Introduccin

En los ambientes naturales los microorganismos se encuentran usualmente como poblaciones mixtas, pero si queremos estudiarlos, caracterizarlos e identificarlos, necesitamos tenerlos como cultivos puros. Un cultivo puro es aquel en el que todos los microorganismos provienen de una sola clula. La obtencin de un cultivo puro, a partir de una poblacin mixta, se lleva a cabo en dos etapas: 1. La muestra debe diseminarse de manera tal que los diferentes microorganismos queden lo suficientemente separados sobre la superficie de un medio de cultivo slido, de manera que luego de la incubacin ellos formen colonias visibles aisladas. Este proceso se conoce como aislamiento. En esta placa tendremos diferentes tipos de colonias correspondientes a los diferentes microorganismos presentes en la poblacin original. Para garantizar la pureza del cultivo obtenido, es conveniente, a partir de cada tipo de colonia aislada, repetir el proceso de aislamiento antes descrito. Se considerar que se ha obtenido un cultivo puro, cuando al realizar este proceso, todas las colonias obtenidas presenten las mismas caractersticas. El medio de cultivo utilizado en el proceso de aislamiento depender, entre otros factores, de los requerimientos nutricionales de los microorganismos que se espera aislar y de la presencia de microorganismos que, por sus caractersticas y/o por la cantidad en que se encuentren en la muestra, dificulten la obtencin del microorganismo objeto del aislamiento. En este ltimo caso, se deben utilizar medios de enriquecimiento y medios selectivos que inhiban el desarrollo de grmenes contaminantes. La temperatura y otras condiciones de incubacin, variarn segn los microorganismos, usualmente la temperatura ptima de los microorganismos patgenos para el hombre oscila entre 30 y 40C. Cuando el microorganismo que se intenta aislar es anaerbico, deben tomarse las precauciones necesarias a fin de eliminar la presencia de oxgeno en el ambiente donde se desarrollar el mismo. Basndose en el origen y naturaleza de la muestra se pueden inferir los posibles microorganismos que se encuentran presentes en la misma, y ese conocimiento ayudar en la seleccin del medio y las condiciones de cultivo adecuadas. Para iguales fines, es de gran utilidad el conocimiento de los sntomas de la enfermedad que padece la persona de quien se obtuvo la muestra analizada.

La tincin de Gram es un tipo de tincin empleado en microbiologa para la visualizacinde las bacterias, debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram que desarroll unmtodo de tincin en 1884.Por mas de una centuria las bacterias han sido clasificadas a la reaccin de Gram, lahabilidad de retener un complejo de iodo violeta cuando se trata con con un solventeorgnico tal como el alcohol o la acetona , las

bacterias Gram positivas retienen la tintura yaparecen de color violeta, mientras que las Gram negativas no lo pueden retener y se tiende color rojo para ser vistas con el microscopio.

OBJETIVOS Conocer a travs de muestras bacteriolgicas, el proceso de cultivo puro. Reconocer las distintos tipos de bacterias, que existen a travs de la utilizacin de la tcnica de la tincin gran y la ayuda del microscopio. Ejecutar las tcnicas bsicas para el aislamiento de microorganismos en cultivo puro, a partir de una muestra que contiene una poblacin. Emplear tcnicas bacteriolgicas simples Conocer el fundamento estructural de la Tincin de Gram. Utilizar el microscopio con el objetivo de inmersin.

