Programa PREPA

2007 - 2008




Curso de microscopia
moderna











Jean-Pierre GALAUP
Laboratoire Aim Cotton
Bt. 505, Centre dOrsay
91405 ORSAY cedex (France)

http://www.lac.u-psud.fr

e-mail : jean-pierre.galaup@lac.u-psud.fr




Universidad de Antioquia Medelln (Colombia)
3-14 de Diciembre 2007

2
3
Plan del curso

1 Introduccin
1.1- Historia de la microscopa
1.2- Principio de la formacin de las imgenes
1.2.1 La ptica geomtrica
1.2.2 Difraccin de Fraunhofer
1.2.3 Teora de Abbe
1.3- Lmite de resolucin de un microscopio
1.3.1 Criterio de Rayleigh
1.3.2 Apertura numrica
1.3.3 Aberraciones geomtricas y cromticas
1.3.4 Papel del condensador
1.4- Resultados comparados de las microscopas pticas

2 Microscopas fotnicas clsicas
2.1- Microscopa a fondo claro
2.1.1 Condiciones de una buena observacin
La contribucin del condensador
Alumbrado de Khler
Cual aumento?
2.2- Microscopa a fondo oscuro - Ultramicroscopa
2.2.1 Microscopa a fondo oscuro
2.2.2 Ultramicroscopa
2.3- Microscopa a contraste de fase
2.4- Microscopa en luz polarizada
2.5- Microscopa a contraste interferencial diferencial "Nomarski"

3 Microscopas pticas confocales
3.1- Principio
3.2- Formacin de la imagen confocal
3.2.1 Mejoramiento de la resolucin en microscopa confocal
Resolucin axial en x,y
Resolucin radial en z
3.2.2 Tratamiento y desconvolucin de la imagen confocal
3.3- Realizacin de un microscopio confocal
3.3.1 Microscopio confocal a barrido lser
3.3.2 Microscopio confocal a disco de Nipkow
3.3.3 Descripcin de un microscopio confocal invertido comercial
3.4- Ejemplos de aplicaciones

4 Microscopas pticas en campo cercano
4.1- Ondas evanescentes
4.1.1 Introduccin
4.1.2 Las ondas evanescentes de Fresnel
El vector de onda de la onda evanescente
4
La polarizacin de la onda evanescente
4.1.3 Algunas consecuencias de estas propiedades inusuales
Vuelta sobre el problema de la resolucin de un instrumento ptico
Los lmites de la onda evanescente de Fresnel
4.1.4 La difraccin evanescente
La difraccin de una onda llana
La microscopa ptica en campo cercano
4.2- Principales configuraciones
4.2.1 Microscopios en transmisin
4.2.2 Microscopios en reflexin
4.2.3 Microscopios a efecto tnel fotnico
Microscopios a efecto tnel ptico a barrido STOM o PSTM
Microscopios STOM/PSTM invertidos: el i-PSTM o TNOM
4.2.4 Microscopios en campo cercano a plasmones de superficie
4.2.5 Microscopios hbridos
Microscopios con control de la fuerza de cizallamiento ("shear-force
control")
Microscopios en campo cercano con contacto
4.3- Estructura bsica de un microscopio SNOM
4.3.1 Parte mecnica
El mdulo de translacin
Los tubos piezoelctricos
4.4- Nanocolectores y nanoemisoras
4.4.1 Distintos conceptos de nanocolectores
4.4.2 Fabricacin de las puntas
4.4.3 Control de la distancia a la superficie
Control ptico
Tcnica "shear-force"
4.5- Tratamiento de las imgenes
4.5.1 Filtrado por transformacin de Fourier

5 evolucin actual
5.1- Microscopa de fluorescencia fotnica multifotnica
5.2- Microscopa de objetos individuales
5.3- Microscopa Raman
5.3.1 Raman de resonancia
5.3.2 Raman exacerbado por efecto de superficie (SERS "Suface Enhanced
Raman Scattering")

6 Anexo: Glosario de microscopa fotnica

7 Bibliografa
5
1- Introduccin

Desde su invencin en el siglo XVII, el microscopio ptico se ha convertido en un
instrumento de uso corriente indispensable en muchos mbitos de la metalurgia a la biologa y
a la medicina.

Es un instrumento simple que aumenta considerablemente las capacidades de percepcin del
mundo a escala micromtrica por el ojo humano.

Los resultados de un microscopio dependen de las calidades de su ptica (Fig. 1.1), de las
condiciones de observaciones utilizadas (Fig. 1.2), pero hasta actualmente, no se comparan no
obstante a las observaciones realizadas en microscopa electrnica, sola tcnica permitiendo
alcanzar resoluciones sub nanomtricas (Fig. 1.3)



Figura 1.1: Resultados comparados
de un microscopio modelo juguete (a la izquierda) con un microscopio de laboratorio (a la derecha).




Figura 1.2: Comparacin entre dos observaciones hechas con un mismo microscopio pero con un alumbrado
incorrecto (a la izquierda) y un alumbrado correcto (a la derecha).

6


Figura 1.3: Observacin comparada de Gyrosigma sinense en microscopa ptica (a la izquierda) y en
microscopa electrnica (a la derecha). La barra representa una distancia de 1 m.

El problema de la finura de los detalles observables y de su resolucin constituye el problema
principal de la microscopa. A causa de la difraccin de la luz por la apertura limitada del
objetivo, una fuente de luz perfectamente puntual no puede dar una imagen tambin puntual,
pero solamente a una mancha de difraccin con un tamao tanto mayor que la apertura ser
limitada y el aumento buscado elevado.

La reciente evolucin condujo a buscar otros medios para superar este lmite impuesto por la
difraccin de la luz y mejorar las condiciones de observaciones de objetos particulares, de ah
la evolucin de la microscopa sobre fondo negro o ultramicroscopia, de las microscopas a
contraste de fase o interferenciales. El progreso ms notable en el mbito de la microscopa
fotnica en campo lejano es el de la microscopa dicha confocal que, si no aumenta
considerablemente la resolucin instrumental, permite una calidad de imagen inigualada y la
posibilidad de reconstituir en 3 dimensiones la imagen de un objeto.

La revolucin en este mbito vino del desarrollo de las tcnicas de microscopa en campo
cercano donde la utilizacin de las ondas evanescentes que solo existen muy cerca de la
superficie de un objeto. Al "recoger" estas ondas evanescentes por una sonda ptica colocada
a algunos nanmetros del objeto, se puede reconstituir una imagen del objeto con una
resolucin ampliamente sub longitud de onda y solamente dependiente de la dimensin de la
sonda.


1.1- Historia de la microscopa

Algunas fechas...

II siglo ante JC: Nron utilizaba al gatito de su anillo como lupa.
1608: Z. Jansen construye un microscopio a dos lentejas convergentes.
1633: Ren Descartes (1596-1650) escribe las leyes de la ptica.
1665: Robert Hooke (Freshwater - Londres 1635 1703) publica Micrographia, la primer
recopilacin de micrografas describiendo cuchillas finas de madera y dnde aparece el
trmino clula (Fig. 1.4). Siendo al mismo tiempo bilogo, paleontlogo, meteorlogo,
mecnico y astrnomo, Hooke fue uno de los ms brillantes experimentadores de su tiempo.
7
Su nombre permaneci tambin asociado a las leyes de deformaciones elsticas de los cuerpos
(ley de Hooke).




Figura 1.4: Microscopio de Hooke y micrografa de una cuchilla de corcho tomada por Hooke.

1669: Isaac Newton (1642-1727) descubre la descomposicin de la luz blanca por el prisma.
1695: Antonie Van Leeuwenhoek (1632 - Delft 1723) construy cerca de 500 microscopios
que le permitieron observar y describir por primera vez los microorganismos como: bacterias,
espermatozoides, protozoos, clulas sanguneas... (Fig. 1.5).



Figura 1.5: Leeuwenhoek y su famoso microscopio a una nica lenteja.

Leeuwenhoek era paero y comenz a pulir "lentejas" despus de la lectura del
Micrographia de Hooke. Amigo ntimo del pintor Vermeer cuyos no tena las subvenciones,
l ha debido buscar la ayuda de un ilustrador para sus tableros.
1746: J. Adams adapta un barrilete porta objetivos.
1828: W. Nicol desarrolla la microscopa en luz polarizada.
1849: J. Quekett publica un tratado prctico sobre el uso del microscopio.
1890: Ernst Abbe (Eisenach 1840 - Ina 1905), fsico, plantea las bases de la formacin de
las imgenes en el microscopio y elabora la teora de la resolucin de los instrumentos (Fig.
1.6). En 1866 l se une al mecnico Carl Zeiss con quien concibe lentejas a las aberraciones
muy escasas (objetivo apocromtico y a inmersin). En 1896, reforma a la sociedad Carl
Zeiss, cuyos beneficios por lo tanto se distribuyen entre la direccin, los trabajadores y la
Universidad de Ina.

8


Figura 1.6: Retrato de Ernst Abbe.

1903: R. Zsigmondy inventa el ultramicroscopio (perfeccionado por A. Cotton). Recibir el
Premio Nobel de Qumica en 1925 para su trabajo sobre los coloideos.
1908: Khler y Siedentopf realizan el microscopio a fluorescencia
1928: E. Synge sugiere un nuevo concepto para superar el lmite de difraccin e introduce el
concepto de super resolucin.
1942: F. Zernike (1888-1966) obtiene el Premio Nobel en 1953 para la microscopa a
contraste de fase.
1952: G. Nomarski se imagina el microscopio interferencial diferencial.
1982: G. Binning y H. Rohrer describen el primer microscopio a punta que utiliza la
corriente tnel electrnico, el "Scanning Tunneling Microscope" (STM).
1984: Los primeros equivalentes pticos del STM aparecen que abren la va a la microscopa
ptica en campo cercano
1985: Puesta a punto de la microscopa confocal a barrido lser.
1990: M. Orrit y J. Bernard detectan molculas nicas por fluorescencia.


1.2- Principio de la formacin de las imgenes

1.2.1 La ptica geomtrica

Segn las leyes de la ptica geomtrica, por un objetivo asimilado a una lenteja fina, se tiene
la relacin:

f
1
' p
1
p
1
= +
(1.1)

dnde p y p' son las distancias relativas respectivamente del objeto y la imagen al centro de la
lenteja y f es la distancia focal de la lenteja. Se tiene en cuenta que la imagen se invierte con
relacin al objeto.

9
objectif
objet
axe optique
image agrandie
Fo
Fi
p p


Figura 1.7: Ampliacin por un objetivo de microscopio. Fo es el foco objeto, Fi es el foco imagen del objetivo.
El aumento es la consecuencia directa de la focal corta del objetivo.

El crecimiento lineal es evaluado por:

p
' p
=
(1.2)

Segn el Eq. 1.1, si p f, entonces p' , lo que significa que si el objeto est en el foco de
la lenteja, la imagen se enva al infinito. Tomando en cuenta el Eq. 1.2 del aumento, se deduce
que la imagen ser tanto mayor que el objeto estar cerca del foco Fo y que la focal de la
lenteja ser corta. Sin embargo, no es posible aumentar infinitamente un objeto reduciendo la
distancia al foco y la focal del objetivo.

Adems, la ptica geomtrica no tiene en cuenta el carcter ondulatorio de la luz y los
fenmenos de difraccin van a limitar el crecimiento lineal de un objetivo a valores que
sobrepasarn apenas l00x. En un microscopio compuesto, la imagen formada en el plano
imagen del objetivo es reanudada por el ocular y el crecimiento total se obtiene multiplicando
el del objetivo por el del ocular.

1.2.2 Difraccin de Fraunhofer

Los fenmenos de difraccin se estudian normalmente en un curso de ptica ondulatoria. La
teora la difraccin se basa en el principio de Huygens-Fresnel que indica que la perturbacin
luminosa en un punto P resulta de la superposicin de las ondas secundarias emitidas por
todos los puntos de una superficie situada entre este punto y la fuente de luz. La traduccin
matemtica de este principio es la integral de Fresnel-Kirchhoff que se escribe:

[ ]dS ) s , n cos( ) r , n cos(
rs
e
2
A
) P ( U
) s r ( k

+
A
i
i
(1.3)

cuando se considera el paso de la luz a travs de una apertura de forma cualquiera A taladrada
en una pantalla (Fig. 1.8). k es el vector de onda = 2/. Si (x
0
, y
0
, z
0
) y (x, y, z) son las
10
coordenadas de los puntos P
0
y P respectivamente y (,) las coordenadas del punto Q en la
apertura, se puede poner de manifiesto que el Eq. 1.3 puede escribirse:

=

+
A
d d e
' s ' r
Ae A cos
) P ( U
) , ( kf
) ' s ' r ( k
i
i
i
(1.4)
dnde:
...
' s 2
) y x (
' r 2
) y x (
' s 2 ' r 2 ' s
y x
' r
y x
) , ( f
3
2
3
2
0 0
2 2 2 2
0 0
+

+
+
+
+
+

+
= (1.5)

La evaluacin de la integral 1.4 es ms simple cuando los trminos cuadrticos y los de
caracteres ms elevados en y pueden descuidarse. En este caso, se habla de la difraccin
de Fraunhofer. Cuando los trminos cuadrticos no pueden descuidarse, se habla entonces de
la difraccin de Fresnel. Afortunadamente, el caso ms simple de la difraccin de Fraunhofer
es el de mayor importancia en la ptica.

x
y z
P
0
P
O
Q
r
r
s
s


Figura 1.8: Difraccin por una apertura de forma cualquiera en una pantalla plana.

Estrictamente hablando, los trminos cuadrticos y los de caracteres ms elevados
desaparecen solamente cuando r' y s' tienden hacia el infinito, es decir, cuando a la vez el
punto fuente y el punto de observacin son al infinito. Es porqu, se habla tambin de
difraccin al infinito (o en campo lejano) en el caso de la difraccin de Fraunhofer. La
difraccin de Fresnel se observa cuando la fuente y la pantalla son muy cercanas. Del punto
de vista de la teora, la difraccin de Fresnel es ms general e incluye la difraccin de
Fraunhofer como un caso particular.

Utilizando las coordenadas polares (,) para el punto Q en la apertura circular:

cos = et sin =

y las coordenadas (,) para el punto P en el plano de difraccin:

11
wcos = p et wsin = q

De esta definicin de p y q, se siga que w =
2 2
q p + es el seno del ngulo que la direccin
(p,q) hace con la direccin central p = q = 0. La integral de Fresnel-Kirchhoff se pone
entonces bajo la forma:

=



d d e C ) P ( U
a
0
2
0
) cos( w k i -
(1.6)

Esta forma evidencia la representacin integral de las funciones de Bessel J
n
(x):

=



d e e
2
) x ( J
2
0
n cos x
n
i i
-n
i
(1.7)

La integral 1.6 se escribe entonces:

=

d ) w k ( J C 2 ) P ( U
a
0
0
(1.8)

Utilizando la relacin de recurrencia:
{ } ) x ( J x ) x ( J x
dx
d
n
1 n
1 n
1 n +
+
+
=
quin da por integracin para n=0:

=
x
0
1 0
) x ( xJ ' dx ) ' x ( J ' x
se obtiene:

(

=
kaw
) kaw ( J 2
a C ) P ( U
1 2

(1.9)

de ah se deduce la intensidad de la mancha de difraccin:

0
2
1
2
I
kaw
) kaw ( J 2
) P ( U ) P ( I
(

= = (1.10)

Es la famosa frmula de Airy, establecida para una apertura circular. Se dice tambin que I(P)
es la funcin de despliego de un punto, "Point Spread Function" en ingls o PSF. I
0
es la
intensidad en el centro de la mancha: I
0
= a
2
E/
2
, E siendo la energa total incidente.

Los mnimos de la funcin de Bessel J
1
(x) con x = kaw = 2aw/ se obtienen para x = 1.22,
2.233, 3.238... de ah se deduce que los rayos de los anillos oscuros son:

a
610 , 0 q p w
2 2

= + =
a
116 , 1


a
619 , 1

(1.11)

12
En el caso de una raja de anchura 2a, la ecuacin correspondiente hace intervenir el seno
cardinal
x
) x sin(
sin
c
= y se escribe:

) x ( sin I I
kpa
) kpa sin(
) P ( U ) P ( I
2
c 0 0
2
2
=
(

= = (1.12)

1.2.3 Teora de Abbe

Ernst Abbe formul la teora de la formacin de la imagen en un microscopio al final del siglo
XIX. Abbe trat el objeto como una fina estructura de difraccin y aunque no sea una
descripcin exacta de la seccin de plantas, es una muy buena aproximacin de la estructura
regular de las diatomeas por ejemplo.

La luz se difracta atravesando una red. Al rayo no desviado de orden 0 se aaden los rayos
difractados, por una y otra parte del rayo de orden 0 y segn los rdenes de difraccin
sucesivos: -1 y +1, -2 y +2, -3 y +3... Todos estos rdenes contienen una parte de la
informacin sobre el objeto estudiado. La apertura del objetivo limita el nmero de rdenes de
difraccin susceptibles de estar recogidos a travs de l (Fig. 1.9).

Las estructuras que difractarn mucho la luz, es decir, correspondiendo a elevadas frecuencias
espaciales equivalentes a una estructura de difraccin con un enorme nmero de rendijas al
milmetro, darn rayos con elevados ngulos de difraccin que no podrn ser recogidos por el
objetivo. Su ausencia no permitir la formacin de una imagen, reconstruccin fiel del objeto.



Figura 1.9: Ilustracin de la teora de Abbe. A la izquierda, el objeto es una red a escaso nmero de rendijas,
todos los rdenes de difraccin pasan por el objetivo y la imagen reconstituye el objeto. A la derecha, el objeto
difracta mucho y no todo los ordenes de difraccin son recogidos por el objetivo. En consecuencia, la imagen es
solamente parcialmente reconstituida, o incluso no aparecen las estructuras finas del objeto.

Vamos a describir este proceso de formacin de la imagen con ms detalle. En esta
presentacin de la teora de la formacin de las imgenes en un microscopio, limitaremos
nuestra atencin a los dos casos extremos de una iluminacin completamente incoherente de
una parte y de una iluminacin perfectamente coherente de otra parte. No se trata el caso de
una iluminacin sino parcialmente coherente.

Iluminacin incoherente

Consideremos un objeto luminoso por s mismo como, por ejemplo, el filamento
incandescente de una lmpara elctrica. Sea P el punto del objeto situado sobre el eje ptico y
Q un punto vecino a una distancia y de P en el plano objeto . Llamemos P' y Q' las imgenes
13
de estos puntos separadas de la distancia y' en el plano imagen ' (Fig. 1.10). y ' son
planes conjugados. Llamemos y ' los ngulos que hacen los rayos marginales que pasan
por el diafragma con el eje ptico.

F
D
a
P
Q
P
Q

y
y
Y
Y


Figura 1.10: Esquema que ilustra la teora del poder de resolucin del microscopio.

Sea a' el rayo de la zona supuesta circular en la cual el haz de luz convergente hacia P' corta el
plan focal posterior F' y llamemos D' la distancia entre el pupilo de salida y el plano imagen,
entonces, puesto que ' es pequeo:

' D
' a
' = (1.13)

Si w =
2 2
q p + es la separacin entre Q' y P', es decir, el seno del ngulo bajo el cual los dos
puntos se ven del centro de la apertura, entonces tenemos con una buena aproximacin:

Y = wD (1.14)

Sean n y n' los ndices de refraccin, y ' las longitudes de onda respectivamente en los
espacios objeto e imagen y
0
la longitud de onda en el vaco, entonces, puesto que segn el
resultado 1.11, el primer mnimo de la figura de difraccin de P es dado por w = 0,61'/a',
habemos al lmite de resolucin:

' ' n
61 , 0
'
'
61 , 0
' a
' D
61 , 0 ' Y
0

= = (1.15)

Utilizando la relacin de los senos: nYsin = - n'Y' sin', se substituye Y' por Y en el Eq. 1.15
y al asimilar sin' a ', se deduce:

sin n
61 , 0 Y
0
(1.16)
14

La ecuacin 1.16 da la distancia entre dos puntos objetos que un microscopio puede
exactamente separar cuando la iluminacin es incoherente y que la apertura es circular.

La cantidad nsin que se produce en esta ecuacin es la apertura numrica. Debe ser grande
para un mejor poder de resolucin.

Iluminacin coherente (teora de Abbe)

Consideramos el otro caso extremo donde la luz que surge del objeto puede tratarse como
estrictamente coherente. Esta situacin se realiza aproximadamente cuando un objeto fino con
una estructura relativamente simple es iluminado por la luz resultante de una fuente
suficientemente pequea a travs de un condensador a escasa apertura. La primera teora
satisfactoria de la resolucin de un microscopio bajo iluminacin coherente fue formulada y
tambin ilustrada con bonitas experiencias por E. Abbe en 1873.

Segn Abbe, el objeto acta a la manera de una estructura de difraccin, aunque no slo cada
elemento de la apertura del objetivo, sino tambin cada elemento del objeto debe tenerse en
cuenta en la determinacin de la perturbacin compleja que se produce en cualquier punto
particular del plano imagen. Bajo forma matemtica, la transicin del plano objeto al plano
imagen implica dos integraciones: una se extiende sobre el plano objeto, la otra se extiende
sobre la apertura. En la teora de Abbe, la difraccin por el objeto se considera primera y se
tiene el efecto de la apertura en cuenta en un segundo tiempo.

Para ilustrar la teora de Abbe, se considera la formacin de la imagen de un objeto con forma
de estructura de difraccin iluminada por una onda plana incidente normalmente sobre el
plano objeto segn el principio de la iluminacin central de Khler. La onda es difractada por
el objeto y da nacimiento a una figura de difraccin de Fraunhofer de la red en el plano focal
posterior F' del objetivo (Fig. 1.11), por eso llamado plano de Fourier. Los mximos que
corresponden a los espectros de carcter sucesivo de esta figura de difraccin se tienen en
cuentaS
-3
, S
-2
, S
-1
, S
0
, S
1
, S
2
, S
3


F
D f
(,)
(x,y)
(x,y)
S
0
S
1
S
2
S
3
S
-1
S
-2
S
-3
(p
,q
)
(p
,q
)


Figura 1.11: Esquema que ilustra la teora de Abbe de la formacin de la imagen en un microscopio bajo
iluminacin coherente.
15

Cada punto en el plano focal puede entonces considerarse como el centro de una emisin
coherente secundaria cuya contribucin ser proporcional a la amplitud en cada punto. Las
ondas luminosas resultantes de cada uno de estos puntos fuentes secundarias interferirn entre
ellas y darn nacimiento a la imagen del objeto en el plano imagen ' del objetivo. Para
obtener una imagen fiel, es necesario que todos los espectros (todos los ordenes de difraccin)
contribuyen a la formacin de la imagen. Esto no es nunca posible estrictamente a causa de la
apertura limitada del objetivo. De un punto de vista prctico sin embargo, es suficiente que la
apertura sea suficientemente grande para admitir todos los rdenes que transportan una
cantidad apreciable de energa.

