranja de acridina, aunque en esta infeccin hay a menudo ausencia de leucocitos en el esputo.
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Se rechazarn e informarn como muestra inaceptable o no compatible con procesos infecciosos bacterianos, segn corresponda, las siguientes muestras: o o o o Esputos con > 10 clulas epiteliales/ campo de 100X. Aspirados traqueales de adultos con > 10 clulas epiteliales/campo de 100X, o los aspirados en los que no se observan microorganismos. Aspirados traqueales de pacientes peditricos en los que no se observen microorganismos, independientemente del nmero de clulas epiteliales. No se rechazarn los esputos y aspirados endotraqueales con peticin de cultivo para Legionella, Mycobacterium, Nocardia y Rhodococcus, ni las muestras de pacientes con fibrosis qustica o neutropenia aunque no cumplan los criterios citolgicos de calidad.
Describir el tipo de microbiota presente como: o Microbiota mixta (cocos grampositivos en parejas, cadenas o racimos; cocos gramnegativos; levaduras; bacilos grampositivos (morfotipo Corynebacterium o anaerobios) etc., pero sin predominio franco de ningn morfotipo. Predominio franco de algn morfotipo concreto (aproximadamente 50 o ms organismos/campo 1000X), tal como cocos grampositivos en diplos (morfotipo compatible con S. pneumoniae); bacilos gramnegativos (morfotipos compatibles con Haemophilus, enterobacterias, Pseudomonas); cocos grampositivos (morfotipo Staphylococcus); cocos gramnegativos en diplos (morfotipo Moraxella) y la presencia de bacilos grampositivos cortos, en cadenas y con formas ramificadas (morfotipo compatible con Nocardia). Aumento en la microbiota mixta compuesta por organismos grampositivos y gramnegativos (bacilos con morfotipo compatible con anaerobios) acompaada por la presencia de organismos intracelulares, lo que es sugerente de neumona por aspiracin.
LBA La tincin de Gram o Giemsa se realiza sobre la extensin del sedimento de la muestra. El mdodo ideal es una citocentrifugacin a baja velocidad, lo que permite obtener una capa monocelular de 6 milmetros de dimetro: o No deben observarse clulas escamosas en proporcin igual o superior al 1% de las clulas contadas, que deberan ser 300. Si se sobrepasa este punto de corte se considera que ha habido contaminacin por microorganismos de las vas altas. El diagnstico se ve favorecido por la observacin de bacterias intracelulares, considerndose diagnstica si se observan microorganismos en el 5% o ms de las clulas. En las infecciones por P. jiroveci y en las infecciones vricas suelen observarse recuentos celulares inferiores al 25% de clulas inflamatorias. Por el contrario en las
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infecciones bacterianas este porcentaje es superior, aunque se trate de enfermos inmunodeprimidos. CTP Se corta el cepillo y se coloca en un tubo que contenga 1 ml de solucin estril de Ringer lactato. Se agita en el Vortex durante 1 minuto, se saca el cepillo y se citocentrifuga. Se realiza el Gram del sedimento y se considera que las muestras que tienen menos de 10 clulas inflamatorias, por campo de 1.000 aumentos, son muestras de mala calidad. 4.1.4 Tincin Ziehl-Neelsen A) Tubo estril con muestras respiratorias de vas bajas Pretratamiento: Concentracin Para que una tincin sea positiva debe contener 105 bacterias por ml de muestra. As, en los lquidos de territorios estriles, que suelen tener un nmero bajo de microorganismos, la microscopa es muy poco rentable. Por ello, algunos autores recomiendan en los lquidos pleurales llevar a cabo tcnicas de concentracin. Aunque la centrifugacin parece la primera opcin plausible, no es totalmente eficaz debido a que la densidad de flotacin de las micobacterias est prxima a 1, lo que hace que muchas de ellas permanezcan en el sobrenadante. Sin embargo, s parecen eficaces la superposicin secuencial en un portaobjetos de varias gotas del fluido corporal no centrifugado o la filtracin mediante una membrana de policarbonato. Fundamento Las micobacterias son difciles de teir debido a la gran dotacin lipdica (cidos miclidos) de su pared, que las hace impermeables a los colorantes habituales. Por ello, las tinciones utilizadas, como la de Ziehl-Neelsen, se basan en el hecho de su cido-alcohol resistencia que, entre otras caractersticas, se manifiesta por la capacidad que tienen estas bacterias de retener un colorante bsico, como determinados arilmetanos (fucsina), tras la accin de un decolorante cido-alcohol. Para que estas bacterias puedan contrastar se utiliza un contracolorante (azul de metileno) que teir el resto de la preparacin. No todas las estructuras cido-alcohol resistentes son micobacterias. Existen otros microorganismos que pueden presentar grados diferentes de cidoalcohol resistencia como son especies de Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Gordona, Legionella (L. micdadei), y los ooquistes de Cryptosporidium, Isospora, Sarcocystis y Cyclospora. Sin embargo, la especificidad del examen directo de la muestra para determinar el gnero es bastante elevada, pero la diferenciacin a nivel de especie suele ser casi imposible. Tcnica de la extensin Siempre se realizarn en una Cabina de Seguridad Biolgica. Tras marcar en un extremo del portaobjeto el nmero de registro de la muestra a estudiar, se proceder de la siguiente forma:
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Muestras bronco-alveolares. Para las extensiones directas, seleccionar la parte ms purulenta de la muestra. Con un asa bacteriolgica estril se coger una porcin significativa de la misma y se extender sobre el portataobjetos (aproximadamente 1,5 cm de ancho x 3 cm de largo). Muestras traqueo-bronquiales (esputo y aspirado traqueal) Para las muestras pretratadas y concentradas por centrifugacin, se homogeneizar el sedimento con la ayuda de una pipeta Pasteur de plstico y se transferir una gota al portaobjetos que se extender como se ha mencionado previamente. Lquido pleural. Superposicin secuencial en un portaobjetos de varias gotas. No deber preparar ms de una extensin por portaobjetos. Fijar el material al portaobjetos mediante un calentador elctrico (60 a 90C) o bien dejndolo secar al aire.
o o o
NOTA: La fijacin mediante calor puede mantener la viabilidad de algunas micobacterias. Por ello, estas preparaciones deberan manejarse con extremo cuidado. Tcnica de tincin o o o Colocar los portaobjetos sobre el soporte de tincin dejando suficiente espacio entre ellos para evitar arrastres y transferencias entre muestras diferentes. Cubrir la preparacin totalmente con la solucin de fucsina fenicada filtrada. Calentar suavemente el portaobjetos flameando varias veces (por ej., 3) la preparacin hasta la emisin de vapores (aproximadamente 10 segundos), evitando la desecacin y la ebullicin. Esperar 5 minutos. Alternativamente el paso anterior se puede realizar calentando la preparacin en un microondas a la intensidad mnima durante 1-2 min evitando la ebullicin. Lavar con agua (preferiblemente destilada en muestras estriles) y decantar la preparacin. Aadir el decolorante alcohol-clorhdrico (97ml alcohol y 3 ml de acido clorhdrico) y mantener hasta que no se desprenda ms colorante, durante 2 min. Lavar con agua y decantar. Aadir el azul de metileno dejndolo durante 3 minutos. Lavar con agua y dejar secar a temperatura ambiente.
o o o o o o
Valoracin o o Examinar en un microscopio (luz visible) con un objetivo de inmersin (x 100) con aceite. Se debe examinar un mnimo de 300 campos antes de dar una tincin como negativa.
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Se procurar seguir un orden dentro del portaobjetos (izquierda a derecha, zig-zag, etc.) iniciando la observacin por un extremo del mismo. Los bacilos cido-alcohol resistentes se teirn en rojo brillante sobre un fondo azulado. Estos tienen aproximadamente de 1 a 10 mm de longitud y de 0,2 a 0,6 mm de ancho, pueden estar ligeramente curvados y no suelen teirse de manera uniforme adoptando un aspecto de granulado a lo largo del cuerpo bacteriano. Ilustracin recomendada: http://www.microbelibrary.org/images/delisle/images/mycobacterium%20tuberculos is%20fig1.jpg
La morfologa vara ligeramente de unas especies micobacterianas a otras, lo que ha llevado a intentar hacer un diagnstico de especies a partir de las caractersticas microscpicas. Sin embargo esta tarea resulta muy arriesgada y poco recomendable aun en el caso de personal entrenado y con experiencia. o En medio de cultivo lquido, Mycobacterium tuberculosis exhibe a menudo un aspecto de cuerdas serpenteantes, pero tambin ocurre con algunas micobacterias no tuberculosas (MNT). Las MNT pueden aparecer con aspecto pleomrfico, con formas cocoides, formando filamentos o teidas uniformemente. M. kansasii suele ser de mayor tamao que otras micobacterias y se tie irregularmente con un aspecto de bandas cruzadas o granulaciones a lo largo del cuerpo bacteriano, que le dan un aspecto arrosariado o atigrado. Pueden existir formas cocceas, muy frecuentes en aquellos individuos sometidos a tratamiento antituberculoso.
4.1.5 Tinciones con fluorocromos A) Tubo estril con muestras respiratorias de vas bajas Los fluorocromos auramina y rodamina tienen la propiedad de fijarse a las paredes celulares de las micobacterias, Se utiliza, adems un colorante de contraste que tiene como funcin evitar la fluorescencia inespecfica. Tcnica o o o o Se cubre la preparacin con la solucin colorante (Auramina O, o AuraminaRodamina), durante quince minutos. Se lava con agua destilada. Se cubre la preparacin con solucin decolorante (alcohol clorhdrico) dejndose actuar durante dos minutos. Se lava con agua destilada.
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o o
Se cubre la preparacin con el colorante de contraste (Permanganato potsico o Naranja de acridina), y se deja actuar durante dos minutos. Se lava con agua destilada y se deja secar al aire.
Valoracin Se observa a microscopia de fluorescencia a x250 o x450, las bacterias cido alcohol resistentes aparecen de color amarillo-naranja brillante sobre un fondo verdusco. Ilustraciones recomendadas: http://thales.cica.es/rd/Recursos/rd99/ed99-0043-01/tinci.htm Las muestras deben procesarse en una cabina de bioseguridad, ya que los aerosoles producidos durante la siembra pueden ser causa de infecciones respiratorias adquiridas en el laboratorio. Procesar las muestras lo ms rpidamente posible y seleccionar la parte de la muestra ms purulenta o con sangre.
4.2 Cultivos bacteriolgicos y fngicos

