INGENIERIA GENETICA

Gua de Trabajos Prcticos de Laboratorio

Normas de Seguridad y de Trabajo en el Laboratorio

1. Dentro del laboratorio, como regla de seguridad general, siempre deben permanecer como mnimo dos personas. 2. El uso de bata (por debajo de las rodillas) es obligatorio dentro del laboratorio al igual que el uso de barbijo y guantes en el laboratorio que lo requiera. 3. No se permitir la entrada a los laboratorios con faldas, pantalones cortos, zapatos abiertos y cabello largo suelto, si as lo requieren las condiciones de trabajo en dicha rea. 4. Todas las prcticas debern realizarse en forma ordenada y al terminar, toda el rea de trabajo deber quedar limpia y ordenado el material usado. 5. Algunos desperdicios lquidos podrn tirarse por las piletas con un rango de pH 6-8, dejando correr agua suficiente. 6. Todos los desperdicios slidos y papeles debern colocarse en los botes de basura. El material de vidrio roto deber descartarse en forma especial para ese efecto se deber avisar al JTP o auxiliares. 7. Al usar cualquier tipo de reactivos, asegrese que es el correcto y lea bien su etiqueta. Si es transferido de recipiente etiqutelo de nuevo colocando nombre de reactivo, fecha y propietario. 8. Usar guantes apropiados para el manejo de reactivos corrosivos y/o altamente txicos. 9. Gafas protectoras para evitar la exposicin a los rayos UV. 10. Todos los reactivos debern manejarse con el material perfectamente limpio. Todos los slidos debern manejarse con esptula. 11. No utilizar reactivos sin haber registrado sus propiedades en el cuaderno de laboratorio, enterndose de los riesgos de su uso y tomando las precauciones pertinentes. 12. No pipetear con la boca cidos, lcalis o cualquier producto corrosivo, inflamable o txico, use una pera o propipeta para extraer cualquier tipo de lquido. si algn reactivo es accidentalmente ingerido, avise de inmediato. 13. No manipular sustancias inflamables (benceno, tolueno, ter, etc.) en presencia de mecheros encendidos. 14. Dilucin de cidos: aadir lentamente el cido al agua contenida en un vaso, agitando constantemente y enfriando el vaso receptor. Nunca aadir agua al cido. 15. Cuando requiera una agitacin vigorosa por inversin del recipiente, tpelo con un tapn de vidrio esmerilado o de goma. Nunca lo haga con la mano. 16. Al calentar soluciones y/o reactivos, hgalo en recipientes adecuados para ese efecto (vidrio PYREX). 17. Al calentar una solucin en un tubo de ensayo, debe hacerse bajo el nivel del lquido y constantemente agitando. No debe apuntarse con el tubo al compaero o a s mismo, pues puede proyectarse. 18. No se debe oler ningn lquido poniendo directamente la nariz donde est contenido, debe abanicarse con la mano los vapores hacia la nariz. 19. Todas las operaciones que desprendan gases txicos y/o irritantes debern efectuarse bajo una campana con extractor. 20. Nunca devuelva al recipiente original una sustancia que se ha sacado del mismo, pues podra contaminarla. 21. No ingiera alimentos o bebidas en el laboratorio. Recuerde que las bromas o juegos dentro del rea de trabajo no estn permitidas, evite disgustos o llamadas de atencin.

22. Al terminar de usar su equipo desconctelo de la electricidad. 23. Tomar slo las cantidades de reactivos necesarios para el trabajo experimental. 24. No lleve sus manos sin lavar a la boca u ojos cuando haya utilizado productos qumicos. 25. Lavarse las manos antes y despus de haber finalizado las tareas en el laboratorio. 26. Todo el material utilizado para cultivar E.coli debe ser esterilizado con lavandina o autoclavado antes de ser descartado.

SEALIZACIN DE SEGURIDAD DE LAS SUSTANCIAS QUMICAS:

Rombo NFPA (Nacional Fire Protection Agency) creado por la Agencia Nacional de Proteccin del Fuego de los Estados Unidos.