Se observar que si el objeto posee estructuras de gran finura, equivalentes pues a una red
grabada muy fina, los ngulos de difraccin debidos a estas estructuras sern muy grande y
solamente un nmero muy limitado de rdenes de difraccin, o incluso al lmite uno slo,
podr pasar a travs del objetivo. Por consiguiente, el objeto no podr reconstituirse con toda
la finura necesaria y se habr alcanzado el lmite de resolucin del instrumento.

Estas consideraciones pueden expresarse de una manera precisa sin limitarse al caso de
objetos asimilados a estructuras de difraccin. Sean (x,y) las coordenadas de un punto tpico
del plano objeto y f la distancia del plano focal F' a la lenteja objetivo, la perturbacin en el
punto (=pf, =qf) del plano F' es dada por la frmula de Fraunhofer:

(

\
|
+

=
A
dxdy y
f
x
f
k exp ) y , x ( F C ) , ( U
1
i (1.17)

dnde F es la funcin que describe la transmisin del objeto, C
1
es una constante y la
integracin se efecta sobre la superficie A del plano objeto cubierta por el objeto.

Consideramos ahora la transicin del plano focal F' al plano imagen P'. D' siendo la distancia
entre estos dos planes, en el punto tpico (x' =p'D', y' =q'D') del plano imagen, la perturbacin
debida a la difraccin de Fraunhofer por una apertura B situada en el plano F' ser:

\
|
+ =
B
d d
' D
' y
' D
' x
k exp ) , ( U C ) ' y , ' x ( V
2
i (1.18)

La sustitucin del Eq. 1.17 en el Eq. 1.18 d:



(

|
|

\
|

|

\
|
+ +
|

\
|
+ =
B A
d dxdyd ' y
' D
f
y ' x
' D
f
x
f
k
exp ) y , x ( F C C ) ' y , ' x ( V
2 1
i (1.19)

Si se supone que F(x,y) se define como nula para todos los puntos del plano objeto que se
encuentran a fuera del objeto el mismo, es decir, de A, entonces la integracin con relacin a
x e y puede formalmente extenderse de +. Del mismo modo, si la apertura B es
suficientemente grande para que ) , ( U sea desdeable para los puntos del plano focal F'
que se encuentran fuera de B, entonces las integraciones con relacin a y pueden tambin
extenderse de +. Llamemos M (<0) el aumento entre los planes y ', definido por:

16
f
' D
M = o
M
1
' D
f
= (1.20)

Al utilizar el teorema de la integral de Fourier, se obtiene

) y , x ( CF )
M
' y
,
M
' x
( CF ) ' y , ' x ( V = = (1.21)

dnde (x,y) es el punto objeto cuya imagen est en (x',y') y la cantidad definida por:

C=C
1
C
2

2
f
2
(1.22)

es constante. As pues, si la apertura es suficientemente amplia, la imagen es estrictamente
similar al objeto, tanto en amplitud como en fase, pero invertida.

En el caso de una iluminacin coherente, se puede poner de manifiesto que el lmite de
resolucin es:

sin n
77 . 0 Y
0
(1.23)

A parte el valor del factor numrico que es realmente un tanto arbitrario, este lmite es
prcticamente idntico a la obtenida en el caso de una iluminacin incoherente.


1.3- Lmite de resolucin de un microscopio

El concepto de resolucin es el concepto ciertamente ms importante en imgenes. Se habla
tambin de poder de resolucin. Describe la capacidad de un sistema para solucionar los ms
pequeos detalles de un objeto. Se propusieron distintos criterios para definir de manera
simple la resolucin de un sistema de imgenes. El ms conocido y utilizado est sin duda
alguna el criterio de Rayleigh que es una forma sucinta del principio de Abbe.

1.3.1 Criterio de Rayleigh

Como se acaba de verlo, la resolucin conferida por un objetivo es limitada por la difraccin.
Resulta de las interferencias al nivel del plano imagen, de las ondas luminosas difractadas a lo
largo del trayecto de los rayos (Fig. 1.12).

La resolucin como tal fue definida por Rayleigh y corresponde a la distancia mnima d
min

entre dos puntos objetos que se darn por separados (solucionados) si el mximo de
intensidad del disco de Airy del primer punto corresponde al primer mnimo de intensidad del
disco de Airy del segundo punto.

Tal como se representa sobre la figura 1.13, se nota que en estas condiciones ideales, la
intensidad en el hueco situado entre los dos mximos es igual al 81% de la intensidad del
mximo de la imagen individual de cada punto.

17


Figura 1.12: Formacin de la imagen en un microscopio. La imagen de un punto es de hecho una mancha de
difraccin (disco de Airy) o funcin de despliego del punto resultante de la interferencia entre las ondas
difractadas que recorren trayectos distintos hasta al plano imagen.



Figura 1.13: Definicin de la resolucin o poder separador por el criterio de Rayleigh que precisa las
condiciones para permitir discriminar dos discos de Airy.

Segn este criterio de Rayleigh, la resolucin terica es igual a:

NA
d
min

= . 61 . 0 (1.24)

dnde NA es la apertura numrica ("Numerical Aperture"), es decir, nsin."

Esta relacin que define el poder separador del instrumento solo est en todo rigor vlida si el
objetivo recoge la luz procedente de un condensador que tiene la misma apertura numrica
que la del objetivo. Muy afortunadamente, en epi-iluminacin, es decir cuando se recoge la
luz de fluorescencia o la luz dispersada sobre un fondo negro, esta condicin se cumple
perfectamente puesto que el propio objetivo desempea tambin el papel de condensador.
18

En realidad, en la formacin de la imagen en un microscopio, es necesario tener en cuenta dos
funciones de distribucin de la luz:
- la funcin de despliego del punto en el plano focal, es decir, la mancha de Airy o ms
generalmente, el PSF que condiciona la resolucin lateral (en X y en Y).
- la funcin de desfocalizacin que condiciona la resolucin axial (profundidad de
campo) a lo largo del eje ptico (en Z).

1.3.2 Apertura numrica

Experimentalmente, la funcin de despliego de un punto (PSF por "Point Spread Function")
se obtiene observando un punto luminoso ideal (infinitamente pequeo) a travs de un
objetivo. Bajo la imagen usual del disco de Airy, el PSF aparece en forma de un mximo de
intensidad rodeado de anillos cada vez ms oscuros. Resulta de la incapacidad de la lenteja
que debe recogerse la luz dispersada ms all de un ngulo dado (medio ngulo de apertura
del cono de luz entre el foco y la lenteja).

El cono de luz entre el foco y la lenteja de medio ngulo en la cumbre define la apertura
numrica NA = nsin del objetivo. La apertura numrica NA es una caracterstica esencial de
un objetivo. Es ella que es directamente responsable de la luminosidad y de la resolucin de
un objetivo.

Dos otras caractersticas del objetivo dependen de la apertura numrica: son la distancia de
trabajo D y la profundidad de campo z. La figura 1.14 ilustra los cambios causados sobre la
funcin de despliego del punto PSF y sobre la profundidad de campo. Cuanto ms la apertura
numrica es grande, ms el PSF es fino y la profundidad de campo z pequea.

D D D
iris iris

z z z
PSF PSF PSF


Figura 1.14: La apertura numrica es caracterizada por el ngulo y determina la distancia de trabajo D y la
profundidad de campo z. Un iris colocado delante de la lenteja permite hacer variar la apertura numrica sin
cambiar el crecimiento y de aumentar as la profundidad de campo.

Un objetivo de alta calidad ser caracterizado por una gran apertura numrica (1.0<NA<1.45)
lo que tiene como consecuencia una distancia de trabajo limitada (90 a 180 m) y una
profundidad de campo reducida (efecto de seccionamiento ptico).
19

Se puede establecer la relacin siguiente entre la profundidad de campo z y la apertura
numrica:

(
(

|
|

\
|

=
2
2
1 1 4
z
n
NA
n

(1.25)

Generalmente, los objetivos de escaso aumento (5x a 20x) tienen una escasa apertura
numrica NA (0.5 a 0.75) pero ofrecen una gran distancia de trabajo y una gran profundidad
de campo. Los objetivos de aumento superior (40x a l00x) tienen una NA superior a 0,75 y
obtienen una excelente resolucin pero una baja profundidad de campo. Para obtener una
apertura numrica efectiva superior a 0.75, los objetivos deben ser a inmersin, es decir que
se interpone entre el objeto y el objetivo un lquido adaptador de ndice (Fig. 1.15). La
apertura numrica entonces se aumenta. Por ejemplo, por un objetivo a inmersin en el aceite
(n = 1.515) teniendo un medio ngulo de 67.5, se obtiene una apertura numrica de 1.40 en
lugar de 0.9 por el mismo objetivo a seco, es decir en el aire (n = 1).

n
2
n
3
n
1
n
1
A B C A B C
Objectif sec
n
1
n
2
Objectif immersion
n
1
n
3


Figura 1.15: Apertura numrica e inmersin del objetivo. A la izquierda la diferencia entre los ndices de
refraccin n
2
y n
1
es grande, los rayos luminosos A,B y C se desvan hacia el exterior en el paso del medio del
objeto en el aire. Se perdern los rayos ms externos. A la derecha, se utiliza un lquido de inmersin de ndice
n
3
muy prximo a n
1
. Los rayos ya no son desviados y todos son recogidos por la lenteja.

Las ventajas de un objetivo a inmersin son triples:
Aumento de la apertura numrica del objetivo,
Eliminacin de la aberracin esfrica debida al cubre-objeto,
Eliminacin de la reflexin total a la superficie superior del cubre-objeto.

Se pueden hasta utilizar condensadores a inmersin, sin embargo, se puede calcular que la
ganancia en resolucin que se obtiene por inmersin del condensador solo es marginal, NA
cond

cambiando no mas que de 0.95 a 1.2.

Algunos objetivos disponen de un diafragma a iris que permite regular la apertura numrica
del objetivo. Esto permite aumentar la profundidad de campo reduciendo la apertura del iris.
Evidentemente, eso implica una degradacin de la finura de la imagen, sin embargo se
20
constatar que una disminucin del dimetro del iris en aproximadamente 80% de su apertura
completa solo disminuye ligeramente el poder de resolucin pero mejora mucho el contraste.
La frmula permite determinar que para una luz a 500 nm, NA
obj
= 1.3 y NA
cond
= 0.95 (es
decir un condensador "seco"), la resolucin mxima del microscopio puede alcanzar alrededor
de 260 nm. Es un lmite que el se puede alcanzar en rutina.

1.3.3 Aberraciones geomtricas y cromticas

La realizacin de un objetivo de microscopio es extremadamente compleja y debe tener en
cuenta toda clase de defectos.

Una correccin importante del objetivo se refiere a la aberracin esfrica. Con los sistemas
de lentejas que no son corregidas, la imagen sufre una tal deformacin esfrica que los
detalles situados al permetro de la imagen se vuelven borrosos si la puesta a punto se hace
sobre el centro, y contrariamente. Los objetivos aplanticos corrigen completamente la
aberracin esfrica. Una correccin parcial puede a menudo ser suficiente y en consecuencia
ms econmica.

Por construccin, una lenteja es una dioptra a curvatura variable que debe garantizar la
convergencia de los rayos luminosos por refraccin. Sin embargo, a causa de la dispersin del
ndice, el ngulo de refraccin vara en funcin de la longitud de onda. Es decir, para un
objeto encendido por la luz blanca, se obtiene una diferente puesta a punto siguiente que las
partes observadas son rojas, verdes o azules tal como representado sobre la figura 1.16.

Fo
Fo
rayon blanc
Bleu Rouge
Sans correction
Avec correction
axe optique


Figura 1.16: Aberracin cromtica. Sobre la mitad superior, el objetivo no es corregido, la luz blanca es
dividida y los rayos rojos, verdes y azules convergen en puntos diferentes a lo largo del eje ptico. Sobre la
mitad inferior, el objetivo es corregido por la adicin de una lenteja divergente para compensar la dispersin de
los rayos de diferente longitud de onda. Todos ahora se concentran en el mismo punto.

Este defecto se llama la aberracin cromtica. En los objetivos de microscopio, se elimina
este defecto fabricando objetivos compuestos constituidos por varias lentejas con leyes de
dispersiones de ndice diferentes con el fin de corregirse mutuamente, pero en la prctica, esta
aberracin cromtica de los objetivos se corrige de manera muy diferente segn los
fabricantes. Segn la correccin efectuada, se distinguen objetivos acromticos, semi-
apocromticos y apocromticos.
Adems si la correccin de la aberracin esfrica tambin se realiza, el objetivo implica la
mencin "aplantica" (por ejemplo, un objetivo ser aplantico-apocromtico). Los objetivos
apocromticos son los que ofrecen la mejor correccin cromtica y un contraste de imagen
especialmente bueno. Se les emplea para examinar las estructuras finas y coloreadas. Las
aberraciones cromticas de los objetivos acromticos baratos no son generalmente
21
perceptibles. Asociados a un filtro verde, los objetivos acromticos pueden perfectamente
emplearse para la fotografa blanco y negro. Para la fotografa color, es preferible utilizar
objetivos semi-apocromticos o apocromticos con el fin de garantizar la fidelidad de los
colores y un buen contraste.

1.3.4 Papel del condensador

El papel del condensador en un microscopio es esencial permitiendo encender de manera
homognea el campo del microscopio. El dispositivo la ms corriente es el condensador de
Khler. Est constituido por una fuente luminosa, seguida de un diafragma de campo
(limitando la iluminacin al campo microscpico visible). Una lenteja colectora recupera la
luz de la fuente, un diafragma de apertura permite ajustar la apertura numrica del
condensador en funcin de la del objetivo utilizado, y finalmente la lenteja condensador
propiamente dicha concentra la iluminacin sobre el espcimen. El ajuste de los distintos
constituyentes del dispositivo condensador es capital para la obtencin de una imagen resuelta
y de un buen contraste (Fig. 1.17). En particular, el centrado y la focalizacin del condensador
deben ajustarse cada vez que se cambia de objetivo. As mismo la apertura de los dos
diafragmas debe siempre ajustarse a la dimensin del campo del microscopio.



Figura 1.17: Influencia del diafragma del condensador sobre la resolucin en el seno de la imagen
microscpica de una diatomea: a la izquierda, el diafragma del condensador es correctamente arreglado; a la
derecha, el diafragma del condensador es demasiado cerrado. La imagen a la derecha, mismo si ella aparece
con un mejor contraste, es sin embargo mala con respecto a la resolucin. Las estructuras finas de la diatomea
solo son visibles sobre la imagen a la izquierda obtenida con un ajuste correcto del diafragma del condensador.

La profundidad de claridad viene determinada por el aumento global y la apertura del
condensador. Cuanto ms el aumento global es elevado, ms la profundidad de claridad es
reducida. La disminucin de la apertura del condensador permite aumentar algn poco la
profundidad de claridad pero a las costas del poder separador.


22
1.4- Resultados comparados de las microscopas pticas

Se comparan los resultados entre las tres principales familias de microscopas pticas. Las
microscopas clsica y confocal se dicen en campo lejano. La luz transmitida, reflexionada o
emitida por el objeto es recogida por un objetivo situado a una relativamente grande distancia
de la muestra. Las nuevas microscopas en campo cercano utilizan una sonda local,
generalmente una fibra ptica de forma muy afinada que viene a recoger la informacin a la
vecindad inmediata, es decir a solo algunos nanmetros de la superficie de la muestra.

En el cuadro 1.1 comparativo, se tiene en cuenta:

1) El tipo de deteccin: la primera condicin para formar una imagen de un objeto
depende de la capacidad del instrumento para detectar la presencia de este objeto y en
consecuencia recoger suficientemente de fotones que llevan una informacin
pertinente sobre el objeto. Un criterio de deteccin puede definirse como la capacidad
para detectar un tal nmero mnimo de fotones tal que la relacin seal/ruido sea
mayor que 1. Si
det
es el lmite mximo de deteccin, debe comprobar desigualdad:

det p
n s > = h con
det
>n (1.26)

dnde n
p
es el nmero de fotones, s la seal y n el nivel medio de ruido en energa.

En el cuadro, se precisa tambin el tipo de deteccin. En un microscopio clsico, la
imagen es recogida directamente por el ojo, una placa fotogrfica o una cmara CCD:
se trata de una deteccin en paralelo de todos los elementos de la imagen. No es el
caso para las otras tcnicas que requieren el barrido de un elemento, por ejemplo del
haz lser, de una sonda local o del propio objeto: se trata entonces de una deteccin
secuencial. La imagen se adquiere punto por punto. Esto puede ser un inconveniente
principal para la observacin de clulas vivas u de objetos mviles.

2) La localizacin: despus de haber extrado la seal del ruido, la prxima etapa es
localizar el elemento emisor o difractando del objeto. Aunque la mancha de difraccin
es mayor que /2, el elemento puede localizarse con una precisin bien mayor que la
longitud de onda. Por ejemplo, el movimiento errtico de una bacteria de un dimetro
de 1 m puede seguirse con una precisin de algunos nanmetros o menos aunque el
dimetro de la imagen pueda ser alrededor de 2 m. Evidentemente, eso es posible si
la imagen del objeto conserva siempre la misma forma en su desplazamiento.

3) La resolucin: hemos examinado este punto con todo detalle anteriormente. Se
mide comparando las funciones de despliego de un punto (PSF) de cada instrumento.
En el caso de los microscopios en campo cercano, es la dimensin de la sonda que es
determinante. Observemos que el contraste a veces se confunde con la resolucin
porque se considera una imagen bien contrastada a menudo como una buena imagen
segn los criterios de la percepcin visual humana.

4) Finalmente, se considera el problema de los artefactos. Es la crtica ms fuerte
relativa a las tcnicas de campo cercano que trabajan "en ciego". Segn los modos de
interaccin de la sonda con la superficie de la muestra, pueden generar seales que,
mal interpretados, pueden conducir a una representacin errnea del objeto.
23

Tipo de microscopia Clsica Confocal Campo cercano
Tipo de deteccin
Paralelo
(formacin de una
imagen)
Secuencial
(a barrido)
Secuencial
(a barrido)
Nivel de seal
(convertido en corriente)
De unos mA a unos A De unos mA a unos A De unos A a unos nA
Relacin seal/ruido Bueno Bueno Dbil
Deteccin Fcil Fcil Difcil
Localizacin Fcil Fcil a difcil Delicada a difcil
Funcin de despliego de
un punto (PSF)
2
1
) ( J 2
(

=
v
v
h
4
1
) ( J 2
(

=
v
v
h
Elevada, mas all de /2
Dependiente del dimetro
de la punta
Coherencia de la luz
Coherente, parcialmente
coherente o incoherente
Coherente Siempre coherente
Riesgo de artefactos
Dbil
(pticos)
Dbil
(pticos o electrnicos)
Importante
(pticos, electrnicos o
mecnicos)

Cuadro 1.1: Comparacin de las tres microscopas pticas bsicas.

Si cada instrumento posee sus ventajas e inconvenientes en funcin de este a que se lo destina,
se tendr en cuenta que las microscopas a campo cercano son instrumentos delicados que
requieren experiencia a la vez en electrnica, ptica y tratamiento de imgenes.

24
25
2 Microscopas fotnicas clsicas

Tratamos en primer lugar brevemente de lo que se acuerda llamar la microscopa a fondo
claro, donde la imagen formada por la luz desviada se ve sobre un fondo de luz no desviada.
Es la forma ms corriente de la microscopa, para la cual recordamos las condiciones que
deben cumplirse para una buena observacin.

En lo que sigue en este captulo, discutimos de tcnicas de observacin ms sofisticadas
complementarias o alternativas: la microscopa con fondo negro y 3 mtodos que permiten el
aumento del contraste de las imgenes. La microscopa a contraste de fase es detallada y
mencionamos brevemente dos otras tcnicas: la observacin en luz polarizada y la
microscopa interferencial DIC Nomarski.


2.1- Microscopa a fondo claro

Es el mtodo ms clsico y ms comn que conviene especialmente al examen de los objetos
coloreados o contrastados. Puede tratarse de objetos ya coloreados o que lo pasan a ser a la
consecuencia de un tratamiento conveniente o an de objetos incoloros que poseen un ndice
de refraccin muy diferente del agua como gotas de aceite, las paredes celulares, los cristales,
los granos de almidn, las burbujas de aire, etc.

2.1.1 Condiciones de una buena observacin

La contribucin del condensador

Al exponer la teora de la formacin de las imgenes, admitimos que la muestra era encendida
por un estrecho haz de luz paralela. A partir de la teora de Abbe, se dedujo que una imagen se
forma cuando los dos mximos de primer orden de difraccin pueden interferir con la luz no
desviada. En realidad, un nico mximo de primer orden basta. Es representativo de la red y
lleva exactamente suficientemente informacin para crear una imagen cuando interfiere solo
con el rayo no desviado.

Eso quiere decir que si se enciende la muestra con un haz oblicuo, a la vez un mximo de
primer orden y el haz no desviado pueden ser recogidos por el objetivo. Se tiene pues ventaja
que utilizar un alumbrado cnico, es decir, por un cono de luz teniendo un ngulo igual al
ngulo de admisin del objetivo. Es exactamente lo que hace el condensador.

Tengamos en cuenta que para recoger completamente la luz con un objetivo a inmersin, el
condensador debe tambin engrasrsele. Este hecho es muy vinculante, aumenta la difusin y
puede tanto reducir el contraste que el beneficio de aumento de la resolucin puede perderse.

Tengamos en cuenta tambin que el diafragma del condensador se abre casi nunca
completamente cualquiera que sea el objetivo y su apertura numrica ya que eso reduce el
contraste. Slo los objetivos apocromticos ms recientes permiten el alumbrado completo de
su apertura, pero incluso con estos objetivos, se obtiene un mejor contraste cuando el
diafragma del condensador es cerrado ligeramente.

Alumbrado de Khler

26
Este mtodo de ajuste debido a Khler se aplica a todas las tcnicas microscpicas por
transparencia, es decir, bsicamente claramente, al contraste de fase y a la polarizacin. Los
detalles del procedimiento que debe seguirse para realizar un buen alumbrado de Khler esta
a continuacin:

Poner en posicin la preparacin y efectuar la puesta a punto con un objetivo de
engorde medio (por ejemplo 10x). Este ajuste no debe despus mas modificarse a
continuacin.