4.2.1 Siembra A) Torundas y tubos en anaerobiosis con muestras de vas respiratorias Mtodo de siembra La muestra se procesa antes de 15 minutos desde su recepcin y si es posible, en una cmara de anaerobiosis. o Torunda: se exprime en un pequeo volumen de caldo mediante movimientos rotatorios sobre las paredes del tubo y este caldo se procesa como una muestra lquida. Aspirado: El material purulento se mezcla bien con la ayuda del agitador Vortex. CTP: Se corta el cepillo y se coloca en un tubo que contenga 1 ml de solucin estril de Ringer lactato. Se agita en el Vortex durante 1 minuto y se saca el cepillo. Tejido o biopsia: se homogeneizan, ya sea con un bistur, cortando trozos muy finos hasta obtener una consistencia homognea, o en un mortero estril aadiendo 1 ml de caldo.
o o o
Una vez homogeneizada la muestra, depositar 1 gota del pus, o 2-3 gotas si es lquido, en cada uno de los medios de cultivo (para extender con estras por agotamiento), una gota en un portaobjetos para la tincin de Gram y el resto en el medio de enriquecimiento. En el caso del CTP, es preferible hacer la extensin para el Gram a partir de la citocentrifugacin, tal y como hemos comentado anteriormente.
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Medios de cultivo La mayora de estas bacterias requieren para su crecimiento vitamina K 1 y hemina. Para su aislamiento e identificacin presuntiva se aconseja utilizar una combinacin: Medios enriquecidos: agar Brucella o agar Schaedler, y caldo de tioglicolato. Medios selectivos: Agar con alcohol fenil-etlico (PEA), agar Brucella o agar Schaedler con antibiticos. Medios selectivos y diferenciales: Agar Bacteroides bilis esculina con amicacina (BBE). Las placas se han de incubar en atmsfera anaerobia, a 35-37 C, hasta las 24h (cmaras) o 48h (jarras o bolsas), mientras que el medio lquido de enriquecimiento entre 7 y 10 das. B) Frascos de hemocultivo para anaerobios y aerobios con lquido pleural o sangre Los lquidos corporales habitualmente estriles, como el pleural, se inoculan en frascos de hemocultivo para aerobios y anaerobios, reservando un pequeo volumen para hacer una tincin de Gram. Se recomienda incubar los frascos durante un perodo de 5 a 7 das. La temperatura ptima de incubacin es de 35 a 37C. C) Torundas en medio Amies y tubos, con muestras de vas respiratorias altas Mtodo de siembra Con estras por agotamiento, para aislamiento. Ilustracin 3.
Ilustracin 3. Siembra para aislamiento en placa 1: Paso 1 o En torunda: hacer rotar la torunda varias veces en uno de los cuadrantes de la placa, cerca del borde de la placa.
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En tubo estril: las muestras lquidas se deben depositar tres o cuatro gotas en la superficie del agar y extenderlas posteriormente con el asa de cultivo.
2: Paso 2, 3 y 4 o 3: Paso 5 o Pinchar el agar sangre con el asa despus de haber rayado la placa, para favorecer la produccin de hemlisis. Con un asa estril realizar estras desde la zona de la descarga por el resto de los cuadrantes de las placas, cada vez cogiendo una porcin del inculo menos denso.
Medios de cultivo Se deben inocular comenzando por el medio ms general hasta el ms selectivo. o Exudados farngeos: imprescindibles agar sangre y agar Sabouraud. En caso de sospecha de infeccin por neisserias aadir un medio selectivo y adems debe inocularse una placa de agar chocolate, dado que algunas cepas de N. gonorrhoeae pueden inhibirse por los antibiticos que contienen los medios selectivos. Para descartar difteria se ha de sembrar en ASCT y opcionalmente en Loeffler. Otitis externa: se deben utilizar agar sangre y agar MacConkey. Si se sospecha de otitis fngica, aadir agar Sabouraud. Si se ha recibido una placa de petri con el raspado, verterlo sobre la placa Sabouraud. Otitis media: agar sangre, agar MacConkey y agar chocolate suplementado. Sinusitis: agar sangre y agar chocolate. En el caso de que la sinusitis sea de origen nosocomial o que en la tincin de Gram se observen bacilos gramnegativos, se ha de aadir agar MacConkey. Se emplearn medios enriquecidos para hongos cuando se sospeche zigomicosis.
o o
Agar Sangre: Es un medio general enriquecido con 5% sangre, para el crecimiento y aislamiento de la mayora de las bacterias patgenas y de algunos hongos. Sirve de ayuda para definir las propiedades hemolticas de los Streptococos. Se ha de incubar a 35C 2C hasta las 24h. Se prolongar el tiempo si se desea descartar la presencia de A. otitidis (3-5 das), y en casos de sinusitis crnica. Agar Thayer Martin, Martin Lewis, New York City o GC: Medios selectivos por la adicin de antibiticos, para el crecimiento y aislamiento del gonococo. Se ha de incubar en ambiente hmedo y con 5% de CO2 a 35C 2C. Ha de examinarse cada 24h hasta las 72 horas. Agar Chocolate: Como el agar sangre pero enriquecido con sustancias nutritivas y calentado hasta liberar el grupo hemo. Promueve el crecimiento de algunas bacterias de desarrollo difcil, vg: Neisseria o Haemophilus. Incubar a 35C 2C en atmsfera enriquecida al 5% de CO2, y examinar cada 24h hasta las 48 horas. Se puede prolongar su incubacin hasta 4 das en los casos de sinusitis crnica.
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Agar Mac Conkey o Levine: Medios diferenciales y selectivos con colorantes, para los bacilos entricos y otras bacterias gramnegativas. A 35C 2C durante 24h. Agar Sabouraud: Medio selectivo por su mnima cantidad en nutrientes y pH bajo, adecuado para el crecimiento y aislamiento de levaduras y hongos superiores. Incubar a 30C 2C examinarse cada 24h, hasta las 48h. Agar glucosado de Sabouraud con cloranfenicol y gentamicina, o el agar con infusin cerebrocorazn y antibiticos (BHI): Medios enriquecidos para hongos. Incubar a 30C y realizar lecturas diarias durante los 5 primeros y posteriormente de forma peridica semanal durante 3-5 semanas de incubacin. Agar sangre con cistena y telurito (ASCT) y medio de Loeffler: El primero es un medio selectivo para C. diphtheriae y el segundo es enriquecido no selectivo. A 35C 2C durante 24h. D) Torundas en tubo con cido Casamino o Amies-Stuart con Charcoal, con exudados nasofarngeos Mtodo de siembra Con estras por agotamiento, para aislamiento. Medios de cultivo Especficos para Bordetella. Agar Regan-Lowe: agar carbn, cefalexina 0,04 g/L y 10% de sangre de carnero desfibrinada. Medio selectivo para B. pertussis. Colocar las placas en una cmara hmeda o en una bolsa de plstico que contengan agua o papel de filtro humedecido, pues B. pertussis es muy sensible a la desecacin. No requiere atmsfera de CO2. Incubar las placas a 35C en atmsfera aerbica, hasta 12 das. Agar sangre: en l crecen B. parapertussis y B. bronchiseptica y no B. pertussis. Igualmente a 35C, hasta 12 das. E) Torundas con exudado farngeo en medio M4 Siembra En medios especficos para Mycoplasma pneumoniae. Caldo SP-4 o Introducir la torunda en el tubo con 1,8 ml de medio, girndola en el interior y luego exprimirla contra las paredes del tubo para desecharla.
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o o
Tomar 200 l con la pipeta y transferirlos al 2 tubo (dilucin 10 ). Mezclar varias veces con la punta de la pipeta. Tomar otros 200 l con la pipeta y transferirlos al 3 tubo (dilucin 10 -3).
-2
El caldo se incuba a 35-37C en aerobiosis durante 6 semanas. Agar SP-4 Rotar la torunda sobre la superficie del agar, o, en su defecto inocular 50 l del tubo de la primera dilucin. La placa se incuba en la jarra con un sobre generador de CO 2, a 35-37C, 6 semanas. F) Frascos y tubos, con muestras de vas respiratorias bajas F1) Muestras recogidas por procedimientos no invasivos Incluyen los esputos, los aspirados endotraqueales (pacientes intubados) y las secreciones bronquiales. Pretratamientos y mtodos de siembra La mayor parte de las muestras clnicas estn contaminadas con una flora bacteriana mixta que tiene un poder de multiplicacin ms rpido que otros agentes con mayor patogenicidad, como pueden ser Legionella, Mycobacterium o Mycoplasma. Es por ello que si se sospecha de alguna de estas bacterias, las muestras recogidas por procedimientos no invasivos han de ser pretratadas segn unos protocolos concretos. Legionella o o Colocar la muestra en una placa de Petri estril. Seleccionar en la muestra la zona de aspecto ms lechoso o sanguinolento y separarla del resto. Las infecciones por Legionella se caracterizan por tos no productiva y por tanto, no son caractersticas las muestras purulentas. Se prepararn 3 fracciones: o Preparar una dilucin 1/10 de la muestra utilizando agua destilada estril como diluyente, en un frasco con tapn de rosca (en las muestras ya diluidas, como los lavados bronquiales, no es necesario realizar este paso). Aadir bolitas de vidrio estriles y agitar en un Vortex. Inocular 0,1 ml en una placa de BMPA. Transferir aproximadamente 0,3 ml de la muestra a un vial con tapn de rosca y mantener en un bao a 50C durante 30 min. Inocular 0,1 ml (3 gotas con una pipeta Pasteur estril) en una placa de BCYE.
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Preparar tambin una dilucin 1/10 de la muestra (0,1 ml) en tampn cido (0.9 ml). Aadir bolitas de vidrio estriles y agitar en un Vortex. Incubar 5 min a temperatura ambiente (25C) e inocular inmediatamente 0,1 ml en una placa de BCYE.
Una vez secos los inculos a temperatura ambiente, se extendern por toda la placa con ayuda de un asa bacteriolgica.
Micobacterias En principio, un procedimiento de descontaminacin debera ser capaz de eliminar, en la medida de lo posible, los contaminantes sin afectar seriamente la viabilidad de las micobacterias. La digestin permite la homogeneizacin de la muestra ya que algunas (en particular los esputos) contienen moco que, si no es licuado, proporciona a las bacterias contaminantes una barrera de proteccin frente a la accin del agente descontaminante. Uno de los mtodos de descontaminacin-digestin ms utilizados (Kubica y cols.) combina el hidrxido sdico (agente descontaminante) con la N-acetil-L-cistena NALC (agente mucoltico). Este tipo de pretratamiento es compatible con los medios de cultivo ms habituales tanto slidos como lquidos, incluidos los nuevos sistemas de deteccin automatizados. Pretratamiento o Preparar cada da la Solucin Descontaminante de Trabajo. Para ello se combina Ia solucin de NaOH-citrato de sodio con la NALC. Una vez preparada esta solucin puede utilizarse durante toda la jornada laboral. Conectar y situarse bajo Cabina de Seguridad Biolgica. Aadir en un tubo estril de fondo cnico (50 ml) un volumen de la solucin de trabajo igual al de la muestra. Si el volumen de la muestra es superior a 10-15 ml seleccionar esta cantidad, a ser posible, de la parte ms purulenta. Agitar la mezcla en un vrtex durante un tiempo no superior a 30 seg. Invertir el tubo para que la solucin entre en contacto con la muestra. Dejar el tubo en un agitador a temperatura ambiente durante 15 min (mximo de 20 min) para descontaminar la muestra. Diluir la mezcla hasta 50 ml con solucin tampn fosfato 0,067 M. Tapar el tubo e invertirlo para que se mezcle bien. Centrifugar a 3.000 x g durante 15-20 min. Desechar el sobrenadante. Suspender el sedimento en 2 ml de agua destilada o tampn fosfato.
o o
o o o o o o o
Usar esta solucin para preparar una extensin y sembrar los medios de cultivo.
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Siembra o o Retirar el posible lquido de condensacin de los tubos de cultivo. Inocular la muestra una vez terminado el proceso de descontaminacin. Se realizar con una jeringuilla de 1 ml o pipeta Pasteur calibrada, dispensando 0,5 ml en cada medio de cultivo.
Micoplasmas o Inoculacin en caldo:
Dispensar 1800 l del caldo de cultivo en tres tubos rotulados como 1, 2 y 3. 1. Tomar 200 l del sedimento de la muestra con la pipeta y transferirlos al tubo 1 (dilucin 10-1). Mezclar con la punta de la pipeta. 2. Tomar 200 l del tubo 1 con la pipeta y transferirlos al tubo 2 (dilucin 10-2). Mezclar varias veces con la punta de la pipeta. 3. Tomar otros 200 l del tubo 2 con la pipeta y transferirlos al tubo 3 (dilucin 10-3). Mezclar. o Inoculacin en placas de agar: Inocular en la placa 50 l del sedimento o del medio de transporte. Efectuar con la placa tapada suaves movimientos de rotacin para distribuir por su superficie el volumen inoculado. Bacterias habituales en infecciones respiratorias Es conveniente que los esputos sean sometidos a un proceso de digestin con algn agente mucoltico, y especialmente en casos de fibrosis qustica. Este procedimiento homogeniza y fluidifica la muestra, lo que permite aumentar la rentabilidad del cultivo bacteriolgico convencional en medios comunes. o Habitualmente se emplean agentes mucolticos (N-acetilcisteina) o ditiotreitol. El tiempo de contacto entre estos productos y el esputo previo a la siembra no debe ser prolongado ya que pueden inhibir o retrasar el crecimiento de diferentes patgenos. Para evitar esta accin deletrea tambin se ha recomendado emplear una homogeneizacin mecnica (sonicacin suave) o utilizar simplemente suero salino. Las placas para el cultivo de este tipo de bacterias se han de sembrar con estras por agotamiento, para aislamiento.
Medios de cultivo o o o o Agar sangre de carnero. Incubar a 35-37C en CO2, hasta 48 h. Agar chocolate o agar de sangre de caballo (HBA), o con 20.000 UI de bacitracina por litro (HBAB). 35-37C en CO2, hasta 48 h. Agar MacConkey o agar EMB. 35-37C en CO2, hasta 48 h. Agar glucosado de Sabouraud con cloranfenicol y gentamicina, o el agar con infusin cerebro-corazn y antibiticos (BHI), si se sospecha de micosis sistmica,
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actinomicosis o nocardiosis. Incubar a 30C y realizar lecturas diarias durante los 5 primeros y posteriormente de forma peridica semanal durante 3-5 semanas de incubacin. o Agar extracto de levaduras charcoal buffered (BCYE-), BCYE- con polimixina, anisomicina, cefamandol y -quetoglutarato (BMPA-), si hay sospecha de Legionella. Tambin est indicado este medio de cultivo para Nocardia, por inhibir el crecimiento de contaminantes. Sern incubadas a 36C, en aerobiosis y en condiciones de humedad, durante 12-15 das. La incubacin en CO2 puede ser beneficioso para el crecimiento de algunas especies de Legionella. Medios selectivos con antibiticos (CNA, CAZ-NB, FEA, TNAP(LIQ)) ante la sospecha de R. equi, para eliminar la flora acompaante. En aerobiosis, 30-37C, hasta 7 das. Si se solicita cultivo de micobacterias los medios ms utilizados son los slidos con huevo, y entre ellos el Lwenstein-Jensen (tabla 3). Incubar a 35-37C. o Los primeros 7-15 das han de estar en una atmsfera de un 5-10% de CO2. Los tubos de Lwenstein-Jensen debern permanecer inclinados hacia arriba en gradillas especficas, para que la muestra est en contacto con la mayor parte de la superficie del medio. Los tapones de los tubos no deben estar totalmente cerrados para que haya intercambio areo y se evapore todo el lquido. Del 15 da hasta 6 semanas. Cuando la superficie del medio est completamente seca (10-15 das aproximadamente) lo tapones se debern cerrar y los tubos se dispondrn en gradillas de manera vertical en un incubador sin CO2. Todos los cultivos debern incubarse durante un mnimo de 6 semanas, antes de considerarlos negativos.
o o
Medios slidos Con huevo: Lwenstein-Jensen, Petragnani, Colestsos, Americam Thoracic Society. Con agar: Middlebrook Selectivos Especiales Medios bifsicos: Septi-Chek Medios lquidos: Convencionales: 7H9 Middlebrook, Dubos, Youmans, Proskauer-Bek Comerciales o Lectura manual: MB redox, MGIT o Deteccin (semi)automtica: BACTEC 460TB, ESP Culture System II, Sistema MB/BacT ALERT 3D, Sistema BACTEC MGIT 960, Sistema BACTEC serie 9000.
Tabla 3. Distintos medios de cultivo para Mycobacterium sp Caldo o agar SP-4 Cuando se especifique cultivo de Mycoplasma. Los caldos se incuban a 35-37C en aerobiosis durante 6 semanas. Las placas se incuban en la jarra con un sobre generador de CO 2 por el mismo periodo de tiempo.
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F2) Muestras recogidas por procedimientos invasivos Mtodo de siembra F2.1) Lavado broncoalveolar obtenido por fibrobroncoscopia o mini-lavado por tcnica ciega Si se solicita estudio de Legionella la muestra obtenida mediante lavado broncoalveolar ha de ser pretratada de igual manera que las anteriores, se tratar como una secrecin contaminada. Sin embargo, para el cultivo de micobacterias no sera necesaria la descontaminacin. El mtodo ha de ser cuantitativo, mediante diluciones seriadas. El cultivo cuantitativo tiene como objetivo diferenciar las bacterias colonizadoras de la orofaringe que contaminan la 4 muestra y que estn presentes en pequea cantidad (concentraciones inferiores a 10 ufc/ml), 5 6 de las bacterias potencialmente patgenas, presentes en altas concentraciones (entre 10 y 10 ms ufc/ml). o o o Agitar la muestra con suavidad para homogeneizarla durante 30-60 segundos. Sembrar 100 microlitros de la muestra en placas. Marcar las placas x10. Cada colonia que se asle equivale a 10 ufc/ml. Pasar 100 microlitros de la muestra a un tubo que contenga 9,9 ml de suero fisiolgico estril. Agitar en el vortex o agitador similar y sembrar 100 microlitros en placas de agar sangre y agar chocolate. Marcar las placas x1000 Cada colonia que se asle equivale a 1000 ufc/ml. Pasar 100 microlitros de la dilucin anterior a un tubo que contenga 9,9 ml de suero fisiolgico estril. Agitar en el vortex y sembrar 100 microlitros en placas de agar sangre y chocolate. Marcar las placas x100.000. Cada colonia que se asle equivale a 100.000 ufc/ml. Las gotas inoculadas en las placas se extendern por toda la superficie de la placa con una pipeta Pasteur doblada en ngulo recto o un asa de plstico.
F2.2) Cepillado bronquial protegido obtenido por fibrobroncoscopia o o Se corta el cepillo y se coloca en un tubo que contenga 1 ml de solucin estril de Ringer lactato. Se agita en el Vortex durante 1 minuto. Si se solicita estudio de Legionella la muestra obtenida mediante CTP, se tratar como una secrecin no contaminada, por tanto, el pretratamiento consistir en lo siguiente: Aadir bolitas estriles de vidrio y agitar en un Vortex. Inocular 0,1 ml en una placa de BCYE y 0,1 ml en otra de BMPA. Para el cultivo de micobacterias tampoco sera necesaria la descontaminacin. Sembrar la muestra para cultivo bacteriano cuantitativo mediante el mtodo de las diluciones seriadas, al igual que para el LBA.
o o
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F2.3) Lquido pleural y tejido obtenidos por toracocentesis Cuando soliciten cultivo de Mycoplasma se ha de seguir el siguiente protocolo: o Lquido pleural: o o Inoculacin en caldo: realizar diluciones seriadas 10-1 ,10-2 ,10-3. Inoculacin en placas de agar: Inocular en la placa 50 l del sedimento. Efectuar con la placa tapada suaves movimientos de rotacin para distribuir por su superficie el volumen inoculado.
Tejidos: o Inoculacin en caldo: Introducir una de las piezas en un tubo con 1,8 ml de medio. Agitar en vortex y realizar diluciones seriadas como en los lquidos. Es importante realizar diluciones seriadas en el caldo, al menos hasta la dilucin 10-3, para evitar interferencias en el crecimiento por antibiticos, anticuerpos y otros inhibidores presentes en la muestra.
Inoculacin en placas de agar: tomar con una aguja estril una pieza del tejido y colocarla sobre el agar. Con la ayuda de la aguja, arrastrar la superficie fresca del corte de la pieza sobre toda la circunferencia de la placa.
Para el resto de aislamientos se dejan caer 2-3 gotas, en cada uno de los medios de cultivo y despus extender con estras por agotamiento. Medios de cultivo Agar sangre, agar chocolate, agar MacConkey. 35-37C (en atmsfera de CO2 al 5%, el agar sangre y chocolate), durante 48 horas como mnimo, preferiblemente 72 horas. Agar para anaerobios. En atmsfera anaerobia, a 35-37 C, hasta las 24h (cmaras) o 48h (jarras o bolsas). Agar de Sabouraud, Agar glucosado de Sabouraud con cloranfenicol y gentamicina, o BHI con antibiticos (si soicitud de cultivo de hongos). Incubar durante 3-5 semanas en estufa de 30C. Agar BCYE (si solicitud de cultvio de Legionella o Nocardia). A 36C, en aerobiosis y en condiciones de humedad, durante 12-15 das. CNA, CAZ-NB, FEA, TNAP(liq) (si sospecha de R. equi). En aerobiosis, 30-37C, hasta 7 das. Tubos de Lwenstein-Jensen (si solicitud de cultivo de micobacterias). Incubar a 35-37C. Los primeros 7-15 das en atmsfera de 5-10% de CO2 inclinados y medio abiertos. Del 15 da hasta la 6 semana, sin CO2, rectos y totalmente cerrados.
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Caldo o agar SP-4 (si solicitud de cultivo de micolplasmas). Se incuban a 35-37C durante 6 semanas. Los caldos en aerobiosis y las placas en CO 2. 4.2.2 Evaluacin del crecimiento A) Placas de agar en anaerobiosis de muestras de vas respiratorias Los medios con crecimiento deben observarse cuidadosamente para detectar todas las colonias diferentes, independientemente de su tamao, y proceder a su subcultivo, cada una de ellas se ha de reaislar en: agar Brucella (anaerobiosis), agar chocolate y agar sangre (ambas en aerobiosis con 10% de CO2). Las colonias subcultivadas que no crezcan en agar chocolate ni agar sangre se consideraran en principio anaerobios estrictos y se procede a su estudio. Igualmente del tioglicolato se deben realizar subcultivos si se aprecia turbidez u otro signo de crecimiento. B) Frascos de hemocultivo en anaerobiosis y aerobiosis con lquido pleural o sangre La lectura se realiza diariamente durante 7 das. En el caso de que haya crecimiento, se extrae una muestra del frasco aerobio mediante jeringa y aguja para realizar tincin de Gram y subcultivos en medios slidos para aerobios y facultativos (agar sangre, agar chocolate, agar MacConkey, por ejemplo). Del frasco anaerobio se hacen subcultivos en agar sangre, agar chocolate y agar sangre para anaerobios. B1) Muestras de vas respiratorias bajas, no contaminadas En las biopsias pulmonares por puncin transtorcica, biopsias a pulmn abierto y en el lquido pleural todos los patgenos se deben identificar e informar junto con las pruebas de sensibilidad a antibiticos. C, D, E y F) Placas y tubos en aerobiosis o CO2, con muestras de vas respiratorias Streptococos.Crecen en Agar sangre y Chocolate como colonias pequeas y diminutas, grisceas a blanquecinas. En Agar sangre se distingue la capacidad hemoltica. El S. pyogenes (Grupo A) y S. agalaciae (Grupo B,) son beta hemolticos aunque no son los nicos y no siempre. Las colonias de S. pneumoniae en placas de agar sangre y agar chocolate, aparecen pequeas, grisceas y mucoides (claras como el agua), y estn rodeadas de una zona verdosa de alfa hemlisis. Ilustraciones recomendadas: http://www.microbiologyinpictures.com/streptococcus%20pyogenes.html http://www.microbiologyinpictures.com/streptococcus%20agalactiae.html http://www.microbiologyinpictures.com/streptococcus%20pneumoniae.html S. aureus. En Agar sangre y Chocolate forma colonias entre pequeas y moderadas, circulares, opacas y lisas, que tienden a ser doradas y generalmente -hemolticas.
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Ilustraciones recomendadas: http://www.microbiologyinpictures.com/staphylococcus%20aureus.html A. otitidis. Crece en agar sangre pero no en agar chocolate ni en tioglicolato, requiere incubacin prolongada en atmsfera enriquecida en CO2 (mnimo tres, hasta cinco das); colonias muy pequeas alfa-hemolticas. Neisseria. N. gonorrhoeae es nutricionalmente mucho ms exigente que N. meningitidis, de manera tal que puede crecer nicamente en medios enriquecidos como agar chocolate, Thayer Martin o similares, pero no puede crecer en agar sangre, mientras que N. meningitidis puede crecer tanto en agar sangre como en agar chocolate. Forman colonias pequeas, bordes lisos e irregulares, grisceas, blanquecinas, traslcidas y brillantes. Ilustraciones recomendadas: http://www.microbiologyinpictures.com/neisseria%20gonorrhoeae.html http://www.microbiologyinpictures.com/neisseria%20meningitidis.html Haemophilus. En Agar sangre no crece a no ser que sea a modo de satlite alrededor de Staphylococcus aureus que hemoliza la sangre. Crece en Agar chocolate formando colonias pequeas, convexas de borde regular, grisceas-transparentes y aspecto brillante. Cuando se observen colonias sospechosas se reaislan en Agar sangre y chocolate simultneamente, para observar el no crecimiento en Agar sangre caracterstico. Ilustracin recomendada: http://www.microbiologyinpictures.com/haemophilus%20influenzae.html M. catarrhalis. En Agar sangre y chocolate forma colonias parecidas a las de Neisseria, algo ms grandes y con un ligero color rosado. Adems las colonias muestran el signo caracterstico del disco de hockey al deslizarse sobre la superficie del agar cuando se empujan. Ilustracin recomendada: http://www.microbiologyinpictures.com/moraxella%20catarrhalis.html Bacilos gramnegativos. En Agar sangre forman colonias grandes y medianas, mucosas y grises y brillantes prcticamente indistinguibles. En los medios Agar Mac Conkey o Levine da lugar a colonias diferenciables por el olor, mucosidad y sobretodo color segn sean fermentadoras de lactosa (K. pneumoniae y resto de enterobacterias) o no (P. aeruginosa, S. maltophilia, Acinetobacter spp, B. pseudomallei). Ilustraciones recomendadas: http://www.microbiologyinpictures.com/klebsiella%20pneumoniae.html http://www.socalemi.org/atlasmicrobiologia/pseudomonas_en_mcconkey.JPG R. equi. Crece en agar sangre pero se selecciona mejor en CNA y similares. El pigmento caracterstico de su nombre (Rhodococcus = coco de color rojo) no suele apreciarse en los cultivos con menos de cuatro das; transcurrido este tiempo, las colonias pueden aparecer de
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color salmn, ligeramente rojas, amarillo plido o incluso carecer de pigmento. En cultivos viejos, las colonias pueden parecer secas, rugosas y de color rojo-anaranjado. Posee adems el factor equi: consiste en reas de hemlisis completa en placa de agar sangre cuando interacta con la hemolisina de L. monocytogenes, Listeria seeligeri V o S. aureus. Ilustracin recomendada: http://www.ijmm.org/viewimage.asp?img=IndianJMedMicrobiol_2011_29_1_65_76529_f2.jpg Cndidas. Puede crecer en Agar sangre y chocolate como colonias pequeas blanquecinas secas, con bordes estrellados (C. albicans). Donde mejor crecen es en Sabouraud, con aspecto blanco cremoso volvindose ms pastosas a medida que envejecen, superficie lisa o rugosa, generalmente elevadas, tamao pequeo y olor dulzn agradable. Ilustracin recomendada: http://www.microbelibrary.org/images/atlas_streakplating/candidaalbicans_4quadrantstreak_fi g13.jpg C. diphtheriae. Crece en Agar sangre como pequeas colonias beta hemolticas, grisceas, de aspecto granuloso. El color tiende a ser blanco amarillento en los medios de cultivo de Loeffler. En ASCT, el organismo puede formar colonias grises con centros negros y bordes dentados o continuos, pero no son las nicas. Se ha de realizar un subcultivo en Agar sangre. Ilustracin recomendada: http://www.microbiologyinpictures.com/corynebacterium%20diphtheriae.html B. pertussis y B. parapertussi. En Regan-Lowe desarrollan colonias pequeas, abovedadas, de superficie lisa y brillante, de color grisceo perlado, puede ser necesaria una lupa en los primeros das. B. pertussis no crece en la placa de agar sangre. B. bronchiseptica crece en 2 3 das en agar sangre donde muestra hemlisis, y en agar MacConkey. Ilustracin recomendada: http://www.microbiologyinpictures.com/bordetella%20pertussis.html Legionella. Las placas BCYE se deben examinar utilizando una lupa binocular cada 1 2 das, ya que las colonias de Legionella pueden quedar enmascaradas por el crecimiento de otros microorganismos, incluyendo hongos. Las colonias de Legionella son lisas con un borde entero, tienen un aspecto granular, como polvo de vidrio y a veces presentan un brillo azul-verdoso o rosa-prpura, con un aspecto cristalino caracterstico. Seleccionar al menos tres colonias caractersticas de Legionella por cada muestra inoculada y subcultivar paralelamente en BCYE y BCYE sin cistena. Incubar a 36C durante al menos 2 das. Se consideran Legionella aquellas colonias con crecimiento en BCYE y sin crecimiento en BCYE sin cistena (o ausencia de crecimiento en agar sangre). Legionella oakridgensis es la nica especie que no requiere cistena en el aislamiento primario, aunque s lo requiere en sucesivos subcultivos.
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Ilustracin recomendada: http://www.microbelibrary.org/images/delisle/images/legcul.jpg Nocardias. Crecen en la mayora de los medios bacterianos convencionales para aerobios, asi como en los de micobacterias (Lwestein-Jensen o Middlebrook), pero en BCYE se miniminizan los contaminantes. Presenta hifas areas en las colonias. Micobacterias. Los tubos de Lwestein-Jensen deben ser examinados con buena luz y detenimiento, al menos, una vez por semana, para detectar la presencia de colonias indicativas de crecimiento. De cualquier crecimiento se deber realizar una tincin de Ziehl-Neelsen, comprobando si se trata de bacilos cido-alcohol resistentes (BAAR) y/o de un contaminante (bacteriano o fngico). La aparicin de colonias rugosas no pigmentadas de crecimiento lento y aspecto de migas de pan suele ser caracterstica de M. tuberculosis; las colonias pequeas, lisas y no pigmentadas son caractersticas del complejo M. avium; y las colonias grandes, lisas, mucosas, de crecimiento lento pero fotocromgenas seran ms tpicas de M. kansasii. http://www.bacteriainphotos.com/Mycobacterium%20tuberculosis.html M. pneumoniae: o o Los caldos SP4 se examinarn cada 5 das para detectar cambio de color en el medio por metabolismo de la glucosa (del rojo original, al naranja y al amarillo). Las placas SP4 se examinarn con microscopio estereoscpico (50X) y transiluminacin para detectar la presencia de las tpicas colonias de M. pneumoniae en forma de grosella. Ilustracin recomendada: http://www.gefor.4t.com/concurso/bacteriologia/mycoplasma1.gif Ante cualquier cambio de color del medio subcultivar: o o o 200 l a otro tubo con medio fresco. 50 l a una placa de agar. 50 l a una placa de agar Columbia sangre, solo en el caso de que el tubo presentara turbidez, lo que indicara contaminacin por otras bacterias.
Hongos filamentosos. En las placas de agar glucosado de Sabouraud con cloranfenicol y gentamicina, o BHI, se examinan macroscpicamente las colonias: forma, color, textura, velocidad de crecimiento y reverso. Tabla 4.
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Micelio Zigomicetes Mucorales Mucor Abundante
Color
Crecimiento
Rhizopus Abundante Entomoftorales Escaso, Conidiobolus colonias membranosas Escaso, Basidiobolus colonias pulvurulentas Hifomicetes Aspergillus
Blanco, amarillo, gris oscuro Gris, marrn Color crema
Rpido: 3-5 das Rpido: 3-5 das Rpido: 3-5 das Rpido: 3-5 das
Blanco, amarillo, verde, negro
Rpido: 3-5 das
Tabla 4. Caractersticas macroscpicas de los principales hongos filamentosos respiratorios Ilustraciones recomendadas: http://www.gefor.4t.com/concurso/hongos/mucor4.jpg http://www.saber.ula.ve/micosis/contenido/capitulo15/figuras/15-0007-de.html http://www.pf.chiba-u.ac.jp/gallery/fungi/c/Conidiobolus_coronatus_colony1.htm http://www.saber.ula.ve/micosis/contenido/capitulo20/capitulo20D/figuras/20D-0001-de.html http://www.gefor.4t.com/concurso/hongos/aspergillusflavus10.jpg
F1) Muestras de vas respiratorias bajas, contaminadas con microbiota de vas altas o Se valorarn, identificarn e informarn los microorganismos no pertenecientes a la microbiota normal, como los aislados de S. pyogenes, estreptococos del grupo B en neonatos, Bordetella (especialmente B. bronquiseptica), M. pneumoniae, C. pneumoniae, Legionella, Nocardia, F. tularensis, B. anthracis, Cryptococcus neoformans y hongos filamentosos (no considerados contaminantes). Tambin, se identificarn e informarn los microorganismos pertenecientes a la microbiota de colonizacin cuyo morfotipo est presente de forma predominante en el Gram de la muestra y que crezcan en cantidades significativas en la segunda o en la tercera rea de reaislamiento de la placa, aunque no sean predominantes en el cultivo. En este grupo se incluyen los aislados de S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, P. aeruginosa, S. maltophilia, Acinetobacter spp. Y Burkholderia spp., stos ltimos de particular inters en pacientes hospitalizados y en pacientes no hospitalizados con bronquiectasias. Igualmente, se identificarn e informarn los microorganismos con crecimiento en cantidad significativa y predominante en el cultivo, en particular si se ha observado su morfotipo en la tincin de Gram de la muestra. En este grupo se incluyen S. aureus, estreptococos del grupo B en adultos, estreptococos -hemolticos de los grupos C o
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G, bacilos gramnegativos cuando crezca un solo morfotipo (en especial K. pneumoniae), especies de Corynebacterium (urea positiva o aisladas en pacientes intubados) y R. equi (en pacientes inmunodeprimidos). Adems, se considerar el crecimiento de pequeas cantidades de especies bacterianas, siempre que coincidan con el morfotipo bacteriano observado en la tincin de Gram del esputo, as como tambin el crecimiento de colonias en el primer cuadrante de la placa en cultivo puro o prcticamente puro. o Por el contrario, no se debe valorar el crecimiento de ms de un morfotipo de bacilos gramnegativos en el medio de MacConkey (E. coli, Proteus spp., etc) y se debe informar como crecimiento de bacilos gramnegativos entricos. Tampoco se valorar ni informar el aislamiento de Enterococcus spp., a menos que se asle en cultivo puro. Las especies de Candida no son causa de neumona (colonizan habitualmente la boca), excepto posiblemente en los pacientes oncolgicos (leucemia), transplantados pulmonares y en los neonatos.
F2) Muestras de vas respiratorias bajas, obtenidas por mtodos invasivos Segn los trabajos de Bartlett y Finegold, Baselski, Wimberley y otros autores, en las vas respiratorias bajas: o Las bacterias orofarngeas que contaminan las secreciones purulentas de las vas areas inferiores estn presentes en pequea cantidad, en concentraciones inferiores a 10.000 ufc/ml de muestra, mientras que, Las bacterias patgenas se encuentran en altas concentraciones, entre 100.000 y 1.000.000 ms ufc/ml.
El cultivo cuantitativo tiene como objetivo diferenciar los dos tipos de bacterias basndose en su concentracin. En las muestras obtenidas por fibrobroncoscpia los puntos de corte indicadores de neumona bacteriana, en especial en los enfermos ventilados mecnicamente con sospecha de neumona nosocomial, estn fijados en: o o o 1.000 ufc/ml (103 ufc/ml) para el cultivo del CTP. 10.000 ufc/ml (10 ufc/ml) para el cultivo del LBA. <1.000 ufc/ml suelen indicar contaminacin por microbiota orofarngea.
4
Sin embargo, en determinadas ocasiones, tanto en el cepillado como en el lavado brocoalveolar estos puntos de corte no deben ser tomados de forma rgida y recuentos de ms o de menos de un logaritmo para el cepillado bronquial (102-104) y de 1-2 para el lavado broncoalveolar 2 6 (10 -10 ) deben interpretarse con precaucin ya que hay varios factores relacionados con la tcnica de la broncoscopia y el procesamiento microbiolgico, pero sobre todo con el tratamiento antibitico que recibe el enfermo, que pueden alterarlos. Excepciones a estos puntos de corte seran patgenos primarios o raramente aislados como parte de la microbiota, como Legionella, Nocardia, y otros, en los que debe valorarse cualquier recuento. Si existe crecimiento en los caldos o agar SP4, no es necesario indicar el ttulo, cualquier crecimiento de M. pneumoniae, si se confirma, es significativo.
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4.3 Pruebas complementarias