MATERIALES: 2 Laminas portaobjetos Isopos esteriles Anzas bacteriolgicas Mechero Microscopio

REACTIVOS: Cristal violeta Lugol Ol- acetona Safranina Aceite de inmersin

MUESTRAS Enterobacterias Mucosa farngea

EXPERIENCIA 1: ENTEROBACTERIAS

PROCEDIMIENTOS 1. Seleccin de muestra 2. Esterilizar la anza redonda, con la ayuda de un mechero, luego dejamos enfriar por 10 s. 3. Con el anza redonda, cogemos agua del tubo de ensayo y colocar sobre la lamina. 4. Calentar el tubo de ensayo que contiene la muestra de enterobacteria 5. Con la ayuda de la anza, tomar la muestra de ella procedemos a colocar en la lamina portaobjetos y flamearla. 6. Aplicamos la tcnica de tincin gram: Colocar el cristar violeta por un minuto y enjuagar El lugol por un 1 minuto y enjuagar Aadir alcohol-acetona e inmediamente enjuagar Agregar safranina por 30 s, enjuagar 7. Esperar unos minutos hasta que la lamina este completamente seca para agregarle aceite de inmersin. 8. Llevar la muestra al microscopio y observar, con el objetivo 100x, ocular 10x Aumento= 1000x

RESULTADOS Y CONCLUSIONES En esta experiencia hemos observado que la muestra bacteriolgica son bacilos cortos gram negativos. Estudio de la morfologa de la colonia: Forma: bastoncillos Tamao: pequeos Bordes: regulares Elevacin: convexos Consistencias: color: rojizos

mucoides

Mtodo de observacin: tincin gram

EXPERIENCIA 2: ISOPADO FARINGEO

PROCEDIMIENTOS: 1. Seleccin de muestra 2. Colocar la muestra en forma de sig-sag, sobre la lamina previamente estrilizada. 3. Esterilizar la anza redonda, con la ayuda de un mechero, luego dejamos enfriar por 10 s. 4. Con el anza redonda, cogemos agua del tubo de ensayo y colocar sobre la lamina. 5. Aplicamos la tcnica de tincin gram: a. Colocar el cristaL violeta por un minuto y enjuagar b. El lugol por un 1 minuto y enjuagar c. Aadir alcohol-acetona e inmediamente enjuagar d. Agregar safranina por 30 s, enjuagar 6. Esperar unos minutos hasta que la lamina este completamente seca para agregarle aceite de inmersin. Llevar la muestra al microscopio y observar, con el objetivo 100x, ocular 10x Aumento= 1000x

RESULTADOS Y CONCLUSIONES: Obtuvimos como resultado cocos gran positivos. FORMA: redonda TAMAO: pequeo 100x BORDES: regular ELEVACION: convexa CONSISITENCIA: mucoides COLOR: violeta http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Obten ci%C3%B3n_de_cultivos_puros.pdf

METODO DE OBSERVACION: tincin gram

FUNDAMENTO Al diseminar sobre un medio de cultivo slido una muestra de bacterias, diluida convenientemente, las clulas individuales quedarn lo suficientemente separadas unas de otras y crecern en forma de colonias aisladas, a partir de las cuales se puede obtener un cultivo puro. Cuando se cultivan los microorganismos sobre medios de cultivo slidos, las clulas aisladas se multiplican sucesivamente hasta dar un crecimiento visible conocido con el nombre de colonia, las caractersticas de estas colonias son estudiadas y se usan en la identificacin de las especies. Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas .La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa depeptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra elcido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que est ancladosolamente en el peptidoglucano

(tambin conocido como murena)Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada,y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (decomposicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capadelgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. Lamembrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido.Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estasdiferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que esel material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Grampositivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas.La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a quela membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos,como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano queposee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristalvioleta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa,perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Grampositivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcinde peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sinoque este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que puedaescaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea.

Actividad:

Qu es y para qu sirve el aceite de inmersin? Medio de inmersin para microscopia sirve para posibilitar la observacion de diferentes muestras en el mayor aumento de un microscopio optico (x100) una gota de aceite hace contacto entre la lamina cubreobjetos (encima de la muestra a observar) y el lente del ocular, entonces el aceite serviria como una lente de aclaramiento y es una union fisica entre la muestra y el microscopio sirve para observar todo tipo de muestras y tinciones

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
P. R. MURRAY. Microbiologa Mdica. 2006. Mosby (Elsevier Science). http://www.geocities.com/CapeCanaveral/3504/gallery.htmg

dibujossssss de todo falta