Cerrar el diafragma de la fuente luminosa y ajustar correctamente el diafragma del
condensador. Para un ajuste ptimo del diafragma del condensador, se retira el ocular
y luego se cierra el diafragma hasta que un tercio del campo est obscurecido.

Subir o bajar el condensador hasta que el borde del diafragma de la fuente luminosa
se vuelva muy neto. Si los defectos cromticos del condensador y el objetivo no son
corregidos perfectamente, uno afilado azul y rojo puede aparecer en el bordo del
diafragma de la fuente luminosa. El diafragma esta perfectamente focalizado cuando
el color pasa del rojo al azul.

Centrar el diafragma de 1a fuente luminosa. Para la mayora de los microscopios
este ajuste se hace a la ayuda de dos tornillos de centrado colocados sobre el
condensador.

Terminar el ajuste abriendo el diafragma de la fuente luminosa hasta que este
desaparezca del campo ptico.

Cual aumento?

Para una buena resolucin, es absolutamente crucial garantizar una gran apertura numrica,
pero el aumento o engorde no dice nada sobre el contenido de la imagen y es una cuestin a
menudo de conveniencia del observador. Es necesario sin embargo garantizar que ninguna
informacin de la imagen se perder.

El engorde de un microscopio se calcula por el producto del crecimiento del objetivo (por
ejemplo 100x) por el del ocular (por ejemplo 10x) de ah un engorde de1000x. La eleccin del
engorde depende del mtodo de observacin:

Observacin visual: a una distancia de lectura cmoda de 25 cm (que es lo que
tenemos aproximadamente en microscopa), las personas teniendo una excelente vista pueden
solucionar detalles de 0.3 mm, para otros ser solamente de 0.5 mm. Un crecimiento de 1000x
es suficiente para algunos, entonces que 1500x es mejor para otros.

Microfotografa: las pelculas de documentacin utilizadas en microfotografa pueden
tener un poder de resolucin de 100 lneas/mm, es decir, 10 m. Con pelculas de menos
buena resolucin, por ejemplo 60 m, un engorde de 200x ser suficiente para registrar un
detalle de 0.3 m.

Monitores vdeo, ordenadores: la trama de la imagen de televisin donde la estructura
pixelizada de la pantalla del ordenador ser el factor que limitar, lo que significa que no se
puede esperar mostrar el detalle de una copia fotogrfica al mismo engorde sobre la pantalla.
27


2.2- Microscopa con fondo negro - Ultramicroscopia

2.2.1 Microscopa con fondo negro

Cuando el sol entra en una habitacin obscurecida a travs de una raja de los aspectos, las
finas partculas de polvo normalmente invisibles aparecen sobre el fondo negro ya que
difunden la luz. La luz no desviada esta excluida, la luz desviada produce la imagen. Una
manera simple de obtener un alumbrado en fondo negro es colocar una mscara central en el
apoyo a filtro del condensador. Esta mscara opaca se clava al centro de un disco transparente
ajustado en el soporte del filtro del condensador (Fig. 2.1).

Esta mscara central para la luz directa y solamente los rayos que forman un ngulo mayor
que "el ngulo de admisin" del objetivo utilizado pueden alcanzar el objeto. El fondo es
negro y la luz difundida (desviada) por el objeto (drenado en azul claro en la figura 2.1) es
vista por el objetivo.



Figura 2.1: La muestra solo se enciende por rayos muy oblicuos y solamente la luz difundida por el objeto (en
luz sobre el esquema) penetra a travs del objetivo.

El tamao de la mscara central depende de la apertura numrica del objetivo. Una mscara
central alrededor de 15 mm de dimetro basta generalmente para dar un fondo negro con un
objetivo de alrededor 0.5 de apertura numrica, segn las propiedades del condensador del
microscopio. Una mscara central de 20 mm permitir generalmente dar un fondo negro a un
objetivo de 40x/NA 0.65.

La altura del condensador debe ajustarse para un mximo de luminosidad al centro del campo.
Puede abrirse el diafragma de campo completamente puesto que no hay gran diferencia entre
una iluminacin de Khler y un alumbrado crtico en esta situacin.

Para los fondos negros a aperturas numricas mayores, se fabrican condensadores especiales
de tipo "cardioides" con fondo negro utilizando espejos (Fig. 2.2). Se engrasan con aceite (o
se puede tambin por razones prcticas utilizar del agua) y exigen una puesta a punto y un
centrado exactos.

28
Incluso estos condensadores especiales no pueden utilizarse con objetivos a apertura numrica
de 1.2 o superior. La razn es que es necesario considerar dos aperturas numricas para estos
condensadores con profundidad negro: la apertura numrica interna (es decir, la porcin de
luz bloqueada) y la apertura numrica externa (que por razones tcnicas se limita a 1.4).



Figura 2.2: Esquema de un condensador modelo cardioide.

Por un objetivo NA 1,25, es necesario parar toda la luz hasta la apertura numrica 1.3 al
menos. El cono de luz restante se limita as entre NA 1.3. y NA 1.4. No est simplemente
suficiente para producir un fondo negro utilizable. La apertura numrica interna lmite
alcanzable con los condensadores con fondo negro actuales es de NA 1.0 lo que se adapta a
objetivos a inmersin de aceite de potencia medio 40x a 60x.

El contraste en fondo negro es extremo y la resolucin es tambin buena que puede darlo el
objetivo utilizado. El fondo negro es espectacular para la observacin de los protozoos vivos o
de las bacterias (Fig. 2.3) ya que vuelve visibles los latigazos y los flagelos, y tambin para
las diatomeas.



Figura 2.3: Imagen sobre fondo negro de bacterias.

Las limitaciones del fondo negro son las siguientes: primero, los objetos gruesos, anchos o
demasiado difusos son inexplotables en fondo negro. A continuacin, los errores residuales de
los objetivos (en particular, las aberraciones esfricas) se vuelven visibles al mximo. Es el
29
caso especialmente con objetivos 40x y forma la razn principal de utilizacin de objetivos
40x a inmersin, mucho ms ventajoso en este caso.

Para el examen de especimenes vivos en fondo negro, un objetivo 40x a inmersin de agua es
ideal. Por ltimo, todos los granos de polvo o los rastros de grasa se vuelven tambin visibles
al mximo. Es necesario pues disponer de una cadena de alumbrado meticulosamente propia:
lentejas superiores del condensador, las dos superficies de la cuchilla, muestra diluida y
"propia", sin grasa.

2.2.2 Ultramicroscopia

La ultramicroscopia es una tcnica de microscopa en fondo negro pero al origen y a
diferencia de la tcnica anterior, se enciende lateral y no la muestra violentamente en
transmisin. Esta tcnica se adapta especialmente para detectar partculas de dimensiones
muy inferiores a la longitud de onda.

La ultramicroscopia utiliza las capacidades de difusin de las partculas (efecto Tyndall) y se
adapta especialmente a la deteccin de partculas metlicas (coloideos de oro o de plata).
Inventado por R.A. Zsigmondy, el ultramicroscopio fue perfeccionado por A. Cotton y H.
Mouton.

Biografa de Richard Adolf Zsigmondy (1865-1929)

Richard Adolf Zsigmondy fue un qumico alemn nacido en Viena en 1865 y
muerto a Gttingen en 1929. Hizo sus estudios en Viena luego en Munich dnde
obtuvo su doctorado en 1889. Fue ayudante a la Universidad de Berln luego paso a
ser en 1893 amo de conferencia a la Escuela Politcnica de Graz en Austria. De
1897 a 1900, trabaj para Schott a Ina. Se volvi luego a ser profesor y director
del Instituto de Qumica a Gttingen
En Berln, se interes por los colores producidos por soluciones coloidales de
oro aplicadas sobre porcelana. Cuando lleg a Iena, estudi los vidrios coloreados,
lo que lo condujo al estudio de los coloideos. En 1903, con uno de sus
colaboradores, inventara y construy el ultramicroscopio que explota el efecto
Tyndall. Este microscopio se volvi el instrumento de referencia hasta la llegada
del microscopio electrnico en 1939 para observar los coloideos.
Obtuvo el Premio Nbel de qumica en 1925 "para su explicacin de la naturaleza heterognea de las
soluciones coloidales y para los mtodos aplicados durante sus investigaciones que tienen una importancia
fundamental en la qumica moderna de los coloideos".

Nota sobre los coloideos: No se pueden observar correctamente al microscopio clsico sino objetos cuyo
tamao es superior a la longitud de onda de la luz visible. Los coloideos estn constituidos por partculas ms
pequeo que esta longitud de onda pero que puede difundir de la luz por efecto Tyndall.

En el libro escrito en 1906 por Cotton y Mouton (Fig. 2.4), se informa de que "las ms
pequeas dimensiones consideradas as en las condiciones ms favorables, con la luz
solar del medio de un bonito da de verano son de 3 a 6 nm".

Aunque esta tcnica no tiene ya que un inters histrico hoy, es importante observar que
algunos de los montajes utilizados son de una gran actualidad, en particular, el dispositivo a
ondas evanescentes de Cotton y Mouton que se encuentra hoy en da en algunos montajes de
microscopa en campo cercano.

30




Figura 2.4: Pgina de cobertura del libro de A. Cotton y H. Mouton escrito en 1906 sobre la ultramicroscopa.
A la derecha, un montaje de ultramicroscopa como utilizado en la poca. Debajo, el dispositivo a ondas
evanescentes imaginado por Cotton y Mouton.


2.3- Microscopa a contraste de fase

El microscopio a contraste de fase es un dispositivo que permite observar preparaciones que
no fueron coloreadas. Se adapta pues especialmente bien a la observacin de clulas vivas.

El principio se basa en la formacin de un contraste de intensidad creado por la interferencia
de rayos luminosos a los cuales se les hace sufrir un defasaje diferencial: el microscopio a
contraste de fase transforma las diferencias de fase normalmente no aparentes en zonas
visibles claras y oscuras. Para eso, se coloca un anillo de fase (un diafragma anular) en el
condensador y una cuchilla de fase anular en el objetivo del microscopio (Fig. 2.5).

El anillo de fase permite crear una iluminacin de forma anular que ser parada
completamente por el anillo opaco de la placa de fase. Este anillo opaco para la transmisin
directa de la luz y evita el deslumbramiento del observador. Los rayos luminosos difractados
por las estructuras finas (membranas celulares, organitos...) cruzan la placa de fase o en la
zona perifrica, o en la zona central. La zona central est constituida por una cuchilla
birrefringente /4 cuyo papel es retrasar ligeramente los rayos difractados que la cruzan. Estos
rayos retrasados van a interferir con los transmitidos sin retraso sobre la periferia.

El defasaje diferencial entre estos rayos crea el contraste y permite poner de relieve las
estructuras celulares.
31



Figura 2.5: Microscopio a contraste de fase. El dispositivo se basa en un anillo de fase colocado en el
condensador, y una placa de fase situada en el objetivo. La placa de fase es una cuchilla de vidrio con un anillo
opaco que cerca una cuchilla birrefringente cuarto de onda.

Se puede dar cuenta de manera simple del principio del contraste de fase considerando la
interferencia de dos ondas. En la figura 2.6, dos ondas de luz estn representadas:"B" es la
onda que pasa al exterior del objeto de fase (es decir que procede directamente del alumbrado
del fondo), "O" es la onda que pasa a a travs del objeto. El objeto de fase que no absorbe,
estas dos ondas tienen la misma amplitud, pero a causa de la diferencia de ndice (o del
espesor de la muestra), la onda "B" esta retrasada. El resultado de la interferencia es la onda
"D" que representa la diferencia entre el fondo y el objeto.



Figura 2.6: Esquema simplificado del contraste de fase. La onda "B" que cruz el objeto de fase es retrasada
con respecto a la onda "O". La onda "diferencia" "D" es desfasada de /4 con respecto a "B".

Para una pequea diferencia de fase, la onda "D" es siempre desfasada de cerca de de
longitud de onda. La diferencia de fase es pues de /4. Si se desplaza artificialmente la onda
"D" de un de longitud de onda suplementaria y que se la haga interferir con "B", entonces
una nueva onda "O" resulta, pero con una ms pequea amplitud que "B". El objeto parece
pues ms oscuro que el fondo. As pues, la diferencia de fase normalmente invisible se
convirti en diferencia de amplitud visible. Este efecto puede acentuarse cuando la onda "B"
se reduce de modo que su amplitud se vuelva idntica pero en oposicin de fase con la de la
onda "D". La intensidad de la onda "O" es entonces cerca de cero, lo que equivale a un
oscurecimiento mximo. Este razonamiento es tambin vlido si "D" no se retrasa, pero
avanza en fase, en este caso "O" resulta ms claro que el fondo ms bien que ms oscuro.
32

As pues, el microscopio a contraste de fase informa sobre el ndice de refraccin de los
objetos y sobre sus detalles. Se dice el contraste de fase positivo si el objeto (por ejemplo de
las bacterias en una solucin nutritiva) de ndice de refraccin ms elevado parece ms oscuro
que el medio que lo rodea. En el caso contrario, (por ejemplo de las vacuolas, una membrana
plsmica) los objetos aparecen en luz sobre fondo oscuro. La condicin esencial para obtener
un buen contraste de fase es que el defasaje con respecto a la longitud de onda de la luz
utilizada sea muy escaso (baja espesor de los detalles que deben observarse y diferencia
minscula entre los ndices de refraccin). Si no es el caso, anillos de difraccin torpes
pueden aparecer. Tengamos en cuenta mientras que el contraste de fase no distingue entre una
diferencia de ndice ptica y una diferencia de grosor o de espesor.

La figura 2.7 muestra cmo eso se realiza en la prctica. La mscara anular se coloca en el
plan focal antes del condensador, cuya imagen es ad infinitum: un haz de luz paralelo sale del
condensador. La luz que viene del condensador es dividida en dos por el objeto, un haz no
desviado y un haz desviado.


Figura 2.7: Esquema que describe la marcha de los haces de luz en un microscopio a contraste de fase.

Formacin de la imagen del haz no desviado (a la izquierda sobre la figura 2.7): el haz de luz
no desviado "B" sigue su camino paralelo y forma una imagen a nivel del plano focal
posterior del objetivo.
33

Formacin de la imagen del haz desviado (a la derecha sobre la figura 2.7): el haz de luz
desviado "D" sale del objeto y forma una imagen dentro del ocular, alrededor de 160 mm por
encima del objetivo.

Porque estas dos imgenes son separadas tanto, el haz "B" puede utilizarse dejando el haz "D"
solo. El objetivo posee una meseta de fase anular especial en su plano focal posterior, cuyo
tamao corresponde a la imagen del anillo de fase del condensador. En esta bandeja de fase,
la onda "B" adquiere el defasaje de un de longitud de onda suplementaria y se reduce su
intensidad tambin (el anillo puede observarse observando a travs del objetivo).

Para la observacin, se procede del siguiente modo. Se ajusta primero el alumbrado segn
Khler. De hecho, se puede dejar el diafragma de campo abierto ya que no es muy efectivo
aqu. El diafragma del condensador debe tambin completamente abrirse. Se selecciona el
anillo de fase correcto por el objetivo utilizado (10x, 20x, etc. tal como se indica en la bandeja
del condensador), se inserta el telescopio de centrado y se centra el anillo. El centrado de los
anillos de fase es crucial tal como recordado sobre la figura 2.8.



Figura 2.8: Centrado para el contraste de fase: A Diafragma anular y anillo de fase centrado. B Diafragma
anular claro mal encubierto por el anillo de fase oscuro. C Diafragma anular y anillo de fase centrados pero
diafragma anular borroso ya que el condensador ha sido ajustado demasiado bajo y que no se realizan las
condiciones correctas del alumbrado de Khler.

El contraste de fase posee tambin limitaciones. En primero, solo es til para los objetos de
fase, es decir: objetos finos que solo absorben muy poco luz. Por otra parte, el contraste de
fase puede ser la causa de una prdida de resolucin. En efecto, el anillo de fase en el
condensador limita "el ngulo de admisin" a un valor inferior al ngulo mximo que el
objetivo utiliza.

Con objetivos de 10x, 20x o 40x de un sistema a contraste de fase, esta reduccin es la mayor
parte del tiempo imperceptible o aceptable, pero sucede que el anillo de la meseta de fase de
objetivos 100x, con los cuales se desea tener la mayor resolucin posible, puede ser
demasiado pequeo en muchos microscopios de rutina. Tales objetivos no solucionan ms una
diatomea del tipo Surirella Gemma , que se soluciona fcilmente en campo claro (sin el
contraste de fase), incluso con objetivos de apertura numrica ms pequea. Se encuentran sin
embargo objetivos 100x a contraste de fase con un anillo que corresponde a una apertura
numrica de alrededor 0.9 que permiten a la vez una buena resolucin y un buen contraste. La
figura 2.9 compara una imagen obtenida en microscopa en fondo claro con la realizada en
contraste de fase.

34


Figura 2.9: Imgenes en microscopa a fondo claro a la izquierda y a contraste de fase a la derecha con un
objetivo ordinario 20x NA 0.45 de cristales de cloruro de estroncio.


2.4- Microscopa en luz polarizada

La microscopa en luz polarizada es sobre todo un mtodo analtico que permite determinar
distintas propiedades pticas de los cristales. En un microscopio polarizador, el objeto se
coloca entre dos polarizadores cruzados.

La microscopa en luz polarizada permite la observacin de objetos birrefringentes
anistropos. Un filtro polarizador polariza la luz resultante del condensador, es el polarizador,
un segundo polarizador cruzado con el precedente selecciona la luz polarizada en una
direccin perpendicular, es el analizador.

Un objeto birrefringente caracterizado por estos dos ndices pticos, respectivamente ndice
ordinario e ndice extraordinario, comparte un haz de luz incidente en dos haces, uno el haz
ordinario sigue el camino definido por el ndice ordinario, otro, el haz extraordinario sigue el
camino definido por el ndice extraordinario. Estos dos haces son polarizados segn
direcciones perpendiculares.

Como estos dos rayos tienen cada uno una velocidad de propagacin propia, una diferencia de
marcha aparece entre los dos rayos, induciendo una diferencia de fase que vara con la
longitud de onda. La interferencia de los dos rayos genera una onda elptica de la que el
estado de polarizacin depende de la diferencia de marcha.

Estructuras birrefringentes con forma de palillo colocadas entre dos filtros de polarizacin
cruzados aparecern cuatro veces bajo forma luminosa cuando se los hace rotar de 360. De
los objetos que presentan una simetra esfrica, como los granos de almidn, se evidencia la
cruz esfrica caracterstica (Fig. 2.10). Las estructuras que no son birrefringentes siguen
siendo invisibles.


35


Figura 2.10: A la izquierda, imgenes de granos de almidn en microscopa de polarizacin. A la derecha, se
comparan las imgenes de celdas en madera de pino observadas en fondo claro y entre polarizadores cruzados.

Colocada entre polarizador y analizador cruzados, una sustancia birrefringente puede tambin
dar nacimiento a la aparicin de coloraciones que dependen del defasaje entre los dos rayos y
conducir a observaciones espectaculares (Fig. 2.11).



Figura 2.11: Observacin de cristales de bicromato de potasio en luz polarizada.

En un mbito particular de colores, muy pequeos defasajes producen una diferencia
claramente sealada por un cambio notable de color. Este mbito se sita en el rojo, a una
longitud de onda llamada "primer orden rojo".

Un filtro de primer orden rojo colocado entre el polarizador y el analizador aumenta mucho
las diferencias de colores tal como se muestra en la figura 2.12.

Como la microscopa a contraste de fase, la luz polarizada permite revelar detalles
normalmente invisibles en fondo claro.

36


Figura 2.12: Estructuras vasculares y microcristales en una piel de cebolla revelados en luz polarizada y por la
utilizacin de un filtro de primer carcter rojo.


2.5- Microscopa a contraste interferencial diferencial "Nomarski"

Se imaginaron varios tipos de microscopios a contraste interferencial en los aos 1940-1950.
Los microscopios concebidos por F. Smith fueron los primeros en utilizar prismas de
Wollaston para la separacin y la recombinacin de los haces. Un problema vinculado a la
utilizacin de prismas Wollaston convencionales era que la prisma utilizada para la
recombinacin de los haces deba ser en el plano focal del objetivo, hay que decir
generalmente en el objetivo.

Biografa de Georges Nomarski (1919-1997)

Georges (Jerzy) Nomarski naci en Polonia en 1919. Despus de estudios a la
Escuela Politcnica de Varsovia, se apasiona por la ptica y decide llevar toda su
carrera en esta va. Particip en la resistencia polaca y fue preso de guerra hasta
marzo de 1945. Nomarski entra a continuacin a la Universidad de Louvain en
Blgica donde solicit el estatuto de refugiado poltico en 1945. En 1947, l eligio
Francia como residencia permanente.
Nomarski fue graduado de la Escuela Superior de la ptica (ESO) de Pars en
1949. En 1950, cre el Laboratorio de Microscopa ptico del Instituto de la ptica
de Orsay) y comenz como Profesor de Microscopa al ESO a partir de 1953. Se
contrat como investigador al CNRS donde se ascendi a Director de Investigacin
en 1965. Es al origen de numerosas invenciones y autor de varias patentes a su
nombre, de los cuales el mas conocido es el del sistema DIC de microscopa a
contraste interferencial diferencial que desarroll en los aos cincuenta.
Su carrera se jalon de mltiples recompensas. Recibi el precio del Duque de Aumale otorgado por la
Academia Francesa de Ciencias en 1952, el precio Gaumont de la Sociedad de Estmulo para la Industria
Nacional en 1963, el precio de la Sociedad de Microscopa de Chicago en 1970, el precio ms prestigioso de la
Sociedad Neoyorquina de Microscopa otorgado a la memoria de Ernst Abbe en 1973.
En 1995, se recompens para toda su carrera cientfica por la Medalla de Oro del SPIE (Society of Photo-
optical Instrumentation Engineers) en homenaje a la importancia y al impacto de sus descubrimientos en
disciplinas muy diferentes. Georges Nomarski tom su jubilacin en 1980 y vivi a Antony, al sur de Pars
donde se muri el 17 de febrero de 1997.

37
El descubrimiento decisivo de G. Nomarski fue imaginar cmo modificar la prisma de
Wollaston normal de modo que se le pueda colocar fcilmente fuera del objetivo. En un
prisma de Wollaston modificada por Nomarski, los cristales estn cortados oblicuamente al
eje ptico esto que permite al plano de localizacin de las franjas ser al exterior del prisma y
en consecuencia, de poder colocarle en el plano focal posterior del objetivo.