4.3.1 Tcnica del scotch o papel de celofn Nos ayuda a la identificacin estructural de los hongos filamentosos. Consiste en tocar la superficie de la colonia con la cinta adhesiva y colocarla sobre un porta, en el que se ha depositado una gota de azul de lactofenol y observar al microscopio. Mejora ostensiblemente la visin microscpica si se aade, adems, una gota de azul de lactofenol sobre el celofn y se deposita un cubre sobre ella. Los criterios de identificacin son fundamentalmente morfolgicos basados en la presencia de estructuras de reproduccin y caractersticas especiales de las hifas. Ilustracin 4 y tabla 5.
Ilustracin 4. Esquema de la estructura de los principales hongos filamentosos respiratorios: A la izquierda, los Zigomicetes; a la derecha los Hifomicetes Ilustraciones recomendadas: http://www.gefor.4t.com/concurso/hongos/mucor5.jpg http://www.saber.ula.ve/micosis/contenido/capitulo15/figuras/15-0010-de.html http://www.saber.ula.ve/micosis/contenido/capitulo20/capitulo20D/figuras/20D-0003-de.html http://www.saber.ula.ve/micosis/contenido/capitulo20/capitulo20D/figuras/20D-0002-de.html http://www.gefor.4t.com/concurso/hongos/aspergillusflavus3.jpg
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Hifas Zigomicetes Anchas, no septadas. Mucorales Mucor Rhizopus Entomoftorales Conidiobolus Basidiobolus Hifomicetes Finas, septadas.
Estructuras reproductoras R. asexual: esporangiosporas en esporangiforos con columela. R. sexual: zigosporas. Esporangios esfricos.
Rizoide Septos en hifas viejas. Esporangiforos alargados. Zigosporas esfricas. Esporangiforos cortos. Zigosporas cnicas. R. asexual: conidios en conidiforos. Conidiforos no ramificados, terminados en vescula. Filides con forma de matraz dispuestas en una o varias series de filides.
Aspergillus
Tabla 5. Caractersticas microscpicas de los principales hongos filamentosos respiratorios 4.3.2 Tincin de Gram La tincin de Gram se podr realizar a cualquier colonia bacteriana para ayudarnos a su identificacin. Legionella es un bacilo gramnegativo que se tie dbilmente con la coloracin de contraste, por lo que es recomendable la utilizacin de fuchsina bsica al 0,1% en vez de safranina en esta tincin. Tabla 6.
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Gram positivos
Gram negativos
S. pygenes
S. pneumoniae S. aureus, A. otitidis
C. diphtheriae R. equi M. catarrhalis Acinetobacter N. gonorrheae Haemophilus Bordetella B. pseudomallei K. pneumoniae, Pseudomonas S. maltophilla Legionella
Tabla 6. Morfologa y afinidad por los colorantes de Gram de la mayora de las bacterias causantes de infecciones respiratorias 4.3.3 Oxidasa La citocromo oxidasa es una enzima de la cadena de transporte de electrones en la ruta metablica de obtencin de energa de algunas bacterias. Consiste en aadir sobre las colonias problema descargadas sobre papel de filtro unas gotas de reactivo oxidasa (clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina al 11% en agua), si aparece una coloracin azul-violeta el microorganismo es oxidasa positivo, si no aparece esta coloracin es oxidasa negativo. Tabla 7. Ilustracin recomendada: http://www.mesacc.edu/~johnson/labtools/Dbiochem/oxi.jpg 4.3.4 Catalasa La catalasa es una enzima bacteriana que desdobla el agua oxigenada en oxigeno y agua. Constituye un sistema de defensa bacteriano frente a agentes hiperoxidantes como el perxido de hidrgeno (agua oxigenada).
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Consiste en aadir sobre las colonias problema unas gotas de H2O2 10 vol. Si aparecen burbujas de O2 gas el microorganismo es catalasa positiva, y si no aparecen las burbujas seria catalasa negativo. Nunca debe realizarse esta prueba en colonias sobre medios con sangre porque los eritrocitos tambin poseen esta actividad enzimtica y podran producirse resultados falsamente positivos. Tabla 7. Ilustracin recomendada: http://www.mesacc.edu/~johnson/labtools/Dbiochem/cat.jpg
Catalasa positiva Staphyloccus A. otitidis C. diphtheriae Acinetobacter R. equi M. catarrhalis Bordetella sp. Legionellla Oxidasa positiva Pseudomonas Neisseria B. pseudomallei R. equi M. catarrhalis B. pertussis, B. bronchiseptica Legionellla
Tabla 7. Identificaciones rpidas de enzimas bacterianos 4.3.5 Prueba de la coagulasa Objetivo Permite separar S. aureus, que posee coagulasa, de las otras especies de estafilococos que genricamente se las denomina estafilococos coagulasa negativos. Fundamento S. aureus posee dos tipos de coagulasa: o Una endocoagulasa o coagulasa ligada o clumping factor, que est unida a la pared celular. Esta acta directamen te sobre el fibringeno provocando la formacin de cogulos o grumos cuando se mezcla una suspensin bacteriana con plasma citratado (test en lmina). Una exocoagulasa o coagulasa libre que acta mediante la activacin de un factor srico (CRF), formndose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibringeno producindose un cogulo de fibrina (test en tubo).
Mientras el test en tubo es definitivo, el test en lmina nos sirve como una rpida y econmica tcnica de tamizaje (screening). Entre un 10 a 15% de las cepas de S. aureus se mostrarn negativas en el test en lmina, por lo cual en esos casos se hace necesario realizar un test en tubo.
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Test en lmina o Procedimiento: se emulsionan sobre un portaobjetos una o ms colonias en una gota de suero fisiolgico hasta formar una suspensin lechosa. Luego se agrega, al lado, una gota de plasma citratado de conejo y se mezclan. Interpretacin de resultados: debe realizarse dentro de los primeros diez segundos. Un test positivo se evidencia por la formacin de grumos. Los test negativos deben ser confirmados por test en tubo.
Test en tubo o Procedimiento: se emulsionan varias colonias en un tubo con 0,5 ml de plasma citratado de conejo. Se incuba a 35 C y se chequea la formacin del cogulo a las 4 horas. Si es negativo se reincuba toda la noche y se procede a su lectura a las 18 horas. La lectura a las 4 horas es fundamental porque en alguna oportunidad puede suceder que las fibrinolisinas de S. aureus lisen el cogulo luego de 18 horas de incubacin y de esta manera se produzcan un test falso negativo. Interpretacin de resultados: se observa la formacin de un cogulo total o parcial si el test es positivo. Ilustracin recomendada: http://medinfo.ufl.edu/year2/mmid/labimage/coag.jpg Aglutinacin con partculas de ltex o o Objetivo: permite separar S. aureus de otras especies de estafilococos. Es un test alternativo para detectar la presencia de la coagulasa y la protena A. Fundamento: se utilizan partculas de ltex cubiertas con plasma. El fibringeno se une al ltex y detecta el clumping factor. Adems, las inmunoglobulinas presentes en las partculas detectan la protena A, capaz de unirse a la porcin Fc de la IgG. La pared celular de S. aureus posee una protena caracterstica llamada protena A. Esta tiene la habilidad de unirse a la porcin Fc de las molculas de inmunoglobulina G (IgG), y por tanto funciona como factor de virulencia, ya que interfiere con la opsonizacin y la ingestin de los microorganismos por los PMN, activando el complemento y dando lugar a reacciones de hipersensibilidad inmediata y tarda. Procedimiento: se trata de test comerciales por lo cual cada formulacin tiene su procedimiento especfico. Generalmente se mezcla el reactivo del test con una porcin de la colonia. Interpretacin de resultados: la formacin de grumos indica un test positivo.
4.3.6 Aglutinacin de estreptococos Muchos Streptococcus aislados de infecciones humanas poseen antgenos especficos de naturaleza polisacrida (polisacrido C o cidos teicoicos) que se encuentran en la pared celular.
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La extraccin del polisacrido C por diferentes tcnicas y su posterior enfrentamiento con antisueros especficos definen una serie de grupos que se denominan con letras maysculas a partir de la A. La utilidad de la extraccin antignica depender del tipo de hemlisis: o o En los estreptococos -hemolticos se ha confirmado como el mejor mtodo para su clasificacin. En los no -hemolticos, la extraccin antignica slo es til para la identificacin de los grupos D y B.
Existen diferentes mtodos para la extraccin enzimtica. Actualmente se utilizan mtodos de extraccin rpida por medio de enzimas de extraccin. Luego se procede a la identificacin del polisacrido por medio de tcnicas de aglutinacin con partculas de ltex que tienen absorbido el antisuero especfico. Tambin existen en el mercado kits comerciales que utilizan tcnicas de coaglutinacin, como la que a continuacin se describe. Coaglutinacin Pueden usarse tres diferentes procedimientos para la preparacin de muestras con Phadebact Streptococcus Test. o o Cultivos primarios: a partir de 1-5 colonias -hemolticas cogidas diectamente de la placa, se les hace reaccionar con una gota de cada reactivo. Procedimiento opcional de extraccin directa de colonias: debe considerarse cuando no hay un nmero suficiente de colonias o se han obtenido resultados inconclusos por el Test por Cultivos Primarios. El mtodo de extraccin no debe usarse con Strep D y Strep F (se recomienda inoculacin en caldo). Se seleccionan 1-3 colonias de estreptococo -hemoltico del cultivo primario y se suspende en una mezcla de extractiva. Se incuba a temperatura ambiente 10-15 minutos o a 100C un minuto. Enfrentar una gota de la solucin con cada reactivo. o Inoculacin en caldo: se toman una o ms colonias de estreptococos -hemolticos de la placa de cultivo, se inoculan en 2 ml de caldo de enriquecimiento y se incuban a 35-37C durante la noche o hasta que la turbidez sea igual a Mac-Farland 3.2 densidad estndar.
Lectura Debe realizarse dentro de un minuto. o o Resultado positivo: presencia de grumos visibles. Resultado Negativo: la ausencia de reaccin con cualquiera de los reactivos indica que la bacteria ensayada no pertenece a los microorganismos ensayados. http://medinfo.ufl.edu/year2/mmid/labimage/phadeb.jpg
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4.3.7 Sensibilidad a Optoquina La optoquina (clorhidrato de etildihidrocupreina), es un derivado de la quinina que inhibe de forma selectiva el crecimiento de S. pneumoniae a muy bajas concentraciones 5 mg/ml. Procedimiento o o Se seleccionan 3 4 colonias y se siembran en agar sangre como si fuera en reaislamiento. Colocar disco de optoquina sobre la zona de la descarga y presionar el disco para que se adhiera al agar. Incubar 18-24 horas a 37C.
Lectura Esta prueba es positiva si aparece un halo de inhibicin mayor o igual 14mm para discos de 6mm, y 16mm para discos de 10mm. Ilustracin recomendada: http://www.mesacc.edu/~johnson/labtools/Dbiochem/opto4.jpg 4.3.8 Sensibilidad a Bacitracina Esta prueba puede utilizarse como diagnstico presuntivo en la identificacin de Streptococcus pyogenes, ya que, a diferencia de la mayora de los estreptococos, suelen ser sensibles a bajas concentraciones de bacitracina (discos 0,04U). Procedimiento o o Lectura La aparicin de cualquier dimetro de halo de inhibicin de crecimiento alrededor del disco se considera prueba positiva. Ilustracin recomendada: http://www.microbelibrary.org/images/nchamberlain/images/streptococcus%20pyogenes%20st reptoccocus%20agalactiae%20fig1an.jpg Se seleccionan 3 4 colonias y se siembran en agar sangre como si fuera en reaislamiento. Colocar disco de bacitracina sobre la zona de la descarga y presionar el disco para que se adhiera al agar. Incubar 18-24 horas a 37C.
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4.3.9 Solubilidad en bilis Las cepas -hemolticas con una zona de inhibicin de 9 mm a 13 mm para la optoquina deben someterse a la prueba de solubilidad en bilis para completar la caracterizacin e identificacin. Se basa en la capacidad de determinadas especies bacterianas de lisarse en presencia de sales biliares, las ms utilizadas de las cuales son el taurocolato y el desoxicolato de sodio. Ambas provocan un descenso de la tensin superficial, que, unido a la actuacin de enzimas autolticos, destruyen la clula. El efecto de esta enzima autoltica se pone de manifiesto sobre colonias de S. pneumoniae crecidas en medios slidos, en las que se aprecia una umbilicacin central, y tambin en colonias mucoides. Procedimiento o o Tomar con un asa varias colonias sospechosas de una placa de agar sangre y preparar una suspensin 0,5-1,0 McFarland. Dividir la suspensin en dos cantidades iguales (0,25 ml por tubo). Aadir 0,25 ml de salina a uno de los tubos y 0,25 ml de desoxicolato de sodio al 2% (sales biliares) al otro. Para hacer una concentracin al 2% de sales biliares, aada 0,2 g de desoxicolato de sodio a 10 ml de salina. Agitar los tubos suavemente e incubarlos a 35C 37C durante 2 horas.
o o Lectura o o o
Examinar los tubos peridicamente para detectar lisis de las clulas en el tubo que contiene sales biliares. Si el tubo se aclara o pierde turbidez, el resultado es positivo. Las cepas en las que la suspensin en el tubo se torna clara en la prueba de solubilidad en bilis deben ser notificadas como solubles en bilis. Las cepas para las cuales la turbidez en el tubo de control de salina permanece igual, deben ser notificadas como negativas para la solubilidad en bilis (o insoluble en bilis o resistente a la bilis).
4.3.10 Requerimientos de factores X, V, XV H. influenzae es un microorganismo fastidioso que requiere medios de cultivo que contengan hemina (factor X) y dinucletido de adeninnicotinamida (DAN y factor V) para crecer. Los requerimientos de factores de crecimiento pueden identificarse con discos o tiras de papel (utilizando los principios de la difusin en agar) o utilizando placas comerciales (que contienen cuatro tipos de medios con factores X y V, y sin ellos). Describiremos el mtodo de difusin.
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Procedimiento o o Lectura o o H. influenzae solo crecer alrededor del disco XV (que contiene ambos factores X y V). H. parainfluenzae crecer alrededor de los discos V y XV. Inocular una placa de agar de soja base triptona o agar caldo infusin de corazn (ambos sin factores X, V y XV), con las colonias sospechosas de un cultivo reciente. Las tiras o discos de papel que contienen factores X, V y XV se colocan en la placa inoculada. Incubar en CO2 durante 1824 horas a 35C.
Ilustracin recomendada: http://www.microbiologyinpictures.com/bacteria%20photos/haemophilus%20influenzae %20photos/HAIN22.html 4.3.11 Test de filamentacin Se realiza en aquellas colonias que han crecido en Agar Sabouraud, para identificar las especies de Cndida albicans, que tienen la facultad de producir tubos germinativos. Procedimiento o o o Lectura La prueba es positiva si se visualizan tubos germinales. Se trata de una extensin filamentosa de la levadura, sin estrechamiento en su origen, cuyo ancho suele ser la mitad de la clula progenitora y su longitud tres o cuatro veces mayor que la clula madre. Ilustracin recomendada: http://www.telmeds.org/wp-content/uploads/2009/09/candida_merckmedicus.jpg Falsos negativos: o o Aproximadamente un 5% de cepas de C. albicans son negativas para tubos germinales. Si se utiliza un inculo demasiado abundante de levaduras, tambin pueden obtenerse falsos resultados negativos. Emulsionar una porcin de la colonia aislada en 0.5 ml de suero humano. Incubar a 35C durante 2h. Depositar una gota de la emulsin sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, colocar un cubreobjetos y visualizar a x400.
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4.3.12 Sistemas comerciales multipruebas Existen en el mercado numerosos sistemas o equipos multipruebas bioqumicas con el fin de conseguir una mayor rapidez en la identificacin de algunas bacterias. Estos sistemas pueden ser manuales o estar automatizados. Sistemas comerciales manuales o galeras multipruebas. Se trata de celdillas aisladas con un sustrato liofilizado que se inoculan individualmente y que permiten realizar simultneamente entre 10 y 50 pruebas bioqumicas. Los resultados de las pruebas se expresan de forma numrica (los resultados de las pruebas se agrupan de tres en tres, de manera que el resultado de cada tro de pruebas queda reducido a un dgito). Cada especie est definida por un cdigo numrico, resultado de la codificacin de las reacciones a las pruebas que se hubieran utilizado. Para codificar el dgito de un tro de pruebas se establece el siguiente sistema: o o o o Si una prueba es negativa se asigna un valor 0 a la prueba. Si la primera prueba es positiva se asigna un valor de 1. Si la segunda prueba es positiva se asigna un valor de 2. Si la tercera prueba es positiva se asigna un valor de 4.
El cdigo numrico se obtiene sumando los valores de las tres pruebas. Los lmites inferior y superior del cdigo son 0 y 7 respectivamente. Ante un microorganismo problema, se busca el cdigo numrico y se comprueba a qu bacteria pertenece. Algunos de los sistemas comerciales disponibles en el mercado son: API (bioMrieux), Enterotube (BBL), Oxi/Ferm Tube (BD), RapID systems y MicroID (Remel), Biochemical ID systems (Microgen), etc. Sistemas comerciales automatizados. Hay en el mercado galeras multipruebas, como las descritas en el apartado anterior pero cuya inoculacin, incubacin y lectura se efectan de modo automatizado. Tambin hay paneles en los que adems de encontrarse los sustratos para el desarrollo de pruebas bioqumicas, se encuentran diversos antimicrobianos a distintas concentraciones, con lo que se realiza simultneamente la identificacin y antibiograma del microorganismo objeto de estudio. Existen distintos paneles para distintos grupos de microorganismos. La inoculacin y la lectura de estos paneles se suele hacer de forma automtica, incorporndose los datos obtenidos en un ordenador, el cual proporciona con un ndice alto de fiabilidad, la identificacin del microorganismo. Algunos de los sistemas de paneles comerciales disponibles de uso ms extendido son: MicroScan, Vitek, ATB, Pasco, Wider, Phoenix, etc. A continuacin se detallan los sistemas manuales API para los agentes etiolgicos de las infecciones respiratorias, por su extensiva aplicacin en los laboratorios de rutina de Microbiologa.
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Api NH Esta prueba nos permite la identificacin definitiva de las colonias que han crecido en Agar Chocolate, Thayer Martin o similares y que en la tincin de gram presentan aspecto de diplococo o cocobacilo gramnegativo. El Api NH banda consta de 10 microtubos que contienen sustratos deshidratados que permiten el desempeo de las 12 pruebas de identificacin (reacciones enzimticas o de fermentacin de azcar), as como la deteccin de una penicilinasa (especial inters en Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Branhamella catarrhalis (Moraxella catarrhalis) y Neisseria gonorrhoeae). Las reacciones se producen durante la incubacin dando lugar a cambios de color espontneos o bien tras la adicin de reactivos. Despus de un perodo de incubacin de 2 horas a una temperatura de 35-37 o o C, la lectura de las reacciones ese realiza visualmente y la identificacin se obtiene mediante la consulta de la lista de perfiles. PEN ODC URE LIP PAL -GAL ProA GGT IND Azcares La Penicilasa acta sobre la Penicilina G. La Ornitina descarboxilasa acta sobre la ornitina y se forman CO2 y aminas. La ureasa hidroliza la urea liberando amoniaco que forma carbonato de amonio. La lipasa acta sobre al 5-bromo-3-indoxilocaprato. La fosfatasa alcalina acta sobre la para-nitrofenil fosfato de 2CHA. La galactosidasa acta sobre la para-nitro-fenil BD-galactopiransido. La arilmidasa prolina hidroliza la prolina-4-metoxinaftilamida . La glutamil transferasa acta sobre la -glutamil-4-metoxinaftilamida . La triptofanasa hidroliza y desamina el triptfano con produccin del indol, cido pirvico y amoniaco. El reactivo de Kovacs reacciona con el indol. De la fermentacin de los azcares se liberan cidos.
Procedimiento (Tabla 8) o o Abrir una ampolla de Medio NaCl 0,85% (2 ml) con el protector de ampolla. Con el uso de un hisopo, recoger algunas colonias bien aisladas y preparar una suspensin con una turbidez equivalente a 4 McFarland, asegurndose de que est bien mezclado. Distribuir la suspensin bacteriana preparada en las cpulas, evitando la formacin de burbujas (inclinar la tira ligeramente hacia delante y coloque la punta de la pipeta en el lado de la cpula). o o o Llene el tubo de la parte de los primeros 7 microtubos (PEN a URE): alrededor de 50 microlitros. Llene el tubo y la cpula de los ltimos 3 microtubos LIP / Proa, PAL / GGT, GAL / IND: cerca de 150 l, evitando la formacin de un menisco convexo.
Cubra las primeros 7 pruebas (PEN a URE) con aceite mineral (pruebas subrayadas). La calidad de la obturacin es muy importante: los tubos que no estn suficientemente o excesivamente llenos pueden causar que los resultados sean falsos positivos o falsos negativos. Cierre la caja de incubacin.
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Se incuba durante 2 horas a 35-37C en condiciones aerobias.
Lectura (Tabla 8) o o o o Tenga en cuenta todas las reacciones espontneas (PEN a GAL). Aada 1 gota de reactivo B ZYM para microtubos 8 y 9: LIP / Proa y PAL / GGT. Aada 1 gota de reactivo a JAMES microtubo 10: GAL / IND. Espere 2 minutos y luego leer las reacciones y registrarlo en la hoja de resultados. o o Si la reaccin es positiva LIP (pigmento azul), interpretar la reaccin de ProA como negativas, si el reactivo B ZYM se ha aadido o no. Si, despus de un perodo de incubacin de 2 horas, varias reacciones (fermentacin, penicilinasa) estn en duda, volver a incubar la banda durante 2 horas y leer las reacciones de nuevo (las pruebas enzimticas no se deben volver a leer en este caso).
PEN
+ azul amarillo
GLU
amarillo rojo
FRU
amarillo rojo
MAL
amarillo rojo
SAC
amarillo rojo
ODC
azul amarillo
URE
rosa amarillo
LIP
azul pp. incoloro
PAL
amarillo incoloro
GAL
amarillo incoloro
ProA
+ amarillo incoloro
GGT
amarillo incoloro
IND
rojo incoloro
Tabla 8. Api NH Api Coryne La galera API CORYNE es un sistema estandarizado para la identificacin en 24 horas de bacterias corineformes, utillizando ensayos miniaturizados. El sistema api coryne est compuesto por una galera de 20 microtubos (cpula y tubo) que contienen substratos deshidratados para la deteccin de actividades enzimticas o de fermentacin de azcares. Los ensayos enzimticos se inoculan con una suspensin densa que rehidrata los substratos enzimticos, las reacciones que se producen mediante la incubacin se traducen en cambios de color, bien espontneos o bien mediante la adicin de reactivos. Despus de la incubacin de la galera, la lectura de estas reacciones se lleva a cabo con una tabla de identificacin.
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NIT PIZ PyrA PAL -GUR -GAL -GLU BNAG ESC URE GEL O Azcares CAT
Reduccin de Nitrato a Nitrito: se aade cido sulfanlico y -naftilamina. Pyrazinamidasa Pyrrolidonyl arylamidasa La fosfatasa alcalina acta sobre la para-nitrofenil fosfato de 2CHA. Glucuronidasa Galactosidasa Glucosidasa N-acetil-b glucosaminidasa La esculina es hidrolizada por la Glucosidasa. Ureasa La gelatina es hidrolizada por una proteasa. Control de la fermentacin de azcares. De la fermenetacin de los azcares se liberan cidos. La catalasa hidroliza el H2O2 en H2O y O2 gas.
Procedimiento (Tabla 9) o o o o o o o o o Abrir una ampolla de API Suspension Medium. Con la ayuda de un escobilln recoger el cultivo previamente preparado, y se realiza una suspensin de 6 de Mc Farland. Se rellenan los 11 primeros ensayos desde el pocillo NIT a GEL. El ensayo GEL se llena completamente, es decir el tubo y la cpula. El ensayo URE se llena solamente el tubo. Para los ltimos 9 test de la tira, transferir el resto de la suspensin bacteriana a una ampolla de API Suspension Medium. Mezclar bien. Distribuir la nueva suspensin dentro de los tubos solo para los test del O al GLYG. Los ensayos marcados con una raya como son URE Y GLYG en la cpula llevan aceite de parafina. A continuacin incubar 24 horas en aerobiosis.
NIT + Rojo Sin color O + Amarillo Rojo
PYZ Marrn Sin color GLU Amarillo Rojo
PyrA Naranja Sin color RIB Amarillo Rojo
PAL Prpura Sin color XYL Amarillo Rojo
GUR Azul Sin color MAN Amarillo Rojo
GAL Prpura Sin color MAL Amarillo Rojo
GLU Prpura Sin color LAC Amarillo Rojo
BNAG Marrn Sin color SAC Amarillo Rojo
ESC Negro Sin color GLYG
URE Rosa Amarrillo CAT
GEL Difusin No Difusin
Amarillo Burbujas Rojo No Burbujas
Tabla 9. Api Coryne
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Lectura (Tabla 9) o o o Ensayo NIT: aadir 1 gota de NIT 1 Y NIT 2. Ensayo PYZ: aadir 1 gota de PYZ. Ensayo PyrA, PAL, GUR, GAL, GLU, BNAG: aadir 1 gota de ZYM A Y 1 gota ZYM B.
Esperar 10 minutos. Leer las reacciones consultando las tablas de identificacin. La identificacin definitiva se obtiene a partir de un perfil numrico. Api 20 A Esta prueba nos permite la identificacin definitiva de las colonias que slo han crecido en los medios de cultivo anaerobios. La prueba est compuesta por 20 microtubos que contienen sustratos deshidratados. Estos se inoculan con una suspensin bacteriana que reconstituye los sustratos. Las reacciones que se producen durante la incubacin se traducen en cambios de color, espontneos o provocados mediante la adicin de reactivos. IND URE ESC GEL Azcares CAT La triptofanasa hidroliza y desamina el triptfano con produccin del indol, cido pirvico y amoniaco. El reactivo de Kovacs reacciona con el indol. La ureasa hidroliza la urea liberando amoniaco que forma carbonato de amonio. La esculina es hidrolizada por la Glucosidasa. La gelatina es hidrolizada por una proteasa. De la fermentacin de los azcares se liberan cidos. La catalasa hidroliza el H2O2 en H2O y O2 gas.
Procedimiento (Tabla 10) o o o o o o Abrir la ampolla de Api 20A Medium. Inocular las colonias puras obtenidas en el Agar Brucella, con una torunda, en la ampolla de Api 20A Medium. Alcanzar una turbidez 3 McFarland. Para mantener cierta anaerobiosis conviene evitar la introduccin de aire durante la homogenizacin del inculo. Con una pipeta Pasterur estril, inocular la galera con la suspensin obtenida (evitando la formacin de burbujas al inclinar ligeramente la galera). Para la prueba GEL, llene completamente toda la cpula. Para la prueba IND, terminar de llenar la cpula en aceite mineral para evitar la evaporacin. Incubar en anaerobiosis a 36C, hasta 48.
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Lectura (Tabla 10) o El prpura bromocresol (BCP) de cada una de las cpulas puede resultar asimilado por la bacteria en algunos pocos casos. Si es as agregue una gota de BCP a los tubos que contengan carbohidratos y estn incoloros. Prueba de IND. Agregar gota de xilol. Mezclar y esperar 3 minutos. Luego agregar una gota de reactivo de EHR. Leer 5 minutos despus. De acuerdo con los resultados obtenidos, obtenga el perfil numrico y proceda a identificar la bacteria. URE Rojo Amarillo AZCARES Amarillo Rojo GEL Difusin No Difusin Tabla 10. Api 20 A Api C AUX Se trata del sistema de identificacin definitivo de levaduras. Se realiza en aquellas colonias que han crecido en la placa de sabouraud y el test de fermentacin ha resultado negativo. Procedimiento La galera Api 20 c AUX se compone de 20 cpulas que contienen substratos deshidratados y permiten realizar 19 ensayos de asimilacin. Las cpulas se inoculan con un medio semi agar y las levaduras crecen solamente si son capaces de utilizar el substrato correspondiente. Las lecturas se efectan por comparacin con los testigos de crecimiento. Se rene fondo y tapa de la galera y humedecer el fondo con 5ml de agua destilada para crear una atmosfera hmeda se introduce la galera en la cmara de incubacin y procedemos a preparar el inculo. Se abre una ampolla de api NACL 0,85% mdium, y se prepara una suspensin de levaduras con una turbidez 2 de Mcfarland (esta suspensin debe ser preparada justo despus de su preparacin), a continuacin se llenan las cpulas evitando la formacin de burbujas, volver a cerrar la cmara de incubacin e incubar de 48 a 72 horas a 30C. Lectura Pasado el tiempo de incubacin, observar el crecimiento, de forma que con una mayor turbidez que la del control nos indicara una reaccin positiva que se anota en la hoja de resultados. La identificacin se obtiene a partir de un perfil numrico. ESC Marrn Amarillo AZUCARES Amarillo Rojo CAT Burbujas No Burbujas
o o
oIND + Rojo Amarillo
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4.3.13 Aglutinacin de legionella: Legionella Latex Test Kit El mtodo consiste en una reaccin antgeno-anticuerpo mediante una aglutinacin en porta, utilizando como reactivo partculas de ltex azul sensibilizadas con anticuerpos especficos que aglutinan visiblemente en presencia de antgenos de la pared celular de Legionella, tras un minuto de contacto. Permite la diferenciacin de L. pneumophila serogrupo 1, L. pneumophila serogrupos 2 a 14 y Legionella spp. que incluye otras 7 especies diferentes. La aglutinacin se puede realizar directamente de colonias o preparando una suspensin bacteriana en solucin salina 0,85%. Procedimiento o o o o Atemperar los reactivos de ltex y las tarjetas de reaccin. Dispensar 1 gota de cada reactivo de ltex sobre 4 crculos de la tarjeta de reaccin, en el borde del pocillo. Aadir a cada pocillo 1 gota de tampn diluyente, en el borde del pocillo. No mezclar con el reactivo de ltex en este punto. Recoger una pequea cantidad de crecimiento bacteriano (o una colonia) y emulsionar suavemente con el tampn de dilucin (se recomienda una suspensin ligera). Mezclar suavemente con el ltex cubriendo toda el rea del pocillo. Repetir los puntos 4 y 5 para cada reactivo de ltex. Rotar la tarjeta de reaccin suavemente, durante 1 min.
o o o Lectura o
Se considera un resultado positivo cuando aparece aglutinacin visible (no emplear lupa para la lectura) de las partculas de ltex azul en menos de 1 min. de contacto, y no hay aglutinacin con el ltex control. Una reaccin positiva indica que se han detectado los antgenos especficos L. pneumophila serogrupo 1, de L. pneumophila serogrupos 2 a 14, de Legionella spp. Se considera un resultado negativo cuando no aparece aglutinacin visible con los reactivos de ltex y tampoco hay aglutinacin con el ltex control, tras 1 min. de contacto. Una reaccin negativa indica que no se han detectado los antgenos especficos contenidos en el reactivo de ltex. Se considera un resultado no interpretable cuando aparece aglutinacin con el ltex control, lo que indica que el cultivo es autoaglutinable.
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Limitaciones del procedimiento o Segn el fabricante, se puede dar reaccin cruzada entre los serogrupos 1 y 9 de L. pneumophila, por lo que algunas cepas podran presentar aglutinacin con ambos reactivos de ltex. Los cultivos envejecidos pueden producir reacciones filamentosas que dificultan la interpretacin de los resultados. La aglutinacin con partculas de de ltex se considera una identificacin presuntiva, que puede ser til cuando se identifican colonias procedentes de muestras de agua, pero que, en el caso de la investigacin de un brote, requiere una confirmacin por otro mtodo, como el que se describe a continuacin. Un resultado negativo con todos los reactivos de ltex no excluye que el cultivo pertenezca al gnero Legionella, ya que los reactivos de ltex no incluyen los serogrupos 15 y 16 de L. pneumophila, ni las restantes 40 especies.
o o
4.3.14 Test del iodo-nitro-trifenil-tetrazolio (INT) La confirmacin de la especie de M. pneumoniae se basa en la capacidad para reducir el INT, que es incoloro, a rojo formazn. La prueba, se realiza inundando las colonias con 2 ml de una solucin al 0,21% de INT e incubando la placa a 37C durante 20-60 minutos, al cabo de los cuales las colonias aparecern teidas de color rojo granate.
4.4 Antibiogramas
El antibiograma define la actividad in vitro de un antibitico frente a un microorganismo determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una bacteria o poblacin bacteriana. Por el momento no existe un mtodo universal que reproduzca las condiciones en las que se encuentra un microorganismo produciendo una infeccin y, por tanto, la situacin ideal en las que deben desarrollarse las pruebas de sensibilidad. En este manual describimos los mtodos bsicos ms utilizados y aceptados para el estudio de la sensibilidad, as como los criterios para su interpretacin, segn recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). A continuacin se detallan los mtodos de mayor aplicacin en los laboratorios de rutina de microbiologa, y adaptados a los agentes etiolgicos de las infecciones respiratorias.
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Difusin en disco: Kirby-Bauer Mtodo Cultivo puro de bacterias no exigentes.
Difusin en tiras: E-test Muestras primarias. Cultivo puro de bacterias exigentes.
Micro-dilucin en caldo Cultivo puro de bacterias no exigentes.
Dilucin en agar
Muestra
Aislamientos de bacterias exigentes, vg: anaerobias.
Medio
Slido en placa: Mueller-Hinton Masiva. 5reposo.
3-5 colonias: (Incubar en Medio liq) 0.5 Mf. Slido en placa: Caldo en pocillos: Mueller-Hinton o Mueller-Hinton y especficos. modificaciones. Masiva. 15reposo. 5x10 UFC/pocillo
4
Slido en placa: Mueller-Hinton o especficos. 1 gota: 4 Aerobios: 10 UFC Anaerobios: 5 10 UFC Replicador Steers (1 placa / 1 concentracin) x n diluciones Med Atb Placa 20 ml 90 19:1 mm medio: atb CMI y CMB Cuantitativo
Siembra
Antibitico
1 Disco: 1 concentracin No dilucin Discos Placa (N) (mm) 6 100 12 150
1 Tira: 15 diluciones Tiras (N) 1 6 Placa (mm) 100 150
(1 pocillo / 1 concentracin) x n diluciones Diluciones seriadas
Lectura Comparacin halos inhibicin con CLSI-NCCLS: S/I/R Cualitativo Aplicacin Ventaja Inconveniente Sencillez Barato No CMI Sencillez Slo aprox. a CMI Automatizado Poco flexible Caro Exactitud De referencia Laborioso Interseccin inhicin con tira: Aprox. CMI Semi-cuantitativo CMI Cuantitativo
Tabla 11. Distintos mtodos de estudio de la sensibilidad bacteriana a los antibiticos
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Ilustracin 5. Distintos mtodos de estudio de la sensibilidad bacteriana a los antibiticos: 1) Difusin en discos. A-F son los antibiticos con sus halos de inhibicin, segn los cuales la bacteria sembrada es Sensible (S), Resistente (R) o Intermedia (I). 2) Difusin en tira. A es el antibitico de concentracin creciente hacia arriba. La Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) corresponde al punto de interseccin del halo de inhibicin con la tira, la bacteria sembrada es sensible a partir de esa concentracin. 3) Microdilucin en caldo. A-D son los antibiticos a distintas diluciones (x3, x2, x1) sobre los que se ha inoculado una bacteria. La CMI corresponde al primer pocillo del panel en que no se observa crecimiento bacteriano. 4) Dilucin en agar. A es el antibitico que se ha diludo a distintas concentraciones en cada placa (x3, x2, x1). Posteriormente se han sembrado varias bacterias en cada placa. La CMI es la concentracin que impide el desarrollo de la colonia, y la Concentracin Mnima Bactericida (CMB) es la que produce la muerte bacteriana. 4.4.1 Antibiograma de muestras primarias Est indicado para muestras respiratorias (aspirado traqueal, broncoaspirado, secreciones bronquiales, lavado broncoalveolar, cepillo telescopado), de pacientes con neumona asociada a ventilacin mecnica. Para conocer el perfil de sensibilidad a antibiticos en las primeras 18-24 h y poder instaurar cuanto antes la terapia antimicrobiana. Mtodo: Epsilon-test directo Se prepara una suspensin 0,5 Mc farland a partir de la muestra, mojamos un escobilln estril y se procede a sembrar el inculo en masivo en placa de Muller-Hinton: deslizar el escobilln por
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la superficie del agar tres veces, rotando la placa unos 60 cada vez y pasndola por ltimo por la periferia del agar para conseguir una siembra uniforme. Dejar absorber el inculo de 10 a 15 minutos. A continuacin se colocan las tiras E-test sobre su superfice, orientadas hacia arriba y con la concentracin mxima cercana al extremo de la placa de petri. Se utilizarn los siguientes antimicrobianos, salvo que el microbilogo considere la necesidad de incluir otros antibiticos adicionales: Oxacilina, Tobramicina Amikacina, Ciprofloxacino, Ceftazidima Cefepima, Imipenem, Piperacilina/Tazobactam. Se incubarn las placas a 35C durante 18-24 horas. Lectura Despus de la incubacin se puede observar una zona de inhibicin elipsoidal y simtrica. La CMI para cada antibitico ser el valor obtenido en el punto en el que el extremo de inhibicin intersecciona con la tira. 4.4.2 Antibiograma de anaerobios No se recomienda realizar, de una forma rutinaria, ensayos de sensibilidad a todos los aislamientos de bacterias anaerobias. Mtodo Dilucin en agar. Permite estudiar la sensibilidad de muchas bacterias a la vez. A partir de un cultivo en placas de agar Brucella enriquecido para anaerobios, se suspenden de 3 a 5 colonias en un caldo de tioglicolato, que se incuba entre 6 y 24 horas o hasta que alcance una turbidez adecuada. La turbidez se ajusta a 0,5 McFarland mediante la adicin de caldo Brucella. La inoculacin en la superficie del agar se hace con la ayuda de un replicador de Steers. El inculo final para anerobios debe ser, aproximadamente, de 105 UFC por punto de inoculacin. Se recomienda, tanto al principio como al final de cada serie, inocular dos placas control sin antibitico, una se incuba en una atmsfera con un 5% de CO2 y la otra en anaerobiosis, durante 42-48 horas, con el fin de comprobar la viabilidad y pureza del inculo. Se debe empezar a inocular siempre por la concentracin ms pequea de cada antibitico. Incubar 42-48 horas en anaerobiosis a 35-37C. Lectura La Concentracin Mnima Inhibitoria se considera como aquella concentracin de antibitico en la que se observa una reduccin marcada en el crecimiento de la bacteria al compararlo con el crecimiento de la placa control, como es el cambio a una fina pelcula, o a numerosas colonias pequeas, o bien a una o varias colonias de tamao normal.
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4.4.3 Antibiograma de Streptococcus Mtodo Difusin con discos en agar. Se prepara una suspensin 0.5 Mc farland, se moja un escobilln estril y se procede a sembrar el inculo en masivo, en placa de Muller-Hinton suplementado con 5% de sangre de carnero. Dejar secar de 3 a 5 minutos antes de depositar los discos de los antibiticos seleccionados en cada laboratorio de Microbiologa. Se incuban las placas en atmosfera CO2 de 16- 20 horas. Lectura Medir los halos de inhibicin del crecimiento alrededor de los discos de antibiticos en milmetros, y compararlos con las sensibilidades establecidas en las Normas CLSI - NCCLS. (Tablas 12 y 13).
Antibitico Clindamicina Cloranfenicol Eritromicina Rifampicina Penicilina Vancomicina Carga Microgramos 2 30 15 5 1 (Oxacilina) 30 Resistente mm 15 20 15 16 14 Intermedio mm 16-18 16-20 17-18 15-16 Sensible mm 19 21 21 19 20 17
Tabla 12. Interpretacin de sensibilidades para S. pneumoniae