Pictograma de advertencias

Algunos reactivos para tener en cuenta:

Acrilamida/Bisacrilamida La acrilamida/bisacrilamida es cancergena, mutagnica, txica por inhalacin e ingestin, irritante, txico para la reproduccin. Irrita los ojos y la piel. Posible riesgo de perjudicar la fertilidad. BCIP/NBT Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto. Nocivo por inhalacin y en contacto con la piel. Irrita los ojos. Triton X-100 Txico si se ingiere. Riesgo de dao severo para los ojos. NFPA ratings (escala 0 - 4) Salud= 2 Inflamabilidad = 1 Reactividad= 0 Azida Sdica Irritaciones en vas respiratorias, ojos, en mucosas de la boca, garganta, esfago y tracto intestinal. Efectos sistmicos: efectos en el sistema nervioso central, taquicardias, hipotensin, dificultades respiratorias, dolores de cabeza, vmitos, nuseas.

2-Mercaptoetanol Nocivo por ingestin, txico en contacto con la piel, provoca quemaduras y lesiones oculares. Metanol Irrita las mucosas nasales y oculares. Produce asfixia, vrtigo, tos, dolor de cabeza, nuseas, vmito, trastornos oculares, convulsiones e inconsciencia. En casos graves: coma, paro respiratorio, ceguera, convulsiones, acidosis metablica severa y muerte. cido actico glacial Los vapores producen irritacin en vas respiratorias. Sustancia muy corrosiva. Puede provocar bronconeumona, edemas en el tracto respiratorio. Quemaduras de piel. Trastornos de visin, ceguera (lesin irreversible del nervio ptico). Quemaduras en mucosas, en esfago y estmago. Espasmos, vmitos, por ingestin. Riesgo de perforacin intestinal y de esfago. No se descarta: shock, paro cardiovascular, acidosis, problemas renales. Radiacin UV (usada en el transiluminador) La exposicin a radiaciones UV puede producir quemaduras de retina, conjuntivitis, queratitis y cataratas. Y en piel puede producir eritemas.

TRABAJO PRACTICO DE LABORATORIO

PARTE B
Pst I P0
ATG

PARTE A

STOP

Pst I

Pst I Pst I P0 N-term Pst I

+
A A

+
Pst I P0 C-t Pst I

T4 DNA ligasa

T4 DNA ligasa Pst I

ATG

T EcoRI A

A T

EcoRI

pGEMT

Transformar bacterias competentes

Transformacin E. coli

Plaquear

LB-Ampicilina

LB-Ampicilina X-Gal IPTG

Esquema del Trabajo Prctico de Laboratorio

PARTE A: SUBCLONADO DE FRAGMENTOS DE PCR EN UN VECTOR CON T OVERHANGS.

Nota: cada grupo utilizara un producto de PCR diferente. 1) Reaccin de Ligacin utilizando vector pGEM-T Easy Vortexear vigorosamente el buffer de ligacin rpida 2X antes de cada uso. Adicionar : Agua milliQ Buffer de ligacin 2X pGEM-T Easy vector (50ng/ul) Producto de PCR DNA ligasa T4 1.5 ul 5 ul 0.5 ul 2 ul 1 ul

Mezclar la reaccin por pipeteo. Dar un spin en microcentrifuga e incubar 1 hora a temperatura ambiente. 2) Transformacin de clulas DH5 competentes con los productos de ligacin 1. 2. 3. 4. 5. Poner los productos de ligacin en hielo. Agregar 100 ul de bactrias competentes. Mezclar suavemente Incubar 10 min en bao de hielo Transferir los tubos a un bao de agua a 42C durante 45 segundos. Evitar agitar los tubos. 6. Transferir rpidamente los tubos a un bao de hielo e incubar durante 10 min. 7. Adicionar 0,8 ml de medio SOB SIN ANTIBITICO a cada tubo e incubar 45 min en estufa a 37C. 8. Preparar las placas: agregar a cada placa 40ul de X-gal 2% en DMF y 20ul de IPTG 100 mM Falta el antibiotico. Rastrillar y dejar secar. 9. Centrifugar la suspensin a 4.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante dejando aproximadamente 100 ul de medio SOB y resuspender el pellet. 10. Plaquear en placas LB-Agar-Ampicilina (50 ug/ml). 11. Incubar toda la noche a 37C. DIA 2 3) Anlisis de placas de clulas transformadas 1. Analizar las placas. Anotar observaciones. 2. Seleccionar 4 colonias blancas y una azul de cada placa con ampicilina. 3. Tomar una colonia con un tip estril e inocular un tubo con medio LB lquido con ampicilina (100 ug/ml). 4. Crecer los cultivos toda la noche a 37C con agitacin.