As pues, la prisma de recombinacin puede instalarse en la torreta portaobjetos y el
dispositivo de Nomarski es simple. Los primeros microscopios a contraste interferencial
diferencial fueron producidos y sido comercializados por Carl Zeiss en 1965.

El contraste interferencial diferencial (DIC) tambin llamado contrasta "Nomarski" se utiliza
igualmente para la observacin de preparaciones no coloreadas. El principio se basa en la
divisin de un rayo luminoso polarizado en rayos de misma longitud de onda, pero
polarizados en direcciones ortogonales y separados en el espacio de una distancia muy corta
(una fraccin de la longitud de onda). La separacin en los dos rayos es realizada por un
Wollaston (montaje particular de dos cristales birrefringentes) tal como se muestra sobre la
figura 2.13.

Estos dos rayos (nombrados respectivamente ordinarios y extraordinarios) cruzan los
especimenes en dos puntos diferentes pero muy cercanos. Segn los medios cruzados por
cada uno de los dos rayos, por ejemplo citoplasma para el rayo ordinario y la membrana
citoplsmica para el extraordinario, stos sufren un diferente defasaje. Despus de ser
colectados por el objetivo, los dos rayos son recombinados por un segundo Wollaston y los
vienen a interferir sobre un filtro polarizador. Segn la diferencia de fase entre los rayos, se
crear un contraste positivo o negativo revelando as las estructuras celulares.



Figura 2.13: Microscopio a contraste Nomarski. El condensador contiene un filtro polarizador seguido de un
Wollaston que separa el rayo ordinario (trazo lleno) del rayo extraordinario (trazo punteado). Tras el objetivo,
los dos rayos son superpuestos por un segundo Wollaston y un filtro polarizador cruzado analiza la diferencia
de fase entre los dos rayos.

Como el microscopio a contraste de fase, el microscopio interferencial permite que sean
visibles las pequeas diferencias de ndice ptico presentes en un objeto pticamente fino, en
forma de diferencias de color o intensidad.

Existen varias tcnicas para realizar un microscopio interferencial. A la diferencia del
microscopio a contraste de fase pero como el microscopio en luz polarizado, la microscopa
interferencial se desarroll primero como un mtodo analtico que permite medidas de gran
sensibilidad de las propiedades pticas de un objeto. De otra parte, un microscopio
polarizador est en realidad una forma de microscopio interferencial.
38
3 Microscopas pticas confocales

La invencin de los mtodos de microscopa confocal fotnica se hizo en medio de los aos
1950. A este tiempo, Marvin Minsky se encontraba ante la necesidad de observar clulas
neuronales en cortes gruesos de tejidos nerviosos. En 1957, puso a punto entonces un
prototipo de microscopio con platino de barrido y dotado con esto que se nombr al tiempo un
sistema de focalizacin doble. Este dispositivo se bautiz rpidamente sistema confocal. Esta
tcnica sin embargo sigui siendo mucho tiempo inutilizado, ya que requera el empleo de una
fuente especfica que entregaba una gran intensidad luminosa y la imagen deba formarse
sobre una pantalla a alta remanencia. De hecho, ser necesario esperar el principio de los
annes1980 dnde la produccin de fuentes lseres a bajo coste y el desarrollo exponencial de
la informtica permiti que esta tcnica innovadora de microscopa encuentra el lugar que
ocupa en adelante en el mbito de la biologa.


3.1- Principio

La microscopa convencional por epi-fluorescencia, ampliamente utilizada hoy da en biologa
celular, entrega imgenes que sufren desgraciadamente de una resolucin limitada y aparecen
como vistas a travs de una bruma difusa. En efecto, el campo del microscopio es encendido
mucho por la fuente luminosa y se excitan los fluorocromos a travs de todo el grosor de la
preparacin (Fig. 3.lA). Resulta que la imagen formada por el microscopio es contaminada
por la luz procedente de puntos situados a fuera del plano focal y aparecen poco contrastados.



Figura 3.1: Principios comparados de la microscopa convencional por epi-fluorescencia (A) y de la
microscopa confocal (B).

El secreto de las imgenes confocales consiste en eliminar la luz parsita fuera del focal. En lo
ms simple de los casos (Fig. 3.1B), esto se obtiene iluminando la preparacin con un punto
luminoso cuyo dimetro esta limitado por las leyes de la difraccin de la luz. As a un
momento dado, solamente una insignificante parte del espcimen es iluminada fuertemente y
va a emitir de la fluorescencia. Los fotones emitidos por los fluorocromos van a ser
detectados punto por punto con un tubo fotomultiplicador durante el barrido de la
preparacin. Un agujero (llamado "pinhole") colocado delante del fotodetector y centrado al
nivel del hogar posterior del objetivo rechaza la luz parsita procedente de los puntos situados
fuera del plano focal. El nombre 'confocal' procede de la puesta en correspondencia de tres
puntos: la fuente luminosa especfica (en general una fuente lser), el punto iluminado situado
al hogar anterior (u hogar 'objeto') del objetivo y el pinhole situado al hogar posterior (u hogar
'imagen').
39

El papel del agujero es determinante para garantizar la resolucin y el contraste del
instrumento como ilustrado sobre la figura 3.2.



Figura 3.2: Ilustracin del papel del diafragma de deteccin en la resolucin del microscopio confocal.

El diafragma de deteccin puede ser un diafragma a iris que permite ajustar el volumen
elemental analizado por la sonda lser. Adems del cumplimiento de las condiciones de la
ptica clsica (eleccin de la longitud de onda, apertura numrica mxima del objetivo), la
resolucin espacial mxima es obtenida por el ajuste del dimetro del pinhole al lmite de
difraccin, hay que decir cuando es igual al dimetro de la mancha de Airy.

3.2- Formacin de la imagen confocal

Como en todo instrumento de ptica, el microscopio confocal obedece a las limitaciones
impuestas por las leyes de la difraccin luminosa. Sin embargo, la configuracin confocal
obtiene una ganancia en trminos de resolucin axial y radial en comparacin a la
microscopa convencional, como revista sobre la figura 3.3.



Figura 3.3: Comparacin entre las funciones de ensanchamiento del punto (PSF) en microscopa convencional
(a la izquierda) y en microscopa confocale (a la derecha). Las intensidades son en negativos para una mejor
legibilidad.

40
Recordemos que el PSF en el plano focal, anotado h
i
(x,y), describe la forma en que la luz que
debera idealmente permanecer concentrada en un punto es extendida por difraccin alrededor
de este punto. En teora de la seal, se dira que el PSF es la funcin de transferencia del
sistema ptico ("Optical Transfer Function", OTF)." Aplicada a una fuente especfica o(x,y),
la imagen i(x',y') despus de haber atravesado un sistema ptico sin aberracin se expresa bajo
la forma:

i(x',y') = o(x,y)h
i
(x,y) (3.1)

dnde el smbolo es el operador de convolucin.

Del mismo modo, se puede introducir el PSF de desfocalizacin, h
0
(x,y), que describe la
forma en que la mancha de Airy se altera cuando se desplaza el objeto a lo largo del eje ptico
Z. la imagen "completa" en 3D se expresa entonces bajo el por la relacin:

i(x',y') = o(x,y)h
i
(x,y)h
0
(x,y,z) (3.2)

dnde z representa el alejamiento del objeto con relacin al hogar de la lenteja. Los dos PSF,
axial y radial, pueden fusionarse en un nico h(x,y,z), representando el PSF tridimensional del
objetivo:

i(x',y',z') = o(x,y,z)h(x,y,z) (3.3)

3.2.1 Mejoramiento de la resolucin en microscopa confocal

Resolucin axial en x,y

La adicin del pinhole implica una mejora de la resolucin lateral. La frmula del poder
separador lateral pasa a ser en el caso del microscopio confocal:

d
min
0,46.
NA

(3.4)

a comparar con la relacin 1.24 obtenida para un microscopio convencional. Se observa
mientras que la mejora de la resolucin lateral no es espectacular.

Es ms bien en la resolucin axial y el poder de seccionamiento que se sita la ventaja de la
microscopa confocal.

Resolucin radial en z

Se evala la resolucin axial de un microscopio confocal midiendo la disminucin en
intensidad la longitud a lo largo del eje Z para un objeto idealmente puntual. La profundidad
de campo (o resolucin axial) se definir como la anchura a media altura del perfil de
intensidad (en Z). As se constata que la profundidad de campo en microscopa confocal, es
disminuida de un factor 1.4 por comparacin a la microscopa convencional. La resolucin
axial d
z
en microscopa confocal se expresa por la relacin:

41
d
z
= 1,77.
2
) (NA

(3.5)

Se notara que la resolucin axial es proporcional al inverso del cuadrado de la apertura
numrica del objetivo. Es pues imprescindible utilizar objetivos a gran apertura numrica para
obtener el mejor seccionamiento ptico.

Se tendr en cuenta tambin que la resolucin espacial de un microscopio confocal es
anistropa, en el sentido que la resolucin lateral (d
xy
) y la resolucin axial (d
z
) tienen valores
diferentes para una misma longitud de onda , un mismo ndice de refraccin n y una misma
apertura numrica NA.

En la prctica, y segn la apertura numrica del objetivo, la resolucin es 2.5 a 4 veces menos
fino en la direccin axial que lateralmente.

El seccionamiento ptico se define como la disminucin de la cantidad total de luz presente
en el plano focal a medida que el se aleja de un objeto luminoso puntual. Es decir, eso
consiste en integrar para cada posicin z el PSF de desfocalizacin.



Figura 3.4: Propiedad de seccionamiento ptica en microscopa convencional (punteados) y microscopa
confocale (continuo). Las curvas representan los valores de la intensidad de la luz integrada (es decir sumada)
en planes paralelos xy alejndose poco a poco del plano focal. Las imgenes se presentan en contraste negativo.

La figura 3.4 representa las curvas de seccionamiento ptico obtenidas integrando la luz en
los planes (xy) sucesivos. En el caso de la microscopa convencional, la intensidad luminosa
integrada sigue siendo constante cualquiera que sea la desfocalizacin. Al contrario, en el
caso de la microscopa confocal, se observa una cada rpida de la intensidad integrada a
medida que se aleje del punto fuente. El pinhole cumple pues perfectamente su papel selectivo
rechazando la luz "fuera del focal".

Esta propiedad de seccionamiento ptica del microscopio confocal es ilustrada perfectamente
por la figura 3.5A. Sobre esta figura se representan los cortes pticos seriados realizados a
travs de una clula viva en cultura cuyas mitocondrias fueron coloreadas por medio de un
fluorocromo especfico (rodamina 123). Los cortes pticos se obtienen subiendo el soporte
porta-objeto de un paso de 2 m entre el registro de cada plano.

42


Figura 3.5: Comparacin entre microscopa confocal (hilera de la cumbre) y microscopa convencional (hilera
de la parte baja). A: Cuatro secciones pticas transversales (xy) separados de 2 m a travs de una clula en
vitro cuyas mitocondrias fueron coloreadas por la rodamina 123. B: Seccin ptica axial (xz), la lnea en
punteado indica la posicin del apoyo en vidrio. El contraste se invirti para facilitar la visualizacin de las
imgenes.

La hilera superior presenta los cortes adquiridos en modo confocal y la hilera inferior muestra
los cortes correspondientes adquiridos en modo convencional. La diferencia entre los dos
mtodos parece muy evidente.

En los cortes confocales, las mitocondrias son muy bien resueltas, se acumulan en el
citoplasma muy en torno al ncleo celular que es vaco de todo marcado. Cada uno de los
cortes establece una diferente informacin de la de sus vecinos.

En el modo convencional, las mitocondrias son ms difciles de distinguir. Aparecen tal como
ahogadas en una bruma difusa debida al fondo de fluorescencia emitido por los planes
adyacentes. La figura 3.5B ilustra otra posibilidad de seccionamiento conferida por el modo
confocal. En efecto, es posible realizar un seccionamiento axial, es decir, de efectuar un corte
ptico segn un plano paralelo al eje ptico del microscopio. All an, el modo confocal se
muestra muy superior al modo convencional. Sin embargo, se tendr en cuenta que la imagen
obtenida presenta una ligera borrosidad en la direccin axial.

Cul ser la resolucin real? Siempre es alterada por distintos factores vinculados al sistema
ptico real y los fabricantes proporcionan generalmente una informacin sobre las
resoluciones mximas posible segn la configuracin utilizada. En prctica, es a menudo
necesario controlar estos valores del fabricante a la ayuda de pruebas pticas relativamente
simples.

As con = 488 nm y NA = 1.4, la resolucin mxima terica de un microscopio confocal
sera de 160 nm en el plano (xy). De hecho, es menos buena que el valor otorgado por el
fabricante: 212 nm por un objetivo 100x/NA1.4.

Tengamos en cuenta que el grosor de una membrana plsmica es de cerca de 10 nm segn los
tipos celulares, lo que quiere decir que estamos bien mas all de la resolucin mxima del
microscopio confocal ms potente que sea!

Un ltimo parmetro que debe tenerse en cuenta en el mbito de la resolucin es el grosor de
las estructuras que se observan. Se admite comnmente que un grosor mximo alrededor de
50 m constituye el lmite para la microscopa confocal monofotnica. Ms all de este valor
la dispersin de la luz por el medio atravesado se vuelve demasiado importante para poder
garantizar una buena resolucin. De otra parte la degradacin de la razon seal sobre ruido se
43
vuelve tambin prohibitiva. Por contra, en modo multifotnico, del hecho de la iluminacin
infrarroja, este grosor puede alcanzar 400m.

3.2.2 Tratamiento y desconvolucin de la imagen confocal

Tenemos dado que el objetivo del microscopio al igual que lenteja efecta instantneamente
una operacin de convolucin (Eq. 3.3). En principio, podra ser posible devolver el objeto y
eliminar los efectos de difraccin debidos al objetivo por una operacin de desconvolucin de
la imagen, como simblicamente se representa sobre la figura 3.6.



Figura 3.6: La imagen de un punto no es un punto, sino una mancha dicha de Airy. Seria posible por un
mtodo opuesto reconstituir el objeto por desconvolucin?

Al conocer la funcin de restitucin de las frecuencias espaciales de un objeto puntual, es
decir el "Point Spread Function", PSF o lo que es equivalentes, el "Optical Transfer
Function", OTF caracterstica de un sistema ptico dado, se debe poder volver a citar cada
fotn detectado en su punto objeto-fuente. Es el sentido de los clculos de desconvolucin en
3D simbolizados por la flecha que da la vuelta hacia la derecha en la figura 3.6. Esta idea es al
origen de esto que el se llama a veces la superresolucin directamente conectado a la ptica
dicha de Fourier que no es otra cosa que la transposicin a la ptica de los mtodos de anlisis
en el mbito de las frecuencias utilizado en electrnica. Se habla tambin de problema de la
difraccin inversa.

Existen numerosos algoritmos, a menudo llamados algoritmos de restauracin de imgenes,
que permiten efectuar estos clculos de desconvolucin. Se puede citar por ejemplo:
* El algoritmo de estimacin del mximo de semejanza ("Maximum Likelihood
Estimation", MLE)";
* El algoritmo iterativo con tensiones de restauracin de Tikhonov-Miller ("Iterative
Constrained Tikhonov-Miller Restoration", ICTM)";
* El algoritmo no iterativo de Tikhonov-Miller ("No Iterative Tikhonov-Miller
Algorithm", QTM)";

De hecho, es importante sobre todo saber que esta operacin se choca con los dos tipos de
problemas fundamentales y en principio casi insuperables.

44
El primer problema es de carcter matemtico. Si una transformada de Fourier inversa es
perfectamente legtima, es necesario recordar que la operacin de convolucin se asocia a la
transformada de Laplace y no la transformada de Fourier. Se demostr que en todo rigor, sin
hiptesis a priori, la transformada de Laplace inversa no es posible. Cierto, en la practica, se
puede a menudo justificar de sustituir Laplace por Fourier y solucionar as la desconvolucin.

El otro problema resulta de los ruidos de toda clase que perturban la adquisicin de una
imagen. Estos ruidos siempre presentes son difciles de eliminar y son fuentes de
inestabilidades en el tratamiento de las coordenadas por medios informticos.


3.3- Realizacin de un microscopio confocal

Los microscopios confocales son hechos para trabajar en reflexin o en epi-fluorescencia.
Estos modos y ms concretamente la epi-fluorescencia constituye la va ms fcil para realizar
el confocalidad en un microscopio puesto que la ptica de iluminacin es la misma que la de
observacin.

Adems, al utilizar la fluorescencia, como las longitudes de onda de las luces de excitacin y
de emisin son siempre muy distintas debido al desplazamiento de Stokes, se pueden muy
fcilmente separarlos con ayuda de un espejo dicroico. Estos espejos reflejan la luz de una
longitud de onda inferior o igual a una determinada longitud de onda pero dejan pasar la luz
de longitud de onda superior. Eso permite obtener un muy bueno informe seal/ruido puesto
que en epi-fluorescencia ser relativamente fcil obtener elevados tipos de rechazo de la luz
de excitacin.

La conjugacin de un punto fuente en la muestra iluminada por un haz lser en el punto focal
con el diafragma de deteccin situado en el plano focal del objetivo define un plano de corte
ptico en la muestra. El paso del haz luminoso por un diafragma de tamao muy inferior al
campo de observacin obliga a efectuar un barrido de la superficie del campo para reconstruir
una imagen del objeto estudiado.

La microscopa confocal es una microscopa a barrido. De manera muy general, se puede
considerar que existen dos tipos de tcnicas de imgenes a barrido:

Imgenes a barrido en el plan imagen: la imagen del objeto se concentra directamente
sobre la superficie sensible del sensor. Este sensor que puede ser o un tubo vdeo modelo
VIDICN o una matriz a elementos CCD analiza la imagen formada recorrindola lnea por
lnea y de arriba abajo.

Imgenes a barrido en el plano objeto: en este caso, es la propia preparacin que es
recorrido por un punto luminoso (mancha de luz focalizada). La interaccin de este punto
luminoso con el espcimen es registrada al vuelo por un detector o un tubo fotomultiplicador
o un fotodiodo a avalancha. La imagen del campo analizado punto por punto se recompone
electrnicamente punto por punto sobre la pantalla de un osciloscopio (o sobre un monitor
vdeo) o numricamente en la memoria de un ordenador. El barrido del objeto se obtiene o
utilizando un punto luminoso fijo y desplazando el objeto bajo el objetivo del microscopio, o
guardando el objeto fijo y desviando el punto luminoso.

45


Figura 3.7: Esquema de principio de un microscopio confocal.

En un microscopio confocal como el esquematizado sobre la figura 3.7, este barrido puede
hacerse de varias maneras.

El haz lser de excitacin que es fijo, se puede simplemente desplazar la platina soportando la
preparacin en primer lugar en (X,Y) para realizar un primer corte ptico, luego desplazarla
segn Z para acceder a un plano vecino. Esta tcnica es demasiado lenta para la
reconstruccin de una imagen y no se utiliza en los instrumentos comerciales.

Es bien preferible reconstruir la imagen del objeto de punto a punto por barrido del campo
analizado en el plano (X,Y) con ayuda de espejos de desviacin de la fuente luminosa. Esta
tcnica es bien ms rpida para la obtencin de una imagen. La platina motorizada sirve
solamente para desplazar la preparacin segn el eje Z que permite la introduccin de
distintos planes pticos en el grosor del objeto. Las imgenes as formadas se almacenan en la
memoria de masa de un ordenador para servir a continuacin a la reconstruccin de una
imagen en 3 dimensiones.

Comercialmente, existen dos tipos principales de microscopios confocales a barrido: los
microscopios a barrido lser y los microscopios a disco de Nipkow.

3.3.1 Microscopio confocal a barrido lser (MCB)

El dispositivo la ms corriente de microscopio confocal a barrido lser se describe
sobre la figura 3.8. Se trata de un sistema de epi-iluminacin donde la fuente de luz est
constituida por un rayo lser. La luz se enva hacia un objetivo a gran apertura numrica
(NA>1.0) por reflexin sobre un espejo dicroico.

46


Figura 3.8: Principio de un microscopio confocal a barrido lser.

Antes del objetivo el rayo pasa por un par de espejos de deflexin subidos sobre ejes de eje de
balancn ortogonales, no representados sobre la figura 3.8. Los ngulos formados por estos
espejos determinan la posicin en X y Y del punto luminoso despus de la travesa del
objetivo. El espcimen puede barrerse punto por punto haciendo variar este ngulo como
esquematizado sobre la figura 3.9.




Figura 3.9: Principio del barrido en X,Y del punto lser para excitar todo un plano de la muestra.

La seal de fluorescencia emitida por cada punto a una longitud de onda diferente de la
longitud de onda de excitacin pasa a travs del espejo dicroico y se detecta a travs del
diafragma de deteccin por el fotomultiplicador.
47


Figura 3.10: Esquema completo de un microscopio confocal a barrido lser.

La imagen es reconstruida a continuacin por medios de clculo informtico aadiendo todas
las seales obtenidas despus del barrido del plano. Un sistema completo as tal como el
representado sobre la figura 3.10 se equipa de un ordenador potente o de una estacin de
trabajo para controlar las distintas funciones de barrido y realizar rpidamente las operaciones
necesarias de reconstruccin y tratamiento de las imgenes. Tal microscopio permite la
reconstitucin de imgenes tridimensionales.

3.3.2 Microscopio confocal a disco de Nipkow

En este enfoque, se realiza un barrido casi instantneo de todo el campo gracias a la rotacin
rpida a ms de 300 vueltas/sec de un disco de Nipkow colocado en el campo imagen del
objetivo. Se taladra un disco de Nipkow de un gran nmero de micro diafragmas dispuestos
de tal modo que cubran la totalidad del campo a cada rotacin (Fig. 3.11).




Figura 3.11: Representacin esquemtica de un disco de Nipkow.
48

En este tipo de microscopio, la iluminacin se efecta a travs de este disco en luz blanca por
una fuente de luz ancha que cubre un rayo del disco de Nipkow. La recuperacin de la seal
"confocal" es efectuada por una cmara de adquisicin clsica que permite la obtencin de
una imagen casi instantnea (Fig. 3.12). Esta estrategia permite la adquisicin en modo
confocal de acontecimientos rpidos sin comprometer la alta resolucin del modo confocal.
Un disco de Nipkow puede equiparse de una micro lenteja sobre cada uno de los diafragmas
para recuperar mejor la luz emitida por el punto fuente y aumentar as la sensibilidad del
instrumento.