Antibitico Cefotaxima Ceftriaxona Penicilina G Tetraciclinas Vancomicina Carga 30 microgr. 30 microgr 10 U 30 microgr. 30 microgr. Resistente mm 14 13 14 18 14 Intermedio mm 15-23 14-23 15-23 19-22 15-16 Sensible mm 24 24 24 23 17
Tabla 13. Interpretacin de sensibilidades para Streptococcus beta hemolticos 4.4.4 Antibiograma de gonococos Mtodo Difusin con discos en agar. Se prepara una suspensin 0,5 Mc farland, con, se moja escobilln estril y se procede a sembrar el inculo en masivo, en placa de agar chocolate. Se colocan sobre la placa los antibiticos seleccionados en cada laboratorio de Microbiologa. Se incuban las placas en atmosfera CO2 de 16- 20 horas.
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Lectura Medir los halos de inhibicin del crecimiento alrededor de los discos de antibiticos en milmetros, y compararlos con las sensibilidades establecidas en las Normas CLSI - NCCLS. (Tabla 14).
Antibitico Penicilina G Ceftriaxona Tetraciclina Ciprofloxacino Carga 10 U 30 microgr 30 microgr. 5 microgr Resistente mm 26 13 30 27 Intermedio mm 27-46 14-34 31-37 28-40 Sensible mm 47 35 38 41
Tabla 14. Interpretacin de sensibilidades para N. gonorrheae 4.4.5 Antibiograma de Haemophilus Mtodo y procedimiento Se prepara una suspensin 0.5 Mc farland, se moja el escobilln y se siembra el inculo en masivo, en placa de Haemophilus test mdium o HTM (Mueller Hinton suplementado con factor X, factor V y extracto de levadura). Seleccionamos los antibiticos especficos del gnero a los que enfrentar la cepa y se colocan los discos sobre la placa. Se incuba en atmosfera CO2 de 16- 20 horas. Lectura Igualmente hacer la lectura segn las Normas CLSI - NCCLS. (Tabla 15).
Antibitico Ampicilina Amox+Clav Cefuroxima Cefpodoxime Claritromicina Aztreonam Cloranfenicol Ciprofloxacino Carga microgramos 10 20/10 30 10 15 30 30 5 Resistente mm 18 19 16 17 10 15 25 15 Intermedio mm 19-21 17-19 18-20 11-12 16-21 26-28 16-20 Sensible mm 22 20 20 21 13 22 29 21
Tabla 15. Interpretacin de Sensibilidades para Haemophilus 4.4.6 Panel de Gramnegativos Los paneles gram negativos estn diseados para determinar la sensibilidad a antimicrobianos y/o la identificacin a nivel de especie de bacilos gram negativos aerobios y anaerobios facultativos.
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Despus de la inoculacin y rehidratacin con una suspensin estandarizada del microorganismo e incubacin a 35C un mnimo de 16 horas, la concentracin mnima inhibitoria (CIM) para el microorganismo se determina observando la concentracin ms baja de antimicrobiano que muestra inhibicin del crecimiento. Mtodo Microdilucin en caldo. Turbidez del inculo estandarizada 0.5 Mc Farland. Preparacin del inculo La tcnica de turbidez estandarizada se recomienda para la inoculacin directa de todos los bacilos aerobios gram negativos. o Usando una torunda esterilizada o asa bacteriolgica, tocar superficie de colonias 4-5 grandes 5-10 pequeas, morfolgicamente similares, bien aisladas y procedente de una placa de agar no selectivo de 18-24 horas. Mezclar con 3ml de agua para inculo debe de ser esterilizada y destilada, la turbidez debe ser equivalente a 0,5 Mc Farland. Agitar la suspensin. Con la ayuda de una pipeta se transfiere 0,1 ml de esta suspensin en 25 ml de agua para inculo con PLURONIC y mezclar.
o o o
Inoculacin del panel La inoculacin del panel se realiza usando el sistema RENOK, debiendo lograrse una concentracin final de 3-7 x 10 CFU/ml, para verificar la integridad del microorganismo, se puede hacer la prueba de pureza en placa agar maconkey y se deja incubar hasta el da siguiente, si en la placa crecen dos o ms colonias habra que repetir el proceso. Antes de incubar el panel cubrir los pocillos que estn subrayados con 3 gotas de aceite mineral. Incubar el panel de 16-20 horas a 35C sin CO2. Revelado panel despus de la incubacin o Se aade una gota pocillo NIT (REACTIVO NIT 1 Y NIT 2), la reduccin de Nitrato a Nitrito se detecta por la formacin de un color rojo, de forma de los estreptococos son nitrato negativos mientras que la mayora de los estafilococos son nitrato positivos. Igualmente se aade 1 gota en el pocillo VP (REATIVO VP1 Y VP2) VOGES-PROSKAUER, la reaccin dara como resultado color rojo. Las especies que llevan a cabo la fermentacin butanodilica de la glucosa aumentan la acetona en el medio. Cuando se aade alfanaftol en medio alcalino (KOH), la acetona se convierte en diacetilo que reacciona formandose un color rojo.
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o Se aade al pocillo TDA 1 gota. Si la bacteria tiene la triptfanodesaminasa,