DIA 3 4) Anlisis de cultivos mediante preparacin rpida de cidos nucleicos. 1) 2) 3) 4) 5) 6) Tomar 100 ul de cada cultivo y transferirlo a un tubo eppendorf Agregar 10 ul de Buffer de Muestra para DNA 6X. Agregar 50 ul de Fenol: Cloroformo (1:1) equilibrado a pH 8.0. Vortexear. Centrifugar a 5000 rpm x 5 min. Sembrar 20 ul de la fase acuosa (superior) en un gel de agarosa 1 %.

5) Minipreparacin de ADN plasmdico

Tomar 1,5 ml cada uno de los cultivos seleccionados en el paso anterior y colocarlo en un tubo eppendorf. Centrifugar a 5000 rpm durante 5 minutos. Volcar en sobrenadante. Resuspender el pellet en 300 ul de Solucin I. Agregar 300 ul de Solucin II preparada recientemente. Mezclar por inversin SIN VORTEXEAR. Agregar 300 ul de solucin III. Mezclar por inversin. Incubar en hielo 15 min. Centrifugar a 13.200 rpm durante 15 minutos. Pasar el sobrenadante a un tubo nuevo con 3ul de RNAsa (20mg/ml) e incubar 2 hs. a 37 C. Realizar extraccin con Cloroformo: Isoamlico (24:1)

Agregar 600ul de Cloroformo: Isoamlico (24:1). Vortexear. Centrifugar a 13.200 rpm a temperatura ambiente durante 2 minutos.
Recuperar el sobrenadante. Precipitacin.

Agregar 600 ul de Isopropanol 100%. Mezclar por inversin en incubar 30 min a

temperatura ambiente. Centrifugar a 13200 rpm durante 15 minutos. Descartar el SN y lavar con 500 ul de etanol 70%. Centrifugar a 13.200 rpm por 5 minutos. Eliminar el sobrenadante y dejar secar el pellet a temperatura ambiente. Resuspender en 40 ul de H2O mQ. Solucin I Tris-HCl Glucosa EDTA Solucin II NaOH SDS Solucin III AcK 3M pH=5,2 0,2 N 1% 25mM 50mM 10mM pH=8

6) Digestin de plsmidos con EcoRI para identificar colonias recombinantes.

Agregar en un tubo:

H2O mQ Buffer Reaccin EcoRI 10X Plsmido EcoRI Incubar 1 hora a 37C. Correr en un gel de agarosa 2 %.

6 ul 1 ul 1 ul 0.5 ul

PARTE B: GENERACIN DE UNA VARIANTE TRUNCADA DE UNA PROTENA.

DIA 1 1) Digestin del plsmido pRSETA-P0 con Pst I. Agregar en un tubo: H2O mQ Buffer Reaccin 2 (10X) BSA 10X Plsmido Pst I 6 ul 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul

Incubar a 37C durante 3 hs. Inactivar la enzima calentando a 80C durante 20 min. 2) Religacin del vector Agregar en un tubo: H2O mQ Buffer Ligasa 10X Producto de digestin T4 DNA ligasa Tubo 1 6 ul 1 ul 2 ul 1 ul Tubo 2 (control sin ligasa) 7 ul 1 ul 2 ul ----

Incubar a temperatura ambiente durante 2 hs. 3) Transformacin de bacterias competentes con el producto de ligacin. Transformar 100 ul de bacterias competentes con 0.5 ul del producto de ligacin anterior. Seguir el mismo protocolo que para el clonado en pGEM-T easy, pero plaquear en placas sin X-Gal ni IPTG. DIA 2. 4) Anlisis de placas de clulas transformadas 1) Analizar las placas. Comparar el nmero de colonias en cada una. Anotar observaciones. 2) Seleccionar 3 colonias de la placa transformada con la ligacin del tubo 1 y una colonia de una placa transformada con el plsmido original sin digerir. 3) Tomar una colonia con un tip estril e inocular un tubo con medio LB lquido con ampicilina (100 ug/ml). 4) Crecer los cultivos toda la noche a 37C con agitacin.

DIA 3. 5) Anlisis de cultivos mediante preparacin rpida de cidos nucleicos. Tomar 100 ul de cada cultivo y transferirlo a un tubo eppendorf Agregar 10 ul de Buffer de Muestra para DNA 6X. Agregar 50 ul de Fenol: Cloroformo equilibrado a pH 8.0. Vortexear. Centrifugar a 5000 rpm x 5 min. Sembrar 20 ul de la fase acuosa (superior) en un gel de agarosa 1 %.

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