Figura 3.12: Principio de un microscopio confocal a barrido del tipo Tndem ( tandem scanning ). La
exploracin del espcimen es obtenida por la rotacin de un disco de Nipkow (a la derecha) taladrado de
millares de agujeros dispuestos segn espirales de Arqumedes imbricados.


Otros dispositivos emparentados existen que recurren a circuitos integrados a microespejos,
una tecnologa desarrollada al origen para los sistemas de vdeo proyeccin.

3.3.3 Descripcin de un microscopio confocal invertido comercial

Se trata del microscopio confocal invertido modelo SP2 de Leica (Fig. 3.13). La
configuracin elegida incluye varias fuentes lser para permitir analizar simultneamente 2
3 fluorocromos diferentes, sin interferencias, y un analizador espectral que permite ofrecer
tambin una flexibilidad sobre la definicin de las ventanas para la deteccin de la
fluorescencia.

Este microscopio permite delimitar las propiedades in situ de fluoroforos naturales o
extrnsecos (como el famosa "Green Fluorescent Protein" o GFP por ejemplo) y desarrollar
unas imgenes radiomtricas, permitiendo, en particular, la lectura de flujos inicos en
sistemas vivos. Este dispositivo se aprecia especialmente en biologa vegetal dada la
importancia de la fluorescencia intrnseca en numerosos casos.

49


Figura 3.13: Vista estallada del microscopio confocal Leica SP2.

50
El equipamiento incluye tambin objetivos a agua (entre otros), facilitando el trabajo sobre
tejidos gruesos y sobre tejidos perfusados, el fotoblanqueo de zonas amorfas para la
experimentacin en FRAP y FLIP por lo que se refiere a la comunicacin entre clulas, entre
compartimentos y movimientos de organitos, y el platina electrnica a memorizacin de
puntos que permite el seguimiento de distintas clulas o zonas sobre una cintica larga
(estudios en mltiplex). Programas informticos 3D y de anlisis cinticos estn disponibles
con este aparato.


3.3- Ejemplos de aplicaciones

La microscopa confocal posee numerosas ventajas en comparacin a la microscopa
convencional. Primero, la baja profundidad de campo (0.5 1.5 m) del microscopio permite
obtener una imagen de un plano focal, realizando as un corte ptico con una definicin bien
superior a la obtenida con un microscopio convencional. En adems, el ruido de fluorescencia
debido al fondo de la muestra se elimina prcticamente. Resulta consecuentemente una muy
buena sensibilidad de deteccin, un aumento del contraste y un "aclaracin" de las imgenes.

Una otra ventaja del microscopio confocal es que se puede obtener cortes pticos no slo en
el plano X,Y sino tambin segn un plan paralelo al eje ptico (plan X,Z) que pueden as
permitir realizar reconstrucciones tridimensionales. Estos cortes pticos no afectan en nada a
la integridad de la muestra biolgica contrariamente a los cortes fsicos necesarios en
microscopa fotnica y electrnica. Adems, la adquisicin numrica de las imgenes permite
sobre estacin de tratamiento de imgenes, aumentar las posibilidades de anlisis y de
cuantificacin.

Las aplicaciones principales de la microscopa confocal se refieren a la biologa. La
configuracin la ms comnmente adoptada es la del microscopio confocal a barrido lser
( Laser Scanning Confocal Microscope ) que trabaja en epi-fluorescencia.

En principio, no obliga nada a la utilizacin de la fluorescencia y algunas aplicaciones en
ciencia de los materiales utilizan de la luz blanca reflejada pero es al detrimento de la
resolucin. Para esto que se refiere a los bilogos, es la epi-fluorescencia que constituye la va
de enfoque privilegiada, sobre todo porque tcnicas como la inmune fluorescencia ofrecen por
naturaleza una enorme precisin en la localizacin de los marcados sobre las estructuras
biolgicas.

Las longitudes de ondas de excitacin son generalmente mltiples o utilizando lseres multi
rayas, o utilizando varios lseres. Al combinar las propiedades de los espejos, de los filtros
dicroicos y los filtros de emisin, se puede seleccionar tal o tal banda de excitacin, separar
las longitudes de ondas emitidas y recuperar la luz en tal o cual zona espectral.

La utilizacin de trazadores fluorescentes muy especficos permite localizar in situ con una
resolucin espacial del orden de algunos centenares de nanmetros, tales componentes
macromoleculares como los cidos nucleicos o protenas, pero tambin pequeas molculas
tales que los pptidos, lpidos e incluso iones. Las figuras 3.14 y 3.15 muestran dos ejemplos
de marcado por marcadores fluorescentes de colores diferentes.

51


Figura 3.14: Imgenes estereoscpicos de una preparacin sujeta a un triple marcado en Actinia (rojo),
Clathrine (verde) y Tubuline (azul). Pueden evidenciar la sensacin de relieve bizqueando ligeramente para
superponer visualmente las dos imgenes.




Figura 3.15: Imgenes obtenidas en microscopas confocales donde el uso de marcadores fluorescentes y filtros
convenientes permite separar los distintos constituyentes de una estructura compleja.

A pesar de sus ventajas, la microscopa confocal tiene tambin sus lmites y sus desventajas.
Primero, el haz lser pudiendo absorberse en la muestra, se puede tener una prdida de seal
penetrando en las capas ms profundas de la muestra. Por otra parte, la excitacin de la
totalidad del grosor de la muestra a cada barrido para reconstruir una imagen en 3
dimensiones puede conducir al fotoblanqueo de los fluorocromos utilizados como marcador
bajo el efecto de la densidad de irradiacin presente en el punto focal del haz lser.
Finalmente en el marco del examen de tejidos biolgicos vivos, las densidades de irradiacin
necesarias pueden tambin ser la causa de cito-toxicidad, es decir de una actividad txica
capaz de matar algunas clulas.

52
53
4 Microscopas pticas en campo cercano

El microscopio "a campo cercano", tambin conocido como "microscopio tnel ptico" es
resultante de la larga historia de la onda evanescente de Fresnel. Algunos precursores, como
S.A. Synge a partir de 1928, J.A. O' Keefe en 1956 luego E.A. Ash y G. Nicholls en 1972
haban imaginado la posibilidad de cruzar el "lmite" de Rayleigh. Tambin haban propuesto
dispositivos capaces de recuperar alguna informacin que se refera a objetos sub longitud de
onda.

Es as muy interesante recordar las especulaciones de Synge que mantuvo una
correspondencia con A. Einstein sobre la posibilidad de utilizar dispositivos con coloideos de
oro, conos de cuarzo metalizados como sondas locales (Fig. 4.1).



Figura 4.1: Tres ideas especulativas emitidas en el debate entre Synge y Einstein para aumentar la resolucin
espacial de un microscopio ptico.

No est mientras hasta a principios de los aos 80, gracias a los trabajos de D.W. Pohl et al. y
U. Fischer en Europa, de G.A. Massey y E. Betzig en los Estados Unidos, de D. Courjon et al.
en Besanon (Francia), luego de otros grupos que realmente se desarrollaron las tcnicas que
permitan cruzar lo que, de simple "criterio" al origen, se haba vuelto un "lmite insuperable".

Este deslizamiento de vocabulario, que haba terminado por esterilizar toda idea de bsqueda
de una mejor resolucin, es ms interesante de destacar que l mismo E. Abbe, que es la causa
de la formulacin del criterio de Rayleigh, no haba considerado nunca l mismo que pueda
tratarse de un lmite definitivo. Escriba as en 1876: "Probablemente en el futuro, el espritu
humano descubrir procesos y fuerzas que permitirn cruzar esta pared que nos parece
actualmente insuperable. Pienso personalmente que eso se har. Pero al mismo tiempo, creo
que cualquiera que sea, la herramienta que nos permitir estudiar el infinitamente pequeo
de manera ms eficaz que nuestro microscopio actual tendr conjuntamente con l que el
nombre". Es intil destacar la pertinencia de esta observacin: el microscopio a campo
cercano no tiene nada que ver con los microscopios clsicos.


4.1- Ondas evanescentes

Las imgenes pticos clsicos encuentran un lmite en la imposibilidad de separar las
imgenes de dos objetos alejados de una distancia inferior a la mitad de la longitud de onda de
la radiacin utilizada. En efecto, el criterio de Rayleigh estipula que solo se ven dos puntos
separadamente si la distancia que los separa es superior /(2nsin), dnde es la longitud de
onda de la radiacin utilizada, n es el ndice ptico del medio ambiente y es el semingulo
54
de apertura del sistema ptico. Este resultado, expresado en forma de un criterio, se encuentra
en el principio de indeterminacin de Heisenberg.

Por esta razn, los microscopistas mucho tiempo pensaron que no sera nunca posible
descender por debajo del lmite impuesto por el criterio de Rayleigh y en consecuencia
observar objetos de dimensin sub longitud de onda.

En realidad, las relaciones de incertidumbre no limitan de ningn modo la resolucin terica
de un instrumento. Ellas nos indican sino qu precisin podemos esperar sobre la posicin de
un objeto por un valor dado del vector de onda. Si el vector de onda utilizado poda ser
infinito, la resolucin sera infinita. Se ve pues dnde se sita la paradoja de una sper
resolucin: las ondas progresivas comprueban siempre la relacin de indeterminacin. Ellas
no pueden pues conducir sino a una resolucin que comprueba el criterio de Rayleigh. Nada
prohbe con todo superar este criterio.

4.1.1 Introduccin

El fenmeno de reflexin total frustrada es muy conocido. Se observa cuando la luz se
propaga en un medio de ndice de refraccin n
1
para reflexionarse sobre un medio de ndice
n
2
<n
1
, a partir de que el ngulo de incidencia
1
del haz es superior a un valor crtico
c

definido por la relacin n
1
sin
c
= n
2
. En tal caso, toda la energa incidente se encuentra
reflexionada hacia el primer medio y se habla entonces de "reflexin total". A pesar de esta
"reflexin total" de la luz, se puede constatar sin embargo la existencia de una perturbacin
electromagntica en el segundo medio donde est a pesar de todo posible detectar una onda.

A causa de su estructura particular que le impone no propagarse ms que en proximidad
inmediata de la superficie de separacin de los dos medios, esta onda se dice "evanescente".
La figura 4.2 indica la manera de generar una onda evanescente o propagativa a lo largo de la
superficie, o estacionaria.



Figura 4.2: Campos evanescentes utilizados para generar localmente una fuente no radiativa. A la izquierda, la
onda evanescente se desplaza segn la direccin x. A la derecha, la onda evanescente es estacionaria.

La primera comprobacin experimental de la existencia de este tipo de onda se asigna a
Newton. Esta experiencia se repite fcilmente con los medios actuales. Enviamos un haz lser
bajo un ngulo de incidencia superior al ngulo crtico
c
en una prisma "a reflexin total" y
acercamos a su superficie una lenteja plano convexo cuya curvatura esta por el lado de la
prisma. Desde que la distancia que separa la lenteja y la prisma es inferior al equivalente de
una semilongitud de onda, por lo tanto antes del contacto de los dos medios, una parte de la
55
luz hasta all completamente reflejada en la prisma, se transmite ahora en la lenteja. Se dice
que la reflexin total "se frustra".

Cuando la lenteja se coloca sobre la dioptra, una mancha de luz puede ser observable sobre
una pantalla colocada ms all de la lenteja. Si en lugar de un lser monocromtico, se utiliza
un haz de luz blanca, se observa entonces que esta mancha es irisada: su centro es blanco
cuando sus bordes son rojos. Esta zona perifrica corresponde a esta dnde la distancia
dioptra-lenteja es la ms grande, entonces esta observacin indica que la luz roja es capaz de
cruzar una capa de aire ms gruesa que los otros colores del espectro: el fenmeno de
"frustracin" de la reflexin total depende de la longitud de onda y puede realizarse tanto
sobre grosores de ms importantes que la longitud de onda es grande.

Tras Newton, la onda evanescente fue estudiada en detalle por Fresnel. Desde, el nico
descubrimiento importante fue hecho en 1947 por Goos y Hanchen que haba puesto de
relieve un desplazamiento longitudinal del haz en el caso de la reflexin total. Hoy en dia, son
a la base de un mbito a parte entera de la ptica llamada "la ptica del campo cercano". Este
mbito que se refiere a fenmenos luminosos observables sobre zonas espaciales muy
inferiores a la longitud de onda se inscribe naturalmente en el campo de la fsica
mesoescopica, nanociencias y nanotecnologas.

4.1.2 Las ondas evanescentes de Fresnel

La descripcin ondulatoria de la luz permite una descripcin del fenmeno. Recordemos en
primer lugar que una onda que cumple las condiciones de propagacin en el aire se dice
progresiva u homognea. Por el contrario, una onda que no cumple estas condiciones no
puede propagarse en el aire y permanece confinada sobre la superficie, se dice entonces
evanescente. Al igual que toda onda, la onda evanescente es definida por su vector de onda y
su polarizacin.

El vector de onda de la onda evanescente

Sean dos medios dielctricos de ndices respectivos n
1
y n
2
<n
1
y Oxyz un sistema de
referencia en el cual la dioptra que separa los dos medios corresponde al plano Oxy. El plano
de incidencia es el plano Oxz. Los componentes del vector de onda de la parte transmitida de
una onda plana que se propaga inicialmente en el medio n
1
y que se reflexiona sobre la dioptra
con un ngulo de incidencia
1
se escriben:

1
2 2
1
2
2 z
y
1 1 2 2 x
T
sin n n
c
K
0 K
sin n
c
sin n
c
K
k K

=
=

=

r r
(4.1)

La estructura de la onda transmitida en n
2
depende pues del carcter real o imaginario de K
z
.
Este trmino es real cuando 0<n
1
sin
1
<n
2
pero se vuelve imaginario puro en cuanto
n
1
sin
1
>n
2
. Hay entonces reflexin total de la luz sobre la dioptra y la onda transmitida en el
segundo medio es evanescente. Para simplificar, nos limitamos en la consecuencia al caso
particular donde n
2
=1. En este caso, los componentes del vector de onda de la onda
evanescente se escriben:
56

K
~
1 sin n
c
K
0 K
c
sin n
c
sin
c
K
k K
1
2 2
1 z
y
1 1 2 x
T
i i

=
=

>

=

r r
(4.2)

Al utilizar estos valores, se tendr en cuenta que el mdulo del vector de onda es:
c / 1 sin n 2 ) c / ( k
1
2 2
1
T
> =
r
,
Aunque sea mayor que /c, el producto escalar del vector de onda con s mismo sigue siendo
bien igual /c : c / k . k
T T
=
r r
, como es el caso para toda la onda electromagntica que se
propaga en el vaco.

En resumen:

- el vector de onda de la onda evanescente es complejo.
- su componente paralelo a la dioptra K
x
comprueba la propiedad inusual de ser en
mdulo superior a /c en el vaco (mientras que para una onda progresiva
homognea ninguna de los componentes del vector de onda no puede all ser superior
a este valor).
- su componente perpendicular a la dioptra K
z
es imaginario puro.

Debido a esta ltima propiedad, la amplitud de la onda evanescente disminuye de manera
exponencial en funcin de z. En efecto, si se lleva el Eq. 4.2 en la expresin usual de una onda
plana, se obtiene la ecuacin general de una onda evanescente de amplitud
T
E
r
:

) t x K ( exp ) z K
~
exp( E ) t z K x K ( exp E E
x
T
z x
T
= + = i i
r r r
(4.3)

As la onda evanescente, que tiene una estructura progresiva en la direccin Ox, ve su
amplitud disminuir de manera exponencial en la direccin Oz (Fig. 4.3).



Figura 4.3: Esquema de reflexin total interna y estructura de la onda evanescente.

57
Es debido a esta disminucin exponencial que la onda evanescente solo es detectable a una
distancia muy escasa de la superficie de separacin de los dos medios. Por convenio su
"profundidad de penetracin" en el segundo medio (aqu el aire) se define como la distancia
para la cual su amplitud ) z K
~
exp( E
T

r
se vuelve igual a e / E
T
r
o sea:

1 sin n 2
K
~
1
1
2 2
1

= =
(4.4)

La polarizacin de la onda evanescente

En el caso de una onda transversa elctrica (TE), la polarizacin de la onda evanescente no
presenta una caracterstica particular. Tal no es ya el caso para una onda transversa magntica
(TM). En el sistema de referencia Oxyz, el vector polarizacin de la onda incidente sobre la
dioptra se escribe en el primer medio ) sin , 0 , cos (
1 1
I
=
r
. La polarizacin de la onda
transmitida en el segundo medio se obtiene a partir de esta expresin utilizando las leyes de
Descartes-Snell. Se obtiene ) sin n , 0 , sin n 1 (
1 1 1
2 2
1
T
TM
=
r
. Cuando n
1
sin
1
>n
2
= 1, es
decir, en el caso de una onda evanescente, esta expresin pasa a ser:

1 sin n
0
1 sin n
1 1 z
y
1
2 2
1 x
T
TM
> =
=
=
=
i
r
(4.5)

Se tendr en cuenta que mientras que la polarizacin de la onda incidente sobre la dioptra era
rectilnea (polarizacin TM):

- la polarizacin de la onda evanescente es elptica, puesto que los dos componentes
E
x
y E
z
del vector polarizacin tienen una diferente longitud y que son desfasadas de
/2.
- esta elipse se sita en el plan de incidencia Oxz (mientras que generalmente la
extremidad del vector polarizacin de una onda plana rota en un plano que le es
perpendicular).
- el gran eje de la elipse es superior a 1 lo que no es nunca el caso con una onda
progresiva.

El conocimiento del campo electromagntico en proximidad de la superficie permite estudiar
el flujo de energa en la onda evanescente. Al calcular el flujo del vector de Poynting, se
encuentra que este flujo de energa es nulo por trmino medio en la direccin Oz mientras que
no lo est a lo largo de la superficie.

4.1.3 Consecuencias de estas propiedades inusuales

Los Eq. 4.2 y 4.5 del vector de onda y la polarizacin de la onda evanescente son
completamente inusuales. Algunas consecuencias pueden considerarse.

Regreso sobre el problema de la resolucin de un instrumento de ptica

58
Vimos que el criterio de Rayleigh determina el orden de magnitud de la resolucin de un
instrumento de ptica. En resumidamente, no se puede distinguir un objeto de dimensin
inferior a una semilongitud de onda de la radiacin utilizada para observarlo. En el mbito
ptico, donde la longitud de onda utilizable es del orden de 500 nm, eso corresponde a un
lmite de visibilidad situado a los alrededores de 250 nm. Para observar objetos de dimensin
inferior, parece pues indispensable utilizar longitudes de ondas inferiores a las longitudes de
ondas luminosas. Es la razn para la cual la microscopa electrnica tom histricamente el
relevo de la microscopa ptica para observar de toda una pequeas estructuras.

Un estudio detallado del problema permite sin embargo incluir el origen de estos resultados e
imaginar una manera de cruzar esta "pared de resolucin". Si llamamos Oxy el plano de una
pantalla que difracta, se puede poner de manifiesto que el poder resolutivo de un instrumento
de ptica es contrariamente proporcional al componente k
//
(paralelo al plano del objeto) del
vector de onda de la radiacin utilizada. Sabiendo que este componente es mayor en una onda
evanescente que no lo est en una onda progresiva, se puede entrever una manera de mejorar
la resolucin.

Esta posibilidad de obtener resoluciones x ms all de la resolucin lmite indicada por el
criterio de Rayleigh puede sorprender. Eso no correspondera a violar las desigualdades de
Heisenberg? Se puede destacar en primer lugar que las relaciones de Heisenberg no imponen
ningn lmite a la medida de la posicin x de un objeto, pero solamente al producto x.p
x
de
las incertidumbres obtenidas sobre medidas simultneas de la posicin y la cantidad de
movimiento de un objeto. Si no se pretende medir simultneamente estos dos cantidades, nada
prohbe a priori obtener un x tan pequeo que se quiere. As pues, ms que de prohibir
cruzar la pared de Rayleigh, las desigualdades de Heisenberg nos muestran al contrario cmo
proceder para liberarse: aplicada en la direccin Ox, y transpuesta al par posicin-vector de
onda, esta relacin de desigualdad se escribe:

x.k
x
> 2 (4.6)

Pone de manifiesto que para obtener una gran resolucin (pequeo x), es necesario que el
intervalo k
x
de los valores de k
x
recogido sea el ms grande posible. Cuando se recogen las
ondas progresivas, el intervalo de los valores de k
x
es [/c,+/c] = [2/,+2/], de ah se
deduce la expresin del intervalo total k
x
= 4/. Llevando este valor en el Eq. 4.6, se
deduce:

x 2/k
x
= /2 (4.7)

Las ondas progresivas en el vaco no pueden pues permitir a lo mejor sino una resolucin de
/2 de acuerdo con el criterio de Rayleigh.

Si se quiere obtener una resolucin superior /2, la desigualdad 4.6 indica que es necesario
utilizar un intervalo de valores de k
x
superior al intervalo [/c,+/c] = [2/,+2/] y en
consecuencia considerar ondas que pueden tener componentes k
x
superior /c. De tales ondas
son ondas evanescentes que ofrecen as un medio de aumentar la resolucin de un sistema
ptico.

Los lmites de la onda evanescente de Fresnel

59
Desgraciadamente, hay lmites. En la onda evanescente de Fresnel, el vector de onda paralelo
a la superficie es ciertamente superior /c, pero sigue siendo bien poco superior a este valor
puesto que su expresin K
x
= n/c sin (Eq. 4.2) pone de manifiesto que no puede ser mejor
que al igual a n/c. En esto que se refiere a este componente, la nica diferencia entre una
onda homognea y la onda evanescente de Fresnel procede as de la presencia del ndice de
refraccin n. Sabiendo que en el mbito ptico este ndice no es nunca muy superior a 2, la
nica ganancia que l lo pueda esperar estara mejor al factor 2.

Expresado por la relacin x 2/k
x
(Eq. 4.6), utilizando el k
x
= n/c sin = n(2/) sin
de la onda evanescente de Fresnel, el criterio de Rayleigh pasa a ser:

n 2 sin n 2
x

(4.8)

Es la misma expresin de la resolucin axial que la que se puede esperar obtener con un
microscopio a inmersin!

En el enfoque anterior, solo consideramos la onda evanescente de Fresnel obtenida por
reflexin total. Para obtener efectos ms espectaculares, es necesario utilizar tipos de ondas
evanescentes con vectores de onda k
//
mayores. Tales ondas evanescentes no son obtenidas
por reflexin total sino por difraccin.