transformar el triptfano en indolpirvico y amoniaco. El cloruro frrico, en caso de que haya cido indolpirvico originar una coloracin pardo-rojiza. o Se aade al pocillo IND 1 gota. Existen bacterias que producen triptofanasa que convierte el triptfano en indol. La presencia de indol se ensaya aadiendo dimetilaminobenzaldehdo.
Lectura Se realiza de forma automtica en el equipo autoSCAN-4 System. 4.4.7 Panel de Grampositivos Los paneles positivos microScan estn diseados para determinar la sensibilidad a agentes antimicrobianos y/o la identificacin a nivel de especie de aerobios facultativos de crecimiento rpido y de cocos gram positivos, algunos cocos aerobios exigentes gram positivos y Listeria monocytogenes. Mtodo, preparacin del inculo e inoculacin del panel Igual que para los Gramnegativos. nicamente, en la inoculacin del panel, la prueba de pureza se ha de hacer en placa de agar sangre. Revelado panel despus de la incubacin o o o Se aade una gota pocillo NIT (REACTIVO NIT 1 Y NIT 2), la reduccin de Nitrato a Nitrito se detecta por la formacin de un color rojo. Igualmente se aade 1 gota en el pocillo VP (REATIVO VP1 Y VP2) VOGES-PROSKAUER, la reaccin dara como resultado color rojo. Se aade una gota de reactivo PYR la reaccin de la peptidasa dara lugar a una reaccin de color rojo. S.pyogenes y Enterococcus poseen la capacidad de hidrolizar el substrato PYR (pirridonil -naftilamida) debido a que poseen la enzima l-piroglutamil aminopeptidasa.
Lectura Se realiza de forma automtica en el equipo autoSCAN-4 System.
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4.5 Cultivos vricos

A) Torunda o tubo en medio para virus, con muestras respiratorias 4.5.1 Virus de la Gripe Los virus de la gripe son capaces de replicarse en diferentes lneas celulares primarias, diploides o continuas, aunque la susceptibilidad a la infeccin es baja en la mayora de ellas. La lnea celular ms comnmente utilizada son las clulas Madin Darby de rin de perro (MDCK): o Las lneas celulares inoculadas con las muestras respiratorias de los pacientes se incuban a 33-35C en presencia de tripsina para asegurar la activacin proteoltica de los virus, durante 4-7 das. La identificacin de la existencia de crecimiento del virus sobre la monocapa de clulas se realiza de modo convencional mediante la observacin del efecto citoptico causado sobre ellas, que consiste en la aparicin de clulas degenerativas y redondeadas que se desprenden de la monocapa. La caracterizacin del virus aislado se efecta por inmunofluorescenia mediante la utilizacin de anticuerpos monoclonales. En ocasiones el efecto citoptico es difcil de apreciar por lo que es necesario disponer de otros mtodos para identificar el crecimiento vrico en los cultivos celulares, como son la hemaglutinacin, la hemadsorcin o la deteccin de antgenos vricos utilizando tcnicas de inmunofluorescencia.
Una de las principales limitaciones del aislamiento de los virus de la gripe es el tiempo necesario de crecimiento e identificacin en cultivo celular. Existen varios mtodos capaces de detectar la presencia de los virus de la gripe de modo ms precoz, entre uno y tres das despus de la inoculacin de la lnea celular y antes de la aparicin del efecto citoptico. El ms comnmente utilizado es el Shell vial: o o Las muestras son directamente centrifugadas sobre la monocapa celular para facilitar la adherenia y penetracin vrica. Posteriormente, a las 24-48 horas se detecta la presencia de protenas vricas mediante inmunofluorescencia.
Los virus de la gripe tambin pueden aislarse tras inocular la muestra en la cavidad alantoidea de huevos de gallina embrionados, ya que estos virus se replican profusamente en las clulas de la cavidad alantoidea del huevo. Los virus de la gripe C, sin embargo, solamente crecen en la cavidad amnitica de los embriones de pollo. o Los huevos inoculados se incuban a 33-35C durante tres das para los aislados de virus de la gripe procedentes de mamferos, y a 37C para los aislados aviares de virus de la gripe A.
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Una vez finalizada la incubacin, se deben analizar por hemaglutinacin los fluidos amnitico y alantoideo en busca de la presencia de actividad vrica.
4.5.2 Otros virus De forma esquemtica se representan otros medios de cultivo para el resto de los virus del tracto respiratorio: virus sincicial respiratorio (VRS), metapneumovirus humano (hMPV), parainfluenza, adenovirus y rinovirus. (Tabla 16).
Virus respiratorio VRS Tipo de lnea celular Hep-2 glutamina en mantenimiento, 50-75% confluencia, pH 7,2-7,4 Clulas primarias de rin de mono Fibroblastos humanos Clulas terciarias de rin de mono LLC-MK2 VERO Hep-2 LLC-MK2 VERO NCI-H292 medio con tripsina PIV1 y 2 no para PIV3 Hep-2 HeLa Fibroblastos He-La Observacin de efecto citoptico 3-7 das
hMPV
3-7 das
Parainfluenza humano Adenovirus Rinovirus
Ms de 10 das
Tabla 16. Virus respiratorios, lneas celulares y tiempo de observacin de efectos citopticos
4.6 Pruebas de deteccin rpida de antgeno