4.1.4 La difraccin evanescente

Para medir el efecto de los pequeos detalles de un objeto sobre el comportamiento de una
onda evanescente, se debe tener en cuenta la difraccin de la luz por estos objetos.
Consideremos el caso de una onda plana monocromtica alumbrando una pantalla plana
taladrada de un agujero de dimetro variable tal como se representa sobre la figura 4.4.

Cuando el agujero es bastante grande, la mayor parte de la luz cruza el agujero sin sufrir
ninguna modificacin y solamente una escasa parte debida a la difraccin de la luz por los
bordes del agujero, va a surgir alejndose de la direccin de la onda incidente de un ngulo .
Ms el dimetro del agujero se vuelve pequeo, ms el ngulo se vuelve grande, es decir,
que el componente tangencial del vector de onda aumenta. Cundo el agujero tendr un
dimetro equivalente al lmite de Rayleigh, el ngulo alcanzar 90 y la luz, a la salida del
agujero, difractar en toda una semiespacio. Si la dimensin del agujero sigue disminuyendo,
la luz no puede difractarse ms all de 90, pero el componente tangencial del vector de onda
continua a aumentar ms all de /c conduciendo as a la generacin de ondas evanescentes
de gran vector k
//
.

Para un agujero de dimensin infinitamente pequea, el componente tangencial del vector de
onda ser infinitamente grande y la onda evanescente correspondiente ser caracterizada por
una disminucin exponencial, segn la direccin transversal, mucho ms rpida que en el caso
de la reflexin total.

60


Figura 4.4: Difraccin de la luz por una apertura cuyas dimensiones pueden ser bien ms pequeas que la
longitud de onda de la luz.

De un punto de vista ms matemtico, consideramos la difraccin de una onda plana por una
raja de anchura 2L (el problema se limita al plan Oxy). Antes de la raja, el campo
electromagntico se propaga segn Oz:

) t z k ( exp E ) z ( E
z 0 0
= i
r r
(4.9)

Justo detrs de la raja, puede escribirse en primera aproximacin:

) L , L , x ( C ) 0 z ( E ) 0 z ( E
0 1
= = =
+
(4.10)

dnde C es la funcin rectngula: C(x,a,+a) = 1 si [ ] a , a x + y C(x,a,+a) = 0 si x es al
exterior [a,+a].

Para calcular el campo en z = Z, es necesario propagar cada onda plana de su transformada de
Fourier. La transformada de Fourier E(k
x
,0
+
) del campo exactamente detrs de la raja
otorgado por el Eq. 4.10 se escribe:

[ ]
L k
L k sin
L E 2
k
e e
E dxe E
) L , L , x ( C ) 0 z ( E dxe ) 0 , k ( E
x
x
0
x
L k L k
0
L
L
X k
0
0
x k
x
x x
x
x
=

= =
+ = =
+
+

+

+

i
i i
i
i
(4.11)

El campo en el punto X sobre una pantalla colocada a la distancia Z de la raja se obtiene
entonces propagando cada uno de los componentes de Fourier del espectro hasta (X,Z). Se
obtiene:

61
x
X k
k
c

z
x
x
0 x
X k
x
dk e e
L k
L k sin
L E 2
2
1
dk e ) Z , k ( E
2
1
) Z , X ( E
x
2
x
2
2
x
i
i
i

+

=
(4.12)

dnde ( )
2
x
2
z y x
k k k , 0 k , k k = = =
r
comprueba la condicin de propagacin k
2
=
2
/c
2
.

Como lo muestra el intervalo de integracin del Eq. 4.12, este campo contiene dos
contribuciones:
- una parte homognea que corresponde a la integracin de k
x
sobre el intervalo
[/c,+/c].
- una parte evanescente que corresponde al resto de la integracin.

El punto esencial en esto que nos concierne es tener en cuenta que los valores de k
x

evanescentes ya no se limitan a:

c
n k
c
x

(4.13)

como en la onda evanescente de Fresnel asociada a la reflexin total de la luz, pero ocupan
tericamente todo el intervalo:

+

x
k
c
(4.14)

En prctica sin embargo, la funcin seno cardinal sin
c
=
L k
L k sin
x
x
reduce este intervalo
trayendo la integracin en un intervalo cuyas terminales se definen por:

L
k L k
x x

= = (4.15)

Se deduce:

- que unas ondas evanescentes difractadas aparecen en cuanto k
x
= /L > /c = 2/.
encontramos all el criterio de Rayleigh L < /2.
- que ms L es pequeo ms la parte evanescente del espectro es importante y sobre
todo, ms L es pequeo ms los valores de k
x
son grandes.

As cada "objeto" sobre la superficie difracta a la vez ondas homogneas y ondas
evanescentes, la parte evanescente de su espectro de difraccin siendo tanto de ms
importante que sus dimensiones son pequea. Como las ondas evanescentes no comprueban la
condicin de propagacin, estas ondas permanecen en alguna forma como "atrapadas" sobre
la superficie.

Estas ondas tendrn una profundidad de penetracin mucho ms baja que la onda de Fresnel y
su deteccin requerir el empleo de una sonda capaz de ir casi a recogerlos en contacto con la
superficie del objeto. De manera ms precisa, vimos que la amplitud de una onda evanescente
62
disminuye de manera exponencial cuando se aleja del objeto. La escritura de su componente
k
z
permite determinar la distancia a la cual el detector va a deber acercarse:

2
2
2
x
2
x 2
2
z
c
k k
c
k

=

= i
(4.16)

As, segn el Eq. 4.16, k
z
es tanto mas mayor cuanto que k
x
es grande lo que significa que la
amplitud de las ondas asociadas a cada frecuencia "evanescente" disminuye pues tanto mas
rpidamente cuanto que k
x
es grande. La informacin relativa a los detalles ms finos
permanece pues confinada en lo ms cerca posible de la superficie y la resolucin podr ser
tanto mayor que el detector podr acercarse ms cerca el objeto. Es sobre el principio de la
deteccin de estas ondas que se basa la microscopa tnel ptico (STOM), pero se concibe
tambin la dificultad de realizar un microscopio ptico a campo cercano.

La microscopa ptica en campo cercano

La evolucin tecnolgica sin embargo permitieron tales realizaciones. Una cuestin podra
plantearse sin embargo: si la onda evanescente no comprueba las condiciones de
propagacin, cmo puede ser recuperada por una fibra ptica? La respuesta a esta cuestin
tiene en el principio de la vuelta inversa de la luz: si un objeto sub longitud de onda puede
transformar por difraccin una onda progresiva en ondas evanescentes, puede, de la misma
manera, transformar por difraccin las ondas evanescentes en ondas progresivas.

As pues, al hundir una punta sub longitud de onda en el campo prximo del objeto
observado, las ondas evanescentes presentes sobre su superficie van parcialmente a
transformarse en ondas progresivas. La seal resultante de este proceso de doble difraccin
estar constituida, en gran parte, por ondas homogneas portadoras de informacin y que
pueden propagarse, en el aire o en cualquier otra gua dielctrica, hasta al detector.

Como la amplitud de estas ondas disminuye de manera exponencial con la distancia de
anlisis, la informacin que contienen no puede detectarse en campo lejano. La informacin
relativa a los detalles del objeto por deber recogerse en sus lugares de existencia, el detector
debe tener una dimensin nanomtrica y poder detectar los fotones. Esta ltima observacin
pone de manifiesto que la resolucin de tal microscopio, que depende de la distancia punta-
objeto, depende tambin de la dimensin de la extremidad de la fibra ptica: cuanto ms sta
ser pequea, ms su poder de recuperacin de ondas evanescentes de enormes vectores de
onda ser grande y ms la resolucin podr pues ser importante. Ya no ser limitada que por
la dimensin de la sonda.


4.2- Principales configuraciones

Los distintos tipos de microscopios pticos en campo cercano a barrido se distinguen por los
modos operatorios utilizados para realizar la iluminacin o la recogida de la luz muy cerca de
la superficie de la muestra.

La tcnica ms comn consiste en utilizar sondas a apertura (agujero o fibra ptica) para traer
o recoger la luz sobre la superficie. Las principales configuraciones se resumen sobre la figura
4.5.
63


Figura 4.5: Distintas configuraciones para una microscopa ptica en campo cercano.

La sonda a apertura para una microscopa en transmisin puede utilizarse o para la
iluminacin (Fig. 4.5a), o para la coleccin (Fig. 4.5b) de luz. Sin embargo, este modo no
puede utilizarse con muestras opacas para las cuales es necesario trabajar en reflexin (Fig.
4.5c). La luz reflejada puede ser recogida por una ptica prxima a la sonda o por la fibra ella
misma, al cual caso, son fibras no metalizadas que se utilizan.

Se elige un diferente enfoque con la configuracin 4.5d dnde se crean algunas ondas
evanescentes sobre la superficie de la muestra por una iluminacin oblicua en campo lejano.
La punta de la sonda acta entonces como un elemento difusor del campo evanescente,
conduciendo a la formacin de ondas homogneas que pueden detectarse. Si esta
configuracin es relativamente fcil de poner en funcin, la interpretacin de las seales no es
sin embargo evidente. El acuerdo en el cual el camino de la luz se invierte es de un gran
inters. Como en el caso anterior, la luz puede ser difundida del campo evanescente por una
otra punta de sonda como la punta de un microscopio a fuerza atmico (Fig. 4.5e).
Finalmente, en la ltima configuracin 4.5f, una pelcula metlica se deposita sobre la
superficie de la muestra y plasmones de superficie son generados por la punta de una sonda.
Estos dos ltimos enfoques constituyen tcnicas de microscopa a campo cercana ptico sin
apertura.

La figura 4.6 resume las caractersticas de un microscopio ptico a sonda local.

64


Figura 4.6: Los distintos tipos de microscopios pticos a sonda local.

El alumbrado del objeto puede realizarse de varias maneras. Cada tipo de alumbrado (Fig. 4.6
a, b, c o d) va a definir una alternativa de este microscopio cuyas denominaciones indicamos
las mas habitualmente utilizadas:

* el STOM ("Scanning Tunneling Optical Microscope") tambin llamado PSTM
("Photon Scanning Tunneling Microscope") es caracterizado por un alumbrado en reflexin
total por transmisin (Fig. 4.6a). Destinado a los objetos pticamente transparentes, se impuso
en los laboratorios en razn de la disminucin exponencial de la intensidad luminosa arriba
del objeto con la distancia que lo separa de la sonda. Se afecta positivamente la razon seal
sobre ruido.

* el SNOM ("Scanning Near-field Optical Microscope") puede funcionar o con un
alumbrado en reflexin externa donde la sonda desempea el papel de punta detectora y
emisora a la vez (Fig. 4.6b), o iluminando directamente el objeto en reflexin bajo incidencia
oblicua (Fig. 4.6c). l permite analizar todo tipo de objeto, transparente o no, y presenta la
ventaja de un alumbrado isotrpico en comparacin al STOM.

* el NSOM ("Near-field Scanning Optical Microscope") trabaja en transmisin, la
punta enciende el objeto, desempea aqu el papel de emisora solamente (Fig. 4.6d). En este
caso la deteccin se efecta en campo lejano utilizando una lenteja colectora.

De por el principio de la vuelta inversa de la luz, todos estos microscopios pueden trabajar
invirtiendo el sentido de alumbrado. Slo el SNOM es perfectamente simtrico.

Se pueden tambin citar dos tcnicas de microscopa en campo cercano sin apertura. Se trata
el i-PSTM o "Tunnel Near-Field Optical Microscope" (TNOM) o an del microscopio a
campo cercano ptico en luz prohibida. Citemos finalmente, el "Plasmon Near-Field
65
Microscope" en el cual las ondas de superficie son exacerbadas por el depsito de una
pelcula metlica y la generacin de plasmones de superficie.

El elemento esencial de un microscopio en campo cercano es la sonda. El tipo de sonda el
ms generalmente utilizado es una fibra ptica estado cortada en punta fina.

El desplazamiento de la sonda arriba del objeto est garantizado a la ayuda de traductores
piezoelctricos. Se obtienen as algunas superficies de barrido que van de algunos nanmetros
cuadrados a algunos centenares de micrones cuadrados. Las velocidades de barrido pueden ser
bastante importantes: se efecta regularmente una imagen de 128x128 puntos que
corresponde a una superficie del objeto de algunos nanmetros en menos de unos minutos. La
incertidumbre en z del desplazamiento de la fibra que debe ser de algunos picmetros
solamente depende esencialmente de la calidad de la electrnica de control.

Se utilizan dos modos de deteccin en microscopa ptica en campo cercano. El primero,
dicho a altitud constante, consiste en barrer la superficie del objeto guardando la punta a
distancia constante de un plano de referencia. La sonda detecta la distribucin de la intensidad
luminosa en el plano de referencia arriba del objeto. El segundo, dicho a intensidad constante,
consiste en controlar, por va electrnica, la intensidad de la seal luminosa detectada sobre
un valor de referencia. La seal registrada es, en este caso, la tensin elctrica de control del
pizo que est directamente vinculada a la posicin en z de la sonda detector. Este modo de
deteccin proporciona una topografa de las lneas de igual intensidad luminosa arriba del
objeto.

Vamos a enumerar estas distintas configuraciones y modos operatorios clasificando los
microscopios pticos en campo cercano en cuatro categoras principales:
* Los microscopios en transmisin que trabajan en emisin o coleccin
* Los microscopios en reflexin
* Los microscopios a efecto tnel fotnico
* Los microscopios hbridos

4.2.1 Microscopios en transmisin

La figura 4.7 esquematiza la configuracin bsica de un microscopio en transmisin.



Figura 4.7: Configuracin de base de un microscopio a campo cercano que funciona en transmisin.

66
Los microscopios en campo cercano en transmisin pueden trabajar con una sonda o emisor
de luz, o colectora de luz. De hecho las dos configuraciones no son totalmente similar.

La figura 4.8 resume los distintos enfoques utilizados en microscopa en campo cercano por
transmisin.



Figura 4.8: Distintos tipos de microscopios en campo cercano ptico en transmisin.

En emisin, la punta de la fibra se utiliza como una nanofuente y el campo transmitido se
recoge en campo lejano. La ventaja de este modo es que el campo iluminado tiene una
superficie muy reducida, esto que elimina un gran nmero de efectos parsitos. Esta superficie
es dada por la envoltura de la distribucin del campo alrededor de la punta. Este campo se
limita a algunos centenares de nanmetros alrededor del pice de la punta y cae a cero a partir
de que la punta se aleja de la superficie.

A la diferencia, en los microscopios donde la fibra se utiliza para recoger la luz transmitida, la
muestra es iluminada intensamente por un haz de luz muy concentrado. En este caso, la
superficie iluminada es la resultante de la distribucin de un campo de tipo de Gauss y cubre
una extensin de alguna decena de micrones. Para objetos de tamao sub micromtrico, se
deduce que se iluminan uniformemente. La consecuencia de esta iluminacin no
perfectamente local es el riesgo de efectos no locales vinculados a fenmenos de propagacin
sobre largas distancias como por ejemplo la propagacin de plasmones.
67

Por razones similares, los dos modos no son equivalentes por lo que se refiere a los problemas
de polarizacin. En modo coleccin, es muy fcil polarizar el haz de luz incidente y recoger la
luz en una fibra monmodo clsica. Por el contrario, en modo emisin, el estado de
polarizacin al pice de la fibra no es simple de determinar.

4.2.2 Microscopios en reflexin

Los primeros ejemplos de microscopios en campo cercano que trabajaban en reflexin
utilizaban una pequea apertura en una pelcula metlica o una nanoesfera de poliestireno
metalizada violentamente iluminada (Fig. 4.9). En esta configuracin, la partcula de
poliestireno sustituye a la nanoapertura y desempea el papel de una nanoantena.



Figura 4.9: Ejemplos de microscopios en campo cercano que utilizan o una pequea apertura, o una pequea
bola como emisora-colector. A la izquierda, el microscopio en reflexin utiliza la difraccin a travs de un
pequeo agujero de un haz completamente reflejado dentro de una cuchilla de vidrio. A la derecha, el
microscopio utiliza la reflexin sobre una bola de poliestireno metalizada.

Otra tcnica consiste en iluminar la superficie en estudiar en reflexin y detectar el campo
evanescente con ayuda de una sonda (Fig. 4.10b). Contrariamente, es posible iluminar a travs
de la fibra y detectar por medio de un colector conveniente (Fig. 4.10c). El principal defecto
del metodo se debe a la sombra producida por la punta.

Se puede tambin utilizar la fibra para iluminar la muestra y recoger la luz reflejada (Fig.
4.10a). Esta tcnica tiene alguna semejanza con la microscopa confocal. Su principal ventaja
es combinar la iluminacin local con una coleccin local de la luz, favoreciendo los rayos
propagndose a lo largo del eje de la punta.

Otra configuracin consiste en detectar el campo cercano generado iluminando la muestra en
reflexin y detectando el campo difundido por la excitacin de una punta por medio de un
colector adaptado (Fig. 4.10d). La punta desempea el papel de un elemento perturbador del
campo evanescente y se llaman estos microscopios sin apertura.

Se muestran otras configuraciones similares sobre las figuras 4 y 4.10f. Utilizando puntas
metlicas o en cualquier caso opacas luego que no sirve para transportar la luz, estos
microscopios sin apertura pueden utilizar las mismas tecnologas que los desarrollados para
los microscopios a efecto tnel electrnico (STM) o a fuerza atmica (AFM). Por este
enfoque, las mejores resoluciones espaciales pudieron demostrarse.

68


Figura 4.10: Distintos tipos de microscopios en campo cercano ptico en reflexin.

4.2.3 Microscopios a efecto tnel fotnico

En realidad, esto es la tcnica ms antigua con experiencia en los aos 1960 Su principio se
presenta en la figura 4.11.



Figura 4.11: Frustracin de la reflexin total interna dentro de una prisma por una superficie ondulada
(experiencia de las dos prismas de Newton).

Del estudio de las ondas evanescentes, sabemos que la frustracin de la reflexin total es muy
dependiente de la distancia a la superficie. En consecuencia, si la superficie de una muestra es
ondulada, las partes ms altas frustrarn la reflexin total mientras que las partes ms bajas no
69
puedan hacerlo. El campo que resultar estar como una forma de imprinta de la topografa de
la superficie.

La configuracin de Guerra descrita sobre la figura 4.12 es una alternativa moderna de los
primeros microscopios a efecto tnel fotnico.



Figura 4.12: Configuracin de Guerra. Una lenteja hemisfrica (generalmente la lenteja frontal de un objetivo de
microscopio) sustituye a la prisma habitual.

Microscopios a efecto tnel ptico a barrido STOM o PSTM

Esta tcnica explota el hecho de que un haz que cae sobre una prisma puede completamente
reflexionarse dentro, generando una onda evanescente. Esta reflexin interna se utiliza como
un medio particular de iluminacin como se muestra sobre la figura 4.13.



Figura 4.13: Distintas configuraciones de montajes en campo cercano que utilizan la reflexin interna. Se
observar la semejanza del dispositivo utilizado en (a) con el montaje imaginado por A. Cotton para su
ultramicroscopio en 1905.

70
El inters de este enfoque es que como el campo evanescente no se propaga, l no puede
perturbar la seal til durante el registro. Adems, ofrece una posibilidad de controlar la
posicin de la punta con relacin a la superficie utilizando la disminucin exponencial del
campo evanescente. Desgraciadamente, al trabajar de esta forma, a la manera de un
microscopio a efecto tnel electrnico, es difcil mantener una resolucin sub longitud de
onda como se espera.

La figura 4.14 muestra algunas alternativas de configuraciones STOM/PSTM. la figura 4.14c
muestra una versin donde un alumbrado isotrpico a simetra de revolucin en torno a un eje
vertical mejora la iluminacin oblicua.



Figura 4.14: Algunas configuraciones de microscopios STOM/PSTM.

Microscopios STOM/PSTM invertido: el i-PSTM o TNOM

Se imagin una nueva configuracin dnde se invierte el sentido de marcha de la luz con
relacin a la configuracin STOM. Puede considerarse como una alternativa de la
microscopa en campo cercano en transmisin. Su inters reside en su capacidad para detectar
esto que algunos autores llaman la "luz prohibida" que corresponde a la luz difundida por las
protuberancias de un pequeo objeto.

4.2.4 Microscopios en campo cercano a plasmones de superficie
71

Los plasmones de superficie son los modos propios de un interfaz metlico. pticamente, la
excitacin de un plasmn de superficie puede ser obtenida por distintas configuraciones.

La primera configuracin dicha de Kretschmann-Raether consiste en depositar una pelcula
metlica sobre un dielctrico y en encender el interfaz con una luz polarizada TM (transverso
magntico) en reflexin total como se representa sobre la figura 4.15.



Figura 4.15: Principio de la deteccin de plasmones de superficie combinando el STOM con la configuracin
de Kretschmann-Raether. La pelcula metlica es una pelcula a menudo de plata u de oro.

El plasmn de superficie se obtiene cuando el componente tangencial del vector de onda
asociado al haz incidente es igual a la del modo propio del plasmn. La intensidad del
plasmn disminuye de manera exponencial cuando se aleja del interfaz. La luz se confina
sobre el interfaz y la presencia de un defecto (topogrfico o de ndice) puede mucho modificar
su distribucin de intensidad. La deteccin en campo prximo a estos plasmones de superficie
aparece pues como un medio potencial de imgenes sper resolutivos.

La deteccin de tales plasmones de superficie generados por un haz de Gauss "casi
polarizado" puede modelarse considerando un haz de Gauss 3D y una deteccin en campo
cercano. El haz de Gauss incidente se divide en ondas planas y se efecta el clculo de los
campos transmitidos y reflexionados a la ayuda de un modo de matrices.



Figura 4.16: Esquema del montaje utilizado para la modelizacin de la deteccin de plasmones.

72
Se considera un haz de Gauss incidente sobre un interfaz que separa un dielctrico de ndice n
= 2.123 de una capa de aluminio de ndice n = -17.9 + i.0.7 y de grosor 53 nm (Fig. 4.16). El
haz de longitud de onda igual a 632.8 nm (lser HeNe) se concentra sobre el interfaz donde su
"waist" es de 7.9 m. El ngulo de incidencia a 44.97 es el que corresponde a la generacin
del plasmn de superficie a la misma longitud de onda.

El resultado de la simulacin se muestra sobre la figura 4.17.



Figura 4.17: Simulacin en 3D del comportamiento de plasmones en distintas situaciones. A la izquierda, la
cara de la prisma est desnuda. Al medio, la cara de la prisma se cubre de una pelcula deplata y se considera
el modo TM. A la derecha, se metaliza la cara de la prisma y se considera el modo TE.

El haz incidente se supone polarizado TM y la figura 4.17a muestra la intensidad luminosa
detectada en campo cercano en el caso donde el metal es ausente. La figura 4.17b presenta la
distribucin de la intensidad luminosa en el caso donde la superficie de la prisma se metaliza
y donde el plasmn de superficie es excitado por una onda incidente polarizada TM. En el
caso de un haz incidente polarizado TE (Fig. 4.17c), dos escasas resonancias plasmones
existen sobre las alas del haz. Esto se debe al hecho de que un haz de Gauss no puede
polarizarse estrictamente y que trminos TM aparecen sobre las alas y conducen a una escasa
resonancia. Se tendr en cuenta la diferencia entre los valores de los mximos de intensidad
en los tres casos.

La figura 4.18 presenta la intensidad del campo electromagntico en cada capa. Z<0 es el
dielctrico (haces incidentes y reflejados), se sita el metal entre Z=0 y Z=53 nm y el vaco se
encuentra para Z>53 nm. A la izquierda, el haz incidente se polariza en TM y la resonancia
plasmn aparece claramente al interfaz dielctrico-metal, el haz reflejado es muy escaso en
comparacin al haz incidente. A la derecha, el haz incidente se polariza en TE y el haz
reflejado es tambin intenso que el haz incidente. Se tiene en cuenta que las escalas del eje Z
y de la intensidad no son las mismas en los tres medios.

73


Figura 4.18: Simulacin de la generacin de plasmones en modo TM a la izquierda y en modo TE a la derecha.
Se tiene en cuenta que la resonancia es fuerte solamente en modo TM.

Una segunda configuracin consiste en excitar el plasmn de superficie directamente en
campo cercano: la sonda de un microscopio ptico en campo cercano enciende el objeto y el
plasmn de superficie es excitado, localmente, por la onda evanescente cuyo vector de onda
corresponde al de la resonancia plasmn. La figura 4.19 presenta el esquema de principio: se
deposita una fina pelcula de aluminio sobre la superficie de una lenteja hemisfrica entonces
que una sonda de microscopio ptica en campo cercano que trabaja en emisin, enciende la
superficie metlica. La deteccin se efecta en campo lejano (el detector barre el plano xy).



Figura 4.19: Excitacin del plasmn de superficie por una sonda en campo cercano. La figura de derecha
muestra la distribucin de intensidad.

La parte derecha de la figura 4.19 representa la distribucin de intensidad luminosa en este
plano calculada en el marco del modelo. Este resultado es de acuerdo con esto que se obtuvo
experimentalmente.

4.2.5 Microscopios hbridos

El hecho de combinar diferentes tcnica de observacin puede tener dos intereses: primero,
responder a la necesidad de controlar la distancia entre la sonda y la superficie mas
cuidadosamente y precisamente, a continuacin, permitir obtener informacin
74
complementaria facilitando la interpretacin de las imgenes obtenidas en campo cercano
ptico.

Microscopios con control de la fuerza de cizallamiento ("shear-force control")

El modo utilizando la fuerza de cizallamiento ("shear-force") se ver ms en detalle ms
lejos. Consiste en hacer oscilar la punta a una frecuencia prxima a su frecuencia de
resonancia. La amortiguacin de la vibracin cuando la punta se acerca la superficie puede ser
detectada fcilmente y utilizada para mantener la punta a una distancia constante de la
superficie. Es una tcnica de control puramente electrnica que puede adaptarse a la mayora
de las configuraciones. La mayora de los microscopios en campo cercano utilizan este modo
para el control de la distancia.

Microscopios en campo cercano con contacto

Es una solucin completamente diferente puesto que la punta afecta la superficie. Para evitar
o limitar el riesgo de rasguos, la punta se sube sobre un micro cantilver cuya tiesura es
suficientemente pequea para garantizar un contacto muy suave. Esta tcnica de contacto
puede convertirse en modo con tapotement ("tapping mode") con el cual el riesgo de daar
la superficie del objeto es en gran parte reducido. La ventaja es que se puede utilizar toda la
tecnologa y la electrnica desarrollada para los microscopios a fuerza atmica.


4.3- Estructura de base de un microscopio SNOM

La figura 4.20 describe las tres clases de componentes que constituyen no importa qu
microscopio a campo cercano.

Los componentes pticos son la fuente de luz, generalmente un lser, un conjunto de
componentes tales que espejos, lentejas, objetivos, fibras, polarizadores y un fotodetector
(fotomultiplicador o fotodiodo a avalancha).
Los elementos mecnicos son los distintos apoyos para el objeto, la fibra, los
mdulos de translacin. Se debe tambin, aadir una tabla antivibratoria y sus dispositivos de
amortizacin.
Los componentes electrnicos estn constituidos por los pisos de deteccin a la vez
para la seal ptica y las seales de control de la distancia de la punta a la superficie, la
electrnica de control del barrido de los mdulos de translacin (generalmente de los tubos
piezoelctricos) u otros transductores pizo o mecnicas ms sofisticados y el piso de control
de la distancia compuesto de un conjunto de amplificadores asociado a un dispositivo de
control PID (Proporcional-Diferencial-Integral).

75


Figura 4.20: Estructura tpica de un microscopio ptico en campo cercano ptico.

4.3.1 Parte mecnica

El piso de translacin

Existen hoy en da pisos de translacin en xy o xyz que combinan dispositivos a base de
sistema tornillo-tuerca diferencial y mdulos piezoelctricos. Sin embargo, la tcnica
basndose en la utilizacin de un simple tubo piezoelctrico permanece una excelente
solucin, a la vez buen mercado, eficaz y preciso.

El efecto piezoelctrico es la capacidad de algunos materiales de contratarse o de dilatarse
bajo la influencia de un campo elctrico. El efecto piezoelctrico es reversible esto que
significa que, cuando se curva una parte de un material piezoelctrico, comprimido o estirado,
cargas aparecen a su superficie que generan un campo elctrico apreciable (se conoce la
aplicacin a los encendedores). Observamos que aunque la relacin entre el campo y la
deformacin no sea lineal, es posible generar desplazamientos sub nanomtricos aplicando
simplemente campos elctricos relativamente modestos. Por ltimo, el tiempo de respuesta es
generalmente ms rapido que el tiempo necesario para un barrido. As pues, son materiales
ideales para el desplazamiento a las precisiones nanomtricas necesario no importa qu
microscopio a campo cercano.

La mayora de los cristales piezoelctricos son materiales ferroelctricos como por ejemplo el
titanato de bario (BaTiO
3
) y varias otras sales (titanatos, circonatos, estannatos) con la
estructura cristalina de la perovskita. El compuesto ciertamente ms conocido es el PZT
76
(titanato circonato de plomo, PbTiO
3
ZrO
4
). Es caracterizado por 4 constantes que son
interdependientes. El ms importante (para la realizacin de un piso de translacin es el
constante de carga d
ji
que es la razon de la densidad de carga
carga
sobre el electrodo normal
al eje i a la tensin aplicada a lo largo del eje j bajo campo E
0
constante.

(
(

=
0
E
j
a arg c
ij
d en Cb.N
-1
(4.17)

Se puede tambin definir la relacin opuesta entre la tensin relativa
j
a lo largo del eje j al
campo elctrico E
i
a lo largo del eje i a tensin
0
constante.

(
(

0
i
j
ij
E
d en mV
-1
(4.18)

El cuadro 4.1 rene los parmetros tiles para una cermica PZT P160 de la sociedad "Quartz
& Silice".

Parmetros Smbolos Unidades Valores tpicas
Mdulos de Young Y
D
33
10
9
Nm
-2
90
Coeficiente de Poisson E - 0,3
Temperatura de Curie - C 340
Resistividad - 10
10
m 1
Constante de carga
d
33

d
31

10
-12
mV
-1

10
-12
mV
-1

400
-175
Campo elctrico mximo - Vmm
-1
800

Cuadro 4.1: Caractersticas de la cermica piezoelctrica P160 de Quartz & Silice .

Los tubos piezoelctricos

Los tubos piezoelctricos tienen generalmente algunos centmetros de longitud. Su grosor est
entre 0.6 y 1 mm y su dimetro vara de 5 mm a algunos centmetros. Los componentes
piezoelctricos se metalizan dentro y fuera del tubo. El parmetro responsable de la extensin
del tubo es el coeficiente d
31
. As, el alargamiento L de un tubo de longitud L y de grosor e
al cual se aplica una tensin V ser dada por:

e
VL
d L
31
= (4.19)

Por ejemplo, si V = -50 V, e = 1 mm., L = 3 cm y d
31
= -175, el alargamiento puede alcanzar
L = 262 nm.

77
Los electrodos metlicos depositados sobre los tubos piezoelctricos utilizados en campo
cercano se dividen en 4 sectores a lo largo del eje de simetra del tubo. Tensiones diferentes
pueden aplicarse a cada una de ellas. La figura 4.21 muestra lo que pasa en este caso.



Figura 4.21: Curvatura de tubos PZT segn las tensiones aplicadas a los cuatro segmentos. La dilatacin que
depende de la longitud del tubo, pueden combinar les y excitarse tal como se muestra en (c) y (d).

Por ejemplo, sobre la figura 4.21a, cuando se aplican dos tensiones diferentes a dos electrodos
opuestos, el tubo va contratarse por una parte y a dilatarse del otro. El resultado global ser
una curvatura del tubo.

El problema de los mdulos piezoelctricos es que no son libres de histresis y que este
defecto debe ser corregido por un control electrnico sofisticado.


4.4- Nanocolectores y nanoemisoras

Queda en adelante claro que las altas frecuencias espaciales del objeto se cifran en la parte no
radiante del campo cercano. El nanocolector o la nanoemisora es pues la parte crucial de un
microscopio en campo cercano. Sin embargo, la concepcin y la realizacin de estas
nanosondas estn mucho para estandarizarse.

4.4.1 Distintos conceptos nanocolectores

La figura 4.22 ilustra distintos conceptos nanosondas donde el nanocolector/nanoemisor
puede ser un elemento difuso, un cono metlico o dielctrico o una minscula apertura de
alguna decena e nanmetros abertura a la extremidad de una fibra metalizada.

78


Figura 4.22: Tres conceptos nanocolectores. A la izquierda, con un centro difusor, al medio, con una punta
dielctrica, a la derecha con una apertura a la extremidad de una fibra metalizada.

La idea de utilizar una nica molcula fluorescente fijada en la extremidad de una fibra
verano emitida sino an no tuvo xito. Las estructuras dendrmeros se prevn para conseguir
de tal resultado.

4.4.2 Fabricacin de las puntas

Se utilizan de maniera preferencial dos modos para poner en forma la extremidad de las fibras
utilizada en los microscopios en campo cercano: el modo qumico y el modo termomecnico.

El modo qumico utiliza la erosin qumica por ataque cido de la extremidad de la fibra. La
fibra hunde en una solucin de cido fluorhdrico cuya concentracin, la temperatura, el
tiempo de exposicin se defini previamente (Fig. 4.23).


(a) (b) (c)

Figura 4.23: Realizacin de una punta por erosin qumica de la extremidad de la fibra de vidrio en una
solucin de cido fluorhdrico. (a) El cido puede subir a lo largo de la fibra por capilaridad. (b) La utilizacin
de una pelcula de aceite impide la capilaridad. (c) Un tubo de cermica protege la fibra.

El modo termomecnico consiste en calentar la fibra hasta una temperatura prxima a la
temperatura de transicin vtrea donde la fibra se ablanda y a estirarla progresivamente hasta
su ruptura. La calefaccin puede ser realizada por un soplete o por un haz lser. A este uso, se
utiliza a menudo un haz de lser a CO
2
a 10.6 m.

La figura 4.24 muestra las diferencias que se pueden observar entre dos fibras producido por
una o el otro modo. Se observa que la extremidad de la fibra puesta en forma por
calefaccin/tirada es bien ms esfrica que en el caso del ataque qumico, esto que puede
asignarse a la reorganizacin de los tomos a la extremidad despus de la ruptura entonces
que la fibra es an caliente.
79


(a) (b)

Figura 4.24: Puesta en forma de la extremidad de una fibra por erosin qumica al cido fluorhdrico en (a) o
por calefaccin/tirada en (b).

La ventaja del modo qumico es no afectar al corazn de la fibra por dnde se gua la luz. En
adems, permite realizar extremidades (pice) extremadamente finas. Por contra, la
realizacin de una punta puede ser larga y el mtodo carece tambin de fiabilidad en la
repeticin de puntas idnticas.


(a) (b)

Figura 4.25: Forma tpico por una punta de fibra obtenida combinando el preformateado por calefaccin/tirada
y una breve etapa de erosin qumica en (a). Se tendr en cuenta la iluminacin de la punta sobre la imagen (b).

La combinacin de los dos mtodos es una buena idea a menudo como revista en la figura
4.25 dnde un preformateado es efectuado por calefaccin/tirada, luego una puesta en forma
final por ataque qumico.

Segn la configuracin del microscopio, la fibra debe metalizarse. La figura 4.26 resume el
conjunto de las etapas que deben realizarse. La metalizacin de la fibra puede hacerse por
modos convencionales de depsito bajo vaco. El grosor de la capa metlica, el lo ms a
menudo posible de dinero, oro, aluminio o cromo no excede 50 nm. La etapa final delicada
consiste en taladrar una apertura lo ms pequea posible a la extremidad de la fibra para
permitir el paso de la luz.

80


Figura 4.26: A la izquierda, se esquematiza el principio del modo por calefaccin/tirada. A la derecha, se
explica el mtodo por ataque qumico y de metalizacin por depsito bajo vaco.

Se muestra una vista por arriba de la apertura taladrada en la pelcula metlica de una fibra
metalizada sobre la figura 4.27.



Figura 4.27: Vista de parte de la apertura de 100 nm abertura a la extremidad de una fibra metalizada.

Va sin decir que estas fibras son frgiles y que el control de su fabricacin es un activo
importante para garantizar la calidad de observacin y la resolucin de un microscopio en
campo cercano.

4.4.3 Control de la distancia a la superficie

Despus de la tcnica de fabricacin de puntas de fibra, es el otro problema crucial que debe
solucionarse para controlar la microscopa en campo cercano.

Las dos tcnicas principales de control de la distancia son el control ptico y el control por la
fuerza de cizallamiento ("shear-force" en ingls)."

Control ptico

81
Esta tcnica es utilizable en los microscopios del tipo STOM/PSTM porque en esta
configuracin, el campo medio evanescente disminuye de manera exponencial. Se limita sin
embargo a materiales que solo tienen pequeas irregularidades topogrficas y/o variaciones de
reflectividad.



Figura 4.28: Control ptico de la distancia. (a) en la configuracin de un STOM/PSTM. (b) en un microscopio
en reflexin que utiliza una cavidad entre la punta y la superficie. (c) Utilizando la reflexin sobre la muestra.


Tecnica shear-force

Es el modo ms utilizado para controlar la distancia. Fue propuesto la primera vez por Betzig
et al. y por Toledo-Crow et al. en 1992 (Fig. 4.29). Observaron la sensibilidad de la
amortiguacin de la amplitud de vibracin de la fibra excitada a una frecuencia vecina de su
frecuencia de resonancia cuando la fibra se acerca a algunos nanomtres de la superficie.



Figura 4.29: Los dos primer memorndums de control por shear-force .

82
El modo actual es puramente electrnico. Explota la oscilacin de un componente
piezoelctrico que resuena como un termoelemento o un diapasn. El diapasn se clava
generalmente a la fibra (Fig. 4.30).




Figura 4.30: Medidas electrnicas de la fuerza de cizallamiento utilizando un diapasn comercial o artesanal.
El diapasn puede servir de detector solamente o de generador/detector. La fotografa de derecha muestra la
fibra iluminada clavada al diapasn.

La fibra es excitada o de manera externa por un pequeo componente piezoelctrico, o
integrando el diapasn en un dispositivo electrnico que resuena. El inters principal es poder
fabricar cabezas de microscopios muy compactas y autnomas.


4.5- Tratamiento de las imgenes

La adquisicin de una imagen con ayuda de un microscopio a campo cercano ptico se
somete a numerosas perturbaciones que pueden venir de las imperfecciones del instrumento
como los defectos de linealidad en los desplazamientos de la punta o ms generalmente de los
ruidos electrnicos y/u pticos.

Las distorsiones lineales son generalmente fciles de corregir a partir de entonces que se
habrn definido correctamente. El registro de muestras pruebas constituido de redes de
caractersticas puede ayudar a definir el problema y a introducir las correcciones necesarias
por un tratamiento informtico conveniente.

4.5.1 Filtrado por transformacin de Fourier

Es una tcnica bien conocida en tratamiento de la seal o imgenes. Permite la reduccin o la
eliminacin de ruidos peridicos. Al calcular el espectro transformada de Fourier de la
imagen, un ruido peridico se definir por una estrecha banda de frecuencia parsita (Fig.
4.31).
83


Figura 4.31: Principio del filtrado de Fourier. El espectro de la imagen contaminada por un ruido peridico
evidencia bandas laterales simtricas que pueden ser eliminadas por un modo de enmascaramiento.

La figura 4.33 muestra la potencia del modo de filtrado de Fourier que debe eliminarse un
ruido peridico. Tal modo slo es sin embargo realmente eficaz ms que en el caso de ruidos
aditivos que no implican una fuerte interaccin con la informacin que debe extraerse.


(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.32: Otra ilustracin del filtrado de Fourier. (a) Imagen bruta de la superficie de un CDROM
perturbada por ruido. (b) Espectro de Fourier de la imagen bruta. (c) Multiplicacin del espectro de Fourier
por una mscara rectangular. (d) Imagen obtenida despus de tratamiento y transformada de Fourier invierte.

Ms all de los modos de tratamiento de imgenes que, gracias al desarrollo de los medios
informticos existen en gran nmero, la cuestin importante de este tipo de microscopa sigue
siendo la interpretacin correcta de las imgenes.


84
85
5 Evolucin actual

La evolucin actual de la microscopa moderna se realiza al mismo tiempo que el de las
nanociencias y nanotecnologas. Es all un extenso campo de investigaciones que no puede
abordarse en este curso. Nos limitamos voluntariamente a dos aspectos que se refieren a las
aplicaciones a la biologa y al estudio del comportamiento de molculas individuales.


5.1- Microscopa de fluorescencia multifotnica

La microscopa de fluorescencia permite examinar preparaciones que son fluorescentes por
ellas mismas o que se impregnaron (se dice sealadas) con colorantes fluorescentes.
Numerosas preparaciones sujetas a una radiacin ultravioleta reemiten de la luz a longitudes
de onda mayor en visible del prpura al rojo. Con los microscopios actuales que trabajan en
espiga-fluorescencia, la luz de excitacin llega sobre la preparacin por el objetivo. En esta
configuracin, el objetivo juega tambin la funcin del condensador (Fig. 5.1).




Figura 5.1: Esquema de un microscopio de fluorescencia por epi-iluminacin. La fuente luminosa es desplazada
sobre el lado y es constituida por una lmpara que ofrece un espectro de longitud de onda extendido hacia la
UV. Un filtro de excitacin permite seleccionar una banda de longitud de onda adaptada al fluorocromo que se
quiere visualizar. Un espejo dicroico reflexiona la luz de excitacin hacia el objetivo que desempea aqu el
papel de condensador. La fluorescencia emitida es recogida por el objetivo y la va a cruzar el espejo dicroico.
Un filtro de paro permite seleccionar la longitud de onda de emisin del fluorocromo.

Un espejo dicroico dirige la luz excitadora de corta longitud de onda sobre la preparacin a a
travs del objetivo. Emitida la luz, de longitud de onda ms elevada (fluorescencia) no es
reflexionada por el espejo dicroico. Filtros de paro impiden la luz excitadora penetrar en el
ocular o alcanzar el detector.

La microscopa de fluorescencia ocupa un lugar destacado desde hace algunos aos en el
diagnstico mdico y es probable que va a desarrollarse para el anlisis de los productos
alimenticios. Es as que se lo busca de las protenas especficas y de otras sustancias por
inmune-fluorescencia. Es el modo dicho "indirecto" que es el empleado. Se revela un
86
anticuerpo especfico no fluorescente, por ejemplo de conejo, reacciona muy de acceso con
los lugares antignicos de la preparacin luego con anticuerpos anti-inmune globulina
fluorescentes de conejo. Las aplicaciones posibles en el anlisis de los productos alimenticios
permiten la definicin inmunolgica de los microorganismos y harinas basada en las protenas
especficas. La inmune fluorescencia es un modo relativamente simple para la deteccin de
escasas cantidades de sustancias.

La reciente evolucin utiliza la excitacin bifotnica y ms generalmente multifotnica. Las
ventajas son que la intensidad se hace a una gran longitud de onda, generalmente vecina de
800 nm (lser de excitacin a zafiro dopado al titanio). A esta longitud de onda, la luz penetra
fcilmente las preparaciones biolgicas, sin tener consecuencias citotxicas o de blanqueo. La
absorcin bifotnica que es proporcional al cuadrado de la intensidad de excitacin, el
volumen de excitacin se define bien mejor que en excitacin a uno solos fotones (Fig. 5.2).



Figura 5.2: Ilustracin de la excitacin en modo a 1 fotn con un lser a argn a 514 nm y en modo a 2 fotones
con un lser a zafiro dopado titanio a 800 nm.

En modo bifotnico, el microscopio de fluorescencia se implica como un microscopio
confocal en el cual el iris confocal ya no es necesario.

La eficacia de la absorcin multifotnica se aumenta con la utilizacin de impulsos lseres
ultra breves, y de este punto de vista el lser femtosegundo a zafiro dopado al titanio
constituye la fuente de excitacin de eleccin. La tcnica de microscopa multifotnica se
presta pues tambin a la medida de las duraciones de vida de fluorescencia de fluorocromos
en distinto medio ambiente.

Se visitar con inters el lugar:

http://confocal.medecine.uhp-nancy.fr/bouton2/microscopie-multiphoton.html

o de los lugares similares para buscar ejemplos de aplicacin en biologa vegetal, animal y
humana en particular.


5.2- Microscopa de objetos individuales

87
Nos limitamos a mostrar un ejemplo particular donde el se combina de la ptica no-lineal, la
utilizacin de fuentes lseres ultra breves y la microscopa confocal.

La ptica no-lineal se introduce aqu con el fenmeno Raman estimulado exacerbado por los
efectos de superficie (Suface Enhanced Raman Scattering SERS).