4.6.1 Frasco de boca ancha y tapn de rosca, con orina Antgeno de Streptococcus pneumoniae A) Inmunocromatografa (ICT) Para la deteccin del antgeno neumococo se dispone de la prueba BinaxNOW. Esta prueba es un ensayo rpido inmunocromatrogrfico in vitro para la deteccin del antgeno estreptococus pneumoniae en la orina de pacientes con neumona y en el lquido cefalorraqudeo de pacientes con meningitis. Tienen por objeto contribuir al diagnstico de ambas la neumona neumoccica y la meningitis neumoccica junto con cultivos y otros mtodos. Es especialmente importante la rapidez de diagnstico que ofrece esta tcnica ya que el avance de la enfermedad leve al coma puede ocurrir en pocas horas, por lo que el diagnstico y el tratamiento antimicrobiano deben ser inmediatos. Entre el 20% y el 30% de los pacientes con meningitis neumoccica mueren, frecuentemente incluso despus de varios das de terapia
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antimicrobiana apropiada. La mortalidad es an mayor entre los pacientes muy jvenes y muy ancianos. Para la deteccin del antgeno de S. pneumoniae en orina con la tcnica de ICT no se recomienda utilizar tcnicas de concentracin, debido a que pueden aumentar los resultados positivos de difcil interpretacin. Se aconseja realizar la tcnica con orina directa sin concentrar y recin emitida. La tcnica consiste en una ICT que se realiza sobre una membrana de nitrocelulosa con anticuerpos de conejo anti-S. pneumoniae adsorbidos y conjugados, frente al polisacrido C (PnC) soluble de las muestras, que es comn para todos los serotipos de S. pneumoniae. La unin de los anticuerpos con los antgenos neumoccicos solubles en la orina forma complejos antigeno-conjugado que son capturados por los anticuerpos anti-S. pneumoniae inmovilizados formando partculas visibles sobre un soporte fibroso inerte, que se manifiestan como una banda de color rosa-prpura. Procedimiento (Ilustracin 6) o o o o o Mojar una torunda en la muestra (en nuestro caso, orina), retirar. Insertar la torunda en el orificio inferior del panel derecho del dispositivo y empujar hacia arriba hasta que la punta de la torunda se vea en el orificio superior. Aadir 3 gotas de reactivo A, que es una solucin tampn, que se encuentra en el envase con cuentagotas. Cerrar el dispositivo, lo que pone la muestra en contacto con la tira de prueba. Leer el resultado en la ventana a los 15 minutos: El antgeno neumoccico presente en la muestra reacciona y se liga al anticuerpo conjugado anti-S. Pneumoniae. Los complejos de antgeno-conjugado resultantes son capturados por el anticuerpo anti-S pneumoniae inmovilizado, y se forma la lnea de muestra. El anticuerpo control inmovilizado captura el conjugado anti-especies, y forma la lnea de control.
Ilustracin 6. Fundamento de la tcnica Inmunocromatografa directa

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Interpretacin o o o La prueba se interpreta mediante la presencia o ausencia de lneas detectables de la gama rosa/violeta. Resultado negativo: se detecta solo la lnea control, lo que indica que no se ha detectado antgeno de S. pneumoniae en la muestra. Resultado positivo: se detecta tanto la lnea de muestra como la lnea control. Toda banda visible es positiva. Las muestras con bajo contenido de antgeno pueden dar un color ms tenue. Resultado no vlido: si no aparece la lnea de control, con o sin presencia de la lnea de muestra.
Anotaciones La tcnica de inmunocromatografa sobre membrana ofrece ventajas frente a otras tcnicas de deteccin de antgenos solubles en orina, como la contrainmunoelectroforesis (CIE), como son: o o o o Mayor rapidez al obtener resultados en 15 minutos. Menor complejidad. Menor equipamiento Detectar todos los serotipos, incluidos los serotipos 7 y 14, que no son detectables por CIE. La tcnica de ICT se utiliza con mayor frecuencia en los laboratorios clnicos que la CIE. La interpretacin debe realizarse con cautela. En los nios, la sensibilidad y especificidad disminuye, al ser, con frecuencia, portadores de este microorganismo, por lo que algunos autores no aconsejan su utilizacin sistemtica. Los resultados negativos podran interpretarse como ausencia de neumona neumoccica, pero los positivos son difciles de interpretar.
Limitaciones Las limitaciones que se deben conocer para realizar una buena interpretacin de los resultados son las siguientes: o o o o La antigenuria se puede detectar al inicio de los sntomas y hasta un mes ms tarde. Incluso en algunos casos la duracin de excrecin del antgeno es mayor. En adultos la sensibilidad es de aproximadamente 70%. En pacientes con EPOC sin exacerbaciones puede detectarse antgeno neumoccico en orina. En nios la especificidad disminuye, posiblemente por la eliminacin del antgeno en orina de nios portadores de S. pneumoniae en orofaringe, especialmente en nios menores de 2 aos.
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La vacuna frente a S. pneumoniae puede producir resultados falsos positivos dentro de los 5 das siguientes a la vacunacin.
Antgeno de Legionella pneumophila Para aumentar la sensibilidad de los ensayos, es preferible trabajar con orinas previamente concentradas mediante ultrafiltracin selectiva o por ultrafiltracin-centrifugacin. Tambin es recomendable trabajar con orinas hervidas para eliminar sedimentos y evitar falsos positivos. Ambos procesos se realizarn antes de comenzar cualquiera de los ensayos. En caso de no disponer de sistemas de concentracin, se proceder con la orina sin concentrar. A) Inmunocromatografa (ICT) BinaxNOW El ensayo de ICT BinaxNOW es una tcnica de diagnstico rpido de L. pneumophila serogrupo 1, que permite estudiar muestras aisladas o muchas muestras simultneamente. Consiste en una membrana de nitrocelulosa donde estn adsorbidos en diferentes lneas anticuerpos frente a L. pneumophila serogrupo 1, formando la lnea de muestra, y anticuerpos anti-conjugado, formando la lnea control. Por otro lado, los anticuerpos conjugados con partculas de oro coloidal se encuentran desecados sobre un soporte inerte. El conjugado as preparado y la membrana de nitrocelulosa se combinan formando la tarjeta de reaccin. Dicha tarjeta contiene una abertura donde se inserta el escobilln con la muestra. En el caso de muestras que contengan antgeno de L. pneumophila serogrupo 1, ste ser capturado por el anticuerpo fijado en la lnea de muestra y ser detectado por el anticuerpo conjugado. El anticuerpo anti-conjugado tambin capturar al anticuerpo conjugado formando la lnea control. Procedimiento (Ilustracin 6) o o o o o o Introducir el escobilln para muestras directamente en la orina del paciente. Escurrir adecuadamente el escobilln contra las paredes del recipiente para eliminar el exceso de muestra. Introducir el escobilln en la tarjeta de reaccin. Aadir dos gotas del reactivo A. Cerrar la tarjeta de reaccin. Leer el resultado a los 15 minutos.
Se deben comprobar los controles positivo y negativo incorporados en cada lote de ensayos. Interpretacin o o El test es negativo cuando nicamente se obtiene banda de color rosa en la lnea control. Es positivo cuando se obtiene banda de color en la lnea control y tambin en la lnea de muestra.
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El test no ser vlido si no aparece banda de color en la lnea control, independientemente de lo que ocurra en la lnea de muestra, en cuyo caso se repetir el ensayo.
En muestras muy hemticas la hemoglobina puede interferir en la lectura de las lneas. En estos casos se solicitar nueva muestra. Anotaciones La falta de color en la banda control podra deberse a la adicin de cantidad insuficiente de Reactivo A, por lo que se recomienda aadir este reactivo manteniendo el envase en posicin vertical. No se recomienda utilizar torundas diferentes de las suministradas en el kit. Las torundas control deben manipularse con las mismas precauciones que las muestras. Limitaciones o o El ensayo ha sido validado nicamente para muestras de orina y no para otro tipo de muestras clnicas. Tampoco puede utilizarse con muestras de agua. Un resultado negativo no descarta la posibilidad de una infeccin debida a L. pneumophila serogrupo 1, en la que los niveles de antgeno en orina se encuentren por debajo del lmite de deteccin del ensayo. Un resultado negativo tampoco descartara una infeccin causada por L. pneumophila de otros serogrupos u otras especies del gnero.
B) Enzimoinmunonlisis (EIA) de Biotest El EIA es de tipo sandwich y la presencia de antgeno se revela con anticuerpos policlonales marcados con peroxidasa que reaccionan con L. pneumophila serogrupo 1, as como con el resto de los serogrupos de L. pneumophila y otras especies. Procedimiento (Ilustracin 7)
Ilustracin 7. Fundamento de la tcnica de Enzimoinmunoanlisis directo Dispensar 100 l de los controles negativos en los pocillos B1 y C1, respectivamente, y 100 l del control positivo en el pocillo D1 del soporte. Reservar el primer pocillo para el blanco.
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o o o o
Aadir 100 l de muestra en los pocillos correspondientes. Incubar a aproximadamente 36C en la estufa durante aproximadamente 1 hora en cmara hmeda. Preparar la solucin de lavado 1x, mezclando 1 ml de solucin (500x) con 500 ml de agua desionizada. Conservar a temperatura ambiente hasta 1 semana. Lavar 3 veces todos los pocillos incluido el blanco, con 500 l de solucin de lavado (1x). El lavado se ha de hacer manualmente vertiendo el contenido de los pocillos de la placa y golpeando la placa invertida sobre un papel absorbente limpio. Aadir 100 l de conjugado en todos los pocillos. Incubar en cmara hmeda a 36C en estufa durante aproximadamente 1 hora. Lavar 3 veces todos los pocillos incluido el blanco, con 500 l de solucin de lavado (1x), igual que en el lavado anterior. Aadir 100 l de sustrato en todos los pocillos. Incubar a temperatura ambiente (20-25C) en ausencia de luz durante 10 minutos. Aadir 100 l de solucin de parada en todos los pocillos. Leer las absorbancias a 450 nm, siguiendo las instrucciones del fabricante.
o o o o o o o
Debe incluirse un control positivo y otro negativo en cada ensayo y se procesarn como las muestras. Interpretacin Para que un ensayo sea considerado vlido la lectura de la absorbancia del control negativo deber ser <0,100 y la absorbancia del control positivo >0,600. o o Se consideran positivas aquellas muestras con una lectura de absorbancia superior al valor de corte. Se consideran negativas las muestras con una lectura de absorbancia inferior al valor de corte. El valor de corte se calcula sumando 0,200 a la absorbancia del control negativo. Las muestras con lecturas de absorbancia intermedias, comprendidas entre la absorbancia del control negativo + 0,100 y el valor de corte, se consideran como valores lmite, siendo necesaria la solicitud de una nueva muestra.
Anotaciones Todos los reactivos se deben atemperar antes de su uso. El substrato de color debe conservarse en frasco oscuro ya que es sensible a la luz. La solucin de parada debe manipularse con precaucin ya que contiene cido sulfrico, que puede causar quemaduras. Un lavado insuficiente puede dar lugar a resultados errneos. Si la absorbancia del control negativo es superior a la esperada se deben incrementar el nmero de lavados.
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Limitaciones El ensayo ha sido validado nicamente para muestras de orina y no para otro tipo de muestras clnicas que puedan contener antgeno de Legionella. A pesar de que el ensayo muestra una alta reactividad con distintas especies de Legionella, no garantiza la misma sensibilidad para todas las especies descritas, por lo que un resultado negativo no descarta una infeccin por Legionella. C) Fluorescencia directa (IFA test) de Bio Rad Laboratories Su uso est indicado para la deteccin e identificacin de L. pneumophila directamente en muestras clnicas o en cultivos. El reactivo colorante Monofluo anti Legionella pneumophila contiene un nico anticuerpo monoclonal marcado con isotiocianato de fluorescena (FICT), que reacciona con una protena de la membrana externa de todos los serogrupos de L. pneumophila. Un posterior lavado elimina el anticuerpo no fijado, y al examinar la extensin con un microscopio de fluorescencia se puede ver la pared de estas bacterias. Se detalla a continuacin el procedimiento de identificacin de cultivos. Procedimiento (Ilustracin 8) o Preparar suspensin bacteriana en agua destilada estril, partiendo de un cultivo puro en BCYE, hasta lograr una turbidez equivalente al estndar N1 de McFarland, que se corresponde aproximadamente con una concentracin de 3x108 bacterias por ml. Agitar hasta homogeneizar la suspensin. Colocar 2 gotas de la suspensin, con una pipeta Pasteur, en un pocillo del portaobjetos, y aspirar para que el pocillo quede cubierto con una fina pelcula de suspensin bacteriana. En el caso de utilizar pocillos ms pequeos aadir menor cantidad de suspensin bacteriana y aspirar. Secar al aire o con ayuda de una placa calefactora a 35-37C. Fijar al calor pasando el porta por la llama suavemente varias veces. Aadir 1-2 gotas de reactivo colorante (tapn azul), o menor cantidad cantidad (10 l) en el caso de utilizar pocillos ms pequeos (cantidad suficiente para que cubra todo el pocillo y no se seque durante la incubacin). Colocar el porta en la cmara humeda e incubar a 35-37C durante 30 minutos. Escurrir el reactivo y enjuagar con agua destilada 8. Dejar en agua destilada durante 2-10 minutos. Escurrir y dejar secar al aire, a temperatura ambiente. Poner una gota de lquido de montaje (tapn blanco) y un cubrir con un cubreobjetos Observar las preparaciones en el microscopio de fluorescencia a 40 aumentos.
o o
o o o o o
Las tinciones se pueden conservadas 24 horas, en oscuridad a 2-8C, o durante ms tiempo a -20C, en cuyo caso se deben atemperar antes de su observacin microscpica.
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Ilustracin 8. Proceso esquemtico de la Inmunofluorescencia directa De forma simultnea se realizar una tincin del control positivo (tapn rojo) y un control negativo (un cultivo de organismo gramnegativo, como por ejemplo Escherichia coli), que se procesarn separadamente de las muestras para evitar contaminaciones cruzadas. Para ambos proceder de la forma siguiente: o Colocar una gota de control positivo (tapn rojo) en un porta y una gota de suspensin bacteriana control negativo en otro porta, y aspirar para eliminar el exceso de lquido. Secar al aire y fijar al calor, pasando los portas suavemente por la llama. Continuar el procedimiento de igual manera que las muestras.
o o
Interpretacin o Se considera un resultado positivo cuando se observan bacilos o cocobacilos con una fluorescencia de color verde claro, de caractersticas morfolgicas y de coloracin similares a las observadas en el control positivo. Este resultado ser interpretado como presencia de L. pneumophila en el cultivo analizado. En el caso de cultivos de origen ambiental, tambin se pueden observar morfologas filamentosas. Se considera un resultado negativo cuando los organismos aparacen sin coloracin, con una coloracin roja oscuro o dorado anaranjado. En estos casos nicamente se puede considerar que el cultivo analizado no pertenece a la especie L. pneumophila, pero no se pueden descartar otras especies diferentes.
Anotaciones Se deben extremar las precauciones para evitar las contaminaciones cruzadas (es decir, que pasen las clulas de Legionella de un porta positivo a otro negativo). La confirmacin de que un cultivo es positivo para L. pneumophila se debe hacer en base al aspecto caracterstico de las colonias, la ausencia de crecimiento en BCYE sin cistena, la morfologa de los bacilos fluorescentes y los resultados de la tincin de Gram. Limitaciones Un resultado negativo no excluye la posibilidad de que el cultivo pertenezca al gnero Legionella, ya que el reactivo empleado no incluye especies diferentes de L. pneumophila, por lo que podra tratarse de otra especie.
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Antgeno Histoplasma capsulatum Actualmente la prueba de deteccin de antgeno en orina y sangre tiene una alta sensibilidad y especificidad. Es una tcnica que nicamente se desarrolla en laboratorios de referencia. Se realiza mediante enzimoinmonoanlisis (EIA). 4.6.2 Torunda en tubo con cido casamino o Amies-Stuart con Charcoal, con exudados nasofarngeos Antgeno de Bordetella pertussis A) Reaccin de fluorescencia directa Se puede realizar directamente a partir de la torunda o a partir de las colonias sospechosas de la placa Regan-Lowe para su confirmacin definitiva. Procedimiento La muestra se aplica directamente a la lmina y se fija con alcohol de 96. En la preparacin para la lectura se realizan los siguientes pasos: Iustracin 38 o o o o o o El conjugado con fluoresceina se aplica a la lmina. Se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se lava 2 veces con buffer fosfato pH 7.2, durante 5 minutos cada vez. Se enjuaga con agua destilada durante un minuto y se deja secar. Se pone una gota de glicerina al 90% encima del frotis y se cubre con una laminilla. Se procede a observar la lmina en un microscopio de fluorescencia a 100x.
Interpretacin Al examen en el microscopio de luz ultravioleta, se observara cocobacilos fluorescentes con bordes brillosos y centro ms oscuro. 4.6.3 Torunda en Amies-Stuart o tubo, con muestras respiratorias de vas altas Toxina de Corynebacterium diphtheriae Se realiza a partir de las colonias aisladas en el medio ASCT o bien de muestras primarias recogidas en la torunda. El diagnstico de confirmacin se efecta en laboratorios de referencia determinando la capacidad toxignica de la cepa de C. diphtheriae, mediante el test de Elek e inoculacin animal en caso que el primero sea negativo.
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4.6.4 Torunda o tubo en medio para virus, con muestras respiratorias Virus de la gripe La principal ventaja de los mtodos basados en la deteccin de los antgenos vricos es su independencia de la infectividad del virus, aunque la calidad de la muestra es muy importante, ya que debe estar en condiciones ptimas despus de su recogida y el transporte hasta el laboratorio. Entre sus ventajas destaca el hecho de que permite una rpida obtencin de resultados, generalmente en unas pocas horas despus de la recepcin de la muestra. Como limitacin reseable cabe apuntar que los resultados a menudo son difciles de interpretar, la especificidad depender de la experiencia del personal que los realice y la sensibilidad suele ser baja. Los mtodos de inmunofluorescencia y EIA (enzimo-inmuno anlisis) se emplean habitualmente para la deteccin de los antgenos vricos directamente en la muestra clnica o bien en las clulas del cultivo en las que previamente se ha inoculado la muestra. Los antgenos vricos utilizados generalmente para el diagnstico son: o Las molculas que se sitan en la superficie del virus, la hemaglutinina y la neuraminidasa, y que tambin pueden encontrarse frecuentemente en la superficie de las clulas infectadas. Otras protenas menos accesibles del virus, como la nucleoprotena, y por ello menos variables, ya que las molculas de la superficie estn sometidas a una continua variacin evolutiva. Tipaje y subtipaje. Un aspecto adicional derivado de la actividad de los profesionales en laboratorios de Referencia de Gripe es que con objeto de realizar vigilancia y estudios epidemiolgicos, es importante realizar el subtipado de los virus de la gripe A. La diferenciacin del virus de la gripe A del tipo B es tan importante como la diferenciacin de los subtipos H1 y H3 dentro de los virus de la gripe A. Por ello, tambin se comercializan actualmente anticuerpos monoclonales que permiten distinguir especficamente el subtipo H1 del H3.
Adicionalmente se han comercializado tcnicas de inmunocromatografa capilar y de enzimoinmunoanlisis de membrana que posibilitan detectar la presencia de virus gripales o sus antgenos en pocos minutos y de lectura visual sin la necesidad de instrumental. Estos ensayos ofrecen resultados rpidos y pueden ayudar al clnico en el tratamiento individual de los pacientes. No obstante, su utilidad se ve limitada debido a su elevado coste y baja sensibilidad y especificidad. Tiene una amplia implantacin en la asistencia urgente y en el mbito peditrico. Virus Sincicial respiratorio El aislamiento del virus o la deteccin del antgeno viral en las secreciones respiratorias es el procedimiento preferido.
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Han sido creadas tcnicas inmunocromatogrficas para el diagnstico de VRS, las cuales tienen menor sensibilidad que la IF realizada por observadores expertos, sin embargo, es una tcnica sencilla que puede ser realizada por personal menos entrenado, rpida y econmica. La prueba BinaxNOW RSV es un ensayo inmunocromatogrfico de membrana, utilizado para detectar el antgeno del Virus Sincicial, con una sensibilidad de un 89% y una especificidad de 100%. El anticuerpo contra el RSV est fijado en la membrana del pack. Al realizar el test y agregar la muestra, el antgeno presente en la muestra reacciona unindose al anticuerpo. Esta reaccin da una lnea color rosa. El diagnostico definitivo se consigue con la inmunofluorescencia directa, que permite detectar el antigeno viral en las clulas infectadas del cultivo, en donde se observa el desarrollo de clulas gigantes y sincitios con su citoplasma teido de verde fluorescente, en los cultivos inoculados. Ilustracin recomendada: http://www.imagenmed.com/especiales/ie9/img/If018.jpg
4.7 Tcnicas de biologa molecular

4.7.1 Frascos de hemocultivo para anaerobios y aerobios con lquido pleural o sangre La Espectrofotometra de Masas (EM) ha demostrado ser capaz de identificar microorganismos causantes de bacteriemia directamente desde los frascos de cultivo (con sangre o lquidos orgnicos), en el momento en que este es identificado como positivo por el sistema automatizado correspondiente con una alta fiabilidad. La espectrometra de masas MALDIT-TOF, acrnimo de Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight, se trata de un mtodo que, mediante la aplicacin de energa laser a una muestra embebida en una matriz, consigue vaporizar e ionizar esa matriz, que eventualmente puede arrastrar en esa vaporizacin e ionizar a su vez a una muestra representativa de las protenas contenidas en la muestra. Esas protenas ionizadas son sometidas a aceleracin en un campo elctrico y a una migracin a travs de un tubo de vaco hasta un detector. El tiempo que transcurra desde su vaporizacin/ionizacin hasta su deteccin depender del cociente masa/carga (m/z) de esa protena, y ese cociente m/z permitir determinar la masa exacta de la protena de manera extremadamente fiable. En el caso de los microorganismos, se genera de esta forma un perfil de protenas con diferentes cocientes m/z, que se comporta como una huella dactilar, permitiendo identificar con gran fiabilidad al microorganismo a partir de dicho perfil. Desde el punto de vista tcnico, la incorporacin de esta tecnologa a la identificacin rutinaria supone en muchos casos un aumento en la fiabilidad y en la rapidez de la misma, fundamentalmente cuando la identificacin convencional depende de sistemas que requieren crecimiento del microorganismo, ya que este sistema permite la identificacin en unos minutos. Aunque la sensibilidad es todava mejorable para la identificacin de algunas especies en estas circunstancias, la especificidad es excelente, de modo que cuando el sistema informa de la
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presencia de un determinado microorganismo con una puntuacin suficiente, este dato es extremadamente fiable. En cuanto a la relacin coste/beneficio, uno de los extremos ms controvertidos ha sido el precio por identificacin. Los equipos de EM tienen un coste de adquisicin alto, pero en contrapartida el gasto en fungible es muy reducido. La EM, por sus caractersticas de rapidez y fiabilidad, est llamada a convertirse en una tcnica bsica de identificacin bacteriana y micolgica en los laboratorios de Microbiologa Clnica, desplazando en una parte muy importante a las tcnicas rutinarias actuales Aunque se ha discutido mucho sobre la capacidad de esta tcnica para identificar determinados grupos de microorganismos (bacterias anaerobias, hongos filamentosos), cada vez existen menos dudas respecto a que el problema principal, en estos casos, deriva fundamentalmente de carencias en las bases de datos, y no se debe a limitaciones de la EM para generar espectros proteicos caractersticos. 4.7.2 Torunda en Amies-Stuart o tubo, con muestras respiratorias de vas altas Toxina de Corynebacterium diphtheriae Se realiza a partir de las colonias aisladas en el medio ASCT o bien de muestras primarias recogidas en la torunda. Existen unos procedimientos basados en la tcnica de la PCR, para detectar el gen productor de la toxina a partir de material clnico: o Mtodo estndar de deteccin por PCR convencional del gen tox.
TaqMan PCR, que consiste en la deteccin inmediata de la secuencia del gen tox por medio de una tcnica de PCR cuantitativa en tiempo real. Las investigaciones preliminares subrayan las ventajas, entre las que se incluyen: una sensibilidad diez veces superior que la deteccin del gen de la toxina por PCR convencional estndar, eliminacin de la manipulacin posterior a la amplificacin, obtencin de un rendimiento elevado y la cuantificacin sencilla de los productos amplificados. Sin embargo, el coste de inversin inicial limita su aplicacin a los laboratorios de referencia centrales. 4.7.3 Torunda en M4 o frasco, con muestras respiratorias de vas bajas Microorganismos causantes de neumonas Las tcnicas moleculares son un instrumento valioso para el diagnstico etiolgico de la neumona, porque pueden detectar en poco tiempo los cidos nucleicos de todos los patgenos potenciales, no dependiendo de la viabilidad del microorganismo. Esta tcnica se ve menos afectada por los tratamientos antibiticos previos que los cultivos y la obtencin de los resultados es ms rpida. Con el desarrollo de la tecnologa de la PCR a tiempo real se consiguen resultados en menos de una hora.
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Estas tcnicas representan un mtodo rpido y relativamente simple de identificacin de micoorganismos con una sensibilidad y especificidad alta y se han aplicado sobre todo a microorganismos que son difciles de identificar utilizando tcnicas microbiolgicas habituales, como L. pneumophila, M. pneumoniae, C. pneumoniae y Pneumocystis jiroveci, y tambin a otros patgenos bacterianos ms frecuentes como S. pneumoniae. 4.7.4 Torunda o tubo en medio para virus, con muestras respiratorias Virus de la gripe Los mtodos moleculares de diagnstico que permiten la deteccin de cidos nucleicos estn basados en la bsqueda y el reconocimiento del genoma vrico en la muestra clnica o en el cultivo vrico. El empleo de estas tcnicas se est incrementando rpidamente, habiendo transformado el diagnstico de otras entidades infecciosas de etiologa vrica; si bien el papel de estos mtodos en la rutina diagnstica de la infeccin respiratoria y en la deteccin y caracterizacin de virus gripales en particular, es an limitado y de reciente incorporacin. A) Tcnicas de amplificacin genmica basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es la tcnica ms empleada. La reaccin de amplificacin tiene que ir precedida de una transcripcin reversa para transformar en ADN cualquiera de los 8 segmentos de ARN que contiene el genoma de los virus de la gripe A y B o de los 7 segmentos del genoma del virus de la gripe C.
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Mtodo PCR simple
PCR mltiple
Ventajas Sensible y especfico. Permite anlisis posteriores del producto amplificado. Sensible y especfico. Permite detectar ms de una diana por ensayo. Permite anlisis posteriores. Sensible y especfico. Elevado rendimiento. Puede ser mltiple. Sensible y especfico. Rpido. Permite cuantificar. Puede ser mltiple. Sensible y especfico. Permite cuantificar. Sensible y especfico. Deteccin de muchas dianas en un solo ensayo.
Desventajas Una diana por ensayo. Los mtodos no comerciales requieren una optimizacin exhaustiva para asegurar la ausencia de falsos negativos y la competicin entre iniciadores. No permite el anlisis posterior de los productos. Requiere evaluacin y validacin minuciosa antes de la integracin en la rutina de trabajo del laboratorio. Requiere equipamiento especfico. No siempre es posible el anlisis del producto. La capacidad de analizar varios genes o patgenos en formato mltiple est limitada por las caractersticas del termociclador. Utiliza tres enzimas, procedimiento largo y costoso. No siempre es posible el anlisis del producto. Requiere equipamiento especfico y amplio desarrollo. No permite el anlisis posterior de los productos.
PCR-EIA
PCR a tiempo real
NASBA
Microarrays
Tabla 17. Caractersticas de los mtodos moleculares disponibles para la deteccin de virus gripales
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Captulo 5
Diagnstico microbiolgico indirecto: Serologa

Tubo con suero Ante una sospecha de neumona atpica adquirida en la comunidad, las determinaciones directas (inmunolgicas y por biologa molecular) y sobretdodo las indirectas (mediante tcnicas inmunolgicas) son las ms indicadas.
5.1 Serologa Mycoplasma pneumoniae

El diagnstico de la infeccin por M. pneumoniae se basa en las tcnicas serolgicas. La fijacin de complemento fue la tcnica de referencia durante aos y an se utiliza en muchos laboratorios. Determina indistintamente la presencia de anticuerpos IgG e IgM. Los principales inconvenientes de la tcnica de fijacin de complemento son su laboriosidad, su difcil estandarizacin y el requerir de personal muy entrenado y cualificado. Existe un sistema automatizado (Seramat ) para la realizacin de la FC que ha sido favorablemente evaluado, con concordancia del 100% para la prueba de micoplasma. Tcnicas de aglutinacin de partculas sensibilizadas. Las tcnicas de aglutinacin permiten detectar tanto IgM como IgG. Para el diagnstico de M. pneumoniae se han usado reactivos de aglutinacin con partculas de ltex, con hemates o con partculas de gelatina.
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La tcnica de aglutinacin de partculas de gelatina (Serodia-Myco II. Fujirebio), utiliza antgeno P1 de M. pneumoniae. Permite una cuantificacin de los anticuerpos en base a un banco de diluciones a partir de 1/40. Segn el fabricante deben considerarse positivos los ttulos >1/40. Sin embargo algunos autores sugieren que los criterios a aplicar para esta tcnica deben ser: o o o un incremento de al menos cuatro veces en el ttulo de anticuerpos. ttulo 1/160 en al menos una muestra. ttulo 1/320 en la fase aguda.
La repeticin de la determinacin en una muestra de suero obtenida 48-72 horas despus, permite demostrar un incremento significativo en el ttulo de anticuerpos, sin necesidad de esperar hasta tres semanas para obtener otra muestra de suero. Adems, se puede disponer del resultado en 4 horas. Ilustracin recomendada: http://www.pomif.com/pages/practicas/micro_clinica/serologia Tcnicas de enzimoinmunoanlisis (EIA). Desde la comercializacin de tcnicas de EIA, su uso se ha impuesto en la mayora de laboratorios. Existe una amplia variedad de reactivos comercializados. Los numerosos trabajos publicados comparando los diferentes reactivos disponibles en el mercado, presentan resultados muy variados. Prueba de la inhibicin metablica. El fundamento radica en la inhibicin del crecimiento de los micoplasmas en cultivo en caldo por la presencia de anticuerpos especficos frente a ellos. El sistema indicador se basa en el cambio de color del indicador del pH del medio como consecuencia de la fermentacin de la glucosa, hidrlisis de la arginina o hidrlisis de la urea, segn la especie de micoplasma estudiada. Sin embargo, es laboriosa y reservada para laboratorios con experiencia en el cultivo de estos microorganismos. Las tcnicas de inmunofluorescencia indirecta con conjugados especficos (IgG o IgM) a pesar de ofrecer resultados reproducibles y cuantificables, no parecen tener un amplio uso. La laboriosidad y la subjetividad de la interpretacin de los resultados han sido, probablemente, los factores limitantes para su difusin.
5.2 Serologa de Chlamydophila pneumoniae

La tcnica de microinmunofluorescencia (MIF) es la nica recomendada en la actualidad para el diagnstico de rutina de la infeccin por C. pneumoniae. Esta tcnica utiliza como antgeno cuerpos elementales purificados especie-especficos y es la tcnica serolgica recomendada como referencia. Es la ms utilizada y permite establecer los criterios de evidencia serolgica de: o o La infeccin aguda. IgM 16, IgG > 512 o seroconversin del ttulo de anticuerpos IgG.
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o o
La exposicin ya pasada al microorganismo. IgG = (8 -256) o IgM < 16.
Ilustracin recomendada: http://www.immunfluoreszenz.de/index.php?id=ak_gegen_chlamydien&L=1 No obstante, hay que sealar que la MIF presenta tambin inconvenientes, como la variabilidad en la calidad de los reactivos comerciales disponibles y la subjetividad de la interpretacin de los resultados.
5.3 Serologa de Legionella pneumophila

Se han desarrollado una variedad de pruebas para detectar anticuerpos especficos en muestras de suero, incluyendo inmunofluorescencia indirecta (IFI), microaglutinacin y mtodos de enzimo-inmunoensayo (ELISA), as como ensayos de hemaglutinacin indirecta y contrainmunoelectro-foresis. La IFI ha sido el mtodo diagnstico ms utilizado durante aos y por ello, el ms evaluado, principalmente para L. pneumophila serogrupo 1. Las pruebas de microaglutinacin presentan la ventaja de que por su facilidad de realizacin permiten ensayar un gran nmero de muestras a la vez. Tambin existen disponibles ensayos de ELISA para la deteccin de anticuerpos frente a Legionella, aunque stos no han sido suficientemente evaluados. A) Inmunofluorescencia indirecta (IFI) Se utiliza un sustrato antignico inactivado con calor que generalmente contiene L. pneumophila serogrupo 1, aunque tambin pueden contener una mezcla polivalente de los serogrupos 1 a 6 de Legionella pneumophila. Estos antgenos estn comercializados, estandarizados y prefijados en los portaobjetos sobre los que se aaden diferentes diluciones del suero del paciente. En el caso de que existan anticuerpos en el suero del paciente frente al correspondiente antgeno, se formar un complejo antgeno-anticuerpo. La posterior adicin sobre este complejo de una antiglobulina humana marcada con fluorescena (FITC) permite la visualizacin de los microorganismos con un microscopio de luz fluorescente con 400 o 500 aumentos. Los anticuerpos no especficos y dems protenas se eliminan por medio de un lavado antes de aadir la antiglobulina marcada, y un segundo lavado tras la adicin de sta, eliminar el conjugado sobrante. Para un aprovechamiento mximo de esta tcnica se recomienda: o o o o Realizar solamente esta prueba con sueros pareados. Recoger las muestras de suero con al menos dos semanas de diferencia, y preferiblemente con seis semanas de diferencia. Realizar la prueba en las dos muestras simultneamente. Guardar las muestras de suero congeladas a -20C hasta su utilizacin.
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No realizar las pruebas en suero hemoltico ni hiperlipmico.
Procedimiento (Ilustracin 9) Descongelar los sueros a analizar. o o o Antes de comenzar con la realizacin de la tcnica, atemperar los portas, controles y conjugados, mantenindolos a temperatura ambiente durante 5 min. Reconstituir los controles positivo y negativo con 0,5 ml de agua destilada. Dejar 15 min a temperatura ambiente hasta su total reconstitucin. Utilizando placas de microtitulacin, realizar diluciones seriadas de los sueros (1/8, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512, 1/1.024) con tampn PBS. Como ejemplo, se puede proceder de la siguiente forma: aadir en el primer pocillo 70 l de PBS y 10 l de suero. En los 7 siguientes pocillos aadir 50 l de PBS. De la primera dilucin ya hecha, se pasarn 50 l al siguiente pocillo, mezclando y volviendo a pasar 50 ml al siguiente y as sucesivamente. Sacar los portas con el antgeno teniendo cuidado de no tocar las reas de aplicacin. Para el marcado de los portas usar slo lpiz duro, nunca rotulador. Aplicar 10 l de cada dilucin en cada pocillo comenzando por la dilucin al 1/1.024 y terminando por la 1/8. Incluir en un pocillo un control positivo y en otro un control negativo. Incubar en cmara hmeda a 37C durante 30 minutos. Extraer el porta de la cmara hmeda y lavar estticamente durante 5 minutos en una cubeta con PBS y otros 5 minutos cambiando el PBS. No mover el porta dentro del PBS. Sacar los portas y enjuagarlos en otra cubeta con agua destilada. Dejar secar los portas completamente. Aadir 10 l del conjugado a cada pocillo cubrindolos completamente con el mismo. ncubar en cmara hmeda a 37C durante 30 minutos. Repetir el punto n 8 y dejar secar. Aplicar 3-4 gotas de medio de montaje por cada porta y cubrir con el cubreobjetos sin que se formen burbujas. Eliminar el medio de montaje excesivo con un papel humedecido en tampn PBS. Realizar una observacin inmediata en el microscopio de fluorescencia con el objetivo de 40x o de 50x. Si esto no fuera posible, guardar los portas en un lugar oscuro y fro y protegidos de la desecacin (mximo 24 horas). Durante la observacin al microscopio, se recomienda no concentrarse mucho tiempo en la misma rea, es preferible desplazarse por toda la preparacin con el fin de evitar prdidas de fluorescencia.
o o o o o
o o o o o
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Ilustracin 9. Proceso esquemtico de la Inmunofluorescencia indirecta Obtencin de resultados Para la aceptacin de los resultados es imprescindible haber validado el resultado de los controles: o o El control negativo (suero sin anticuerpos anti-Legionella,) no debe mostrar fluorescencia. El control positivo (suero con anticuerpos anti-Legionella) debe presentar una fluorescencia intensa y brillante de color verde manzana. El suero control positivo debe proporcionar el ttulo esperado dentro del rango de una dilucin ms o menos. Si el ttulo no es el esperado, se debe repetir todo el procedimiento. Muestras: o Evaluacin positiva: la fluorescencia especfica es de un color verde manzana con una intensidad generalmente de 1+ (dbil), 2+ (regular), 3+ (brillante), hasta 4+ (muy brillante). Evaluacin negativa: ausencia de flluorescencia.
Las fluorescencias amarillentas o verde oscuras son inespecficas y no deben tenerse en cuenta. Ilustracin recomendada: http://www.vircell.com/index.php/Legionellapneumophila/136/0/?&L=%20orDer%20by%20999%23&cHash=32b2eb9d1b17f62027907efe81b b0f4a Ttulo: el ttulo es el valor recproco de la mayor dilucin en la cual se puede observar como mnimo una fluorescencia de 1+. Ejemplo: en caso de valorarse una dilucin 1/64 como positiva y una dilucin 1/128 como negativa, el ttulo ser de 1/64.
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Seroconversin: se considera seroconversin cuando al analizar dos muestras de suero del paciente obtenidas con una diferencia de 20 das, se observa un aumento del nivel de anticuerpos como mnimo del cudruple y el ttulo de la segunda muestra es > 1/128. Expresin de resultados Un ttulo nico inferior a 1/256 debe considerarse como negativo. o Un ttulo igual o superior a 1/128 debe considerarse como resultado presuntivo de enfermedad o contacto previo. o Seroconversin: se observa un aumento del ttulo al menos al cudruple entre los dos sueros pareados.
Limitaciones del procedimiento La principal limitacin es la necesidad de realizar la tcnica en sueros pareados para poder demostrar una seroconversin, ya que en ocasiones no se llega a disponer de una segunda muestra de suero. Adems, la seroconversin puede tardar hasta dos meses en producirse desde el inicio de los sntomas, lo que provoca un retraso en el diagnstico. Se debe tener en cuenta que alrededor del 20-30% de los casos confirmados con cultivo no seroconvierten, por lo que un resultado negativo no excluye la enfermedad.
5.4 Serologa de Coxiella burnetii