Este fenmeno fue observado por casualidad en 1974 por Fleischman, Hendra y McQuillan
sobre seales Raman de piridina fijada sobre electrodos brutas de plata. Asignaron el efecto
de aumento de la intensidad Raman a un efecto de superficie. En realidad, se demostr a
continuacin que bien ms que un efecto de superficie, el SERS es un efecto asociado a
nanoobjetos esencialmente metlicos como partculas coloidales de oro o de plata, en las
cuales la excitacin de modos de resonancia plasmn contribuyen eficazmente.

El resultado notable es que mientras que el fenmeno Raman espontneo es un efecto no-
lineal de tercer orden, por lo tanto de baja eficacia con secciones eficaces del orden de 10
-30

cm
2
, la ganancia asociada al SERS puede alcanzar 10
10
a 10
14
, permitiendo la deteccin
Raman y del espectro Raman completo de molculas o nanoobjetos individuales.

La figura 5.3 representa el esquema de una experiencia de espectroscopia Raman que utiliza
un microscopio confocal asociado a un espectrmetro.



Figura 5.3: Esquema de una experiencia de espectroscopia Raman sobre nanopartculas.

Para las aplicaciones relativas a la biologa, se tiene el uso de marcadores no fluorescente
fijado sobre partculas metlicas de tamao nanomtrico. Estas partculas pueden ser
introducidas en clulas vivas y ser entonces posible localizarlos muy precisamente gracias a
la seal SERS. Para este efecto, las partculas coloidales de oro o de plata son casi
equivalentes.

88


Figura 5.4: Espectroscopia Raman a alta sensibilidad dentro de clulas vivas. A la izquierda, se muestra la
imagen en microscopa a contraste de fase de dos clulas vivas que contienen partculas de oro coloidal. A la
derecha, la imagen SERS de las mismas clulas esta presentada que permite localizar precisamente las
partculas de oro.



Figura 5.5: Espectros Raman de un cromoforo fijado sobre partculas de oro dentro de una clula. Se observan
los cambios del espectro segn la localizacin de las partculas.


5.3- Microscopa Raman

5.3.1 Raman de resonancia

5.3.2 Raman exacerbado de superficie SERS Surface Enhanced Raman Scattering

Ver el curso de espectroscopia Raman.

89
6 Anexo

GLOSARIO de MICROSCOPA FOTNICO adaptado por S Brown y C Talbot,
de Grard Graud, Instituto Jacques Monod

Aberracin:
Fenmeno de un sistema ptico que produce una imagen borrosa. Un punto imagen
est representado por una mancha cuanto ms o menos geomtrica siguiente el tipo de
aberracin.

Aberracin cromtica:
Fenmeno en el cual los rayos de luz que pasan a travs de una lenteja se concentran
en distintos puntos que dependen de las longitudes de ondas. Existen dos tipos de
aberracin cromtica:
a) axial, caracterizada por una variacin de focal segn la longitud de onda utilizada.
b) lateral, caracterizada por una variacin de aumento segn la longitud de onda
utilizada.

Aberracin esfrica:
Error de convergencia de los rayos luminosos entre la zona axial et la zona lateral de la
lenteja o del medio atravesado.

Acromtico:
Correccin de la aberracin cromtica de un sistema ptico para dos longitudes de
onda.

Airy:
Imagen de una fuente puntual, compuesta de un disco de intensidad mxima (la
primera mancha de Airy), rodeado por una sucesin de anillos de intensidad
regresivas. Es la representacin de la funcin de presentacin de un punto, "Point
Spread Function" o PSF en ingls.

Aliasing:
Motivo de una imagen numrica cuyo muestreo no es correcto. Las altas frecuencias
espaciales mayores que la frecuencia de Nyquist son progresivamente "graficadas"
como bajas frecuencias. El aliasing introduce un indeseable motivo tornasolado
cuando las frecuencias espaciales de la seal exceden el tipo de numeracin del sensor.
Usualmente, se lo constata cuando una gran imagen numrica esta presentada sobre un
monitor, un video proyector, etc.

AOBS : Acousto Optical Beam Splitter (filtro dicroico opto acstico sintonizable)
Sistema electro ptico utilizado como un espejo dicroico en un microscopio que
permite la entrada de un haz lser y a cambio la transmisin de seales emitidas por la
muestra hacia los detectores.

AOTF : Acousto Optical Tunable Filter (filtro opto acstico sintonizable)
Sistema electro ptico que permite seleccionar una raya lser y de ajustar la
intensidad. Este componente incluye un cristal birrefringente de dixido de telurio
modulado por ondas acsticas, al cual se lig un transductor piezoelctrico que enva
en el cristal vibraciones acsticas.
90

Aplantico:
Sistema de lentejas cuya esfericidad se corrige para dar una imagen plana.

Apocromtico:
Sistema de lentejas cuya cromaticidad y esfericidad son corregidas respectivamente
para tres y dos longitudes de ondas (y no necesariamente para todo el espectro visible).

Bertrand : (Lenteja de Bertrand)
La lenteja de Bertrand colocada en el tubo del microscopio o al lugar de un ocular,
permite observar la imagen formada en el plano focal posterior del objetivo.

BiFC : Bimolecular Fluorescence Complementation
Tcnico basada en la complementariedad de dos fragmentos no fluorescentes de una
protena fluorescente, por ejemplo de la YFP ("Yellow Fluorescent Protein") con un
pptido espaciador a libre rotacin. Cada fragmento es ponente de una protena
distinta. Si estas protenas obran recprocamente, los dos fragmentos del YFP se
complementan por auto-montaje y el conjunto flurese.

Bleaching: (fotoblanqueo)
Destruccin irreversible de los fluorocromos por una iluminacin muy intensa. En
microcopia confocal, los fluorocromos son excitados por un lser a un elevado nivel
de energa, el estado singulet. Cuando las molculas regresan a su estado normal de
energa, se emite una seal fluorescente. Si la intensidad de excitacin es demasiado
elevada, las molculas excitadas pasan de un estado singulet a un estado triplet y
pueden interactuar entre ellas (excmeros). La duracin de vida de las molculas en el
estado triplet que es significativamente ms larga, las molculas pueden obrar
recprocamente y pierden as definitivamente su capacidad de fluorescencia.

CALI: Chromophore-Assisted Laser Inactivation
Fotoablacin asistida por un cromoforo: tcnica que pone en obra un anticuerpo
acoplado a un cromoforo tal como la Malaquita Green para reconocer una protena
especfica. A raz de el efecto de un lser, los radicales libres producidos por este
cromoforo inactivan por peroxidacin toda protena en un rayo de algunas decenas de
nm.

Crculo de menor confusin:
Zona de errores de focalizacin de los rayos implicada por los distintos tipos de
aberraciones.

Colocalisacion:
Dos objetos que presentan posiciones espaciales idnticas, dentro del lmite del poder
resolutivo del sistema utilizado. Hay que tener en cuenta que se solucionan las
posiciones con ms precisin que los volmenes.

Confocal:
Se dice un microscopio "confocal" cuando un punto de la muestra es visto bajo el
mismo ngulo por el condensador y el objetivo.

Contraste de fase:
91
Tcnica que transforma las diferencias de orden de marcha (fase) de las ondas
electromagnticas introducidas por la muestra en una diferencia de amplitudes
(intensidad).

Contraste interferencial: (Differential Interference Contrast, DIC, Nomarski o Hoffman)
Tcnica que consiste en introducir y analizar una diferencia de marcha de dos trenes
de ondas polarizados y que es proporcional al grosor y a los ndices de refracciones de
la muestra. Resulta un contraste pseudotopogrfico o pseudorelieve.

Cross-Talk:
Paso de una emisin de fluorescencia en un canal de deteccin no conveniente.

Diafragma de campo:
Control la zona de iluminacin de la muestra. Su imagen debe situarse, segn los
principios de Khler, en el plano focal antes del objetivo.

Desplazamiento de Stokes: (Stokes shift)
Diferencia espectral entre el mximo de excitacin o absorcin y el mximo de
emisin del fluorocromo.

Epi-microscopio: (microscopio a epi-iluminacin)
El objetivo de tal microscopio sirve a la vez para iluminar y observar la preparacin.
(epi significa por encima).

FCS: Fluorescence Correlation Spectroscopy
Tcnica de espectroscopia que mide el tiempo de difusin de las partculas
fluorescentes en solucin o en un volumen minsculo y la correlacin (asociacin) de
las distintas partculas.

Filtros:
- bloque filtra de epi-fluorescencia
Juego de filtros compuesto tpicamente de tres filtros: un filtro de excitacin, un espejo
dicroico divisorio de haces a 45 y un filtro de emisin.

- filtro de excitacin (ortogonal)
Transmite selectivamente una porcin del espectro de la fuente (tpicamente de una
lmpara a mercurio) o suprime a algunas rayas de un lser.

- espejo dicroico
Separador interferencial de espectro, concebido generalmente para cortar el haz
incidente a 45. Reflexiona una luz y transmite otra. Por ejemplo, en un microscopio a
epi-fluorescencia, reflexiona la luz a ondas cortas seleccionada por el filtro de
excitacin y lo enva sobre la muestra. A cambio, transmite la fluorescencia (a ondas
ms largas) emitida por la muestra hacia el filtro de emisin.

- filtro de emisin (ortogonal)
Para selectivamente todas las luces debidas a reflexiones parsitas u otros fluoroforos
y deja pasar una seleccin de la luz emitida por la muestra.

- filtro Band-Pass BP (filtro pasabanda)
92
Transmite una banda espectral particular de la luz, utilizado siempre cuando una
discriminacin espectral sea necesaria. Los filtros pasabandas de caracterstica
espectral amplia se utilizan para obtener una imagen de intensidad y contraste mximo
manteniendo al mismo tiempo un aislamiento correcto.

- filtro DD (Doble Dicroico)
Dejar pasar especficamente 2 longitudes de onda de excitacin.

- filtro TD (Triple Dicroico)
Deja pasar especficamente 3 longitudes de onda de excitacin.

- filtro Long-Pass LP (filtro pasoalto)
Transmite una amplia banda de longitudes de onda superior a un valor especificado (y
si el filtro es interferencial, reflexiona las longitudes inferiores hacia otro canal del
sistema ptico). Utilizado cuando la aplicacin requiere la coleccin del mximo de
emisin y cuando la discriminacin espectral no se busca como en el caso de la
deteccin de una nica seal de fluorescencia o en el caso fluorescencias multi muy
bien separadas.

- filtro Short-Pass SP (filtro pasobajo)
Transmite una amplia banda de longitud de onda inferior a un valor especificado. A
veces utilizado en combinacin con un filtro Long-Pass (o pasoalto) para aislar una
regin espectral.

- filtro de discriminacin DF (Discriminating Filter)
Filtro de excitacin o emisin de tipo pasabanda con una transicin muy tiesa en
marchas de escalera que implican atenuacin especial de energa cerca de la banda
espectral de transmisin.

- KG
Filtro pasobajo de absorcin colorimtrica, transmite una banda espectral y reduce las
energas de las longitudes de ondas inferiores o superiores a la banda de transmisin.

- MB: Multiband Filter Set
Composicin de filtros necesarios para excitar simultneamente y detectar, dos, tres e
incluso cuatro fluorocromos.

- NB: Narrow-Band filter
Designado para optimizar la razn seal sobre ruido en aplicaciones donde el
aislamiento del espectro es ms importante que la intensidad de la seal.

- ND: Neutral Density filter
Filtro de atenuacin de la intensidad de luz en un mbito espectral plano. El nivel de
atenuacin de un filtro se expresa en densidad ptica (de 0.4 a 4 DO).

- OG: Orange Glass
Filtro pasoalto, absorbe un 99.999% de la luz azul.

- RG: Red Glass
Filtro pasoalto, absorbe un 99.999% de la luz azul verde.
93

FLIP: Fluorescence Loss In Photobleaching
Tcnica derivada del FRAP a la diferencia que la radiacin lser que debe apagar la
fluorescencia se emite en continuo y no sobre un corto perodo. En consecuencia, toda
partcula fluorescente que entra en el campo de radiacin se apaga, hasta la extincin
completa del compartimiento contiguo. Eso permite en particular medir el volumen de
un compartimiento.

FLIM: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
Tcnica de imgenes que consiste en medir sobre una escala de tiempo variable del
picosegundo a algunas decenas de nanosegundos la duracin de vida de fluorescencia
() de las molculas. Esta duracin de vida o duracin de vida del estado excitado
singulet, es un parmetro caracterstico del estado fsico-qumico de la sonda
fluorescente estudiada.

FRAP: Fluorescent Recovery (Redistribution) After Photobleaching
Despus del fotoblanqueo del fluoroforo, seguido de la reaparicin de la fluorescencia
gracias a la comunicacin celular o a la difusin que trae nuevas molculas
fluorescentes hacia la zona photoblanqueada.

FRET: Fluorescence Resonant Energy Transfer
(Vase Transferencia de Energa por Resonancia (RET))

Fluorina:
Los objetivos en fluorina son corregidos al menos para 3 longitudes de ondas para la
esfericidad y para 3 y ms para la cromaticidad.

Grandecimento: (magnification)
Razon que define la distancia real entre dos puntos en el plano focal del objetivo y la
distancia observada en el ocular.

FWHMT: Full Width at Half Maximum Transmission
Define la anchura de la banda espectral transmitida por el sistema ptico. Para un filtro
pasabanda, se hace referencia con relacin a la transmisin tomada a medioaltura del
mximo.

Iris condensador:
Diafragma del condensador, colocado en el plano focal antes del condensador. Visible
por la lenteja de Bertrand en el plano posterior del objetivo. Ajusta la apertura
numrica y la profundidad de campo de la lenteja.

Iluminacin Khler:
Modo de iluminacin descrito por A. Khler, para el cual se concentra una imagen de
la fuente en el plano focal antes del condensador y el diafragma de campo se concentra
en el plan del objeto. Eso permite minimizar las aberraciones, reflexiones parsitos, el
deslumbramiento y el calentamiento.

Imagen intermedia:
Situada en el tubo entre los oculares y el plan posterior del objetivo.

94
Inmersin: (lquido de inmersin)
Lquido que ocupa el espacio entre el objetivo y la muestra. Se requiere tal lquido por
objetivos con un focal de 3 mm o menos con el fin de limitar la incidencia de los
interfaces entre la muestra y el objetivo.

ndice de refraccin, n:
El ndice de refraccin n es el constante de proporcionalidad que es definido por la
relacin entre la velocidad de propagacin de la luz en el vaco c y la velocidad de
propagacin de la luz en un medio transparente v: n = c/v. Algunos ndices: n
aire
= 1,
n
agua
= 1.33, n
vidrio
= 1.518, n
aceite
= 1.515, n
medio
= 1.3 1.5

Iris objetivo:
Diafragma del objetivo, ajusta la apertura numrica y la profundidad de campo de la
lenteja.

Longitud de tubo: (Optical tube-length)
La distancia se mide entre el plano focal posterior del objetivo y el plano focal antes
de un ocular. Tpicamente esta distancia vale 160 mm, antes de la introduccin de las
ptica corregidos ad infinitum .

Promedio al registro:
Permite mejorar la razn seal/rudo: entre 2 y 4 en general
- Promedio por lnea: rpido para un punto dado y en consecuencia conviene para
los estudios de material vivo, favorece el fotoblanqueo.
- Promedio por secciones: conviene para los estudios de material fijado.

NLO: Non Linear Optics
Sistemas que recurren a otros rdenes de la luz incidente como la
modulacin/desmodulacin de frecuencia o sobre todo a los lseres pulsados para la
microscopa bifotnica.
Nyquist: (teorema de Shannon)
Ley de muestreo de una imagen: d/2.3. El tamao del pixel debe ser ms pequeo o
igual a la distancia que separa dos puntos que deben solucionarse d, dividida por 2.3.

OD: Optical Density
Unidad que mide la transmisin T de la luz. Conversin: OD = - log
10
(T). Por ejemplo,
1% transmisin, 0.01 en absoluto, as - log
10
(0.01) = OD 2.

ON: Apertura Numrica (NA, Numerical Aperture)
La apertura numrica de una lenteja. Se define como el producto del ndice de
refraccin n del medio en el cual se coloca la muestra, por el seno del semingulo de la
apertura del objetivo: ON = NA = n.sin.

Ondas evanescentes: (TIRF, Total Internal Reflection Fluorescence)
En el interfaz entre dos medios de ndices de refraccin diferentes, un rayo lser
oblicuo incidente bajo un ngulo crtico implica una reflexin total pero su campo
electromagntico (ondas evanescentes) puede excitar fluorocromos sobre 100 nm en el
segundo medio.

OTF: Optical Transfer Function (Point Spread Function, PSF)
95
Caracteriza para un sistema ptico, la funcin de restitucin de las frecuencias
espaciales de un objeto.

Overlap: (Solapamiento o recaudacin)
Solapo de dos espectros de emisin o excitacin de fluorocromos.

Pinhole: (agujero de aguja)
Diafragma de deteccin: diafragma a iris sobre la mayora de los aparatos que permite
ajustar el volumen analizado. Desempea un papel esencial en la resolucin espacial.
Se regula sobre el valor de la mancha de Airy por un objetivo dado.

Pixel: (del ingls Picture Element)
Elemento bsico del formato de una imagen convertida. Cada pixel expresa un nivel
de gris. Para un campo dado (x,y) el nmero de pixeles determina la definicin de la
imagen (tpicamente 514 x 514 1024 x 1024). Por extensin, una serie de imgenes
sobre un volumen (x, y, z) estn constituida por voxels (Volume Element).

Plan-Apocromtico:
Objetivo con correcciones de llanura y aberracin cromtica avanzadas.

Plan de campo: (Field plane)
En un microscopio ajustado segn Khler, los distintos planes de campo se combinan
con la muestra focalizada. Incluyen pues el plano de la muestra, el diafragma de
campo, el plano imagen intermedia y la imagen sobre la retina o el sensor.

Profundidad de focalizacin: (Depth of focus)
Se refiere a la zona anterior y posterior del plano focal imagen donde un punto imagen
borroso es ms pequeo que el crculo de confusin.

Profundidad de campo: (Depth of field)
Es la distancia que separa, de parte y de otro del plano focal objeto de la lenteja, los
objetos que parecen netos. La profundidad de campo vara con la longitud focal de la
lenteja, NA y .

PSF: Point Spread Function (Optical Transfer Function, OTF)
Caracteriza para un sistema ptico la funcin de restitucin de las frecuencias
espaciales de un objeto.

Quenching: (desexcitacin)
Todo fenmeno que disminuye el rendimiento cuntico del fluoroforo. En trminos
electrnicos, se hablar de quenching dinmico (colisiones), o estticos (complejos), o
a distancia (resonancia). En trminos qumicos, se observa la fotodegradacin con
formacin de excmeros, transferencia de protones. Contrariamente, la fotoestabilidad
corresponde al nmero de excitaciones que puede sufrir una molcula fluorescente
antes de destruirse.

Refraccin:
Desviacin de un rayo luminoso que cruza la superficie de separacin de dos medios,
en los cuales las velocidades de propagacin son diferentes.

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Rendimiento cuntico:
Razn del nmero total de fotones emitidos en todo el espectro de emisin de
fluorescencia con respecto al numero de fotones recibidos y absorbidos en la zona
espectral de excitacin.

Resel:
Se llama as la unidad de resolucin por "resolution element".

Resolucin:
La resolucin corresponde al poder separador, es decir, a la capacidad de un sistema
ptico para distinguir dos puntos distintos. Ernst Abbe (1840-1905) defini la
resolucin al lmite de difraccin. Dos detalles de una muestra separada de una
distancia son resueltos cuando la apertura numrica (ON) del objetivo es
suficientemente grande para capturar el primer orden de difraccin producido por
estos detalles a la longitud de onda utilizada. La resolucin o poder separador , de un
objetivo de microscopio depende de la apertura numrica y se define por: resolucin =
= 0.61 /ON dnde es la longitud de onda. Pues, la resolucin es mejor (el ms
pequeo) si es pequea y si la Apertura Numrica es grande. Los lmites tericos del
poder separador de un microscopio se sitan en torno a una semilongitud de onda (250
nm) y su aumento a 1000 veces la apertura numrica.

Shannon:
(Vase Nyquist).

Espectrmetro ptico:
Sistema ptico que transmite una banda especfica del espectro electromagntico. La
dispersin de las distintas longitudes de ondas es obtenida por la capacidad de una
prisma para difractar la luz. Sistema utilizado en los microscopios confocales LEICA
SP.

TC-SPC: Time Correlated Single Photon Counting
Imgenes por registro x, y, t de la posicin y del tiempo de deteccin de cada fotn. A
posteriori, se puede as jugar de nuevo las coordenadas con regiones de inters,
ventanas de tiempo y tiempo de integracin modulado segn la reactividad observada.

Transferencia de energa por resonancia: Frster Resonant Energy Transfer (FRET)
Dos cromoforos acercados ( 7 nm) que tienen un solapo del espectro de emisin de
un donante de energa y el espectro de absorcin de aceptante de energa pueden, en
funcin de la orientacin de sus dipolos, producir una transferencia no radiativa por
resonancia. En el caso de fluoroforos, Fluorescence Resonant Energy Transfer
(FRET): se excita al donante y se observa la emisin del aceptante. Tambin en este
caso, la duracin de vida del donante (
f
) disminuye. El FRET permite obtener una
estimacin de la distancia entre dos molculas.

Wide-field:
Microscopa a campo amplia, microscopa convencional.

WD: Working distance (distancia de trabajo)
Distancia entre la lenteja y el objeto focalizado, menos el grosor de la cuchilla cubre-
objeto (normalmente de 170 m de grosor).
97
7 Bibliografa

[1] M. Born et E. Wolf, Principles of Optics, 6
me
didition, Pergamon Press, Oxford (1995).

[2] B. Rossi, Optics, Addison-Wesley (1957).

[3] J. Surrel, Optique instrumentale, optique de Fourier, Ellipses (1996).

[4] J.W. Goodman, Introduction to Fourier Optics, 2
me
dition, Mc Graw-Hill International
Editions (1996).

[5] The Handbook of Biological Confocal Microscopy, J. Pawley Ed., 2
me
dition, Plenum
Press, New York (1995).

[6] D. Courjon, Near-Field Microscopy and Near-Field Optics, Imperial College Press
(2003).

[7] D. Courjon et C. Bainier, Le champ proche optique : thorie et applications, Springer
(2001).

[8] Biomedical Photonics Handbook, Tuan Vo-Dinh Ed., CRC Press, 2003.

[9] Visitez les sites :
http://www.olympusmicro.com/primer/java/index.html
http://confocal.medecine.uhp-nancy.fr/bouton2/microscopie-multiphoton.html