El diagnstico ms ampliamente utilizado de la fiebre Q es el indirecto, para el cual disponemos de tcnicas de reaccin de fijacin del complemento (FC) y de inmunofluorescencia indirecta (IFI). o o La FC es una tcnica poco sensible que puede dar resultados falsos negativos, sobre todo en las formas crnicas. La IFI, considerada el mtodo de referencia, presenta mayor sencillez, rapidez, sensibilidad y ausencia de interferencias con los sueros anticomplementarios de algunos pacientes. Debe ir precedida de la absorcin del factor reumatoide, con lo que se eliminan los resultados falsos positivos en la deteccin de anticuerpos de clase IgM. Adems, la IFI permite identificar las distintas clases de inmunoglobulinas (IgG, IgA e IgM). Ilustracin recomendada:
http://www.vircell.com/index.php/Coxiellaburnetii/129/0/?&L=%20orDer%20by%20999%23&cHash=32b2eb9d1b17f62027907efe81bb0f4a
Formas agudas (antgeno en fase II): Son significativos los ttulos de anticuerpos de clase IgG 1/128; la seroconversin y los ttulos de anticuerpos de clase IgM 1/32.
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o o
Se considera diagnstico en la fase II los ttulos de los anticuerpos IgG< 1/16, indicativo de Negativo; y la IgG 1/256, indicativo de Positivo.
En las formas crnicas (antgeno en fase I), la deteccin de ttulos de anticuerpos de clase IgG 1/800 se considera diagnstico. No obstante, en un estudio realizado por Fraile et al. en 19 pacientes con manifestaciones clnicas y pruebas diagnsticas compatibles con fiebre Q crnica, identificaron a 8 pacientes con serologa positiva para antgenos de fase I con ttulo 1/512 (rango 1/512-1/2.048) y ttulos elevados de IgG frente al antgeno de fase II ( 1/200). segn el rea geogrfica, por lo que el incremento de los ttulos de anticuerpos de clase IgG e IgM para antgenos de C. burnetii en fase II o en fase I, observado en dos muestras sricas diferidas por 1-2 semanas, debe tambin tomarse en cuenta para el diagnstico y seguimiento de estos pacientes.
o Por tanto, los criterios serolgicos de diagnstico pueden diferir discretamente
Se recomienda que a todos los pacientes con endocarditis y hemocultivo negativo, o con fiebre y aneurisma artico, o con fiebre prolongada, hepatitis granulomatosa, neumona atpica, fiebre prolongada y alteraciones neurolgicas, se les realice, al menos, un estudio serolgico para fiebre Q.
5.5 Serologa de Rickettsia coronii

En los laboratorios clnicos se recomienda realizar pruebas serolgicas en sueros pareados. Es necesario tener un especial cuidado para evitar la produccin de aerosoles durante la manipulacin para la separacin del suero a partir de la sangre. Dada la peligrosidad que implica el trabajo con microorganismos vivos, el intento de aislamiento o la deteccin por inmunofluorescencia directa deben limitarse y las muestras post-mortem de los casos fatales deben enviarse a un laboratorio de referencia. La Inmunofluorescencia indirecta (IFI) es el mtodo ms empleado para su diagnstico. Cuando se observa al microscopio se puede distringuir: o o Resultado positivo: fluorescencia puntiforme caracterstica. Resultado negativo: ausencia de fluorescencia.
Ilustracin recomendada: http://www.vircell.com/index.php/Rickettsiaconorii/139/0/?&L=%20orDer%20by%20999%23&cHash=32b2eb9d1b17f62027907efe81bb0f4a
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5.6 Serologa de Francisella tularensis

El aislamiento y la identificacin bioqumica de F. tularensis no justifican el riesgo que supone la manipulacin del cultivo. Por ello, el diagnstico microbiolgico de la tularemia es fundamentalmente serolgico (aglutinacin o ELISA).
5.7 Serologa del virus sincicial respiratorio

El diagnstico serolgico de las infecciones producidas por VRS ha sido evaluado ampliamente en estudios clnicos, siendo la sensibilidad de la IFI algo mayor que del ELISA. o o La deteccin de IgM indica infeccin reciente. Un aumento de cuatro o ms veces en el ttulo de IgG tiene valor diagnstico.
Ilustracin recomendada:
http://www.vircell.com/index.php/Virus-SincitialRespiratorio/140/0/?&L=%20orDer%20by%20999%23&cHash=32b2eb9d1b17f62027907efe81bb0f4a
Al determinarse en nios menores de dos aos principalmente, son probables los falsos negativos y positivos. o Falsos negativos: Un aumento de ttulos no se detecta en la mitad de los nios menores de 6 meses; la IgM no se detecta en el 50 % de los pacientes con infeccin documentada. Falsos positivos: En los recin nacidos se detecta IgG materna.
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Contenedor-muestra Torundas y tubos en anaerobiosis con: lceras, aspirados, CTP o tejidos. Frascos de hemocultivos para an/aerobios con: lq. pleural o sangre. Torundas en tubo amies y tubos estriles, con muestras de vas respiratorias altas.
Microorganismo Buscado Anaerobios Angina de Vincent Bacterias aerobias y anaerobias
Procedimiento Tincin Gram Tioglicolato, PEA, BBE Incubacin
Hongos Bacterias y hongos S. pyogenes Cndidas N. gonorrheae C. diphtheria Toxina S. aureus, S. pyogenes P. aeruginosa Cndidas, Aspergillus S. aureus, S. pneumoniae, A. otitidis H. influenzae, M. catarrhalis Bacilos gramnegativos S. pneumoniae, S. pyogenes H. influenzae, M. catarrhalis Bacilos gramnegativos Hongos filamentosos
Fresco: KOH, NaOH, Tinta China, Azul Metileno, Fucsina, Blanco Calcoflor. Tincin Gram Agar sangre Sabouraud Agar Choc, Thayer-Martin ASCT, Loeffler Test Elek , inoc animal, PCR Agar Sangre McConkey Sabouraud Agar Sangre Agar Chocolate McConkey Agar Sangre Agar Chocolate McConkey BHI
Farngeos:
Otitis externa
Otitis media
Sinusitis
Tabla 18. Resumen de los procedimientos especficos del laboratorio de microbiologia para las muestras recepcionadas de infecciones respiratorias
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Contenedor-muestra Torunda en c. Casamino o Amies-Stuart con Charcoal, con exudados nasofarngeos. Torundas en medio M4 con exudado farngeo. Frascos y tubos estriles, con muestras de vas respiratorias bajas.
Microorganismo Buscado Bordetella M. pneumoniae C. pneumoniae
Procedimiento Agar regan-lowe, Agar sangre. IFD Caldo o agar SP-4 PCR a tiempo real PCR a tiempo real
Hongos P. jiroveci Bacterias y hongos o Mtodos no invasivos S. pneumoniae H. influenzae, M. catarrhalis Enterobacterias y bacilos g(-) no fermentadores Hongos filamentosos Esputos y aspirados traqueales Legionella, Nocardia R. equi Micobacterias
Fresco: KOH, NaOH, Tinta China, Azul Metileno, Fucsina, Blanco Calcoflor. Tincin argntica rpida PCR a tiempo real Tincin Gram
Agar sangre Agar chocolate McConkey PCR a tiempo real BHI Pretratamiento BCYE-, BMPA- PCR a tiempo real CNA Pretratamiento Tincin baar Lwenstein-Jensen Pretratamiento Caldo o agar SP-4 PCR a tiempo real PCR a tiempo real
M. pneumoniae C. pneumoniae
Tabla 18 continuacin. Resumen de los procedimientos especficos del laboratorio de microbiologia para las muestras recepcionadas de infecciones respiratorias
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Contenedor-muestra o BAL CPT Mtodos invasivos:
Microorganismo Buscado
Procedimiento Diluciones seriadas Diluciones seriadas Agar sangre Agar chocolate McConkey
S. pneumoniae H. influenzae, M. catarrhalis Enterobacterias y bacilos g(-) no fermentadores Anaerobios Hongos filamentosos Lquido pleural y tejidos
Torunda o tubo en medio para virus, con muestras respiratorias
Orina
Suero
PCR a tiempo real Tioglicolato, PEA, BBE BHI Pretratamiento Legionella, Nocardia BCYE-, BMPA- PCR a tiempo real R. equi CNA Tincin baar Micobacterias Lwenstein-Jensen Pretratamiento M. pneumoniae Caldo o agar SP-4 PCR a tiempo real C. pneumoniae PCR a tiempo real MDCK, huevos de gallina embrionados, Hep-2, fibroblastos, Virus de la gripe, VSR, hMPV, rin mono, LLC-MK2, VERO Parainfluenza Adenovirus, Rinovirus. IFI, EIA, ICT, EIA-mb PCR S. pneumoniae ICT L. pneumophila ICT, EIA, IFD H. capsulatum EIA M. pneumoniae FC, Aglutinacin, EIA, IFI C. pneumoniae MIF L. pneumophila IFI C. burnetii FC, IFI R. coronii IFI F. tularensis Aglutinacin, ELISA VSR IFI, ELISA
Tabla 18 continuacin. Resumen de los procedimientos especficos del laboratorio de microbiologia para las muestras recepcionadas de infecciones respiratorias
124
Informe de los resultados
Captulo 6

6.1 Visualizacin directa
Los estudios microscpicos en fresco y tinciones deben informarse con precaucin, as: o Visualizaciones con tinta china en busca del Cryptococcus: o o o Los resultados positivos: se observan levaduras capsuladas compatibles con C. neoformans. Los resultados negativos deben informarse: no se observan estructuras fngicas.
Visualizaciones de la tincin argntica rpida, para Pneumocystis jiroveci: o o Positivo: se observan formas redondeadas compatibles con quistes de P. jioveci. Negativo: no se observan estructuras fngicas.
En la tincin de Gram de lceras farngeas: o Informar si hay microorganismos que sugieren la Angina de Vincent.
Los resultados de la tincin de Baar, se han de informar teniendo en cuenta la siguiente correlacin dependiendo del tipo de tincin elegida:
125
Informe No BAAR Dudoso (repetir) Positivo 1 + Positivo 2 + Positivo 3 +
Fucsina (x 1.000) 0 1-2 / 300 campos (3 barridos) 1-9 / 100 campos (1 barrido) 1-9 / 10 campos 1-9 / campo
Fluorocromo (x 250) 0 1-2 / 30 campos (1 barrido) 1-9 / 10 campos 1-9 / campo 10-90 / campo
Fluorocromo (x 450) 0 1-2 / 70 campos (1,5 barridos) 2-18 / 50 campos (1 barrido) 4-36 / 10 campos 4-36 / campo
Tabla 19. Tipo de tincin, aumento ptico y n de BAAR observados El informe utilizando la escala semicuantitativa estandarizada asegura la reproducibilidad de los resultados y permite evaluar: la gravedad de la enfermedad, la infectividad del paciente, y la evolucin del paciente bajo tratamiento. Toda demora en la entrega de un resultado positivo puede retrasar el inicio del tratamiento, prolongar el perodo durante el cual el paciente permanece infeccioso o determinar que se pierda un enfermo. Es necesario el mayor esfuerzo posible para que los resultados de la baciloscopia sean recibidos por la unidad de salud dentro de 24 horas de entregada la muestra al laboratorio.
6.2 Cultivos
Los informes preliminares pendientes de confirmaciones en laboratorios externos, como puede ser el caso de la difteria, se debn informar como: Se aisla Corynebacterium diphtheriae. Informe preliminar positivo en espera de confirmacin. Si se aisla y se confirma la especie de M. pneumoniae se informar: se asla M. pneumoniae, sin necesidad de indicar el ttulo de crecimiento, ni realizar pruebas de sensibilidad a los antibiticos. El aislamiento de M. pneumoniae del tracto respiratorio es clnicamente significativo en la mayora de los casos, pero deber relacionarse con la enfermedad clnica y ser, adems, corroborado por las pruebas serolgicas, ya que existen portadores asintomticos. El aislamiento de M. pneumoniae de cualquier lquido orgnico o tejido estril, es siempre significativo. Muestras de vas respiratorias bajas, contaminadas con microbiota de vas altas Cuando la muestra de esputo se rechace para cultivo siguiendo los criterios de la tincin de Gram, es apropiado comunicar uno de los siguientes resultados: o Se observan > 10 clulas epiteliales escamosas por campo de bajo aumento, lo cual sugiere mala calidad de la muestra; el cultivo no se realiza. Por favor, recoger nueva muestra si existe indicacin clnica. No se observan bacterias tras el examen con objetivo de 1.000X; el cultivo no se realiza. Contactar con el laboratorio si estn indicados clnicamente otros estudios.
126
o o
Si no se asla ningn patgeno en el cultivo se informar como crecimiento de microbiota habitual. Si se aslan microorganismos patgenos se informar la especie identificada y las pruebas de sensibilidad.
Muestras no contaminadas con microbiota de vas respiratorias altas En las biopsias pulmonares por puncin transtorcica, biopsias a pulmn abierto y en el lquido pleural todos los patgenos se deben identificar e informar junto con las pruebas de sensibilidad a antibiticos. Cultivos cuantitativos en muestras obtenidas por fibrobroncoscopia En la informacin de los resultados deben considerarse los siguientes aspectos: o o o Se debe informar el recuento de cada tipo de colonias bacterianas expresado en unidades formadoras de colonias por mililitro (ufc/ml). Recuentos superiores o inferiores de microorganismos no potencialmente patgenos se pueden informar como microbiota respiratoria habitual. Considerar como muestra pobre o de mala calidad, e informarlo as, a aquellas en las que se observen menos de 10 neutrfilos por campo de 1.000 aumentos en la tincin de Gram o de Giemsa. Si en la tincin de Gram o de Giemsa se observan clulas epiteliales en una proporcin superior al 1% se ha de informar que el resultado del cultivo bacteriano puede corresponder a microbiota orofarngea. Se informar del morfotipo o morfotipos bacterianos observados en la tincin de Gram. En el LBA se debe informar si se observan bacterias intracelulares en la tincin de Gram. Del resto de pruebas para virus, hongos, parsitos y bacterias se informar del resultado, aadiendo la interpretacin del microbilogo si se considera conveniente.
o o o
6.3 Deteccin rpida de antgenos

Legionella o En el caso de tener un resultado positivo el informe recomendado sera: o Cuando se utilizan los ensayos de EIA (Binax o Bartles) o el ensayo de ICT deteccin de antgeno soluble de Legionella pneumophila serogrupo 1: positiva.
127
o o
Si se utiliza el ensayo de EIA de Biotest se expresar como deteccin de antgeno soluble de Legionella: positiva.
En el caso de tener un resultado negativo se expresara como: o Cuando se utilizan los ensayos de EIA (Binax o Bartles) o el ensayo de ICT deteccin de antgeno soluble de Legionella pneumophila serogrupo 1: negativa. En caso de utilizar el ensayo de EIA de Biotest se expresar como deteccin de antgeno soluble de Legionella: negativa.
o o o
En cualquier caso, se debe indicar si la muestra de orina ha sido concentrada o no, ya que el factor de concentracin puede influir en el resultado final. En el caso de que no proceda la realizacin de los ensayos por disponer de ensayos previos, se informar tambin el motivo: o o Deteccin de antgeno soluble de Legionella: no procedente por determinacin previa positiva hace menos de un mes, o Deteccin de antgeno soluble de Legionella pneumophila: no procedente por determinacin previa negativa hace menos de una semana o an pendiente.
6.4 Serologa
Los resultados obtenidos son cualitativos (positivo o negativo) y cuantitativos (ttulo del suero), que se traducen en infeccin actual, pasada o ausente. En la tabla 20 se muestra la correlacin entre los posibles resultados, su interpretacin y el informe analtico.
2 muestras (4 semanas) INFECCIN ACTIVA SEROCONVERSION x4 el Ttulo IgG x4 el Ttulo x2 Indice Una nica muestra CONTACTO PREVIO POSITIVO NO EXISTE INFECCION NEGATIVO
Informe Interpretacin Aglutin. IFI ELISA
Agudo 1/320 IgG IgM 1/25 6 >1
IgG 1/12 8
IgM 1/32
IgG <1/16
IgM
<1
Tabla 20. Informe de las serologas infecciosas
128
Bibliografa
Captulo 7
Bibliografa
Bactus AB. Instrucciones tcnicas del fabricante. Phadebact Streptococcus Test. Binax. Manual de instrucciones del ICT Binax NOW para S. pneumoniae Antigen Test, Portland, USA. Suministrado por el fabricante. Binax. Manual de instrucciones del ICT Binax NowTM Legionella Urinary Antigen Test, Portland, USA. Suministrado por el fabricante. Biomerieux. Instrucciones tcnicas del fabricante. API 20 A, API NH, API CORIYE y API AUX. Biotest AG. Manual de instrucciones del EIA Biotest Legionella Urinary Antigen, Dreilich, Germany. Suministrado por el fabricante. Cercenado, E. & Cantn, R. (2003-2011). Procedimientos en Microbiologa Clnica (2 Ed.). SEIMC. Disponible en: http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/ Fraile Farias, M.T. & Muoz Collado, C. (2010). Infeccin por Coxiella burneti (Fiebre Q). Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica, 20(1), 29-32. Garca Bermejo, I. (2001). Rhodococcus equi: Aspectos microbiolgicos y clnicos. Control calidad SEIMC.
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Bibliografa
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http://www.sampac.es/index.sw?mod=noticias&noticia=51
Ilustraciones recomendadas
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Sobre los autores
Sobre los autores del libro

M Jos Lpez Garca
Doctora en Farmacia Facultativa especialista en Anlisis Clnicos Agencia Sanitaria Alto Guadalquivir lopezmjose.68@gmail.com
Marta Crdenas Povedano

Tcnico Especialista de Laboratorio Hospital de Montilla Agencia Sanitaria Alto Guadalquivir martacar22@gmail.com
Aurora Urbano Felices

Tcnico Especialista de Laboratorio Hospital Infanta Margarita. Cabra Servicio Andaluz de Salud felices70@hotmail.com
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Sobre el revisor
Sobre el revisor del libro

Jos Miguel Aguilar Bnitez
Licenciado en Ciencias Biolgicas. Facultativo especialista en Microbiologa y Parasitologa clnica. Facultativo especialista en Anlisis Clnicos. FEA anlisis clnicos y responsable de los laboratorios de los hospitales de alta resolucin de Alcal la Real y Alcaudete. Agencia sanitaria Alto Guadalquivir. jmaguilar@ephag.es
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Manual de laboratorio de microbiologa para el diagnostico de infecciones respiratorias

1 edicin 2012 OmniaScience (Omnia Publisher SL) www.omniascience.com

Infecciones de vas respiratorias bajas

CAPTULO 4 DIAGNSTICO MICROBIOLGICO DIRECTO 4.1 Visualizacin directa

4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5

Cultivos bacteriolgicos y fngicos

Pruebas de deteccin rpida de antgeno

Tcnicas de biologa molecular

5.5 5.6 5.7

Manual de laboratorio de microbiologa para el diagnstico de infecciones respiratorias

Flora respiratoria normal

Flora respiratoria normal

1.1 Fosas nasales

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Infecciones respiratorias y agentes etiolgicos

Infecciones respiratorias y agentes etiolgicos

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Infecciones respiratorias y agentes etiolgicos

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Infecciones respiratorias y agentes etiolgicos

Nios mayores, adolescentes y adultos

Ronquera, dolor de garganta, fiebre, y congestin nasal

Bebs y nios pequeos (3 meses-3 aos)

Fiebre, tos perruna, dificultad respiratoria, tiraje, y estridor

Nios de 2-6 aos

Aparicin brusca de fiebre, dolor de garganta y agitacin

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Infecciones respiratorias y agentes etiolgicos

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Infecciones respiratorias y agentes etiolgicos

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Infecciones respiratorias y agentes etiolgicos

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Infecciones respiratorias y agentes etiolgicos

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2.2 Infecciones de vas respiratorias bajas

Infecciones respiratorias y agentes etiolgicos

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Manual de laboratorio de microbiologa para el diagnstico de infecciones respiratorias

3.1 Muestras del tracto respiratorio superior

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3.2 Muestras del tracto respiratorio inferior (mtodos no invasivos)

3.3 Muestras del tracto respiratorio inferior (mtodos invasivos)

Manual de laboratorio de microbiologa para el diagnstico de infecciones respiratorias

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Tipo de muestra patologa Nasofaringe: exudado Laringitis, Laringotraquetis